CN101514372A - 出生缺陷靶向寡核苷酸微阵列比较基因组杂交芯片的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及诊断试剂领域，提供了一种出生缺陷靶向寡核苷酸微阵列比较基因组杂交芯片的制备方法。由本发明所述方法制备的出生缺陷靶向寡核苷酸微阵列比较基因组杂交芯片是由靶向特定的染色体或染色体区域的探针构建而成，既能保证病理性CNVs的检出又可以大大减少临床意义不明的CNVs的检出。

Description

出生缺陷靶向寡核苷酸微阵列比较基因组杂交芯片的制备方法

技术领域

本发明涉及诊断试剂领域，尤其涉及一种出生缺陷靶向寡核苷酸微阵列比较基因组杂交芯片的制备方法。

背景技术

出生缺陷(Birth Defect)也称先天异常，是指胚胎发育紊乱引起的形态、结构、功能、代谢、精神、行为等方面的异常，包括先天畸形、智力障碍、发育迟缓和代谢性疾病等。出生缺陷的原因复杂，遗传因素是出生缺陷的主要原因。最近的研究表明，基因组拷贝数变化(copy number alterations，CNVs)是许多先天异常(如先天畸形、胎儿发育异常、智力低下等)的细胞遗传基础。所谓CNVs，如缺失、获得、扩增和非整倍体改变等，被用来描述病人与正常参考基因组DNA之间拷贝数的差异以及导致微缺失和微复制综合征的基因组不平衡，其发生率至少是SNPs的3倍。特征性的CNVs常常是各种先天异常的细胞遗传基础，并且对先天异常的产前诊断以及发病机制的研究有重大意义。目前，对大多数出生缺陷尚缺乏有效的治疗措施，因此，预防是降低出生缺陷发生率的主要措施，而可靠的产前诊断则是降低出生缺陷发生率的关键所在。

核型分析是诊断和预防出生缺陷的主要方法之一。随着技术的发展，核型分析正由传统核型分析向分子核型分析转变，分析结果更加完整、准确和可靠。然而，由于我国医疗水平和经济条件的限制，全国绝大多数医院仍在使用传统的染色体显带技术，虽然结果准确可靠，但是分辨率低，难以检测小于5～10Mb的CNVs，难以确定CNVs的大小和断裂点以及标记染色体的性质，且需要细胞培养、显微计数和分析，费时费力。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)分辨率高，能够检测亚显微基因组变化，克服了显带分析的不足，然而，FISH操作繁琐，费时费力，需要预先知道待测CNVs的位置和类型，难以检测中间缺失和复杂的染色体重排。荧光定量PCR(quantitative fluorescence polymerase chainreaction，QF-PCR)和多重连接介导的探针扩增(multiplex ligation-dependentprobe amplification，MLPA)均能同时对多个标本进行快速检测，但也只能对已知的或与探针互补的基因组区域进行检测，无法对整个基因组进行高通量检测，因此难以用于临床筛查。比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)一次试验能筛查整个基因组的CNVs并把结果定位于基因组上，然而，CGH需要中期细胞，费时费力，敏感性低，难以检测嵌合体，分辨率低，难以检测小于5～10Mb的CNVs。总之，以上细胞遗传分析方法要么由于分辩率低，难以检测亚显微的CNVs，要么由于低通量性，会漏检大量的CNVs，常导致假阴性检测结果，从而会导致大量异常胎儿的出生。

微阵列(microarray)，又称基因芯片、生物芯片，是一种微型的分析装置，是生物学、化学、物理学、工程学和计算机等多门学科结合的尖端生物技术，具有并行性、高通量、微型化、自动化等优点。虽然商业化的生物芯片越来越多，但有关靶向array CGH芯片的报道并不多，国内还未见有报道。尽管国外有少数实验室在研究靶向array CGH芯片，但他们要么选择的靶点有限，要么构建的是BACs arrayCGH芯片。若要使array CGH芯片能适用于临床诊断，就必须要满足两个条件：首先，array CGH芯片必须能高分辨率、高敏感性和高特异性的检测出病理性CNVs；其次，array CGH的结果要易于分析，尽可能地减少或避免临床意义不明的CNVs的检出。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种出生缺陷靶向寡核苷酸微阵列比较基因组杂交芯片的制备方法。

为达到上述目的，本发明一种出生缺陷靶向寡核苷酸微阵列比较基因组杂交芯片的制备方法包括以下步骤：

1)出生缺陷基因组拷贝数变化靶点筛查与鉴定

a)收集确诊为发育迟缓、智力低下或多发先天下畸形病例以及经超声检测为先天异常的胎儿病例；

b)采用高分辩率全基因组微阵列比较基因组杂交芯片进行检测，每例标本经染料互换共检测两次；

c)杂交结果扫描和分析；

d)对检测出的基因组拷贝数变化用FISH、定量PCR或MLPA进行验证；

e)鉴定并记录与特定畸形表型相关的基因组拷贝数变化；

2)靶点的选择：将经上述检测所得到的基因组畸变区域和国际病理性基因组拷贝数变化数据库最新检测和确定的所有微缺失和微复制综合征的基因组畸变区域共同作为本芯片的靶点。

3)探针的选择：选择靶向上述靶点的探针、质量控制探针和阴性对照探针，探针长为50至70bp，相邻靶向探针的间距为6.3至6.5Kb；

4)玻片表面经硅化处理：对玻片进行表面硅化处理，以有利于探针牢固地结合于载体表面；

5)点样：将靶向探针随机点于玻片上，每个探针重复4次，共分4个区块，每个区块都点有重复的质量控制探针和阴性对照探针。

所选探针具有出生缺陷靶向性，有质量控制探针和阴性对照探针做质量控制，所有探针均自行设计和合成。

所述质量控制探针是指以人类的管家基因的DNA序列设计合成的探针，这种DNA序列在人群中很稳定，质量控制探针可以检测芯片的杂交效果和灵敏度等，防止假阴性结果。所述阴性对照探针是不能与人类基因组序列退火杂交的DNA序列，主要用于防止假阳性和检测背景信号。

微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization，array CGH)的出现弥补了传统细胞遗传分析方法的不足，使检测结果变得更加完整可靠。由本发明所述方法制备的出生缺陷靶向寡核苷酸微阵列比较基因组杂交芯片是由靶向特定的染色体或染色体区域的探针构建而成，既能保证病理性CNVs的检出又可以大大减少临床意义不明的CNVs的检出。

本发明所述方法通过对过去几年国外对基因组CNVs研究工作所取得的成果进行仔细总结、整理和加工，将所有的异常基因组位点集中于同一张芯片上，构建靶向已知微缺失、复制综合征关键区域和有明确临床意义区域的寡核苷酸array CGH芯片。以后可根据国际CNVs数据库的更新不断增加靶点，保证由此方法制备的出生缺陷靶向寡核苷酸微阵列比较基因组杂交芯片的先进性。

附图说明

图1是G显带染色体分析显示Y染色体像X染色体短臂，胎儿核型为：46，X0，+der；

图2是胎儿8p23.1(10245882和11676699之间)重复的array-CGH扫描图，纵轴为染色体定位标记，横轴为log2病人/参照比值，背景为各染色体区域含有的基因。在没有CNVs的区域，绿色和红色的点以0为中心左右对称分布；在扩增的区域，各点向红色方向偏移(紫色涂染区)；

图3是18染色体的array-CGH扫描图。左边，是18染色体的模式图，右边，是18染色体探针的log2比值及在染色体上所处的位置。每一个点代表array-CGH芯片上的一个探针。拷贝数缺失(18p11.21→pter)的比值≤-0.5，移向左边；拷贝数复制(18p11.21→qter))的比值≥0.5，移向右边；

图4是存在亚显微CNVs的染色体的array-CGH扫描图，无CNVs区域的log2比值应该为0。

具体实施方式

实施例1

病例资料

一37岁孕3产0汉族孕妇，此次妊娠26w时，超声检查发现胎儿完全性ECD。爱人42岁，否认近亲结婚，否认高血压、糖尿病、肾病、肝炎、结核病等病史，否认家族遗传病史。G显带染色体分析难以确定胎儿Y染色体的性质，像X染色体短臂，因此标记为衍生染色体，胎儿核型为：46，X0，+der(？)(图1)。父母的核型均正常。流产后检查发现胎儿为男性，患有右手轴前六指畸形，未发现其它异常。

细胞收集

收集经G显带染色体检查后剩余的胎儿细胞悬液，-20℃保存。收集一核型和表型均正常的男性个体的外周血细胞培养悬液作为正常对照，-20℃保存。

Array-CGH分析

运用Agilent Technologies Array CGH Kits(Santa Clara，USA)进行array-CGH分析，此芯片平台的探针是60-mer的寡核苷酸，能以～20kb(kit 244A)的分辩率进行全基因组扫描。DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen，Germany)提取胎儿和对照标本的基因组DNA，片段化。用(Sigma，USA)进行全基因组扩增，纯化。用Genomic DNA Labeling Kit PLUS(Agilent，USA)通过随机引物法对两样本进行标记，用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP分别标记胎儿和对照标本。纯化标记产物并检测标记效率，将标记产物和50μg Cot-1 DNA混合、变性和预退火后，于65℃与芯片旋转杂交40h。冲洗两次后，用Agilent Scanner and Feature ExtractionV.9.5(Agilent，USA)对杂交结果进行扫描，所得数据由CGHAnalytics 3.4(Agilent，USA)进行分析。

RT-qPCR

为了验证array-CGH检测结果的准确性，所有的CNVs(11个新发现的CNVs和8p23.1重复区域)，按照Qiao等(Qiao Y，Liu X，Harvard C，et al.Large-scalecopy number variants(CNVs)：distribution in normal subjects andFISH/real-time qPCR analysis.BMC Genomics，2007，8：167.)所用的方法在待测基因组区域中选择非多态性片段进行RT-qPCR检测。通过比较病人与对照样本同一位点的CT值来计算病人此位点拷贝数的相对变化，数据采用2-ΔΔCT法进行分析。

结果

Array-CGH分析结果

对胎儿进行全基因组array-CGH扫描分析后，显示衍生染色体为Y染色体，并非X染色体短臂，且不存在CNVs。在8p23.1 ORDRs之间的区域发现一～1.43Mb的重复(位于10245882和11676699之间)，见图2。此重复区域含有27个基因，其中21个是已知基因，剩下的6个是新基因，包括GATA4、SOX7等基因。另外，还检出了11个亚显微CNVs，因为与国际公共病理性CNVs数据库[the Database of ChromosomalImbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources(DECIPHER，http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/)]和国际公共良性CNVs数据库[the Database of Genomic Variants(http://projects.tcag.ca/variation/)]已报道过的CNVs均无重叠，因此为新发现的。此11个CNVs均含有OMIM数据库列出的基因(N＝24)，分别涉及人类生物合成、转运、催化、蛋白编码、泛素化、信号转导、去甲基化、转录调节等生物功能(表1)。

RT-qPCR

11个新发现的亚显微CNVs(表1)和8p23.1重复区域(表2)的RT-qPCR检测结果与array-CGH的检测结果相吻合。

表1  Array-CGH检测出的11个新发现的亚显微CNVs以及RT-qPCR验证结果

注：ΔΔCT＝[C_T(待测)-C_T(内参)]_(样本)-[C_T(待测)-C_T(内参)]_(对照)

表2  胎儿8p23.1重复区域的RT-qPCR检测结果

注：计算结果表明8p23.1在对照样本中的拷贝数为1，则在病人样本中的拷贝数为3.25

实施例2

病例资料

韩慧玲，28岁，汉族，孕3产0，怀孕26w，因超声检查发现胎儿多发畸形而收住本院。超声发现胎儿双侧桡骨缺失并双手畸形，双侧肱骨较短，右侧足内翻，Taussing-Bing综合征(室间隔缺损，肺动脉骑跨)，双侧脉络膜囊肿，颈项软组织增厚。否认近亲结婚，否认高血压、糖尿病、肾病、肝炎、结核病等病史，否认家族遗传病史。G显带染色体分析结果为：46，XY，-18，+der(？)。FISH检测结果表明衍生染色体可能是18q等臂双着丝粒染色体[idic(18)(p11→qter)]，确切的断裂点尚无法确定。父母的核型均正常。

细胞收集

收集经G显带染色体检查后剩余的胎儿细胞悬液，-20℃保存。收集一核型和表型均正常的男性样本的外周血细胞培养悬液作为正常对照，-20℃保存。

Array-CGH分析

运用Agilent Technologies Array CGH Kits(Santa Clara，CA)进行array-CGH分析，此芯片平台的探针是60-mer的寡核苷酸，能以高达-20kb(kit 244A)的分辩率进行全基因组扫描。DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN，Germany)提取病例和对照标本的基因组DNA，片段化。用

(SIGMA，USA)进行全基因组扩增，纯化。用Genomic DNA Labeling Kit PLUS(Agilent，USA)通过随机引物法对两样本进行标记，用Cy5-dUTP和Cy3-dUTP分别标记病例和对照标本。纯化标记产物并检测标记效率，将标记的产物和50μg of Cot-1 DNA混合、变性和预退火后，于65℃与芯片旋转杂交40小时。冲洗两次后，用Agilent Scanner and FeatureExtraction V.9.5对杂交结果进行扫描，所得数据由CGHAnalytics 3.4(AgilentTechnologies)进行分析。CNVs的筛选标准为：相邻的4个探针向同一方向变化，且log2待测/对照比值≤-0.5或≥0.5，分别用于评估CNVs的缺失或复制。

RT-qPCR

为了验证array-CGH检测结果的准确性，选择2个亚显微CNVs(一个微复制和一个微缺失)按照Qiao等(Qiao Y，Liu X，Harvard C，et al.Large-scale copynumber variants(CNVs)：distribution in normal subjects and FISH/real-timeqPCR analysis.BMC Genomics，2007，8：167.)所用的方法进行RT-qPCR检测。

结果

Array-CGH分析结果

对胎儿进行全基因组array-CGH扫描分析后，显示18p11.21→pter缺失，18p11.21→qter复制，断裂点位于12104527和12145199之间(距离18p端粒)(见图3)，表明idic(18)(p11→qter)实际上是18等臂双着丝粒染色体[idic(18)(p11.21→qter)]。另外，从其他13条染色体中发现了21个亚显微CNVs并被分为两个组(见图4和表2)，其中最小的CNV仅13.91kb。A组含有13个公共数据库[the Database of Genomic Variants(http://projects.tcag.ca/variation/)已报道过的CNVs，且大都是已报道的CNVs片段当中的一个区段。B组中的8个CNVs是新发现的。13个CNVs(A组有7个，B组有6个)是微复制。在21个亚显微CNVs中，有9个含有OMIM数据库列出的基因，涉及人类免疫、代谢、转录调节、解毒和肿瘤发生等生物功能。

RT-qPCR

2个亚显微CNVs(一个微缺失和一个微复制)的RT-qPCR检测结果(表3)与array-CGH的检测结果相吻合(表4、表5)。

表3  Array-CGH鉴定出的所有亚显微CNVs

表4  病人微复制(22q11.23)的RT-qPCR检测结果

注：计算结果表明对照样本中22q11.23的拷贝数为1，则在病人样本中的拷贝数为3.12

表5  病人微缺失(14q11.1-q11.2)的RT-qPCR检测结果

注：计算结果表明参照样本中14q11.1-q11.2的拷贝数为1，则在病人样本中的拷贝数为0.48。

实施例3玻片表面经硅化处理

1、玻片的清洗与硅烷化，将玻片浸于1mol/L的NaOH中2小时，浸泡过程中放在摇床上震动，用灭菌水清洗干净后放入1M HCL中浸泡过夜，再用灭菌水清洗，最后用甲醇清洗。将玻片放入含1％的缩水甘油-丙氧基三甲氧基硅烷(GOPS)的95％的乙醇溶液中硅化30min后，用乙醇溶液清洗，烘干。

2、Poly-L-Lysine包被，将硅烷化玻片浸入1∶10的Poly-L-Lysine与PBS培养液中摇晃室温反应2小时，反应完毕后，双蒸馏水清洗玻片5次，然后将玻片放入离心机中500r/min离心5min，45℃真空干燥箱中烘干。

3、表面活化，将上一步Poly-L-Lysine包被的玻片放入活化液中，室温反应2小时，然后依次用甲醇和丙酮清洗两次，45℃真空干燥箱中烘干，暗盒中保存备用。活化液组成为0.2％的次亚苯基二异硫氰酸盐PDITC(1，4-phenylendiisothiocyanate)，10％的无水吡啶，89.9％的二甲基甲酰胺(DMF)。

Claims (3)

1、一种出生缺陷靶向寡核苷酸微阵列比较基因组杂交芯片的制备方法，包括以下步骤：

1)出生缺陷基因组拷贝数变化靶点筛查与鉴定

a.收集确诊为发育迟缓、智力低下或多发先天下畸形病例以及经超声检测为先天异常的胎儿病例；

b.采用高分辩率全基因组微阵列比较基因组杂交芯片进行检测，每例标本经染料互换共检测两次；

c.杂交结果扫描和分析；

d.对检测出的基因组拷贝数变化用FISH、定量PCR或MLPA进行验证；

e.鉴定并记录与特定畸形表型相关的基因组拷贝数变化；

2)靶点的选择：将经上述检测所得到的基因组畸变区域和国际病理性基因组拷贝数变化数据库最新检测和确定的所有微缺失和微复制综合征的基因组畸变区域共同作为本芯片的靶点；

3)探针的选择：选择靶向上述靶点的探针、质量控制探针和阴性对照探针，探针长为50至70bp，相邻靶向探针的间距为6.3至6.5Kb；

4)玻片表面经硅化处理：对玻片进行表面硅化处理，以有利于探针牢固地结合于载体表面；

5)点样：将靶向探针随机点于玻片上，每个探针重复4次，共分4个区块，每个区块都点有重复的质量控制探针和阴性对照探针。

2、根据权利要求1所述的出生缺陷靶向寡核苷酸微阵列比较基因组杂交芯片的制备方法，其特征在于：所选探针具有出生缺陷靶向性，有质量控制探针和阴性对照探针做质量控制，所有探针均自行设计和合成。

3、根据权利要求1所述的出生缺陷靶向寡核苷酸微阵列比较基因组杂交芯片的制备方法，其特征在于：所述质量控制探针是以人类的管家基因的DNA序列设计合成的探针；所述阴性对照探针是不能与人类基因组序列退火杂交的DNA序列。

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