CN104711362A - 一种利用囊胚期胚胎细胞进行胚胎染色体异常检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用胚胎囊胚期细胞进行基因组扩增并结合高通量测序技术对植入前的胚胎进行染色体检测，从中筛选出染色体正常胚胎的方法，可以全面完整的分析胚胎基因组的遗传变异信息，从而指导植入前胚胎的选择，减少遗传性疾病，提高试管婴儿的成功率，所涉及的步骤包括：囊胚期滋养层细胞分离；全基因组扩增；DNA片段化；Proton文库构建、上机测序及测序数据分析。该发明利用发育到囊胚期的胚胎进行滋养层细胞分离检测，避免了卵裂期细胞分离对胚胎造成的伤害，获得细胞数量比卵裂期更多，提高了基因组扩增的成功率及扩增效果；囊胚期的胚胎经过自然淘汰过程，选择优质的囊胚期胚胎进行检测，更节约成本。

Description

一种利用囊胚期胚胎细胞进行胚胎染色体异常检测的方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地说，涉及一种利用体外发育到囊胚期的胚胎细胞，在单细胞扩增基础上进行染色体异常检测的方法。

背景技术

20年前，我国育龄人群中的不孕不育率仅为3％，处于全世界较低水平。2009中国不孕不育高峰论坛公布的《中国不孕不育现状调研报告》显示，全国不孕不育患者人数已超过5000万，以25岁至30岁人数最多，呈年轻化趋势，平均每8对育龄夫妇中就有1对面临生育方面的困难，不孕不育率攀升到12.5％-15％，接近发达国家15％-20％的比率。最为严峻的是，这一比例还在不断攀升，卫生组织专家预估中国的不孕不育率将会在近几年攀升到20％以上。

辅助生殖技术可有效解决这一问题，其中，试管婴儿是最受欢迎的一种辅助技术，自1978年诞生第一位试管婴儿以来，目前全世界已有超过500万例试管婴儿诞生。近年来，我国辅助生殖领域也处在高速发展阶段，但仍存在周期数高、妊娠率和活产率低的现状，造成巨大的医疗资源的浪费和经济、健康损失，提高试管婴儿的成功率是各大辅助生殖中心面临的主要问题。据报道，通过试管婴儿技术获得的胚胎通常有40％-60％存在染色体异常，这是导致试管婴儿失败的主要原因之一，通过对植入前的胚胎进行遗传学检测，确保染色体数目以及结构正常以后再进行胚胎植入，可以有效提高植入健康胚胎的概率，改善妊娠结果，因此胚胎植入前遗传学筛查(PGS)技术开始越来越受到重视。

胚胎植入前遗传学筛查是指胚胎植入着床之前，对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，通过一次性检测胚胎23对染色体的结构和数目，分析胚胎是否有遗传物质异常的一种早期产前筛查方法。目前，临床上进行PGS检测的方法主要包括Fish、Array CGH等，然而这两种技术都存在一定的局限：FISH技术目前存在的问题在于无法一次性检测所有染色体，操作繁琐，分辨率低；CGH的缺点在于只能检测已知的染色体异常，并且费用昂贵。而利用半导体高通量测序法进行PGS检测，既弥补了FISH在准确度和检测通量方面的缺陷，又降低了单个样本的检测成本，同时提高了检测准确度，已经成为未来PGS检测的发展方向。

胚胎植入前染色体检测是通过分离胚胎中的部分细胞，通过对这部分细胞的检测推断整个胚胎的染色体是否正常。无论基于何种检测技术，首先需要对体外发育中的胚胎进行部分细胞的分离，目前常用的是卵裂球分离法，从发育到8细胞期的胚胎中分离出1-2个卵裂球，通过对1-2个卵裂球进行单细胞扩增测序进行染色体异常检测，但由于模板数量极少，经常容易发生扩增失败及扩增偏好性大的问题，影响实验结果。而囊胚期的胚胎相对于卵裂期而言，细胞数量大量增加，而且此时形成的胚胎滋养层细胞不直接发育成胎儿，可以分离5-10个滋养层细胞而胚胎的正常发育不会受到影响。本发明就是建立了一套分离囊胚期胚胎滋养层细胞进行胚胎染色体检测的流程，该技术不仅仅提高了单细胞扩增的成功率，结合高通量测序的方法也使染色体检测的准确度和灵敏度大幅提高，可达99％以上。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用胚胎囊胚期细胞进行基因组扩增并结合高通量测序技术对植入前的胚胎进行染色体检测，从中筛选出染色体正常胚胎的方法，所涉及的步骤包括：

1、囊胚期滋养层细胞分离：在受精卵体外发育到第5天时，分离5-10个胚胎滋养层细胞；

2、全基因组扩增：对分离出的细胞样本进行全基因组扩增，扩增后的样本用磁珠法纯化DNA；对扩增的基因组DNA进行定量分析，分析检测结果显示无降解、无污染、符合二代测序技术所要求的DNA起始量的样品才可以进行下一步实验；所述定量分析方法为琼脂糖凝胶电泳、Agilent 2100 Bioanalyzer检测或Qubit dsDNA HS Assay Kit；

3、DNA片段化：对扩增样本进行酶切处理，使DNA的片段长度适合二代测序的长度要求，用EDTA终止实验，然后用磁珠法纯化酶切产物；对于片段化后的DNA，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量分析，使用Agilent 2100 Bioanalyzer检测进行片段大小分析；

4、Proton文库构建：用DNA酶切后的产物进行文库构建，DNA片段末端补平后纯化，两端加特异性接头后纯化，PCR扩增后纯化；

5、上机测序：计算文库的稀释倍数，利用乳液PCR技术形成达到测序要求的阳性测序模板，利用Ion Proton半导体测序系统对测序模板进行测序，最终获得每个DNA片段的碱基序列；

6、测序数据分析：将测序结果利用生物信息学分析把这些序列定位到人类基因组参考图谱上，通过与参考基因组的对比分析样本的染色体变异信息。

本发明的优点在于：利用发育到囊胚期的胚胎进行滋养层细胞分离检测，避免了卵裂期细胞分离对胚胎造成的伤害，获得细胞数量比卵裂期更多，提高了基因组扩增的成功率及扩增效果；囊胚期的胚胎经过自然淘汰过程，选择优质的囊胚期胚胎进行检测，更节约成本；此外，本发明利用高通量测序的方法可以准确高效的对染色体全部的非整倍体异常及4M以上的微缺失微重复等进行检测，检测通量高，准确性和灵敏度可达到99％以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为用显微操作仪吸取胚胎滋养层细胞的操作图；

图2为基因组扩增后的Aglient2100分析结果图；

图3为本发明中3个样本的基因组扩增测序重复性分析图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1：

分离囊胚滋养外胚层细胞

选择试管婴儿中的高危人群(年龄≥35，反复种植失败，反复流产)的体外受精胚胎，采用常规胚胎活检方法获取囊胚滋养外胚层细胞；在胚胎发育到D3阶段时用激光进行透明带打孔，继续培养至D5阶段，此时滋养外胚层细胞挤出透明带，如图1，用平口显微操作针吸取部分滋养外胚层细胞(5-10个)，用激光切断；吸取的细胞转移至PBS溶液中洗涤3遍。

实施例2：

裂解细胞及单细胞扩增

(1)细胞裂解

洗涤好的细胞转移至0.2mL的PCR管，根据样本数量，混合细胞裂解缓冲液和细胞裂解酶，将混合液加入到细胞样本中，单个样本反应体系如下表1所示：

表1

组分	反应体积(μL)
		单细胞样本	<2
细胞裂解缓冲液	5
		细胞裂解酶	0.1
反应体系总量	<7.1

在预热的PCR仪中孵育样本，条件如下表2所示：

表2

(2)预扩增

根据样本数量，混合预扩增缓冲液和预扩增酶，将混合液加入到上一步的反应管中，单个样本反应体系如下表3所示：

表3

组分	反应体积(μL)
		裂解后的样本	～7
预扩增缓冲液	30
		预扩增酶	1
反应体系总量	～38

在PCR仪中孵育，反应条件如下表4：

表4

(3)指数扩增

根据样本数量，混合扩增缓冲液和扩增酶，将混合液加入到细胞样本中，单个样本反应体系如下表5所示：

表5

组分	反应体积(μL)
		预扩增样本	～38
扩增缓冲液	30
		扩增酶	0.8
反应体系总量	～68.8

在PCR仪中孵育，反应条件如下表6：

表6

(4)扩增产物纯化

将反应体系转移到1.5mL的EP管中，向其中加入98μL的XP磁珠，Votex震荡或用枪吹打混匀反应体系，室温放置5min；放入磁力架，待磁珠完全吸附，吸去液体；用300μL 70％的乙醇洗涤2次；瞬时离心后，放入磁力架，单磁珠吸附完全后，吸干残留液体，保持盖子敞开室温晾干3min左右；向其中加入35μL H2O混匀使磁珠重悬，室温放置5min；放入磁力架，待磁珠吸附完全，吸取液体到新的1.5mL的EP管中，不要吸到磁珠；用Qubit 2100测定单细胞扩增后的浓度，并通过Aglient2100分析扩增片段大小分布，如图2所示。

实施例3：

DNA片段化

(1)DNA片段化使用NEB的片段化酶切试剂盒，将DNA片段化酶短暂离心3s，放置于冰盒上，在1.5mL的EP管中配置如下表7所示体系：

表7

组分	反应体积(μL)
		纯化后的DNA样本	X(500ng)
片段化缓冲液	2
		水	16-X
片段化酶	2
		反应体系总量	20

将EP管放置在恒温金属浴中37℃反应30min；反应结束后加入5μL终止反应缓冲液。

(2)片段化后的DNA纯化

向反应体系中补水30μL，使体系体积达到50μL，加入75μL的XP磁珠，Votex震荡或用枪吹打混匀反应体系，室温放置5min；放入磁力架，待磁珠完全吸附，吸去液体；用300μL 70％的乙醇洗涤2次；瞬时离心后，放入磁力架，单磁珠吸附完全后，吸干残留液体，保持盖子敞开室温晾干3min左右；向其中加入33μL H2O混匀使磁珠重悬，室温放置5min；放入磁力架，待磁珠吸附完全，吸取液体到新的1.5mL的EP管中，不要吸到磁珠。

实施例4：

文库构建

文库构建采用Life的Ion Xpress Plus Fragment Library Kit试剂盒进行文库构建：

(1)末端修复

配制如下表8所示反应体系，25℃反应30min：

表8

组分	反应体积(μL)
		DNA	30
末端修复缓冲液	20
		末端修复酶	1
无核酸酶水	49
		反应体系总量	100

反应结束后，向反应体系中加入60μL的XP磁珠，Votex震荡或用枪吹打混匀反应体系，室温放置5min；放入磁力架，待磁珠完全吸附，吸取液体到新的1.5mL EP管中；向其中加入90μL的XP磁珠，Votex震荡或用枪吹打混匀反应体系，室温放置5min。放入磁力架，待磁珠完全吸附，吸去液体，用300μL 70％的乙醇洗涤2次；瞬时离心后，放入磁力架，单磁珠吸附完全后，吸干残留液体，保持盖子敞开室温晾干3min左右；向其中加入33μL H2O混匀使磁珠重悬，室温放置5min；放入磁力架，待磁珠吸附完全，吸取液体到新的1.5mL的EP管中，不要吸到磁珠。

(2)DNA片段末端加接头

按照下表9配制反应体系，25℃反应30min，其中，特异性接头X指1-96个index序列：

表9

组分	反应体积(μL)
		平末端DNA	32
无核酸酶的水	54
		连接缓冲液	10
DNA连接酶	2
		P1接头	1
特异性接头X	1
		反应体系总量	100

反应结束后，向反应体系中加入150μL的XP磁珠，Votex震荡或用枪吹打混匀反应体系，室温放置5min；放入磁力架，待磁珠完全吸附，吸去液体；用300μL 70％的乙醇洗涤2次；瞬时离心后，放入磁力架，单磁珠吸附完全后，吸干残留液体，保持盖子敞开室温晾干3min左右；向其中加入32μL H2O混匀使磁珠重悬，室温放置5min；放入磁力架，待磁珠吸附完全，吸取液体到准备好的八连管中，不要吸到磁珠。

(3)PCR扩增DNA片段

按照下表10配制反应体系：

表10

组分	反应体积(μL)
		连接接头的DNA	30
PCR酶混合液	95
		PCR引物混合液	5
反应体系总量	130

反应条件如下：

72℃，20分钟；98℃，2分钟；(98℃，15秒；62℃15秒；70℃1分钟)10个循环；70℃，5分钟；4℃Hold；

反应结束后，将反应体系转移到1.5mL的EP管中，向其中加入195μL的XP磁珠，Votex震荡或用枪吹打混匀反应体系，室温放置5min；放入磁力架，待磁珠完全吸附，吸去液体；用300μL 70％的乙醇洗涤2次；瞬时离心后，放入磁力架，单磁珠吸附完全后，吸干残留液体，保持盖子敞开室温晾干3min左右；向其中加入20μL H2O混匀使磁珠重悬，室温放置5min；放入磁力架，待磁珠吸附完全，吸取液体到新的1.5mL的EP管中，不要吸到磁珠。

实施例5：

文库定量

使用目前实验室常用的Qubit 2.0荧光计、2100生物分析仪或荧光定量PCR仪进行文库定量。本发明中采用Qubit 2.0荧光计进行文库定量，定量结果如下表11：

表11

实施例6、上机测序及测序数据分析

利用半导体测序系统Ion Proton及其配套试剂进行上机测序，根据文库定量结果，换算成摩尔浓度，换算公式如下：

摩尔浓度(pM)＝Qubit浓度*10^7/306/660

根据摩尔浓度将文库稀释到100pM，各文库等量混合后去10pM的混合溶液进行上机测序；

将测序结果利用生物信息学分析把这些序列定位到人类基因组参考图谱上，通过与参考基因组的对比分析，查找各染色体上存在的数目和结构异常；经分析，共鉴定出了8个异常样本，包括3个T21、1个T18、1个T13、2个XO、1个微缺失样本，并通过Array CGH进行验证，结果均一致；结果证明当测序覆盖度低至0.40X左右时即可以准确检测出染色体数目结构异常(表12)；随机选取3个样本，对其囊胚细胞扩增测序的重复性进行分析，统计连续200kb窗口的测序数据量；图3结果显示，3次扩增结果在基因组上连续的200kb窗口的测序数据量变化趋势是一致的。

表12:

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种利用囊胚期胚胎细胞进行胚胎染色体异常检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)囊胚期滋养层细胞分离：从发育至囊胚期的受精卵中分离胚胎滋养层细胞；

(2)全基因组扩增：对分离出的胚胎滋养层细胞样本进行全基因组扩增并纯化、并进行基因组DNA的定量分析；

(3)DNA片段化：将步骤(2)中定量分析合格的基因组DNA进行片段化处理并定量分析；

(4)Proton文库构建后进行上机测序以获得每个DNA片段的碱基序列，并对碱基序列进行分析以获得染色体变异信息。

2.根据权利要求1所述的一种利用囊胚期胚胎细胞进行胚胎染色体异常检测的方法，其特征在于，步骤(1)中，在受精卵体外发育到第5天时，分离5-10个胚胎滋养层细胞。

3.根据权利要求1所述的一种利用囊胚期胚胎细胞进行胚胎染色体异常检测的方法，其特征在于，步骤(2)中，对分离出的细胞样本进行全基因组扩增，扩增后的样本用磁珠法纯化DNA；对扩增的基因组DNA进行定量分析，分析检测结果显示无降解、无污染、符合二代测序技术所要求的DNA起始量的样品用于进行下一步实验。

4.根据权利要求1所述的一种利用囊胚期胚胎细胞进行胚胎染色体异常检测的方法，其特征在于，步骤(3)中，对扩增样本进行酶切处理，使DNA的片段长度适合二代测序的长度要求，用EDTA终止实验，然后用磁珠法纯化酶切产物；对于片段化后的DNA进行定量分析及片段大小分析。

5.根据权利要求1所述的一种利用囊胚期胚胎细胞进行胚胎染色体异常检测的方法，其特征在于，步骤(4)中，用DNA酶切后的产物进行文库构建，DNA片段末端补平后纯化，两端加特异性接头后纯化，PCR扩增后纯化。

6.根据权利要求5所述的一种利用囊胚期胚胎细胞进行胚胎染色体异常检测的方法，其特征在于，步骤(4)中，文库构建后，计算文库的稀释倍数，利用乳液PCR技术形成达到测序要求的阳性测序模板，利用Ion Proton半导体测序系统对测序模板进行测序，最终获得每个DNA片段的碱基序列。

7.根据权利要求6所述的一种利用囊胚期胚胎细胞进行胚胎染色体异常检测的方法，其特征在于，步骤(4)中，将测序结果利用生物信息学分析把这些序列定位到人类基因组参考图谱上，通过与参考基因组的对比分析样本的染色体变异信息。