TWI534262B - 確定單細胞染色體非整倍性的方法和系統 - Google Patents

確定單細胞染色體非整倍性的方法和系統 Download PDF

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Description

確定單細胞染色體非整倍性的方法和系統
本發明涉及生物醫學領域。具體而言，涉及一種確定單細胞染色體非整倍性的方法和系統。
非整倍染色體與人類一些遺傳疾病密切相關。最常見的如唐氏綜合症，發病率約1/1000，由於多了一條21號染色體所致，以及13三體和18三體綜合症，分別因多出一條13號和18號染色體而出現流產等。常染色體異倍性也是引起妊娠失敗而流產的一大方面原因。性染色體數目異常會造成性別發育異常。男性多一條X染色體(47，XXY)的個體為先天性睾丸發育不全症(Klinefelter綜合症)。Turner綜合症又稱先天性卵巢發育不全綜合症，由於缺失一條X染色體，核型為45，X。
然而，目前關於染色體非整倍性的檢測方法，仍有待改進。
本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個方面提出了一種能夠有效確定單細胞染色體非整倍性的方法。另一個方面提供了一種能夠有效實施該方法的確定單細胞染色體非整倍性的系統。
根據本發明的實施例的確定單細胞染色體非整倍性的方法包括下列步驟：對所述單細胞的全基因組進行測序，以便獲得第一測序結果；對所述第一測序結果中可比對上參考基因組(本文中，有時也稱為「已知基因組」)的測序數據的總數目進行計數，得到數值L；對所述第一測序結果中可比對到參考基因組第一染色體的測序數據的數目進行計數，得到數值M；基於所述數值L和數值M，確定第一參數；以及基於所述第一參數和預定的對照參數的差異，確定關於所述第一染色體，所述單細胞是否具有非整倍性。基於單細胞的全基因組測序的測序結果中，針對某一特定染色體的測序數據的數目，是與全基因組中該染色體的含量呈正相關的，因而，通過對測序結果中來源於某一特定染色體的測序數據的數目以及全基因組測序的總數目進行分析，能夠有效地確定關於該染色體，單細胞是否具有非整倍性。
根據本發明的一些實施例，上述確定單細胞染色體非整倍性的方法還可以具有下列附加技術特徵：根據本發明的一個實施例，進一步包括從生物樣本分離單細胞的步驟。由此，能夠直接以生物樣本作為原材料，獲得關於該生物樣本是否具有染色體畸變的訊息，從而反映生物體的健康狀態。
根據本發明的一個實施例，所述生物樣本為選自血液、尿液、唾液、組織、生殖細胞、卵裂球和胚胎的至少一種。由此，可以方 便地從生物體獲取這些樣本，並且能夠具體地針對某些疾病採取不同的樣本，從而針對某些特殊疾病採取特定的分析手段。
根據本發明的一個實施例，從生物樣本分離單細胞是通過選自稀釋法、口吸管分離法、顯微操作、流式細胞分離術、微流控法的至少一種進行的。根據本發明的一個具體示例，較佳所述顯微操作為顯微切割。由此，能夠有效便捷地獲得生物樣本的單細胞，以便實施後續操作，提供確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，對所述單細胞的全基因組進行測序進一步包括：對所述單細胞的全基因組進行擴增得到經過擴增的全基因組；利用所述經過擴增的全基因組構建全基因組測序庫；以及對所述全基因組測序庫進行測序，以便獲得多個測序數據，所述多個測序數據構成所述第一測序結果。根據本發明的一個具體示例，還進一步包括對所述單細胞進行裂解，以便釋放所述單細胞的全基因組的步驟。由此，能夠有效地獲取單細胞的全基因組訊息，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，利用鹼性裂解液將所述單細胞進行裂解，以便釋放出全基因組。由此，能夠有效地裂解單細胞，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，利用基於PCR的全基因組擴增方法 對所述全基因組進行擴增。根據本發明的一個具體示例，所述基於PCR的全基因組擴增方法為OmniPlex WGA方法。由此，能夠有效地對全基因組進行擴增，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，利用選自Hiseq2000、SOLiD、454、和單分子測序裝置的至少一種對所述全基因組測序庫進行測序。由此，能夠利用這些測序裝置的高通量、深度測序的特點，進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，所述多個測序數據的平均長度為約50bp。由此，可以方便地對測序數據進行分析，提高分析效率，進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，進一步包括將所述第一測序結果與已知基因組序列訊息進行比對以便獲得所有能比對上已知基因組的測序數據以及獲得所述來自於第一染色體的測序數據的步驟。由此，能夠有效地確定來自特定染色體的測序數據，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，所述第一染色體為選自21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的至少一種。由此，能夠有效地確定常見的人類染色體疾病。
根據本發明的一個實施例，所述第一參數是所述數值M與所述數值L的比值M/L。由此，能夠方便地對測序結果進行分析，提高確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，所述預定的對照參數是通過下列步驟獲得的：對參照單細胞全基因組進行測序，以便獲得第二測序結果，其中，所述參照單細胞全基因組來自不存在染色體非整倍性的樣本；對所述第二測序結果的測序數據中可比對上參考基因組的測序數據的總數目進行計數，得到數值L’；對所述第二測序結果中可比對到參考基因組第一染色體的測序數據的數目進行計數，得到數值M’；以及確定所述M’/L’的比值M’/L’，以便獲得所述預定的對照參數。由此，能夠方便地確定對照參數，提高確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，如果所述第一參數與所述預定的對照參數的比值超過第一閾值，則確定所述單細胞中所述第一染色體的數目為3條；如果所述第一參數與所述預定的對照參數的比值低於第二閾值，則確定所述單細胞中所述第一染色體的數目為1條；以及如果所述第一參數與所述預定的對照參數的比值在所述第一閾值和所述第二閾值之間，則確定所述單細胞中所述第一染色體的數目為2條。由此，通過設置第一閾值和第二閾值，可以快速地判斷特定的染色體的數目是否存在異常。
根據本發明的一個實施例，進一步包括對所述第一參數與所述預定的對照參數的比值或者分別對所述第一參數和所述預定的對照參數進行T-檢驗，以便獲得所述第一染色體的T-檢驗數值的步驟。由此，能夠進一步提高分析測序結果的準確度和精確度。
根據本發明又一方面，本發明提出了一種用於確定單細胞染色體非整倍性的系統。根據本發明的實施例，該用於確定單細胞染色體非整倍性的系統包括：全基因組測序裝置，所述全基因組測序裝置用於對所述單細胞的全基因組進行測序，以便獲得第一測序結果；以及測序結果分析裝置，所述測序結果分析裝置從所述全基因組測序裝置接收所述第一測序結果，以便執行下列操作：對所述第一測序結果的測序數據中可比對上參考基因組的測序數據的總數目進行計數，得到數值L；對所述第一測序結果中可比對到參考基因組第一染色體的測序數據的數目進行計數，得到數值M；基於所述數值L和數值M，確定第一參數；以及基於所述第一參數和預定的對照參數的差異，確定關於所述第一染色體，所述單細胞是否具有非整倍性。利用該用於確定單細胞染色體非整倍性的系統，能夠有效地實施根據本發明實施例的確定單細胞染色體非整倍性的方法，由此，能夠有效地確定單細胞染色體非整倍性。
根據本發明的一些實施例，用於確定單細胞染色體非整倍性的系統還可以具有下列附加技術特徵： 根據本發明的一個實施例，進一步包括全基因組測序庫製備裝置，所述全基因組測序庫裝置與所述全基因組測序裝置相連，以便為所述全基因組測序裝置提供用於測序的全基因組測序庫，其中，所述全基因組測序庫製備裝置進一步包括：單細胞分離單元，所述單細胞分離單元用於從生物樣本分離單細胞；單細胞裂解單元，所述單細胞裂解單元用於接收分離的單細胞並且裂解所述單細胞，釋放出全基因組；全基因組擴增單元，所述全基因組擴增單元用於接收所述單細胞的全基因組並且對所述單細胞的全基因組進行擴增；測序庫構建單元，所述測序庫構建單元用於接收所述經過擴增的全基因組，並且利用所述經過擴增的全基因組構建所述全基因組測序庫。由此，能夠有效地獲取單細胞的全基因組訊息，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，所述單細胞分離單元包括適於執行選自下列操作的至少一種的裝置：稀釋法、口吸管分離法、顯微操作、流式細胞分離術、微流控法的至少一種。根據本發明的一個具體示例，所述顯微操作較佳為顯微切割。由此，能夠有效便捷地獲得生物樣本的單細胞，以便實施後續操作，提供確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，所述單細胞裂解單元包括適於對單細胞進行鹼裂解，以便釋放全基因組的裝置。由此，能夠有效地裂解並釋放單細胞的全基因組，從而進一步提高了確定單細胞染色體 非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，所述全基因組擴增單元包括適於利用基於PCR的全基因組擴增方法對所述全基因組進行擴增的裝置。根據本發明的一個具體示例，所述基於PCR的全基因組擴增方法為OmniPlex WGA方法。由此，能夠有效地對全基因組進行擴增，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，所述全基因組測序裝置包括選自Hiseq2000、SOLiD、454、和單分子測序裝置的至少一種。由此，能夠利用這些測序裝置的高通量、深度測序的特點，進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，所述測序結果分析裝置進一步包括序列比對單元，所述序列比對單元用於將所述第一測序結果與已知基因組序列訊息進行比對以便獲得所有能比對上參考基因組的測序數據以及獲得所述來自於第一染色體的測序數據。由此，能夠有效地確定來自特定染色體的測序數據，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，所述測序結果分析裝置進一步包括T-檢驗單元，以便對所述第一參數與所述預定的對照參數的比值或者分別對所述第一參數與所述預定的對照參數進行T-檢驗，並且獲 得所述第一染色體的T-檢驗數值。由此，能夠進一步提高分析測序結果的準確度和精確度。
本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐瞭解到。
下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在圖式中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考圖式描述的實施例是示例性的，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
需要說明的是，術語「第一」、「第二」僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特徵的數量。由此，限定有「第一」、「第二」的特徵可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特徵。進一步地，在本發明的描述中，除非另有說明，「多個」或「複數個」的含義是兩個或兩個以上。這個所使用的術語「非整倍性」是與染色體的整倍性相對而言的，其是指在其基因組中缺少或額外增加一條或若干條染色體。通常而言，正常的細胞中每種染色體會有兩條，但由於在減數分裂時一對同源染色體不分離或提前分離而形成染色體數目異常的配子，這類配子彼此結合或同正常配子結合，會產生各種非整倍體細胞。另外在體細胞分裂時也會產生非整倍體細胞，如變異率非常高的腫瘤細胞等。
本發明的一個方面提出了一種能夠有效確定單細胞染色體非整倍性的方法。根據本發明的實施例的確定單細胞染色體非整倍性的方法包括下列步驟：
S100：對單細胞的全基因組進行測序，以便獲得第一測序結果。
根據本發明的實施例，單細胞的來源不受特別限制。根據本發明的一些實施例，可以直接從生物樣本中分離單細胞。進而，根據本發明的一個實施例，可以包括從生物樣本分離單細胞的步驟。由此，能夠直接以生物樣本作為原材料，獲得關於該生物樣本是否具有染色體畸變的訊息，從而反映生物體的健康狀態。根據本發明的實施例，可以採用的生物樣本並不受特別限制。根據本發明的一些具體示例，可以採用的生物樣本為選自血液、尿液、唾液、組織、生殖細胞、受精卵、卵裂球和胚胎的任意一種。本領域具有通常知識者能夠理解的是，針對不同的疾病，可以採用不同的生物樣本來進行分析。由此，可以方便地從生物體獲取這些樣本，並且能夠具體地針對某些疾病採取不同的樣本，從而針對某些特殊疾病採取特定的分析手段。例如，對於可能罹患特定癌症的測試對象，可以從該組織或其附近採集樣本，並進一步分離單細胞進行分析，由此，能夠精確並且盡可能早地獲知該組織是否發生癌變。根據本發明的實施例，從生物樣本分離單細胞的方法和設備不受特別限制。根據本發明的一些具體示例，可以採用選自稀釋法、口吸管分離法、顯微操作(較佳顯微切割)、流式細胞分離術、微流控法的至少一種從生物樣本分離單細胞。由此，能夠有效便捷地獲得生物樣本的單細 胞，以便實施後續操作，提供確定單細胞染色體非整倍性的效率。
另外，根據本發明的實施例，對單細胞的全基因組進行測序的方法不受特別限制。根據本發明的一個實施例，對單細胞的全基因組進行測序進一步包括：首先，對單細胞的全基因組進行擴增得到經過擴增的全基因組；接下來，利用經過擴增的全基因組構建全基因組測序庫；最後，對全基因組測序庫進行測序，以便獲得第一測序結果。所得到的第一測序結果是由多個測序數據構成的。由此，能夠有效地獲取單細胞的全基因組訊息，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。本領域通常知識者可以根據採用的基因組測序技術的具體方案選擇不同的構建全基因組測序庫的方法，關於構建全基因組測序庫的細節，可以參見測序儀器的廠商例如Illumina公司所提供的規程，例如參見Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide(Part#1005361；Feb 2010)或Paired-End SamplePrep Guide(Part#1005063；Feb 2010)，通過參照將其並入本文。
任選地，根據本發明的實施例，可以進一步包括對所述單細胞進行裂解，以便釋放所述單細胞的全基因組的步驟。根據本發明的一些示例，可以用於裂解單細胞並釋放全基因組的方法不受特別限制，只要能夠將單細胞裂解較佳充分裂解即可。根據本發明的具體示例，可以利用鹼性裂解液將所述單細胞裂解並釋放所述單細胞的全基因組。發明人發現，這樣能夠有效地裂解單細胞並釋放出全基因組，並且所釋放的全基因組在進行測序時，能夠提高準確率，從 而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。根據本發明的實施例，單細胞全基因組擴增的方法不受特別限制，可以採用基於PCR的方法例如可以採用引子擴增前放大法(primer extension preamplitication,PEP-PCR)、退化性寡核酸引子PCR(degenerate oligonucleotide primed-PCR,DOP-PCR)、和OmniPlex WGA，也可以採用非基於PCR的方法例如多重鏈置換擴增(multiple displacement amplification,MDA)。根據本發明的具體示例，較佳採用基於PCR的方法，例如OmniPlex WGA方法。可選用的商業化試劑盒包括但不限於Sigma Aldrich的GenomePlex，Rubicon Genomics的PicoPlex，Qiagen的REPLI-g，GE Healthcare的illustra GenomiPhi等。因而，根據本發明的具體示例，在構建測序庫之前，可以採用OmniPlex WGA對單細胞全基因組進行擴增。由此，能夠有效地對全基因組進行擴增，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。根據本發明的實施例，可以採用選自Hiseq2000、SOLiD、454、和單分子測序裝置的至少一種對所述全基因組測序庫進行測序。由此，能夠利用這些測序裝置的高通量、深度測序的特點，進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。當然，本領域具有通常知識者能夠理解的是，還可以採用其他的測序方法和裝置進行全基因組測序，例如第三代測序技術，以及以後可能開發出來的更先進的測序技術。根據本發明的實施例，通過全基因組測序所得到的測序數據的長度不受特別限制。根據本發明的一個具體示例，所述多個測序數據的平均長度為約50 bp(base pair)。發明人驚奇地發現，當測序數據的平均長度為約50bp時，能夠極大地方便對測序數 據進行分析，提高分析效率，同時能夠顯著降低分析的成本。進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率，並且降低了確定單細胞染色體非整倍性的成本。這裏所使用的術語「平均長度」是指各個測序數據長度數值的平均值。
S200：對所述第一測序結果中可比對上參考基因組的測序數據的總數目進行計數，得到數值L。
在完成對單細胞的全基因組進行測序之後，所得到的測序結果中包含了多個測序數據。在本文中所使用的術語「可比對上參考基因組的測序數據」的意思是指，通過將測序結果的所有測序數據與已知參考基因組序列(例如人類基因組Hg19)進行比對，能夠與參考基因組比對上的測序數據。本領域具有通常知識者能夠理解，可以採用任何已知的方法對這些測序數據的總數目進行計算。例如，可以採用測序儀器的製造商所提供的軟體進行分析。
S300：對第一測序結果中可比對到參考基因組第一染色體的測序數據的數目進行計數，得到數值M。
這裏所使用的術語「第一染色體」應做廣義理解，其可以是指任何期望研究的目的染色體，其數目並不僅限於一條染色體，甚至可以同時將全部染色體進行分析。根據本發明的實施例，第一染色體可以為人類染色中的任意染色體，可以為選自人類1~23號染色體的任意染色體。根據本發明的實施例，較佳為選自人類21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的至少一種。 由此，能夠有效地確定常見的人類染色體疾病，例如可以預測胎兒的遺傳性疾病。因而，根據本發明的實施例的確定單細胞染色體非整倍性的方法，能夠非常有效地應用於體外生殖領域中的植入前篩查(PGS)和植入前診斷(PGD)，以及胎兒有核細胞的產前檢測等，也可以應用於通過從孕婦羊水中提取胎兒的單細胞來進行產前檢查。由此，可以通過簡單地提取單細胞來快速預測胎兒的染色體是否存在異常，避免胎兒患有嚴重的遺傳性疾病。在本文中所使用的術語「可比對到參考基因組第一染色體」是指，通過將測序數據與參考基因組第一染色體的已知序列進行比對，能夠與第一染色體的序列比對上的，從而確定這些測序數據來源於第一染色體的測序結果。
根據本發明的實施例，從第一測序結果中篩選來自特定染色體的測序數據的方法不受特別限制。根據本發明的一個具體示例，可以通過將第一測序結果與已知的基因組序列訊息進行比對，從而能夠篩選出來自於第一染色體的測序數據。因而，根據本發明的一個實施例，可以進一步包括利用常規的軟體，將第一測序結果與已知基因組序列訊息進行比對以便篩選所述來自於第一染色體的測序數據的步驟。由此，能夠有效地確定來自特定染色體的測序數據，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。
S400：基於數值L和數值M，確定第一參數。
根據本發明的實施例，可以對數值L和數值M進行任何常規的數學計算和分析，並且將所得到的結果與預定的對照參數進行比 較，從而獲得關於數值M所代表的染色體是否具有非整倍性的訊息。通過數值L和數值M，可以計算關於特定染色體的數據量相對於總測序數據量的相對數據量，即特定染色體數據量占總數據量的比率，其可以在整條染色體範圍內統計，也可人為劃分窗口進行統計，窗口的大小可以固定，也可不固定。數據量的類型可以包括但不限於測序讀段(reads)數、鹼基數、深度、平均深度、覆蓋度等。根據本發明的一個實施例，第一參數是數值M與數值L的比值M/L。發明人發現，通過簡單的數學運算所得到的數值，即能夠獲得反映特定染色體在全基因組中含量的相關訊息。由此，能夠方便地對測序結果進行分析，提高確定單細胞染色體非整倍性的效率。
S500：基於第一參數和預定的對照參數的差異，確定關於第一染色體，單細胞是否具有非整倍性。
根據本發明的實施例，可以通過將前面所確定的第一參數與預定的對照參數進行比較，基於第一參數和預定的對照參數之間的差異，來確定關於特定的染色體，單細胞是否具有非整倍性。基於單細胞的全基因組測序的測序結果中，針對某一特定染色體的測序數據的數目，是與全基因組中該染色體的含量呈正相關的，因而，通過對測序結果中來源於某一特定染色體的測序數據的數目以及全基因組測序的總數目進行分析，能夠有效地確定關於該染色體，單細胞是否具有非整倍性。在本文中所使用的術語「對照參數」是指將已知基因組正常的單細胞重複針對生物樣本單細胞實施的操作和分析所得到的關於特定染色體的相關數據。本領域具有通常知識者能 夠理解的是，可以採用相同的測序條件和數學運算方法，分別獲得特定染色體的相關參數，以及正常細胞的相關參數。這裏，可以將正常細胞的相關參數作為對照參數。另外，本文中所使用的術語「預定的」，應做廣義理解，可以是預先通過實驗確定的，也可以是在進行生物樣本分析時，採用平行實驗獲得的。這裏所使用的術語「平行實驗」應作廣義理解，既可以指的是同時進行未知樣品和已知樣品的測序和分析，也可以是先後進行在相同條件下的測序和分析。根據本發明的實施例，當採用數值M與數值L的比值M/L作為第一參數時，可以採用下列方法確定對照參數值：首先，對參照單細胞全基因組進行測序，以便獲得第二測序結果，其中，參照單細胞全基因組來自不存在染色體非整倍性的樣本；接著，對所述第二測序結果的測序數據中可比對上參考基因組的測序數據的總數目進行計數，得到數值L’。接下來，對第二測序結果中可比對到參考基因組第一染色體的測序數據的數目進行計數，得到數值M’。最後確定所述M’/L’的比值M’/L’，可以將獲得的比值M’/L’作為預定的對照參數。由此，能夠方便地確定對照參數，提高確定單細胞染色體非整倍性的效率。
為了確定第一參數與預定的對照參數之間的差異，本領域具有通常知識者可以採用任何已知的數學運算進行操作。根據本發明的實施例，發明人發現，可以首先獲得第一參數與預定的對照參數的比值，然後將該比值與預先確定的第一閾值和第二閾值來獲取關於特定染色體非整倍性的訊息。在本文中所使用的術語「第一閾值」 和「第二閾值」是分別反映額外增加一條染色體和缺少一條染色體的數值，本領域具有通常知識者可以根據已知基因組狀態的樣本進行相關系列試驗來確定這些數值，例如可以通過提取患有唐氏綜合症的胎兒的樣本，進行上述實驗，來獲取關於人類第21條染色體額外增加一條染色體狀態時的閾值，即第一閾值，同樣可以採用其他相關的病理樣品，來確定缺少一條染色體時的閾值，即第二閾值。根據本發明的一個實施例，第一閾值可以為約1.25-1.75例如可以為約1.5，第二閾值可以約為0.25-0.75例如可以為約0.5。因而，根據本發明的一個實施例，如果第一參數與預定的對照參數的比值超過第一閾值，則確定單細胞中所研究的染色體的數目為3條，即額外增加了一條染色體；如果第一參數與預定的對照參數的比值低於第二閾值，則確定單細胞中所研究的染色體的數目為1條；以及如果第一參數與預定的對照參數的比值在第一閾值和第二閾值之間，則確定單細胞中所研究的染色體的數目為2條。由此，通過設置第一閾值和第二閾值，可以快速地判斷特定的染色體的數目是否存在異常。另外，根據本發明的實施例，還可以通過對第一參數與預定的對照參數的比值或者分別對第一參數及預訂的對照參數進行數學統計檢驗，例如T-檢驗，來提高分析測序結果的準確度和精確度。本領域具有通常知識者可以理解，在進行相關的數學統計檢驗後，也可以相應地設置不同的第一閾值和第二閾值，來進行上述相似的分析。
根據本發明又一方面，本發明提出了一種用於確定單細胞染色 體非整倍性的系統1000。下面參考第2圖至第4圖，根據本發明的實施例，用於確定單細胞染色體非整倍性的系統1000包括：全基因組測序裝置100以及測序結果分析裝置200。根據本發明的實施例，全基因組測序裝置100用於對單細胞的全基因組進行測序，以便獲得第一測序結果。測序結果分析裝置200從全基因組測序裝置100接收第一測序結果。測序結果分析裝置可以執行下列操作：首先，將所獲得的第一測序結果的測序數據中可比對上參考基因組的測序數據的總數目進行計數，得到數值L；接著，對第一測序結果中可比對到參考基因組第一染色體的測序數據的數目進行計數，得到數值M；接下來，基於數值L和數值M，確定第一參數；最後，基於第一參數和預定的對照參數的差異，確定關於所述第一染色體，單細胞是否具有非整倍性。利用該用於確定單細胞染色體非整倍性的系統1000，能夠有效地實施根據本發明實施例的確定單細胞染色體非整倍性的方法，由此，能夠有效地確定單細胞染色體非整倍性。
參考第3圖，根據本發明的一個實施例，用於確定單細胞染色體非整倍性的系統1000可以進一步包括全基因組測序庫製備裝置300。根據本發明的示例，全基因組測序庫裝置300為全基因組測序裝置100提供用於測序的全基因組測序庫。參考圖4，全基因組測序庫製備裝置300可以進一步包括：單細胞分離單元301、單細胞裂解單元302、全基因組擴增單元303以及測序庫構建單元304。根據本發明的實施例，單細胞分離單元301用於從生物樣本分離單細胞。單細胞裂解單元302用於接收分離的單細胞並且裂解單細胞， 釋放單細胞的全基因組。全基因組擴增單元303與單細胞裂解單元302相連，用於接收單細胞的全基因組並且對單細胞的全基因組進行擴增。測序庫構建單元304與全基因組擴增單元303相連，用於接收經過擴增的全基因組，並且利用經過擴增的全基因組構建全基因組測序庫。由此，能夠有效地獲取單細胞的全基因組訊息，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。這裏所使用的術語「相連」應作廣義理解，既可以是直接相連，也可以是間接相連，甚至可以使用相同的容器或設備，只要能夠實現功能上的銜接即可，例如單細胞裂解單元302與全基因組擴增單元303可以在相同的設備中進行，即在實現對單細胞裂解之後，在相同的設備或者容器中即可進行全基因組擴增處理，不需要將所釋放的全基因組輸送至其他的設備或者容器，只要將設備內的條件(包括反應條件和反應體系的組成)轉換為適於進行全基因組擴增反應即可，這樣即實現了單細胞裂解單元302與全基因組擴增單元303在功能上的銜接，也可以認為被術語「相連」所涵蓋。
根據本發明的一個實施例，單細胞分離單元301包括適於執行選自下列操作的至少一種的裝置：稀釋法、口吸管分離法、顯微操作、流式細胞分離術、微流控法的至少一種。根據本發明的一個具體示例，可以採用的顯微操作為顯微切割。由此，能夠有效便捷地獲得生物樣本的單細胞，以便實施後續操作，提供確定單細胞染色體非整倍性的效率。本領域具有通常知識者可以根據採用的基因組測序技術的具體方案選擇不同的構建全基因組測序庫的方法和設 備，關於構建全基因組測序庫的細節，可以參見測序儀器的廠商例如Illumina公司所提供的規程。根據本發明的一些示例，可以用於裂解單細胞並釋放全基因組的方法不受特別限制，只要能夠將單細胞裂解較佳充分裂解，以便釋放全基因組DNA即可。根據本發明的具體示例，利用鹼性裂解液將所述單細胞裂解並釋放所述單細胞的全基因組。發明人發現，這樣能夠有效地釋放單細胞的全基因組，並且所獲得的全基因組在進行測序時，能夠提高準確率，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。由此，根據本發明的一個實施例，單細胞裂解單元302包括適於進行鹼裂解獲取全基因組的裝置(圖中未示出)。由此，能夠有效地獲取單細胞的全基因組，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。根據本發明的一個實施例，全基因組擴增單元303包括適於利用OmniPlex WGA方法對所述全基因組進行擴增的裝置。由此，能夠有效地對全基因組進行擴增，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。
根據本發明的一個實施例，全基因組測序裝置100包括選自Hiseq2000、SOLiD、454、和單分子測序裝置的至少一種。由此，能夠利用這些測序裝置的高通量、深度測序的特點，進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。當然，本領域具有通常知識者能夠理解的是，還可以採用其他的測序方法和裝置進行全基因組測序，例如第三代測序技術，以及以後可能開發出來的更先進的測序技術。根據本發明的實施例，通過全基因組測序所得到的測序數據的長度不受特別限制。
根據本發明的一個實施例，測序結果分析裝置200進一步包括序列比對單元(圖中未示出)。序列比對單元用於將第一測序結果與已知基因組序列訊息進行比對以便獲得所有可比對上參考基因組的測序數據以及獲得來自於第一染色體的測序數據。由此，能夠有效地確定來自特定染色體的測序數據，從而進一步提高了確定單細胞染色體非整倍性的效率。這裏所使用的術語「第一染色體」應做廣義理解，其可以是指任何期望研究的目的染色體，其數目並不僅限於一條染色體，甚至可以同時將全部染色體進行分析。根據本發明的實施例，第一染色體可以為人類染色中的任意染色體，例如可以為選自人類21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的至少一種。由此，能夠有效地確定常見的人類染色體疾病，例如可以預測胎兒的遺傳性疾病。因而，根據本發明的實施例的確定單細胞染色體非整倍性的方法，能夠非常有效地應用於體外生殖領域中的植入前篩查(PGS)和植入前診斷(PGD)，以及胎兒有核細胞的產前檢測等，也可以應用於通過從孕婦羊水中提取胎兒的單細胞來進行產前檢查。由此，可以通過簡單地提取單細胞來快速預測胎兒的染色體是否存在異常，避免胎兒患有嚴重的遺傳性疾病。
前面已經詳細描述了基於數值L和數值M，對染色體非整倍性進行分析，此處不再贅述。需要說明的是，根據本發明的一個實施例，測序結果分析裝置200可以進一步包括T-檢驗單元，以便對第一參數與預定的對照參數的比值或者分別對第一參數及預訂的對照參數進行T-檢驗，並且獲得所述第一染色體的T-檢驗數值。由此， 能夠進一步提高分析測序結果的準確度和精確度。
下面通過具體的實施例，對本發明進行說明，需要說明的是這些實施例僅僅是為了說明目的，而不能以任何方式解釋成對本發明的限制。
實驗材料： 採用正常男性血液(簡稱為YH血液)的單細胞作為正常對照血液單細胞。待測樣本血液單細胞為來自唐氏綜合症(具有三條人類第21條染色體)女性的血液(簡稱為T21血液)的單細胞。其他試驗材料如未特別說明，均為本領域中常規的方法配置的試劑或者市售可得的試劑。
實驗流程：
1、單細胞分離
將YH血液和T21血液樣本經離心，分離出白細胞層。將白細胞經PBS洗滌後，懸浮於PBS小滴中，用口吸管將單個白細胞分離，置於1-2μl鹼性細胞裂解液中，-20℃凍存30min以上。YH血液和T21血液各分離了3個單細胞(分別記為YHSigm-1、YHSigm-2、YHSigm-3、T21Sigm-1、T21Sigm-2、和T21Sigm-3)。
2.單細胞裂解以及全基因組擴增
置於裂解液中的單細胞進行65℃，5-15min處理，裂解單細胞。 之後選用Sigma Aldrich的GenomePlex WGA試劑盒進行單細胞全基因組擴增，具體操作可見GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit(WGA4)-Technical Bulletin(PHC 09/10-1)，通過參照並入此處。簡言之，首先，將單細胞基因組DNA隨機打斷，用於構建兩端有通用引物結合區的OmniPlex庫，之後對OmniPlex庫進行有限的PCR循環擴增，即完成單細胞全基因組擴增。
3.構建全基因組測序庫
根據Paired-End SamplePrep Guide(Part#1005063；Feb 2010)，通過參照並入此處，採用Illumina Paired-End DNA Sample Prep Kit構建插入片段約350bp的全基因組測序庫。
4.高通量測序
採用Illumina Hiseq2000測序系統進行高通量測序。將製備的全基因組測序庫經cBot製備Cluster，之後即在Hiseq2000測序儀運行，測序長度50bp。
5.數據比對到參考基因組
將測序獲得的reads數據用SOAP軟體比對到參考基因組，選用HG18為人參考基因組序列，容許2個鹼基錯配，將比對結果進行統計。表1為數據比對結果統計，每個單細胞獲得約11.7-14.6M的reads數，比對率在68%-76%範圍，唯一比對率在75%-80%，與基因組DNA測序比較，單細胞WGA的數據比對率偏低，由於 GenomePlex WGA的PCR擴增中引物的簡並序列結合的偏差而導致。由於偏差部分不能比對上參考序列，因此那些可比對的數據不會受到影響。
6.計算統計量
統計所有樣本的相對數據量，或以YH血液單細胞作為正常對照，統計T21血液單細胞與YH的相對數據量比值。以每條染色體的reads數作為數據量進行統計，表2為統計結果。然後統計所有樣本每條染色體數據量占總數據量的比率，為相對數據量，見表3。再計算T21單細胞與YH單細胞相對數據量之間的比值(Ri)，其中將3個YH單細胞數據量取平均值進行計算，表4為計算的比值結果，表4表明，三個T21單細胞樣本的21號染色體比值均接近理論值1.5，明顯高於其它常染色體，可以正確反映21三體的情況。
7.將統計量進行統計檢驗，判斷染色體是否正常
將前面獲得的相對數據量比值(R i )進行T-檢驗。簡言之，對T21Sigm-1、T21Sigm-2和T21Sigm-3每條染色體的相對數據量比值，求平均值(mean)和標準差(sd)，根據公式統計每條染色體的Z-score，表5為計算的每條染色體的Z-score值。根據正態分布理論，-3<Z-score值<3時為正常，超出這個範圍即判斷染色體異常。由於T21樣本(女性)和YH樣本(男性)性別不同，所以性染色體的比值不進行Z-score計算。結果顯示，三個T21單細胞樣本的21號染色體Z-score值均大於3，差異顯著，可以判定為21三體。
8、對3個正常對照YH單細胞YHSigm-1、YHSigm-2、YHSigm-3和T21Sigm-1的相對數據量計算平均值(mean)和標準差(sd)，再以這個模型計算待測樣本T21單細胞相對數據量的Z-score，見表6。根 據正態分布理論，-3<Z-score值<3時為正常，超出這個範圍即判斷染色體異常。對於性染色體X，本實施例中由Z-score判斷T21待測樣本比對照樣本多出一條X染色體，由於對照樣本YH為男性，因此可判斷T21待測樣本為女性。三個T21單細胞樣本的21號染色體Z-score值均明顯大於3，差異顯著，可以判定為21三體。由於T21樣本(女性)和YH樣本(男性)性別不同，所以性染色體的比值不進行Z-score計算。
在本說明書的描述中，參考術語「一個實施例」、「一些實施例」、「示意性實施例」、「示例」、「具體示例」、或「一些示例」等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含於本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。另外，需要說明的是，本領域具有通常知識者能夠理解，在本發明所提出的方案中所包含的步驟順序，本領域具有通常知識者可以進行調整，這也將包括在本發明的範圍內。
儘管已經示出和描述了本發明的實施例，本領域的普通具有通常知識者可以理解：在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的範圍由申 請專利範圍及其等同物限定。
以上所述僅為本發明之較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做之均等變化與修飾，皆應屬本發明之涵蓋範圍。
100‧‧‧全基因組測序裝置
200‧‧‧測序結果分析裝置
300‧‧‧全基因組測序庫製備裝置
301‧‧‧單細胞分離單元
302‧‧‧單細胞裂解單元
1000‧‧‧用於確定單細胞染色體非整倍性的系統
S100‧‧‧步驟
S200‧‧‧步驟
S300‧‧‧步驟
S400‧‧‧步驟
303‧‧‧全基因組擴增單元
304‧‧‧測序庫建構單元
S500‧‧‧步驟
第1圖顯示了根據本發明一個實施例的確定單細胞染色體非整倍性的流程示意圖。
第2圖顯示了根據本發明一個實施例的用於確定單細胞染色體非整倍性的系統的示意圖。
第3圖顯示了根據本發明一個實施例的用於確定單細胞染色體非整倍性的系統的示意圖。
第4圖顯示了根據本發明一個實施例的用於全基因組測序製備裝置。
S100‧‧‧步驟
S200‧‧‧步驟
S300‧‧‧步驟
S400‧‧‧步驟
S500‧‧‧步驟

Claims (15)

  1. 一種確定單細胞染色體非整倍性的方法，包含下列步驟：對一單細胞的一全基因組進行測序，以便獲得一第一測序結果，其中對該單細胞的該全基因組進行測序進一步包含：對該單細胞的該全基因組進行擴增得到經過一擴增的全基因組；利用該擴增的全基因組構建一全基因組測序庫；以及對該全基因組測序庫進行測序，以便獲得複數個測序數據，該等測序數據構成所述第一測序結果；對該第一測序結果中可比對上一參考基因組的測序數據的總數目進行計數，得到一數值L；對該第一測序結果中可比對到一參考基因組中一第一染色體的測序數據的數目進行計數，得到一數值M；基於該數值L和該數值M的比值，確定一第一參數；對一參照單細胞全基因組進行測序，以便獲得一第二測序結果，其中，該參照單細胞全基因組來自不存在染色體非整倍性的樣本；對該第二測序結果的測序數據中可比對上參考基因組的測序數據的總數目進行計數，得到一數值L’；對該第二測序結果中可比對到參考基因組第一染色體的測序數據的數目進行計數，得到一數值M’；基於該數值L’與該數值M’的比值，確定一對照參數；以及 對該第一參數與該預定的對照參數的比值進行T-檢驗，以獲得該第一染色體的一T-檢驗數值，並基於該T-檢驗數值確定關於該第一染色體，該單細胞是否具有非整倍性。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之確定單細胞染色體非整倍性的方法，其中進一步包含從一生物樣本分離該單細胞的步驟。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之確定單細胞染色體非整倍性的方法，其中該生物樣本為選自血液、尿液、唾液、組織、生殖細胞、卵裂球和胚胎的至少一種。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之確定單細胞染色體非整倍性的方法，其中從該生物樣本分離該單細胞是通過選自稀釋法、口吸管分離法、顯微操作、流式細胞分離術和微流控法的至少一種進行的。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之確定單細胞染色體非整倍性的方法，其中進一步包含對該單細胞進行裂解，以便釋放該單細胞的全基因組的步驟。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之確定單細胞染色體非整倍性的方法，其中利用鹼性裂解液對該單細胞進行裂解，以便釋放該單細胞的全基因組。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之確定單細胞染色體非整倍性的方法，其中利用一基於PCR的全基因組擴增方法對該全基因組進行擴增。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之確定單細胞染色體非整倍性的方法，其中該第一染色體為選自人類21號染色體、18號染色體、13號染色體、X染色體和Y染色體的至少一種。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之確定單細胞染色體非整倍性的方法，其中，如果該第一參數與該預定的對照參數的比值超過一第一閾值，則確定該單細胞中該第一染色體的數目為3條；如果該第一參數與該預定的對照參數的比值低於一第二閾值，則確定該單細胞中該第一染色體的數目為1條；以及如果該第一參數與該預定的對照參數的比值在該第一閾值和該第二閾值之間，則確定該單細胞中該第一染色體的數目為2條。
  10. 一種用於確定單細胞染色體非整倍性的系統，包含：一全基因組測序裝置，該全基因組測序裝置用於對一單細胞的一全基因組進行測序，以便獲得一第一測序結果，以及對一參照單細胞全基因組進行測序，以便獲得一第二測序結果，其中，該參照單細胞全基因組來自不存在染色體非整倍性的樣本；以及一測序結果分析裝置，該測序結果分析裝置與該全基因組測序裝置相連，並且從該全基因組測序裝置接收該第一測序結果以及該 第二測序結果，以便執行下列操作：對該第一測序結果的測序數據中可比對上參考基因組的測序數據的總數目進行計數，得到一數值L；對該第一測序結果中可比對到參考基因組第一染色體的測序數據的數目進行計數，得到一數值M；基於該數值L和該數值M，確定一第一參數；對該第二測序結果的測序數據中可比對上參考基因組的測序數據的總數目進行計數，得到一數值L’；對該第二測序結果中可比對到參考基因組第一染色體的測序數據的數目進行計數，得到一數值M’；基於該數值L’與該數值M’的比值，確定一對照參數；以及對該第一參數與該預定的對照參數的比值進行T-檢驗，以獲得該第一染色體的一T-檢驗數值，基於該T-檢驗數值確定關於該第一染色體，該單細胞是否具有非整倍性。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之用於確定單細胞染色體非整倍性的系統，其中，進一步包含一全基因組測序庫製備裝置，該全基因組測序庫裝置為該全基因組測序裝置提供用於測序的全基因組測序庫，其中，該全基因組測序庫製備裝置進一步包含：一單細胞分離單元，該單細胞分離單元用於從一生物樣本分離該單細胞；一單細胞裂解單元，該單細胞裂解單元用於接收分離的單細胞並 且裂解該單細胞，以便釋放該單細胞的該全基因組；一全基因組擴增單元，該全基因組擴增單元與該單細胞裂解單元相連，用於接收該單細胞的該全基因組並且對該單細胞的該全基因組進行擴增；以及一測序庫構建單元，該測序庫構建單元用於接收該經過擴增的全基因組，並且利用該經過擴增的全基因組構建該全基因組測序庫。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之確定單細胞染色體非整倍性的系統，其中該單細胞裂解單元包含適於進行單細胞鹼裂解的裝置。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之確定單細胞染色體非整倍性的系統，其中該全基因組擴增單元包含適於利用一基於PCR的全基因組擴增方法對該全基因組進行擴增的裝置。
  14. 如申請專利範圍第10項所述之確定單細胞染色體非整倍性的系統，其中，該測序結果分析裝置進一步包含一序列比對單元，該序列比對單元用於將該第一測序結果與已知基因組序列訊息進行比對以便獲得所有可比對上參考基因組的測序數據及獲得該來自於第一染色體的測序數據。
  15. 如申請專利範圍第10項所述之確定單細胞染色體非整倍性的系統，其中，該測序結果分析裝置進一步包含一T-檢驗單元，以便對該第一參數與該預定的對照參數的比值進行一T-檢驗，並且獲得該 第一染色體的該T-檢驗數值。
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