TW201728758A - 一種同時完成基因位點、染色體及連鎖分析的方法 - Google Patents

一種同時完成基因位點、染色體及連鎖分析的方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201728758A
TW201728758A TW105137959A TW105137959A TW201728758A TW 201728758 A TW201728758 A TW 201728758A TW 105137959 A TW105137959 A TW 105137959A TW 105137959 A TW105137959 A TW 105137959A TW 201728758 A TW201728758 A TW 201728758A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
snp
reaction
amplification
sample
analysis
Prior art date
Application number
TW105137959A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI640636B (zh
Inventor
Xiaoliang Xie
Jie Qiao
Si-Jia Lu
Li-Ying Yan
fu-chou Tang
Lei Huang
Original Assignee
Shanghai Xukang Medical Science & Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Xukang Medical Science & Technology Co Ltd filed Critical Shanghai Xukang Medical Science & Technology Co Ltd
Publication of TW201728758A publication Critical patent/TW201728758A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI640636B publication Critical patent/TWI640636B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明涉及一種同時完成基因位點、染色體及連鎖分析的方法，具體包括胚胎細胞樣本的獲取、全基因組擴增、目的基因突變位點擴增、全基因組擴增產物及目的基因突變位點的資料庫建立、高通量定序和數據分析各主要步驟，藉由利用全基因組擴增技術結合高通量定序，一步完成多項綜合性檢測，避免了使用多方法、多步驟分別進行單基因遺傳病突變位點、染色體疾病和連鎖分析的檢測。本發明所提供的方法為微量樣本提供了有利條件，不僅可用於PGD檢測，確定胚胎是否攜帶致病基因和染色體複製數異常情況；也適用於反覆流產、高齡婦女胚胎的遺傳性篩選，實現一個步驟完成單個樣本多項檢測。因其操作簡單、週期短、可行性強，有利於推廣和應用。

Description

一種同時完成基因位點、染色體及連鎖分析的方法
本發明涉及基因組序列分析領域和生物資訊學領域，具體涉及一種利用MALBAC擴增技術結合高通量定序，一步完成單細胞單基因疾病、染色體疾病及連鎖分析的方法。
遺傳疾病是指人體中的遺傳物質(染色體或者粒線體DNA上的基因序列)發生改變而引起的疾病，近年來遺傳病的發生率逐年增高。在我國，每年有多達數萬例染色體異常的患兒出生，染色體異常患兒至今仍無法治癒。而目前已經發現的單基因遺傳疾病有7000多種，其中已經明確致病基因的有4000多種，雖然單基因遺傳病的單個病種發生率較低，但由於其種類繁多，所以在出生活嬰中的整體發生率和人群中的整體盛行率並不低，並且大部分單基因遺傳病具有致死性、致殘性或致畸性，除少部分可以藉由某些治療手段進行校正外，大部分至今尚無有效的治療手段。解決上述問題的根本途徑就是進行出生前或胚胎移植前診斷，避免此類患兒的出生，因此，胚胎著床前遺傳診斷對預防單基因遺傳病及染色體遺傳病的發生和傳遞具有重要的科學及社會意義。
遺傳病的胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)是生殖醫學重要內容，可以阻斷在胚胎著床前，避免患兒出生，從而避免和減少遺傳病的發生，減輕家庭和社會的經濟負擔。目前，胚胎著床前遺傳學診斷主要採用FISH和單細胞PCR技術，以及近幾年應用到臨床PGD的CGH array和SNP array技術。其中，應用FISH進行胚胎篩選受到探針的限制，不能同時檢測所有染色體狀態；單細胞固定易導致訊息丟失，單細胞PCR技術易造成等位基因丟失(ADO)，從而引起誤診；CGH array只能診斷染色體數目改變及大片段染色體結構(非平衡易位，重複、缺失)，而SNP array雖能進行所有CGH能診斷的染色體異常，分辨率較CGH提高，但不能同時完成單基因遺傳病和染色體疾病的診斷。
可見，現有的胚胎植入前遺傳學診斷技術仍存在各種不足，無法滿足實際需求，在使用和推廣上均受到一定的限制。
此外，連鎖分析方法現有的主要是採用STR和SNP兩種遺傳標記。多重螢光PCR技術將多重PCR結合螢光探針檢測STR分型，由於STR連鎖標記較少，應用到具體案例中可能會沒有可用STR位點，所以進行臨床檢測前需要做大量預實驗工作，STR遺傳標記大多距離致病位點距離較遠，易發生染色體重組導致誤診，且檢測成本較高，故此技術無法進行批量檢測。而晶片和探針捕獲SNP的方法，與普通PCR捕獲SNP方法相比較，成本偏高，週期偏長。
綜上所述，即使對於大量細胞的樣本，現有技術無法藉由一步檢測同時完成單基因遺傳病、染色體異常和連鎖分析。另外，對於少量細胞的樣本(尤其是用於胚胎植入前遺傳學診斷的微量細胞)，更無法有效地進行同時完成單基因遺傳病、染色體異常和連鎖分析。
因此，本領域急需一種開發在僅採用微量細胞就能同時進行單基因遺傳病、染色體異常和連鎖分析的PGD檢測方法。
本發明的目的就是提供一種開發僅基於微量細胞(如3-10個細胞或更少細胞)就能同時進行單基因遺傳病、染色體異常和連鎖分析的PGD檢測方法。
在本發明的第一方面，提供了一種同時完成基因位點、染色體及連鎖分析的方法，包括以下各步驟： (1)   胚胎細胞樣本的獲得：藉由單精子注射獲得受精卵，培養至囊胚期在外滋養層細胞分離獲得包含3-10個細胞的樣本； (2)   全基因組擴增：在樣本中加入裂解液放入PCR儀中進行裂解、失活蛋白酶，對獲得的細胞裂解樣本進行全基因組擴增； (3)   目的基因突變位點擴增：在完成引子設計、引子評估之後，將目的基因突變位點進行普通PCR擴增獲得PCR產物，將同一樣本的PCR產物與步驟(2)中獲得的片段化的基因組DNA按照一定比例混合； (4)   全基因組擴增產物與目的基因突變位點進行資料庫建立； (5)   採用高通量定序平臺，對樣本進行定序； (6)   數據分析 (6.1)   將步驟(5)獲得的定序結果去掉轉接子以及低品質數據，採用比對軟體比對到參考基因組； (6.2)   下機的數據經品質控制後比對到參考序列上，統計位點的等位基因的分佈及其頻率，檢測目的基因位點突變資訊； (6.3)   下機的數據經品質控制後比對到參考序列上，序列按照一定視窗進行GC校正，以幾千例全基因組擴增的單細胞數據為數據庫進行修正，最終檢測出染色體複製數變異(CNV)； (6.4)   採用SNP-單套型進行連鎖分析。
在另一優選例中，所述方法是非診斷性、非治療性的。
在另一優選例中，所述步驟(3)中，普通PCR擴增的模版選自下組：(i)細胞裂解樣本的核酸、(ii)步驟(2)的全基因組擴增反應的產物、或(iii)由(i)和(ii)混合的形成的混合模版。
在另一優選例中，所述的普通PCR擴增的模版為步驟(2)的全基因組擴增反應的產物、或細胞裂解樣本的核酸與步驟(2)的全基因組擴增反應的產物的混合物(其中，(ii)與(i)的混合比為10-10000：1，較佳地100-1000：1)。
在另一優選例中，所述步驟(2)的全基因組擴增由多重黏合與成環擴增循環(MALBAC)實現，包括第一輪線性擴增和第二輪指數擴增。
在另一優選例中，所述步驟(2)中第一輪線性擴增的條件為： (1)   90-98℃反應90s-5min； (2)   15-25℃反應30s-1min； (3)   25-35℃反應30s-1min； (4)   35-45℃反應20s-1min； (5)   45-55℃反應20s-1min； (6)   55-65℃反應20s-1min； (7)   65-85℃反應2min-6min； (8)   90-98℃反應10-40s； (9)   45-65℃反應5-20s； (10) 重複步驟(2)到步驟(9) 5至20個循環。
在另一優選例中，所述步驟(2)中第一輪線性擴增的條件優選為： (1)   94℃反應3min； (2)   20℃反應40s； (3)   30℃反應40s； (4)   40℃反應30s； (5)   50℃反應30s； (6)   60℃反應30s； (7)   70℃反應4min； (8)   95℃反應20s； (9)   58℃反應10s； (10) 重複步驟(2)到步驟(9) 8個循環。
在另一優選例中，所述步驟(2)中第二輪指數擴增的條件為： (1)   90-98℃反應10s-50s； (2)   90-98℃反應10s-40s； (3)   45-65℃反應20s-45s； (4)   65-80℃反應75s-5min； (5)   重複步驟(2)到步驟(4) 10至30個循環； (6)   將擴增後的產物在0-5℃保存。
在另一優選例中，所述步驟(2)中第二輪指數擴增的條件優選為： (1)   94℃反應30s； (2)   94℃反應20s； (3)   58℃反應30s； (4)   72℃反應3min； (5)   重複步驟(2)到步驟(4) 17個循環； (6)   將擴增後的產物在4℃保存。
在另一優選例中，MALBAC擴增後的產物在300-2000bp之間或250-2000bp之間。
在另一優選例中，所述步驟(3)中的引子設計在設計時，引子長度為20-25bp，擴增片段大小根據定序用的reads來進行調整設計，單端的不能超過reads長度，雙端的不能超過2倍長。
在另一優選例中，所述步驟(3)中PCR產物與片段化的基因組DNA的混合比例為1：(1-100)；較佳地為1：(10-100)；更佳地1：(20-50)。
在另一優選例中，所述步驟(5)中的高通量定序如果只進行單基因致病位點和染色體複製數變異(CNV)分析，每個樣本定序平均深度最低為基因組的0.1倍；如果要同時獲得SNP連鎖資訊，每個樣本定序平均深度最低為基因組的2倍。
在另一優選例中，所述步驟(6.4)採用SNP-單套型進行連鎖分析具體操作如下： (1)   選擇SNP區域，界定在目的基因上下游1M範圍內； (2)   用軟體獲得目標區域的SNP，所述軟體選自：samtools mpileup，GATK，FreeBayes，VarScan； (3)   SNP過濾：等位基因雜合度差異最低為10%，除去潛在錯誤的SNP； (4)   篩選區分型SNP，並構建父本和母本SNP-單套型：同一SNP位點，在父本和母本的4個等位基因鹼基中，有1個鹼基不同於其他3個即可區分； (5)   分析SNP-單套型：胚胎SNP-單套型有2個，分別遺傳自父本和母本各1條，根據區分型SNP和孟德爾遺傳原理，判斷其SNP-單套型具體哪個是父源遺傳，哪個是母源遺傳； (6)   結果分析：根據步驟(4)確定父本和母本SNP-單套型，區分出與致病位點連鎖的單套型，將胚胎所在SNP的具體等位基因對比，根據孟德爾遺傳原理，判斷胚胎是否攜帶致病基因位點。
在另一優選例中，步驟(5)的胚胎SNP-單套型分析中，區分型SNP最低為10個，若有3個以上SNP錯誤，此胚胎SNP-單套型數據視為數據量不足，難以進行分析。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
較佳實施例之詳細說明
本發明人經過長期廣泛而深入的研究，藉由大量的試驗，首次開發了一種針對微量細胞樣本(如僅3-10個細胞)、基於MALBAC擴增技術結合高通量定序、簡便、快速、準確地對同一樣本一步完成胚胎單基因遺傳病、染色體疾病及連鎖分析等綜合性檢測的方法。具體地，本發明方法藉由對微量樣本(如胚胎樣本例如3-10個滋養層細胞)進行全基因組擴增(MALBAC擴增)，然後以樣本核酸（優選全基因組擴增產物）作為模版進行普通PCR擴增(即突變位點PCR擴增)，將來自同一樣本的突變位點PCR擴增產物與全基因組擴增產物以一定比例混合[例如1：(10-100)]後一起建立資料庫，然後進行高通量定序，並對定序數據進行比對分析，實現對同一微量樣本一步完成胚胎單基因遺傳病、染色體疾病及連鎖分析等多項檢測。在此基礎上，本發明人完成了本發明。檢測方法
本發明提供了一種如第一方面中所述的同時完成基因位點、染色體及連鎖分析的方法。
典型地，一種同時完成基因位點、染色體及連鎖分析的方法包括以下各步驟： (1)   胚胎細胞樣本的獲得：藉由單精子注射獲得受精卵，培養至囊胚期在外滋養層細胞分離獲得包含3-10個細胞的樣本，其中胚胎細胞可以選自人或者其他哺乳動物。 (2)   全基因組擴增：在樣本中加入裂解液放入PCR儀中進行裂解、失活蛋白酶，對獲得的細胞裂解樣本進行全基因組擴增，優選採用多重黏合與成環擴增循環(MALBAC)實現；具體而言，在細胞裂解樣本中加入預擴增混合液進行第一輪線性擴增，之後再加入擴增混合液進行第二輪指數擴增，將擴增產物進行純化；MALBAC擴增後的產物在300-2000bp (或在250-2000bp)之間。 典型地，第一輪線性擴增的條件為： (1)   90-98℃反應90s-5min； (2)   15-25℃反應30s-1min； (3)   25-35℃反應30s-1min； (4)   35-45℃反應20s-1min； (5)   45-55℃反應20s-1min； (6)   55-65℃反應20s-1min； (7)   65-85℃反應2min-6min； (8)   90-98℃反應10-40s； (9)   45-65℃反應5-20s； (10) 重複步驟(2)到步驟(9) 5至20個循環。 第二輪指數擴增的條件為： (1) 90-98℃反應10s-50s； (2) 90-98℃反應10s-40s； (3) 45-65℃反應20s-45s； (4) 65-80℃反應75s-5min； (5) 重複步驟(2)到步驟(4) 10至30個循環； (6) 將擴增後的產物在0-5℃保存。 (3)   目的基因突變位點擴增：在完成引子設計、引子評估之後，將目的基因突變位點進行普通PCR擴增獲得PCR產物，將同一樣本的PCR產物與步驟(2)中獲得的片段化的基因組DNA按照1：(1-100)[較佳地1：(10-100)]的質量比混合。其中在進行引子設計時，引子長度為20-25bp，擴增片段大小根據定序用的reads來進行調整設計，單端的不能超過reads長度，雙端的不能超過2倍長。 (4)   MALBAC擴增產物與目的基因突變位點進行基因庫的建構。 (5)   採用高通量定序平臺，對樣本進行定序；如果只進行單基因致病位點和染色體複製數變異(CNV)分析，每個樣本定序平均深度最低為基因組的0.1倍；如果要同時獲得SNP連鎖資訊，每個樣本需定序平均深度最低為基因組的2倍。 (6)   數據分析 (6.1)   將步驟(5)獲得的定序結果去掉轉接子以及低品質數據，採用比對軟體比對到參考基因組； (6.2)   下機的數據經品質控制後比對到參考序列上，統計位點的等位基因的分佈及其頻率，檢測目的基因位點突變資訊； (6.3)   下機的數據經品質控制後比對到參考序列上，序列按照一定視窗進行GC校正，以幾千例MALBAC擴增的單細胞數據為數據庫進行修正，最終檢測出染色體複製數變異(CNV)； (6.4)   採用SNP-單套型進行連鎖分析： (6.4.1)  選擇SNP區域，界定在目的基因上下游1M範圍內； (6.4.2)  用軟體獲得目標區域的SNP，所述軟體包括但不限於samtools mpileup、GATK、FreeBayes、VarScan中的至少一種； (6.4.3)  SNP過濾：等位基因雜合度差異最低為10%，除去潛在錯誤的SNP； (6.4.4)  篩選區分型SNP，並構建父本和母本SNP-單套型：同一SNP位點，在父本和母本的4個等位基因鹼基中，有1個鹼基不同於其他3個即可區分； (6.4.5)  分析SNP-單套型：胚胎SNP-單套型有2個，分別遺傳自父本和母本各1條，根據區分型SNP和孟德爾遺傳原理，判斷其SNP-單套型具體哪個是父源遺傳，哪個是母源遺傳；其中區分型SNP最低為10個，若有3個以上SNP錯誤，此胚胎SNP-單套型數據視為數據量不足，難以進行分析； (6.4.6)  結果分析：根據步驟(6.4.4)確定父本和母本SNP-單套型，區分出與致病位點連鎖的單套型，將胚胎所在SNP的具體等位基因對比，根據孟德爾遺傳原理，判斷胚胎是否攜帶致病基因位點。
優選地，所述步驟(2)中第一輪線性擴增的條件為： (1)  94℃反應3min； (2)  20℃反應40s； (3)  30℃反應40s； (4)  40℃反應30s； (5)  50℃反應30s； (6)  60℃反應30s； (7)  70℃反應4min； (8)  95℃反應20s； (9)  58℃反應10s； (10) 重複步驟(2)到步驟(9) 8個循環。
優選地，所述步驟(2)中第二輪指數擴增的條件為： (1)  94℃反應30s； (2)  94℃反應20s； (3)  58℃反應30s； (4)  72℃反應3min； (5)  重複步驟(2)到步驟(4) 17個循環； (6)  將擴增後的產物在4℃保存。
本發明的一個突出特點是僅利用微量細胞(3-10個細胞)，就一次性獲得全面的檢測或診斷結果，這樣有助於提高PGD檢測的準確度並減少成本。為此，本發明方法中藉由對於參數和步驟的組合進行了優化，從而對於來自微量細胞的核酸樣本，既保證了常規染色體(如CNV)檢測的有效性，又充分擴展了對於發生頻率較低或極低的單基因遺傳病和/或連鎖進行有效而準確分析的檢測能力。
在本發明中，對於來自微量細胞的核酸樣本，先進行MALBAC擴增。其中，所採用的MALBAC擴增引子可以是本領域已有的擴增引子，例如WO2012/166425所述的引子。然而，為了實現對微量細胞同時進行多項檢測的目的，最適化的MALBAC擴增參數如上所述。
此外，為了有效地進行單基因遺傳病和/或連鎖分析，必須獲得高品質(即高保真且擴增覆蓋區域全)擴增產物。為此，在進行針對突變位點進行常規PCR擴增時，雖然可以採用高品質的萃取自微量細胞的核酸作為模版，但是優選採用部分MALBAC擴增產物作為模版。
典型地，在突變位點的PCR擴增反應中，模版選自下組：(i)細胞裂解樣本的核酸、(ii)步驟(2)的全基因組擴增反應的產物(即片段化的基因組DNA)、或(iii)由(i)和(ii)混合的形成的混合模版。較佳地，所述模版為步驟(2)的全基因組擴增反應的產物、或細胞裂解樣本的核酸與步驟(2)的全基因組擴增反應的產物的混合物[其中，(ii)與(i)的混合比為10-10000：1，較佳地100-1000：1]。
此外，對於步驟(2)獲得的全基因組擴增產物和步驟(3)獲得的目的基因突變位點擴增產物，在本發明中藉由將其按一定比例混合，從而可以一次性地藉由後續的資料庫建立、定序和分析，獲得全面的檢測結果。這樣，就可以避免分別建立資料庫和/或分別檢測的麻煩。
在本發明中，在所述混合步驟中，突變位點的PCR擴增產物與片段化的基因組DNA的混合比例為1：(1-100)；較佳地為1：(10-100)；更佳地1：(20-50)。
本發明的主要優點包括： (1)  本發明方法僅需微量樣本(來自胚胎樣本的3-10個滋養層細胞)，就可完成本領域原本需要大量樣本或需要分步進行的檢測。本發明利用MALBAC擴增技術全基因組擴增並結合目的基因突變位點擴增，然後對擴增產物的混合基因庫藉由一次高通量定序，對同一樣品，一步完成胚胎單基因遺傳病、染色體疾病及連鎖分析等綜合性檢測。 (2)  本發明方法可操作性強，降低成本，操作簡單快速，適用範圍廣，避免了使用多方法、多步驟分別進行單基因遺傳病突變位點、染色體疾病和連鎖分析的檢測。 (3)  本發明方法應用廣泛，不僅可用於胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)檢測，確定胚胎是否攜帶致病基因位點和染色體複製數異常情況；同樣適用於反覆流產、高齡婦女胚胎的遺傳性篩選，簡便、快速、準確地完成針對微量細胞樣本的多項而全面的檢測。 (4)  本發明的檢測結果準確，可有效減少等位基因脫扣(ADO)等問題。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子選殖：實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。試劑和設備
除非另外說明，否則所有的試劑和儀器均為市售產品，或按常規方法製備。
MALBAC引子參見WO2012/166425的實施例1。實施例 實施例 1
一體染色體顯性遺傳病模型，致病基因為A。本家系中，父本及父本的父親均為攜帶者，分別攜帶Mutation突變位點(c.233delC)。經分析，胚胎9、10、11和12為父源突變攜帶者的致病性胚胎，胚胎7和8不攜帶突變位點。 1  取胚胎單細胞： 1.1    精卵受精
對MII期的卵子顯微注射單精子(ICSI)，將卵子放到(G-MOPS)操作液中，轉移到顯微操作儀平臺上，進行顯微操作。 1.2    胚胎體外培養
將受精胚在G1培養液(Vitrolife)或Gm培養液中(Global)中培養72小時左右至5-8細胞期，在透明帶上進行雷射打孔，轉移至已經平衡過的G2培養液(Vitrolife)或Gm培養液中(Global)繼續培養至囊胚，借助雷射將孵化的囊胚外滋養層細胞分離一小團，包含3-10個細胞。
其中，胚胎細胞可以選自人類或者其他哺乳動物。 2. MALBAC擴增 2.1    MALBAC擴增 2.1.1 裂解細胞
將胚胎細胞轉移至含有5 μl裂解液的PCR管中，放入PCR儀中進行裂解，50℃ 50分鐘。 2.1.2 失活蛋白酶
將PCR管放入PCR儀中失活，80℃ 10分鐘。 2.1.3 第一輪線性擴增
在5 μl的細胞裂解樣品中加入30 μL預擴增混合液。
溫度流程：94℃ 3分鐘，8×(20℃---40秒，30℃---40秒，40℃---30秒，50℃---30秒，60℃---30秒，70℃---4分鐘，95℃---20秒，58℃---10秒)。 2.1.4 第二輪指數擴增
在35 μl的預擴增混合液中加入30 μl擴增混合液。
溫度流程：94℃---30秒，17×(94℃---20秒，58℃---30秒，72℃---3分鐘)，4℃保存。 2.2    MALBAC擴增結果
單細胞或等量DNA可藉由單細胞擴增反應，從每65 μL的反應體系中，獲得範圍在約300-2000 bp之間的擴增產物2-4 μg(即片段化的基因組DNA)。
產物電泳如圖1。圖中M表示2K DNA ladder，E1、E2、E3、E4表示四個胚胎擴增產物，NC表示負對照組，由圖1可知，單細胞擴增終產物大小範圍在約250-2000bp。 2.3    MALBAC產物純化
利用商業純化試劑盒，進行MALBAC產物的純化。 3. 目的基因突變位點擴增 3.1    引子設計
利用Oligo、Primer等引子設計軟體或引子專業設計網站進行引子設計，設計時，引子長度20-25bp左右，擴增片段大小根據定序用的reads來進行調整設計，單端的不能超過reads長度，雙端的不能超過2倍長。 3.2    引子評估
引子設計完成後採用NCBI或UCSC等專業網站進行引子特異性評估(如錯配率、髮夾結構等等)，評估合格後進行引子合成。 3.3    目的基因突變位點擴增
將目的基因突變位點進行普通PCR擴增。
來自同一樣本的PCR產物和片段化的基因組DNA按照一定質量比進行混合，目的基因突變位點PCR產物：基因組DNA=1：(10-100)。 4. MALBAC產物及目的基因突變位點的資料庫建立
利用商業資料庫建立試劑盒，進行MALBAC產物及目的基因突變位點的資料庫建立。 5. 高通量定序
採用高通量定序平臺，對樣本進行定序。定序平臺不受特別限制，第二代定序平臺包括但不限於Illumina公司的GA、GAII、GAIIx、HiSeq1000/2000/2500/3000/4000、X Ten、X Five、NextSeq500/550、MiSeq，Applied Biosystems的SOLiD，Roche的454 FLX，Thermo Fisher Scientific(Life Technologies)的Ion Torrent、Ion PGM、Ion Proton I/II；第三代單分子定序平臺：包括但不限於Helicos BioSciences公司的HeliScope系統，Pacific Bioscience的SMRT系統，Oxford Nanopore Technologies的GridION、MinION。定序類型可為單端(Single End)定序或雙端(Paired End)定序。
如果只進行單基因致病位點和染色體複製數變異(CNV)分析，每個樣本定序平均深度為只需0.1X；如果要同時獲得SNP連鎖資訊，每個樣本需定序平均深度為2X。 6. 數據分析 6.1    參考序列比對
將定序結果去掉轉接子及低品質數據，比對到參考基因組。參考基因組可為全基因組、任意染色體、染色體的一部分、基因。參考基因組通常選擇已被公認確定的序列可為NCBI或UCSC的基因序列為參考序列(如人類Hg19，小鼠mm10)，或任意一條染色體。比對軟體可用任何一種免費或商業軟體，如BWA (Burrows-Wheeler Alignment tool)、SOAPaligner/soap2 (Short Oligonucleotide Analysis Package)、Bowtie/Bowtie2。 6.2    目的基因突變位點分析
下機的數據，經品質控制後比對到參考序列(如人類Hg19，小鼠mm10)上，統計位點的等位基因(Allele)分佈及頻率，檢測目的基因位點突變資訊。 6.3    CNV分析
下機的數據，經品質控制後比對到參考序列(如人類Hg19，小鼠mm10)上，序列按照一定視窗(bin)進行GC校正，以幾千例MALBAC擴增的單細胞數據為數據庫進行修正，最終檢測出染色體複製數，見CNV分析示例：表1和圖2。圖2中X座標表示染色體編號，Y座標表示染色體複製數目，箭頭所示染色體複製數異常染色體。 表1.   CNV分析結果 6.4    連鎖分析
本方法中以SNP-單套型為示例。 6.4.1 SNP calling和SNP過濾
選擇SNP區域，界定在目的基因上下游1M範圍內，雜合度較高(千份個體數據庫中頻率大於0.3)；SNP間距越小，重組率越小。
用軟體獲得目標區域的SNP，軟體包括但不限於samtools mpileup，GATK，FreeBayes，VarScan中的至少之一。
SNP過濾，等位基因雜合度差異最低10%，除去潛在錯誤的SNP。 6.4.2 篩選區分型SNP，並構建父本和母本SNP-單套型。
區分型SNP，即同一SNP位點，父本和母本的4個等位基因鹼基中，有1個鹼基不同於其他3個即可區分。如表2，A-SNP1，父本等位基因型為A/G，母本等位基因型為A/A，父本的父親個體等位基因型為A/A。說明，父本此位點鹼基A與致病位點連鎖在同一單套型中，並遺傳給後代；父本此位點鹼基G與正常等位基因連鎖在同一單套型中。這個SNP位點即為區分型SNP，其他位點以此類推，詳見表2示例。 表2.   A基因區域部分SNP基因型 注釋： 1.    表2中“_”表示無法得到相應SNP資料(無數據覆蓋或深度較低)； 2.    粗斜體表示攜帶的c.233delC致病突變； 3.    表2中父本單套型1表示致病突變所在單套型； 4.    表2中Mutation為致病突變。 6.4.3 分析胚胎SNP-單套型
胚胎SNP-單套型有2個，分別遺傳自父本和母本各1條，根據區分型SNP和孟德爾遺傳原理，判斷其SNP-單套型具體哪個是父源遺傳，哪個是母源遺傳。胚胎SNP-單套型分析中，區分型SNP最低為10個，若有3個以上SNP錯誤，此胚胎SNP-單套型分析錯誤。 6.4.4 結果分析
根據6.4.2確定父本和母本SNP-單套型，區分出與致病位點連鎖的單套型，將胚胎所在SNP的具體等位基因對比。例如，分析表2 A-SNP1，胚胎7、8的等位基因中均有鹼基G，說明這2個胚胎均不攜帶父源的致病基因位點；胚胎9、10、11、12的等位基因中均有鹼基A，說明這4個胚胎均攜帶父源的致病基因位點。根據孟德爾遺傳原理，判斷胚胎是否攜帶致病基因位點。 7. 方法可行性驗證 7.1    Sanger定序
對目的基因突變位點設計特異性引子，進行普通PCR擴增和Sanger定序，與高通量定序結果進行比較，用於驗證本專利中目的基因突變位點檢測方法的可行性，具體結果見圖3。圖3中黑色標註位置為目的基因突變位點；Sanger定序圖中除“A/T/C/G”四種鹼基外，另有“R/S/M/W/V”等簡單鹼基，分別表示由突變引起的A/G、G/C、A/C、G/A/C雜合峰。從圖3中可以得知，Sanger定序結果與表2中高通量定序結果一致。 7.2    STR位點連鎖分析
對目的基因連鎖兩個STR位點(STR1和STR2)設計特異性引子，進行STR位點連鎖分析，用於驗證本發明中高通量定序SNP-單套型分析方法的可行性，具體見圖4。其中“■”表示患病男性，“●”表示患病女性，“□”表示正常男性，“○”表示正常女性。圖中數字“229”、“235”和“238”表示STR1位點等位基因型，“193”、“195”和“197”表示STR2位點等位基因型。從圖4中可以得知，STR位點連鎖分析結果與表2中SNP-單套型分析結果一致。
綜上，本發明中所述一次定序完成單基因、染色體和連鎖分析的方法，可行性和準確性強。討論
在本發明中，針對微量細胞(如3-10個細胞或更少細胞)，利用MALBAC擴增技術結合高通量定序，一步完成胚胎單基因遺傳病、染色體疾病及連鎖分析等綜合性檢測，可操作性強，降低成本，操作簡單快速，適用範圍廣，避免了使用多方法、多步驟分別進行單基因遺傳病突變位點、染色體疾病和連鎖分析的檢測。本發明所提供的方法為微量樣本(如胚胎樣本)的多種檢測提供有利條件，應用廣泛，不僅可用於PGD檢測，確定胚胎是否攜帶致病基因位點和染色體複製數異常情況；同樣適用於反覆流產、高齡婦女胚胎的遺傳性篩選，實現一個步驟完成單個樣本多項檢測。綜上，本發明操作簡單、工作週期短，實踐可行性強，尤其利用高通量定序方法，檢測和數據分析快速，有利於推廣和應用。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
圖1為本發明MALBAC擴增結果的產物電泳圖。
圖2為本發明實施例1中胚胎全基因組定序的CNV分析圖。
圖3為本發明實施例1中目的基因突變位點的Sanger定序圖。
圖4為本發明實施例1中STR位點連鎖分析圖。

Claims (11)

  1. 一種同時完成基因位點、染色體及連鎖分析的方法，其特徵在於，包括以下各步驟： (1)   胚胎細胞樣本的獲得：藉由單精子注射獲得受精卵，培養至囊胚期在外滋養層細胞分離獲得包含3-10個細胞的樣本； (2)   全基因組擴增：在樣本中加入裂解液放入PCR儀中進行裂解、失活蛋白酶，對獲得的細胞裂解樣本進行全基因組擴增； (3)   目的基因突變位點擴增：在完成引子設計、引子評估之後，將目的基因突變位點進行普通PCR擴增獲得PCR產物，將同一樣本的PCR產物與步驟(2)中獲得的片段化的基因組DNA按照一定比例混合； (4)   全基因組擴增產物與目的基因突變位點進行資料庫建立； (5)   採用高通量定序平臺，對樣本進行定序； (6)   數據分析 (6.1)   將步驟(5)獲得的定序結果去掉轉接子以及低品質數據，採用比對軟體比對到參考基因組； (6.2)   下機的數據經品質控制後比對到參考序列上，統計位點的等位基因的分佈及其頻率，檢測目的基因位點突變資訊； (6.3)   下機的數據經品質控制後比對到參考序列上，序列按照一定視窗進行GC校正，以幾千例全基因組擴增的單細胞數據為數據庫進行修正，最終檢測出染色體複製數變異(CNV)； (6.4)   採用SNP-單套型進行連鎖分析。
  2. 如請求項1的方法，其特徵在於，所述步驟(2)的全基因組擴增由多重黏合與成環擴增循環(MALBAC)實現，包括第一輪線性擴增和第二輪指數擴增。
  3. 如請求項2的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中第一輪線性擴增的條件為： (1)   90-98℃反應90s-5min； (2)   15-25℃反應30s-1min； (3)   25-35℃反應30s-1min； (4)   35-45℃反應20s-1min； (5)   45-55℃反應20s-1min； (6)   55-65℃反應20s-1min； (7)   65-85℃反應2min-6min； (8)   90-98℃反應10-40s； (9)   45-65℃反應5-20s； (10) 重複步驟(2)到步驟(9) 5至20個循環。
  4. 如請求項2的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中第二輪指數擴增的條件為： (1)   90-98℃反應10s-50s； (2)   90-98℃反應10s-40s； (3)   45-65℃反應20s-45s； (4)   65-80℃反應75s-5min； (5)   重複步驟(2)到步驟(4) 10至30個循環； (6)   將擴增後的產物在0-5℃保存。
  5. 如請求項1的方法，其特徵在於，所述步驟(3)中，普通PCR擴增的模版選自下組：(i)細胞裂解樣本的核酸、(ii)步驟(2)的全基因組擴增反應的產物、或(iii)由(i)和(ii)混合的形成的混合模版。
  6. 如請求項2至5任一項所述的方法，其特徵在於，MALBAC擴增後的產物在300-2000bp之間或250-2000bp之間。
  7. 如請求項1的方法，其特徵在於，所述步驟(3)中的引子設計在設計時，引子長度為20-25bp，擴增片段大小根據定序用的reads來進行調整設計，單端的不能超過reads長度，雙端的不能超過2倍長。
  8. 如請求項1的方法，其特徵在於，所述步驟(3)中PCR產物與片段化的基因組DNA的混合比例為1：(1-100)。
  9. 如請求項1的方法，其特徵在於，所述步驟(5)中的高通量定序如果只進行單基因致病位點和染色體複製數變異(CNV)分析，每個樣本定序平均深度最低為基因組的0.1倍；如果要同時獲得SNP連鎖資訊，每個樣本定序平均深度最低為基因組的2倍。
  10. 如請求項1的方法，其特徵在於，所述步驟(6.4)採用SNP-單套型進行連鎖分析具體操作如下： (1)   選擇SNP區域，界定在目的基因上下游1M範圍內； (2)   用軟體獲得目標區域的SNP，所述軟體選自：samtools mpileup，GATK，FreeBayes，VarScan； (3)   SNP過濾：等位基因雜合度差異最低為10%，除去潛在錯誤的SNP； (4)   篩選區分型SNP，並構建父本和母本SNP-單套型：同一SNP位點，在父本和母本的4個等位基因鹼基中，有1個鹼基不同於其他3個即可區分； (5)   分析SNP-單套型：胚胎SNP-單套型有2個，分別遺傳自父本和母本各1條，根據區分型SNP和孟德爾遺傳原理，判斷其SNP-單套型具體哪個是父源遺傳，哪個是母源遺傳； (6)   結果分析：根據步驟(4)確定父本和母本SNP-單套型，區分出與致病位點連鎖的單套型，將胚胎所在SNP的具體等位基因對比，根據孟德爾遺傳原理，判斷胚胎是否攜帶致病基因位點。
  11. 如請求項10的方法，其特徵在於，步驟(5)的胚胎SNP-單套型分析中，區分型SNP最低為10個，若有3個以上SNP錯誤，此胚胎SNP-單套型數據視為數據量不足，難以進行分析。
TW105137959A 2015-11-18 2016-11-18 A method for simultaneously performing gene locus, chromosome and linkage analysis TWI640636B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
??201510794535.5 2015-11-18
CN201510794535.5A CN105543339B (zh) 2015-11-18 2015-11-18 一种同时完成基因位点、染色体及连锁分析的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201728758A true TW201728758A (zh) 2017-08-16
TWI640636B TWI640636B (zh) 2018-11-11

Family

ID=55822896

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105137959A TWI640636B (zh) 2015-11-18 2016-11-18 A method for simultaneously performing gene locus, chromosome and linkage analysis

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN105543339B (zh)
TW (1) TWI640636B (zh)
WO (1) WO2017084624A1 (zh)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543339B (zh) * 2015-11-18 2021-07-16 上海序康医疗科技有限公司 一种同时完成基因位点、染色体及连锁分析的方法
WO2018148903A1 (zh) * 2017-02-16 2018-08-23 上海亿康医学检验所有限公司 泌尿系统肿瘤的辅助诊断方法
CN106834490B (zh) * 2017-03-02 2021-01-22 上海亿康医学检验所有限公司 一种鉴定胚胎平衡易位断裂点和平衡易位携带状态的方法
CN107247863A (zh) * 2017-04-18 2017-10-13 北京水母科技有限公司 整合高通量基因分型与临床医学信息的生物医学本体集成方法
CN106929595B (zh) * 2017-04-28 2021-03-30 上海亿康医学检验所有限公司 一种鉴定胚胎平衡易位携带状态的系统和方法
CN108165610A (zh) * 2017-12-22 2018-06-15 上海美吉生物医药科技有限公司 一种单细胞全基因组扩增试剂盒
CN108410979A (zh) * 2018-05-25 2018-08-17 安徽华大医学检验所有限公司 一种同时检测单基因疾病和染色体疾病的芯片及其应用
CN110628891B (zh) * 2018-06-25 2024-01-09 深圳华大智造科技股份有限公司 一种对胚胎进行基因异常筛查的方法
WO2020047694A1 (zh) * 2018-09-03 2020-03-12 深圳华大智造科技有限公司 确定新发突变在胚胎中的遗传状态的方法和装置
CN110872618B (zh) * 2018-09-04 2022-04-19 北京果壳生物科技有限公司 一种基于Illumina人全基因组SNP芯片数据判断被检样本性别的方法及用途
CN110305943A (zh) * 2019-05-23 2019-10-08 北京新抗元生物技术有限公司 一种用于评估基因测序数据噪声的内参体系及其建立方法
CN110093406A (zh) * 2019-05-27 2019-08-06 新疆农业大学 一种盘羊及其杂交后代遗传基因研究方法
CN110241262A (zh) * 2019-06-26 2019-09-17 云南省第一人民医院 一种基于pgd的卵裂期胚胎单细胞检测hbv病毒基因组垂直传播方法
CN110305968A (zh) * 2019-07-14 2019-10-08 西安交通大学口腔医院 一种基于ngs分型用于法医学个体识别的snp-dip微单倍型域的复合扩增体系
CN111276189B (zh) * 2020-02-26 2020-12-29 广州市金域转化医学研究院有限公司 基于ngs的染色体平衡易位检测分析系统及应用
CN111440857B (zh) * 2020-03-11 2023-03-21 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司 用于无创胚胎植入前遗传性检测的方法
CN113436680B (zh) * 2020-05-22 2022-03-25 复旦大学附属妇产科医院 一种同时鉴别胚胎染色体结构异常和致病基因携带状态的方法
CN111816248B (zh) * 2020-05-22 2023-12-01 武汉菲沙基因信息有限公司 一种基于Pacbio subreads和Hi-C reads的全基因组分型方法
CN113035271B (zh) * 2020-12-22 2024-01-23 苏州奥根诊断科技有限公司 一种检测异源cfDNA的多重PCR引物设计、引物组及检测方法及其用途
CN114507728B (zh) * 2022-03-03 2024-03-22 苏州贝康医疗器械有限公司 一种捕获引物及其应用
CN114717337B (zh) * 2022-05-18 2023-10-13 中国计量大学 一种细胞交叉污染检测方法及其应用
CN114898803B (zh) * 2022-05-27 2023-03-24 圣湘生物科技股份有限公司 突变检测分析的方法、设备、可读介质及装置
CN114836536B (zh) * 2022-07-04 2022-09-30 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种基于malbac的单细胞高扩增区域筛选方法及系统
CN115064210B (zh) * 2022-07-27 2022-11-18 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种鉴定二倍体胚胎细胞中染色体交叉互换位置的方法及应用
CN116153395B (zh) * 2023-04-17 2023-06-30 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种单细胞小片段染色体拷贝数变异的检测方法及系统
CN117721222B (zh) * 2024-02-07 2024-05-10 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种单细胞转录组预测胚胎着床的方法及应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103890191B (zh) * 2011-05-27 2018-12-04 哈佛大学校长及研究员协会 单细胞全基因组扩增方法
CN104004817A (zh) * 2013-02-22 2014-08-27 哈佛大学 利用极体或胚胎的单细胞基因组测序来选择试管婴儿的胚胎
CN104711362A (zh) * 2015-03-27 2015-06-17 苏州贝康医疗器械有限公司 一种利用囊胚期胚胎细胞进行胚胎染色体异常检测的方法
CN104745718B (zh) * 2015-04-23 2018-02-16 北京中仪康卫医疗器械有限公司 一种检测人类胚胎染色体微缺失和微重复的方法
CN105543339B (zh) * 2015-11-18 2021-07-16 上海序康医疗科技有限公司 一种同时完成基因位点、染色体及连锁分析的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105543339A (zh) 2016-05-04
WO2017084624A1 (zh) 2017-05-26
TWI640636B (zh) 2018-11-11
CN105543339B (zh) 2021-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI640636B (zh) A method for simultaneously performing gene locus, chromosome and linkage analysis
JP6997813B2 (ja) 高度多重ｐｃｒ法および組成物
JP6521956B2 (ja) 性染色体におけるコピー数変異を判定するための方法
CN105441432B (zh) 组合物及其在序列测定和变异检测中的用途
US20140206552A1 (en) Methods for preimplantation genetic diagnosis by sequencing
US20130196862A1 (en) Informatics Enhanced Analysis of Fetal Samples Subject to Maternal Contamination
WO2013052557A2 (en) Methods for preimplantation genetic diagnosis by sequencing
WO2014127749A1 (zh) 单细胞基因组测序在植入前遗传学诊断中的应用
CN104136628A (zh) 一种检测染色体微缺失和微重复的方法
WO2015043278A1 (zh) 同时进行单体型分析和染色体非整倍性检测的方法和系统
AU2018327337A1 (en) Systems and methods for non-invasive preimplantation genetic diagnosis
Tšuiko et al. Preimplantation genetic testing: single-cell technologies at the forefront of PGT and embryo research
Deleye et al. Massively parallel sequencing of micro-manipulated cells targeting a comprehensive panel of disease-causing genes: A comparative evaluation of upstream whole-genome amplification methods
JP7333838B2 (ja) 胚における遺伝パターンを決定するためのシステム、コンピュータプログラム及び方法
Xing et al. Long‐read Oxford nanopore sequencing reveals a de novo case of complex chromosomal rearrangement involving chromosomes 2, 7, and 13
JP2014530629A (ja) 染色体の微細欠失及び微細重複を検出する方法
Vendrell et al. New protocol based on massive parallel sequencing for aneuploidy screening of preimplantation human embryos
WO2024040957A1 (en) Simplified analysis method of dna and cell free dna and uses thereof
Bakhtiar et al. Omics technologies for clinical diagnosis and gene therapy: medical applications in human genetics
Tobler et al. The use of next-generation sequencing (NGS) for preimplantation genetic screening (PGS) and diagnosis (PGD)
WO2017124214A1 (zh) 一种检测染色体罗氏易位的方法
Fragouli et al. Genomics for Embryo Selection
Yilmaz Structural Variants in Health and Disease
Lee et al. Live births and ongoing pregnancies after thawed euploid embryo transfer in women 40 to 43
CN116814772A (zh) 检测fanca基因突变的引物组合、试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees