CN109182494B - 一种用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片、试剂盒及基因芯片的应用方法 - Google Patents

一种用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片、试剂盒及基因芯片的应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片、试剂盒及基因芯片的应用方法，基因芯片包括片基，该片基上设有探针组形成微阵列基因芯片；试剂盒包括该基因芯片/引物组和酶系等。基因芯片的应用方法为：首先，准备含有DNA的样本，然后PCR扩增，然后采用所述的基因芯片进行杂交。该微阵列芯片能够以待测孕妇外周血的cf‑fDNA为模板进行多重PCR扩增，得到PCR扩增产物后，与本发明的芯片进行杂交，根据杂交结果确定胎儿是否携带有先天性半侧颜面短小综合征相关基因；非常简单，大大降低误差率和时间成本，提高精确度；能用于产前先天性遗传病的诊断，在无创产前诊断领域具有很大的潜力。

Description

一种用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片、试 剂盒及基因芯片的应用方法
技术领域
本发明涉及生物、医药技术领域，具体涉及一种用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片、试剂盒及基因芯片的应用方法。
背景技术
半侧颜面短小综合征(craniofacial microsomia，CFM)是一组包含了外中耳畸形、上下颌畸形、面神经以及颌面软组织畸形的重大出生缺陷。在世界范围内，半侧颜面短小发病率介于1/3000-1/5000，男女性别比例约为3∶2。我国位于半侧颜面短小的三大高发地区(中南美洲、东亚、北欧)之一，出生缺陷监测数据显示在我国的发病率为1/3000新生儿，是仅次于唇腭裂的第二大颅面部畸形疾病。半侧颜面短小在我国某些地域高发，如广东等地合并外耳畸形的半侧颜面短小发病率竟高达2/1000，同时，农村的发生率显著高于城市。基于我国庞大的人口基数和二胎政策的放开，2016年后每年将会迎来大约1700万新生儿，其中半侧颜面短小综合征的新发病例将达4000余例。
半侧颜面短小综合征主要表现为颌面骨骼和软骨组织发育不良，可导致患者面部严重不对称、耳道闭锁、面裂等症状，严重影响患者的身心健康。传
目前，针对半侧颜面短小综合征的病因学研究相对滞后，多集中在环境风险因素的探查，包括孕期用药或接触致畸级，高龄、多次生产等。在遗传病因学方面，除本研究团队外，仍无针对半侧颜面短小综合征的大规模组学研究报道。其他研究局限于包含颅面畸形的综合征类疾病研究，致病基因重复性差，遗传病因学难有突破。从发育角度来讲，该畸形公认的两个病因学假说为：“神经嵴细胞(Neural Crest Cell，NCC)扰乱”和“颅面发育局部缺血”，但一直缺乏有力的证据来验证假说的可靠性。
近年来，我国出生缺陷发生率呈上升趋势，每年新增病例约90万例，给社会和家庭带来沉重负担。随着二胎政策的放开，高龄妊娠和多次生产等环境高危因素大量涌现，将进一步增加先天畸形出现的潜在风险。本发明人开展了世界上第一个半侧颜面短小综合征的大规模全基因组致病基因研究，找到了12个风险基因，提示“神经嵴细胞扰乱”是半侧颜面短小的真正病因学解释。该研究是针对该疾病目前最重要的研究结果，其成果的发表(Nature communications)为半侧颜面短小综合征病因学研究指明方向，为进一步揭示该疾病的遗传基础、调控机制、以及开发产前诊断技术奠定基础。
基因芯片技术是指将特定寡核苷酸片段作为探针固定于支持物上，掺入标记物的目的DNA片段通过PCR扩增后，按碱基配对原理进行杂交，再通过信号检测系统对芯片进行扫描，并配用相关分析软件对每一探针上的信号作出比较和检测。目前该技术在疾病检测领域已得到了广泛应用。通过检测孕妇及其配偶常见半侧颜面短小综合征致病基因突变携带情况，可早期发现半侧颜面短小综合征生育风险，结合产前诊断有效降低半侧颜面短小综合征的发病率。相对传统方法，半侧颜面短小综合征基因芯片检测具有结果可信度高、通量大、速度快、可操作性强等优点，适用于半侧颜面短小综合征产前基因检测。
传统的半侧颜面短小综合征并无特异的产前检测方法，只能在出生后，经过漫长等待至5-7岁后接受手术治疗，给患者家庭带来了精神和身体上的双重痛苦。因此，寻找一种高灵敏度的无创产前诊断半侧颜面短小综合征的方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片、试剂盒及基因芯片的应用方法，以克服现有技术中提到的不足。本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片，所述基因芯片包括片基，该片基上设有用于检测半侧颜面短小综合征相关基因的探针组形成微阵列基因芯片；
所述探针组包括13个探针，各个探针的序列如下所示：
(1)探针P1：其核苷酸序列为AGAGTAATGCTGTCCATTGCCCA；
(2)探针P2：其核苷酸序列为AAGATATTCACTCTCTGGCTAGGCCTA；
(3)探针P3：其核苷酸序列为ATATGAAATAAGGAGGAGATAAGAGA；
(4)探针P4：其核苷酸序列为GCTGGGATTACAGGCATGAGCCACTGT；
(5)探针P5：其核苷酸序列为AAAGAAAATATCTCAAAGAATCAAC；
(6)探针P6：其核苷酸序列为AAGCTCAGGGGCTCAGGAGGCAGGA；
(7)探针P7：其核苷酸序列为CTGAATCCTTGTTGGCTTCAGAGTCAG；
(8)探针P8：其核苷酸序列为CTGATCCTCTGAGGGATTGATGACA；
(9)探针P9：其核苷酸序列为TAAAGTGGGAGGATTGCTTGAGCCC；
(10)探针P10：其核苷酸序列为GGGAAAGAAATGGGAAGAGGAGG；
(11)探针P11：其核苷酸序列为CAACTACTGCCAAATATAAACAAAGG；
(12)探针P12：其核苷酸序列为AATAACCTTATTGTGTTGTTGTGACAA；
(13)探针P13：其核苷酸序列为TGAATATATGTTACCTAACATTGATCA；
在，探针P1～探针P13中，每条探针的5’端均标记有荧光基团，其3’端均标记有淬灭基团。
进一步地，所述片基为采用载玻片、硅片或膜作为载体的片基。
进一步地，在基因芯片上，每个所述的探针均设有3条(即重复三次)，则基因芯片上含有39条所述的探针。
进一步地，在基因芯片上，还固定有阳性质控探针、阴性质控探针和空白对照探针；优选地，阳性质控探、阴性质控探针和白对照探针各设有3条，则基因芯片上固定有48条探针。
进一步地，在上述(1)～(13)中，每个探针中的5’端所标记的荧光基团均为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的任意一种；每个探针中的3’端所标记的淬灭基团均为TAMRA、MGB和BHQ中的任意一种。
进一步地，所述探针P1到探针P13中的荧光基团相同，所述探针P1到探针P13中的淬灭基团相同。
一种用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的试剂盒，所述试剂盒包括以上所述的基因芯片。
进一步地，所述试剂盒还包括引物组，所述引物组为13组引物，如下所示：
(1)引物组1：①引物F1：其核苷酸序列为ATTCCCCTTCATCATTGTC；②引物R1A：其核苷酸序列为GGTCAGCTFAGTATCCAGG；③引物R1：其核苷酸序列为GGTCAGCTTAGTATCCAGA；
(2)引物组2：①引物F2：其核苷酸序列为TGGATTCTACATTTCCTAA；②引物F2A：其核苷酸序列为TGGATTCTACATTTCCTAG；③引物R2：其核苷酸序列为GGCAGTAGTGATAGGAGAA；
(3)引物组3：①引物F3：其核苷酸序列为TTAGAAAATGGTTAAGTGT；②引物F3A：其核苷酸序列为TTAGAAAATGGTTAAGTGG；③引物R3：其核苷酸序列为ACTCCAGCTAGAGGTAAAT；
(4)引物组4：①引物F4：其核苷酸序列为GACCTTAGGTGATCTGCCC；②引物F4A：其核苷酸序列为GACCTTAGGTGATCTGCCT；③引物R4：其核苷酸序列为CTGCTTGTGAATCCCAAAT；
(5)引物组5：①引物F5：其核苷酸序列为ACCTTTTGCAGTCTCCAAG；②引物F5A：其核苷酸序列为ACCTTTTGCAGTCTCCAAT；③引物R5：其核苷酸序列为TCTTCTGGGACATCTGGTT；
(6)引物组6：①引物F6：其核苷酸序列为AAACTGGGAGCAGCGTGGG；②引物R6：其核苷酸序列为TGCGTGTGCGTGTGAATGC；③引物R6A：其核苷酸序列为TGCGTGTGCGTGTGAATGT；
(7)引物组7：①引物F7：其核苷酸序列为AGGCTGACATCTGTCCCCA；②引物F7A：其核苷酸序列为AGGCTGACATCTGTCCCCG；③引物R7：其核苷酸序列为TGCTGCTCTCCTTGGCTGT；
(8)引物组8：①引物F8：其核苷酸序列为CTCCCTGCACTTCCCCCAA；②引物F8A：其核苷酸序列为CTCCCTGCACTTCCCCCAG；③引物R8：其核苷酸序列为GCGTGTTCCCTTGTGTTTC；
(9)引物组9：①引物F9：其核苷酸序列为ACTTGTAGTCCCAGCTATC；②引物F9A：其核苷酸序列为ACTTGTAGTCCCAGCTATT；③引物R9：其核苷酸序列为ATGGTCATAGCTCACTCTA；
(10)引物组10：①引物F10：其核苷酸序列为GCTTATTCCAACCCACAGT；②引物R10：其核苷酸序列为AAGGAAATCAGCAATCCAG；③引物R10A：其核苷酸序列为AAGGAAATCAGCAATCCAA；
(11)引物组11：①引物F11：其核苷酸序列为CAAGAAATGTTTTTAGAGC；②引物R11：其核苷酸序列为CACATTAGTTGATGATGTC；③引物R11A：其核苷酸序列为CACATTAGTTGATGATGTA；
(12)引物组12：①引物F12：其核苷酸序列为GCCTTCTTCTGAGCCTTGG；②引物R12：其核苷酸序列为CCAGATGTTGAGGGCTTCG；③引物R12A：其核苷酸序列为CCAGATGTTGAGGGCTTCT；
(13)引物组13：①引物F13：其核苷酸序列为ACACTATGTCGCTTCCACA；②引物R13：其核苷酸序列为AAAACCAGTGCCAGTTATG；③引物R13A：其核苷酸序列为AAAACCAGTGCCAGTTATC。
进一步地，13组引物组的加样量均一致，每组中的3条引物中的体积比为：1∶1∶1。
进一步地，所述试剂盒还包括酶系，所述包括Tfl DNA聚合酶和Stoffel片段或TflDNA聚合酶、MMLV反转录酶和Stoffel片段。
一种基因芯片的应用方法，所述方法为：首先，准备含有DNA的样本，然后PCR扩增，然后采用所述的基因芯片进行杂交。
进一步地，在PCR扩增中需要添加引物组，所述引物组如上所述的引物组。
本发明的有益效果为：本发明公开了一种基因芯片，并将13条特定的碱基序列固定在芯片上形成微阵列，进而采用该芯片进行检测评估半侧颜面短小综合症，通过基因芯片的方式进行检测，比直接使用探针具有诸多优势。具体地，其对半侧颜面短小综合征的检测技术操作步骤更简便，时间更短，通常30～60分钟便可完成检测，大大缩短了时间周期，且检测的特异性好，具有高分辨率、高灵敏度、准确、快速的特点；并具有高通量的特点，可以快速筛查半侧颜面短小综合征相关基因的变异，并将半侧颜面短小综合征疾病的诊断提高到基因水平上；总之，该方法节约成本时间，减少病人痛苦，可无创产前诊断胎儿的患病几率。
该微阵列芯片，是以待测孕妇外周血的cf-fDNA(胎儿与母体游离DNA混合物)为模板进行多重PCR扩增，将得到的PCR扩增产物后，与本发明的芯片进行杂交，根据杂交结果确定胎儿是否携带有先天性半侧颜面短小综合征相关基因；非常简单，大大降低误差率和时间成本，提高精确度；能用于产前先天性遗传病的检测，在无创产前诊断领域具有很大的潜力。
附图说明
通过以下参照附图对本发明实施例的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：
图1是本发明实施例所述的基因芯片中探针顺序的分布结构示意图；
图2是为杂合携带有半侧颜面短小综合征相关基因的扫描结果示意图；
图3是为部分显阳性的扫描结果示意图。
具体实施方式
下面以具体实验案例为例来说明具体实施方式，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片，所述基因芯片包括片基，该片基上设有用于检测半侧颜面短小综合征相关基因的探针组形成微阵列基因芯片；所述探针组包括13个探针，各个探针的序列如下所示：(1)探针P1：其核苷酸序列为AGAGTAATGCTGTCCATTGCCCA；(2)探针P2：其核苷酸序列为AAGATATTCACTCTCTGGCTAGGCCTA；(3)探针P3：其核苷酸序列为ATATGAAATAAGGAGGAGATAAGAGA；(4)探针P4：其核苷酸序列为GCTGGGATTACAGGCATGAGCCACTGT；(5)探针P5：其核苷酸序列为AAAGAAAATATCTCAAAGAATCAAC；(6)探针P6：其核苷酸序列为AAGCTCAGGGGCTCAGGAGGCAGGA；(7)探针P7：其核苷酸序列为CTGAATCCTTGTTGGCTTCAGAGTCAG；(8)探针P8：其核苷酸序列为CTGATCCTCTGAGGGATTGATGACA；(9)探针P9：其核苷酸序列为TAAAGTGGGAGGATTGCTTGAGCCC；(10)探针P10：其核苷酸序列为GGGAAAGAAATGGGAAGAGGAGG；(11)探针P11：其核苷酸序列为CAACTACTGCCAAATATAAACAAAGG；(12)探针P12：其核苷酸序列为AATAACCTTATTGTGTTGTTGTGACAA；(13)探针P13：其核苷酸序列为TGAATATATGTTACCTAACATTGATCA。
优选地，所述片基为采用载玻片、硅片或膜作为载体的片基；所述载体为或片基可为由高分子材料制成。
在上述探针P1～探针P13中，每条探针的5’端均标记有荧光基团，其3’端均标记有淬灭基团。基因芯片上探针的顺序如图1所示，即包括两行，上面一行由左至右依次为P1～P7，下面一行由左至右依次为P8～P13，按顺序进行排列，为后面的结果判定带来便利。
优选地，在基因芯片上，每个所述的探针均设有3条(即重复三次)，则基因芯片上含有39条所述的探针，如图1所示，即所述微阵列所述先天性半侧颜面短小综合征13个相关基因13个相关突变位点的野生型和突变型的39条探针。
优选地，在基因芯片上，还固定有阳性质控探针(即附图1～3中的PC2)、阴性质控探针(即附图1～3中的PC1)和空白对照探针(即附图1～3中的NC)；优选地阳性质控探、阴性质控探针和白对照探针各设有3条，一共9条，则基因芯片上一共固定有48条探针。
13条探针的5’端所标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的任意一种；3’端所标记的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的任意一种。优选地，所述探针P1到探针P13中的荧光基团相同，所述探针P1到探针P13中的淬灭基团相同。
在本实施例中，检测评估半侧颜面短小综合征时，只需要在PCR扩增以后与本实施例中的固定有特定数量与特定序列探针的基因芯片杂交便可，最后根据杂交结果进行相应的评估。
实施例2
一种用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片的制备方法，选择载玻片作为基因芯片的载体片基，则该基因芯片的制备则包括如下步骤，依次如下：(1)载玻片的酸碱预处理；(2)醛基化处理；(3)异硫氰酸化处理，(4)芯片探针设计；(5)探针点制；(6)点制完成的芯片放置80℃烘烤10min，制成微阵列玻片；(7)存储在带有干燥剂的盒子里，室温保存。
在本实施例中，制备方法可按常规方法制备也可以，重点是基因芯片本身，而非其制备方法。
实施例3
一种用于无创产前风险评估先天性半侧颜面短小综合征的试剂盒，所述试剂盒包括实施例1中所述的基因芯片。
所述试剂盒还包括引物组，所述引物组优选为13组引物，13组引物如下所示：
(1)引物组1：①引物F1：其核苷酸序列为ATTCCCCTTCATCATTGTC；②引物R1A：其核苷酸序列为GGTCAGCTTAGTATCCAGG；③引物R1：其核苷酸序列为GGTCAGCTTAGTATCCAGA；
(2)引物组2：①引物F2：其核苷酸序列为TGGATTCTACATTTCCTAA；②引物F2A：其核苷酸序列为TGGATTCTACATTTCCTAG；③引物R2：其核苷酸序列为GGCAGTAGTGATAGGAGAA；
(3)引物组3：①引物F3：其核苷酸序列为TTAGAAAATGGTTAAGTGT；②引物F3A：其核苷酸序列为TTAGAAAATGGTTAAGTGG；③引物R3：其核苷酸序列为ACTCCAGCTAGAGGTAAAT；
(4)引物组4：①引物F4：其核苷酸序列为GACCTTAGGTGATCTGCCC；②引物F4A：其核苷酸序列为GACCTTAGGTGATCTGCCT；③引物R4：其核苷酸序列为CTGCTTGTGAATCCCAAAT；
(5)引物组5：①引物F5：其核苷酸序列为ACCTTTTGCAGTCTCCAAG；②引物F5A：其核苷酸序列为ACCTTTTGCAGTCTCCAAT；③引物R5：其核苷酸序列为TCTTCTGGGACATCTGGTT；
(6)引物组6：①引物F6：其核苷酸序列为AAACTGGGAGCAGCGTGGG；②引物R6：其核苷酸序列为TGCGTGTGCGTGTGAATGC；③引物R6A：其核苷酸序列为TGCGTGTGCGTGTGAATGT；
(7)引物组7：①引物F7：其核苷酸序列为AGGCTGACATCTGTCCCCA；②引物F7A：其核苷酸序列为AGGCTGACATCTGTCCCCG；③引物R7：其核苷酸序列为TGCTGCTCTCCTTGGCTGT；
(8)引物组8：①引物F8：其核苷酸序列为CTCCCTGCACTTCCCCCAA；②引物F8A：其核苷酸序列为CTCCCTGCACTTCCCCCAG；③引物R8：其核苷酸序列为GCGTGTTCCCTTGTGTTTC；
(9)引物组9：①引物F9：其核苷酸序列为ACTTGTAGTCCCAGCTATC；②引物F9A：其核苷酸序列为ACTTGTAGTCCCAGCTATT；③引物R9：其核苷酸序列为ATGGTCATAGCTCACTCTA；
(10)引物组10：①引物F10：其核苷酸序列为GCTTATTCCAACCCACAGT；②引物R10：其核苷酸序列为AAGGAAATCAGCAATCCAG；③引物R10A：其核苷酸序列为AAGGAAATCAGCAATCCAA；
(11)引物组11：①引物F11：其核苷酸序列为CAAGAAATGTTTTTAGAGC；②引物R11：其核苷酸序列为CACATTAGTTGATGATGTC；③引物R11A：其核苷酸序列为CACATTAGTTGATGATGTA；
(12)引物组12：①引物F12：其核苷酸序列为GCCTTCTTCTGAGCCTTGG；②引物R12：其核苷酸序列为CCAGATGTTGAGGGCTTCG；③引物R12A：其核苷酸序列为CCAGATGTTGAGGGCTTCT；
(13)引物组13：①引物F13：其核苷酸序列为ACACTATGTCGCTTCCACA；②引物R13：其核苷酸序列为AAAACCAGTGCCAGTTATG；③引物R13A：其核苷酸序列为AAAACCAGTGCCAGTTATC。
13组引物组的加样量均一致，每组中的3条引物中的体积比或数量比为：1∶1∶1。
在本实施例中，检测评估半侧颜面短小综合征时，只需要在PCR扩增前加入上述13组引物，再进行扩增，扩增以后与本实施例中的固定有特定数量与特定序列探针的基因芯片杂交便可，最后根据杂交结果进行相应的评估。
实施例4
在实施例3的基础上，所述试剂盒还包括酶系，所述的酶系包括Tfl DNA聚合酶和Stoffel片段(Stoffel片段的购买公司：Cetus公司)的酶混合液；优选地，该酶系还包括MMLV反转录酶，即酶系为Tfl DNA聚合酶、Stoffel片段和MMLV反转录酶的酶混合液。
此外，所述试剂盒还包括反应试剂，该反应试剂包括：(1)Tris-硫酸；(2)MOPS缓冲液；(3)柠檬酸钠；(4)(NH4)2SO4；(5)MgSO4和(6)乙酰化BSA。
则在本实施例中，试剂盒中各种成分的量为：300～800nM的引物组0.5ml、酶混合液、20～50mM的pH8.5的Tris-硫酸1ml、10～20mM的pH7.9的MOPS缓冲液1ml、2～5mM的柠檬酸钠1ml、10～20mM的(NH4)2SO4 1ml、5～10mM的MgSO4 1ml和0.1mg/ml的乙酰化BSA 1ml。
其中，在上述成分中，引物组包括实施例3中的(1)～(13)中的13组引物组，每组中的引物的浓度均控制在300～800nM的范围内，且体积均一致；酶混合液是由0.5～1unit(浓度)的Tfl DNA聚合酶0.5mL和0.5～1unit(浓度)的Stoffel片段0.5ml混合而成，或者酶混合液是由0.5～1unit(浓度)的Tfl DNA聚合酶0.5ml、0.5～1unit(浓度)的Stoffel片段0.5ml、0.5～1unit(浓度)的MMLV反转录酶0.5ml混合而成。
在本实施例中，检测评估半侧颜面短小综合征时，只需要在PCR扩增前加入13组引物组、酶系以及反应试剂等，再进行PCR扩增，扩增以后与本实施例中的固定有特定数量与特定序列探针的基因芯片杂交便可，最后根据杂交结果进行相应的评估。基因芯片的应用，使得检测的过程以及结果的确认等均简单化，节约时间，精确度提高。
实施例5
一种基因芯片的应用方法，其特征在于，所述方法为：首先，准备含有DNA的样本，然后PCR扩增，然后采用所述的基因芯片进行杂交，杂交以后再进行数据处理和图像分析，芯片扫描等再进行结果评估。具体如下：
(1)采集孕妇血液，提取血液中的胎儿cf-DNA
S1：准备洗涤液(购买厂家：常州百代生物科技有限公司)，配制洗涤液A和洗涤液B；
a)洗涤液A：取21ml洗涤液则加入9ml无水乙醇；若取42ml洗涤液则加入18ml无水乙醇。
b)洗涤液B：取9ml洗涤液则加入21ml无水乙醇；若取18ml洗涤液则加入42ml无水乙醇。
S2：取1.5ml离心管，加入200μl所采集的孕妇血液样本，4μl DNA Carrier(DNA载体，购买厂家：常州百代生物科技有限公司)混合均匀，加入300μl裂解液(购买厂家：常州百代生物科技有限公司)，以及20μl消化液(购买厂家：常州百代生物科技有限公司)，振荡混匀，56℃水浴10分钟。
S3：向S2中的离心管中加入1000μl无水乙醇，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响DNA的提取与后续实验；
S4：将吸附柱放入收集管内，将760μl步骤S3中所得到的溶液转入吸附柱内，静置2分钟，将含有收集管的吸附柱在12,000rpm 4℃离心1分钟，拿出吸附柱，弃收集管内的废液，并将吸附柱重新放回收集管内，将剩余760μl溶液转移至吸附柱内，重复一次该步骤；
S5：将重复步骤中收集管内所得到的液体除去，并将吸附柱再放回收集管内，加500μl洗涤液A至吸附柱内，12,000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液，将吸附柱放回收集管内；
S6：加500μl洗涤液B至吸附柱内，12,000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液，并将吸附柱放回收集管内，12,000rpm 4℃离心2分钟，离去残留的洗涤液；
S7：取出吸附柱，放入新的1.5ml离心管内，加入30-50μl洗脱液，静置3分钟，12,000rpm 4℃离心2分钟，收集DNA溶液。提取的DNA即可用于下一步实验或-20℃保存。
(2)实时荧光定量q-PCR反应
实时荧光定量RT-PCR反应体系为：300～800nM的引物组0.5ul、酶混合液1.5ul、20～50mM的pH8.5的Tris-硫酸1ul、10～20mM的pH7.9的MOPS缓冲液1ul、2～5mM的柠檬酸钠1ul、10～20mM的(NH4)2SO4 1ul、5～10mM的MgSO4 1ul、0.1mg/ml的乙酰化BSA 1ul和、420mM的dNTP 1ul，RNAase-free ddH2O补至50μl。其中，引物组包括实施例3中的(1)～(13)中的13组引物组，每组中的浓度均在300～800nM的范围内，且13组中的引物组的体积均一致或一样；酶混合液为：0.5ul浓度为0.5-1unit的Tfl DNA聚合酶和0.5ul浓度为0.5-1unit的Stoffel片段的混合物，或者酶混合液为：0.5ul浓度为0.5-1unit的Tfl DNA聚合酶、0.5ml浓度为0.5-1unit的Stoffel片段和0.5ul浓度为0.5-1unit的MMLV反转录酶的混合物。
实时荧光定量RT-PCR反应程序为：第一步：45℃，20～45分钟；94～96℃，2分钟；第二步：94～95℃，15～30秒；65～69℃，30～75秒；68～72℃，30～40秒；6～9个循环；第三步：93～95℃，15～20秒；60℃，30秒；68～72℃，30秒；8个循环；第四步：93～95℃，15秒；52～55℃，30～60秒；40个循环；55℃时收集荧光；
(3)杂交
首先制备芯片杂交液：杂交液如：100～300mM Hepes-HCl(pH 8.0)、1～3M NaCl、0.5～1mM EDTA(pH 8.0)；然后将PCR产物及杂交液等比例混匀后在95℃条件下变性10min后，立即置于冰浴中5min，同时将基因芯片在0.2％SDS中漂洗20s后，再在超纯水中漂洗5s，甩去基因芯片表面的水，在室温条件下晾干。取变性的扩增产物10μl，小心加入基因芯片反应区中，使其分布均匀(以杂交混合液覆盖杂交反应区且不溢出为准)。将杂交混合液加入基因芯片反应区时，应注意切不可使枪头与基因芯片接触，以免影响探针阵列。将基因芯片平置于杂交盒中，在待定杂交温度的水浴中杂交1小时。杂交反应时应防止冷凝水滴落在基因芯片上；移动杂交盒时应小心，以防各反应区的反应液交叉污染。杂交反应结束后，将基因芯片在SSC洗涤液中漂洗。取出基因芯片，甩去残留在基因芯片上的液体，室温晾干。
(4)数据处理和图像分析
杂交结果采用激光共聚焦基因芯片扫描仪对步骤(3)中的基因芯片进行扫描，并采用信号分析软件进行分析。
具体可根据现有技术进行操作。
(5)基因芯片效果验证
使用上述基因芯片检测经测序验证为正常人样品20份和ROBO1突变型样品20份、SHROOM3突变型样品10份、SEMA7A突变型样品8份、NRP2突变型样品15份、GBX2突变型样品20份等12突变型样品，共计100份(包括混合病例)，检测结果均与Sanger测序结果一致，证明了本发明的基因芯片检测半侧颜面短小综合征基因突变时具备特异性。
结果判定：
结合附图1-3，本发明的阳性扫描结果如附图中的图标
Figure BSA0000170649130000121
，实心图标；阴性扫描结果如附图中的图标
Figure BSA0000170649130000122
，内填充斜杠图标；杂合携带者如附图中的图标
Figure BSA0000170649130000123
，内填充三角形图标。
图1为基因芯片上探针的顺序示意图，图2和3省略顺序标号，对照图1便可。图2所示为胎儿只有杂合携带有半侧颜面短小综合征相关基因的扫描结果示意图，即13个致病基因序列均显示为阴性或杂合，其中P1|、P4、P7、P10、P12为杂合携带，其余为阴性。图3为胎儿混合携带有半侧颜面短小综合征相关基因SHROOM3、SEMA7A、NRP2、ROBO1、GBX2等13个致病基因的扫描示意图，其中P1|、P4、P7、P10、P12为阳性携带；P3、P5、P6、P8、P9为杂合携带；P2、P11、P13为阴性结果。
则杂交、扫描以后进行分析时只需要对比图1～3便可，非常简单，不需要另外计算Ct值等等，也不需要绘制相应的曲线图辅助判断，大大节约时间，且减少误差率，增加结果的精确性，对于实际应用具有极其重要的价值。
对于基因芯片所显示的最终结果，通过每一个风险基因以及多个风险基因协同作用研究和大数据案例验证，结果发现，携带风险基因位点越多，则出现半侧颜面短小综合征的表型的风险越大，具体地，若受检样本同时携带13个致病位点时，胎儿至少具有一个半侧颜面短小综合征的特征表现的风险在90％以上，至少具有2个半侧颜面短小综合征的风险在80％以上。例如：当受检样本同时携带10-12个风险致病位点时，则至少具有一个半侧颜面短小综合征特征表现的风险在80％以上；当受检样本同时携带7-9个风险致病位点时，则具有至少一个半侧颜面短小综合征特征表现的风险在60-80％；当受检样本同时携带4-6个风险致病位点时，则具有至少一个半侧颜面短小综合征特征表现的风险在40-60％；当受检样本携带1-3个风险致病位点时，则具有至少一个半侧颜面短小综合征的风险在15％以下。
上述的半侧颜面短小综合征特征表现包括小耳、半侧颜面短小、先天心脏疾患、肾脏畸形或肋软骨畸形等等。
在上述步骤(1)中，对于孕妇，最早于怀孕4-8周便可进行该疾病的筛查，即通过本发明的试剂盒，使得采集怀孕4-8周孕妇的外周血便能评估判断胎儿具有半侧颜面短小综合征的可能性，若检测结果为阳性，则胎儿患有半侧颜面短小综合征的可能性极高，可进行提早干预。
在本实施例中，13组物探针组可在一次实时荧光定量RT-PCR中同时扩增，也可以分成多次进行扩增，具体可根据实验条件和实际需要而定。
需要说明的是，本申请中的引物探针组以及试剂盒是根据人体13个风险致病基因所研究开发的，13个风险致病基因的基因序列分别如SEQ NO.1～SEQ NO.13所示。
实施例6
为了验证本发明探针、引物组的特异性以及方法的有效性，本发明采集了样本库中的阴性样本和阳性样本各4个(为了研究方便，本申请人具有大型的样本库)，分别记为样本A01～A08，按照实施例5所述的方法进行检测，并且探针3、探针10和探针11的5’端所标记的荧光基团为FAM，探针1、探针2、探针9和探针5的5’端所标记的荧光基团为HEX，探针4和探针13的5’端所标记的荧光基团为TET，探针7和探针12的5’端所标记的荧光基团为CY5，探针6和探针8的5’端所标记的荧光基团为VIC；探针3、探针4、探针7、探针9和探针12的3’端所标记的淬灭基团为BHQ，探针2、探针5、探针10和探针13的3’端所标记的淬灭基团为TAMRA，探针1、探针6、探针8和探针11的3’端所标记的淬灭基团为MGB。
其实时荧光定量RT-PCR反应体系以及实时荧光定量q-PCR反应与实施例5一致。
所得结果如以下表1所示。
表1 实时荧光定量RT-PCR扩增结果数据分析结果
Figure BSA0000170649130000141
*：上述结果与胎儿出生后表型的结果完全一致。
在表1中，类型和风险位点携带情况均为已知，通过本发明的方法所检测到的阴性和阳性结果、包括哪几个基因为阳性等均与样本库中记录的信息完全一致，所预测的胎儿可能含有的表型数量等也与实际中婴儿的数量基本一致。此外，本发明人在多年的研究中，已经对样本库中的几百个案例进行了验证研究，结果均与实际中的基本一致，故本申请中的准确率极高，基本能够达到97％以上。
在本实施例中，上述每个探针中所标记的荧光基团和淬灭基团均可被本发明所提到的其它荧光基团和淬灭基团替代。
实施例7
对象：采集怀孕4～5周的孕妇的外周血，且所采集的孕妇均为带有半侧颜面短小综合征表型或其家族近亲含有半侧颜面短小综合征；
采集地点：在全国范围将近30个医院进行采集；
时间：2017.1～2017.10；
数量：188个；
方法：按照实施例5所述的方法进行检测，并且探针3、探针10和探针11的5’端所标记的荧光基团为FAM，探针1、探针2、探针9和探针5的5’端所标记的荧光基团为HEX，探针4和探针13的5’端所标记的荧光基团为TET，探针7和探针12的5’端所标记的荧光基团为CY5，探针6和探针8的5’端所标记的荧光基团为VIC；探针3、探针4、探针7、探针9和探针12的3’端所标记的淬灭基团为BHQ，探针2、探针5、探针10和探针13的3’端所标记的淬灭基团为TAMRA，探针1、探针6、探针8和探针11的3’端所标记的淬灭基团为MGB。其实时荧光定量RT-PCR反应体系以及实时荧光定量q-PCR反应与实施例5一致。
结果：其中，181例通过实时荧光定量RT-PCR反应成果的进行了扩增；7例由于胎儿发育较为缓慢等原因，导致孕妇外周血中的胎儿基因较少，故PCR不理想，因此，在这7例孕妇怀孕7～8周的时候进行了第二次采集，同样采用实施例5所述的方法进行检测，最后成功得到了扩增产物。
具体的RT-PCR结果以及实际的结果如下表2所示，实际结果为产后跟踪观察、检测所得到的结果。
表2 样本的基因型检测结果和实际结果对比
Figure BSA0000170649130000151
Figure BSA0000170649130000161
由上表2可知，本申请通过采集怀孕初期孕妇的外周血，采用本发明的试剂盒对13个风险治病基因进行了检测，并统计其阳性率；然后在出生后进行跟踪检测，结果发现，所得的实际结果均在本申请的预测结果范围内。由此可进一步获知，本申请的试剂盒准确率高，预测精确，基本可精确到95％左右，使得孕妇能够及早知道胎儿情况，有助于及早进行治疗或干预，对于优生优育具有极其重要的价值。
更重要的是，在孕妇怀孕4～5周，几乎是刚发现怀孕时，99％左右的孕妇便能够进行该项目的检测，最晚8周便能检测到，从而进行较为精确的预估；当然8周以后更能检测到，但越早检测到意义越大。
需要说明的是，本实施例中采集的所有样本均是在30～60分钟便得到最终结果，速度快，效率高，准确度高。而且本实施例中采集的所有样本均是在孕妇同意的情况下，用其产检常规所采的血液进行试验。
在本发明中，所采用的基因芯片中的探针序列特异性强，若改变其中一条或几条探针中的某一个或某几个碱基，则特异性大大降低，导致误差率高。而且本申请试剂盒中的引物组序列也具有极强的特异性，改变某些引物组中的碱基位点，也会对结果的准确表达具有极其影响，本发明人通过多年的研究测试验证等，得到了高特异性、高精确度的本申请中的探针和引物组序列。
在本发明中，所针对的致病基因为EPAS1，NRP2，ROBO1，GATA3，FGF3，ARID3B，SEMA7A，KLF12，SHROOM3，EDNRB，PLCD3、GBX2等。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片，其特征在于：所述基因芯片包括片基，该片基上设有用于检测半侧颜面短小综合征相关基因的探针组，形成微阵列基因芯片；
所述探针组包括13条探针，各个探针的序列如下所示：
(1)探针P1：其核苷酸序列为AGAGTAATGCTGTCCATTGCCCA；
(2)探针P2：其核苷酸序列为AAGATATTCACTCTCTGGCTAGGCCTA；
(3)探针P3：其核苷酸序列为ATATGAAATAAGGAGGAGATAAGAGA；
(4)探针P4：其核苷酸序列为GCTGGGATTACAGGCATGAGCCACTGT；
(5)探针P5：其核苷酸序列为AAAGAAAATATCTCAAAGAATCAAC；
(6)探针P6：其核苷酸序列为AAGCTCAGGGGCTCAGGAGGCAGGA；
(7)探针P7：其核苷酸序列为CTGAATCCTTGTTGGCTTCAGAGTCAG；
(8)探针P8：其核苷酸序列为CTGATCCTCTGAGGGATTGATGACA；
(9)探针P9：其核苷酸序列为TAAAGTGGGAGGATTGCTTGAGCCC；
(10)探针P10：其核苷酸序列为GGGAAAGAAATGGGAAGAGGAGG；
(11)探针P11：其核苷酸序列为CAACTACTGCCAAATATAAACAAAGG；
(12)探针P12：其核苷酸序列为AATAACCTTATTGTGTTGTTGTGACAA；
(13)探针P13：其核苷酸序列为TGAATATATGTTACCTAACATTGATCA；
在探针P1～探针P13中，每条探针的5’端均标记有荧光基团，其3’端均标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片，其特征在于：所述片基包括载玻片、硅片或膜；
在基因芯片上，每个所述的探针均设有3条，则基因芯片上含有39条所述的探针。
3.根据权利要求2所述的用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片，其特征在于：在基因芯片上，还固定有阳性质控探针、阴性质控探针和空白对照探针。
4.根据权利要求3所述的用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片，其特征在于：阳性质控探、阴性质控探针和白对照探针各设有3条，则基因芯片上固定有48条探针。
5.根据权利要求4所述的用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片，其特征在于：在上述(1)～(13)中，每个探针中的5’端所标记的荧光基团均为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的任意一种；每个探针中的3’端所标记的淬灭基团均为TAMRA、MGB和BHQ中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的基因芯片，其特征在于：所述探针P1到探针P13中的荧光基团相同，所述探针P1到探针P13中的淬灭基团相同。
7.一种用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1～6中所述的基因芯片。
8.根据权利要求7所述的用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括引物组，所述引物组为13组引物，13组引物的序列如下所示：
(1)引物组1：①引物F1：其核苷酸序列为ATTCCCCTTCATCATTGTC；②引物R1A：其核苷酸序列为GGTCAGCTTAGTATCCAGG；③引物R1：其核苷酸序列为GGTCAGCTTAGTATCCAGA；
(2)引物组2：①引物F2：其核苷酸序列为TGGATTCTACATTTCCTAA；②引物F2A：其核苷酸序列为TGGATTCTACATTTCCTAG；③引物R2：其核苷酸序列为GGCAGTAGTGATAGGAGAA；
(3)引物组3：①引物F3：其核苷酸序列为TTAGAAAATGGTTAAGTGT；②引物F3A：其核苷酸序列为TTAGAAAATGGTTAAGTGG；③引物R3：其核苷酸序列为ACTCCAGCTAGAGGTAAAT；
(4)引物组4：①引物F4：其核苷酸序列为GACCTTAGGTGATCTGCCC；②引物F4A：其核苷酸序列为GACCTTAGGTGATCTGCCT；③引物R4：其核苷酸序列为CTGCTTGTGAATCCCAAAT；
(5)引物组5：①引物F5：其核苷酸序列为ACCTTTTGCAGTCTCCAAG；②引物F5A：其核苷酸序列为ACCTTTTGCAGTCTCCAAT；③引物R5：其核苷酸序列为TCTTCTGGGACATCTGGTT；
(6)引物组6：①引物F6：其核苷酸序列为AAACTGGGAGCAGCGTGGG；②引物R6：其核苷酸序列为TGCGTGTGCGTGTGAATGC；③引物R6A：其核苷酸序列为TGCGTGTGCGTGTGAATGT；
(7)引物组7：①引物F7：其核苷酸序列为AGGCTGACATCTGTCCCCA；②引物F7A：其核苷酸序列为AGGCTGACATCTGTCCCCG；③引物R7：其核苷酸序列为TGCTGCTCTCCTTGGCTGT；
(8)引物组8：①引物F8：其核苷酸序列为CTCCCTGCACTTCCCCCAA；②引物F8A：其核苷酸序列为CTCCCTGCACTTCCCCCAG；③引物R8：其核苷酸序列为GCGTGTTCCCTTGTGTTTC；
(9)引物组9：①引物F9：其核苷酸序列为ACTTGTAGTCCCAGCTATC；②引物F9A：其核苷酸序列为ACTTGTAGTCCCAGCTATT；③引物R9：其核苷酸序列为ATGGTCATAGCTCACTCTA；
(10)引物组10：①引物F10：其核苷酸序列为GCTTATTCCAACCCACAGT；②引物R10：其核苷酸序列为AAGGAAATCAGCAATCCAG；③引物R10A：其核苷酸序列为AAGGAAATCAGCAATCCAA；
(11)引物组11：①引物F11：其核苷酸序列为CAAGAAATGTTTTTAGAGC；②引物R11：其核苷酸序列为CACATTAGTTGATGATGTC；③引物R11A：其核苷酸序列为CACATTAGTTGATGATGTA；
(12)引物组12：①引物F12：其核苷酸序列为GCCTTCTTCTGAGCCTTGG；②引物R12：其核苷酸序列为CCAGATGTTGAGGGCTTCG；③引物R12A：其核苷酸序列为CCAGATGTTGAGGGCTTCT；
(13)引物组13：①引物F13：其核苷酸序列为ACACTATGTCGCTTCCACA；②引物R13：其核苷酸序列为AAAACCAGTGCCAGTTATG；③引物R13A：其核苷酸序列为AAAACCAGTGCCAGTTATC。
9.根据权利要求8所述的用于无创产前评估半侧颜面短小综合征的试剂盒，其特征在于：13组引物组的加样量均一致，每组中的3条引物中的体积比为：1∶1∶1；
所述试剂盒还包括酶系，所述包括Tf1 DNA聚合酶和Stoffel片段或Tf1 DNA聚合酶、MMLV反转录酶和Stoffel片段。
10.一种权利要求1-6中任意一项所述的基因芯片的应用方法，其特征在于，所述方法为：首先，准备样本，然后PCR扩增，然后采用权利要求1-6中任意一项所述的基因芯片进行杂交。
11.根据权利要求10所述的基因芯片的应用方法，其特征在于：在PCR扩增中需要添加引物组，所述引物组如权利要求8所述的引物组。
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