CN104450922A

CN104450922A - 一种利用染色体特异位点在单细胞扩增基础上进行染色体非整倍体检测的方法

Info

Publication number: CN104450922A
Application number: CN201410770910.8A
Authority: CN
Inventors: 梁波; 孔令印; 冒艳; 宣黎明; 申静静; 祝轶君
Original assignee: Sai Health Research Centre (taicang) Ltd
Current assignee: Suzhou Bei Kang Medical Devices Co., Ltd.
Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2014-12-15
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明涉及一种利用染色体特异位点在单细胞扩增基础上进行染色体非整倍体检测的方法，包括以下步骤：a)初筛待检测染色体的特异位点；b)选取健康人群的单细胞样本；c)利用全基因组随机引物对单细胞样本进行等温置换扩增；d)将单细胞扩增后的样本进行文库构建并进行高通量测序；e)对测序结果进行比对分析，统计不同人同一特异位点上获得的数据量，筛选数据量比较均一的特异位点；f)利用筛选出的特异位点对待测样本进行染色体非整倍体检测。本发明克服了现有检测技术针对整个基因组的所有染色体进行高通量测序需要测量大量无关数据的缺陷，可显著的提高检测的通量，从而降低检测成本，快速简便，有助于染色体非整倍体检测的大规模推广。

Description

一种利用染色体特异位点在单细胞扩增基础上进行染色体非整倍体检测的方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地说，涉及一种利用染色体特异位点在单细胞扩增基础上进行染色体非整倍体检测的方法。

背景技术

不孕不育是遍及全球的生殖健康问题，近年来不孕症患者呈逐年增长趋势。1995年世界卫生组织人类生殖特别规划署的统计显示，全球不孕夫妇已达6000-8000万对，中国不孕夫妇约1200-1500万对，占育龄人群中的15-20％。辅助生殖技术已成为目前治疗不孕不育的主要手段。

然而，根据国际权威统计，试管婴儿手术的平均成功率只有30％左右，如何提高试管婴儿的成功率是当前急需解决的难题。而通过研究发现，试管婴儿失败绝大部分归因于植入胚胎本身的问题。现代社会，随着工作压力的不断增加，越来越多的女性推迟生育年龄，在不孕症夫妇中，高龄妇女占20％-30％，经辅助生殖治疗后成功率只有20％左右，而年轻的妇女成功率可达40％-50％。主要原因在于随着年龄的增加卵母细胞的质量明显下降，卵母细胞非整倍体率明显增加。由于植入的成功率低，很多妇女要承受反复着床失败的痛苦。

为了提高试管婴儿的成功率，临床上针对一些高龄、反复种植失败、习惯性流产的人群进行胚胎植入前的检测，在胚胎植入母体之前，对其遗传物质进行分析，选择遗传背景正常的胚胎植入，提高妊娠成功率，避免缺陷患儿的出生，减轻家庭和社会的经济负担。

目前临床上常用的胚胎植入前检测技术是荧光原位杂交(FISH)、比较基因组杂交(CGH)。然而这两种技术都存在一定的局限，FISH技术目前存在的问题在于无法一次性检测所有染色体，操作繁琐，分辨率低；CGH的缺点在于只能检测已知的染色体异常，并且费用昂贵。近年来，随着二代测序技术的发展，很多研究机构开始将二代测序技术应用于胚胎植入前的检测，经验证，其准确度和检测通量方面均优于传统技术。目前通过二代测序进行胚胎植入前检测的常规操作，首先是要分离胚胎的少量细胞，对这些细胞进行全基因组扩增，构建测序文库进行测序。操作步骤较多，耗时较长，易出现操作错误，而且要经过多次扩增，其引入的一些扩增偏好性和扩增错误也可能导致检测结果不准确。因此临床上需要开发一种更简单快速且成本低廉的检测技术。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种非治疗目的的利用染色体特异位点在单细胞扩增基础上进行染色体非整倍体检测的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种非治疗目的的利用染色体特异位点在单细胞扩增基础上进行染色体非整倍体检测的方法，包括以下步骤：

a)根据已经公布的人类基因组序列，从待检测的染色体上筛选得到初筛特异位点；

b)选取健康人群的单细胞样本；

c)利用全基因组随机引物对所述的单细胞样本进行等温置换扩增；

d)根据初筛特异位点设计引物，将单细胞扩增后的样本利用所述的引物进行文库构建并进行高通量测序；

e)对测序结果进行比对分析，统计不同人同一特异位点上获得的数据量，选择出数据量比较均一的特异位点，得到复筛特异位点；

f)对待测样本进行染色体非整倍体检测：对待测样本的单细胞进行等温置换扩增；将单细胞扩增后的样本利用复筛特异位点的引物进行文库构建并进行高通量测序；根据不同染色体上各位点的reads数差异判断待测样本的染色体非整倍性。

步骤a)中，所述的初筛特异位点符合以下标准：

a)序列长度的范围为150-200bp；

b)GC含量在45％～55％之间；

c)序列中不包含字符“N”；

d)与单核苷酸多态性位点库进行比较，序列中不存在任何单核苷酸多态性位点；

e)与基因组变异数据库中拷贝数变异信息进行比较，所述的初筛特异位点不能包含在任何已知的拷贝数变异中；

f)两初筛特异位点片段间不能有超过10bp的同源序列，且Tm值相差在4度以内。

步骤b)中，所述的单细胞样本是口腔上皮细胞的单细胞样本。

步骤b)中，所述的单细胞样本的数目大于或等于100个。

所述的复筛特异位点在所有单细胞样本中的标准方差≤20。

步骤f)中，统计不同染色体上各复筛特异位点的reads数时，通过值平滑算法对每个复筛特异位点的片段数量进行标准化，最后根据如下公式计算待测样本的其中一条待测染色体值：

Z_{j} = \frac{p_{j} - p_{0}}{\sqrt{\frac{p_{0} (1 - p_{0})}{n_{j}}}}

其中，p_j：其中一条待测染色体上复筛特异位点的标准化后的平均片段数量除以所有待测染色体上复筛特异位点总和的标准化后的平均片段数量；

p₀：一个测序泳道中所有样本p_j的中值；

n_j：各条待测染色体上复筛特异位点平均片段数量的总和；

Z_j：样本j的其中一条待测染色体值。

所述的平均片段数量是按照20％切尾均值方法计算，即去除掉10％的最低值以及10％的最高值。

所述的非治疗目的是指并不是以有生命的人体或者动物体为直接实施对象，进行识别、确定或消除病因或病灶的过程。本发明的方法可用于非治疗目的，例如用于检测非受精卵中的非整倍体发生情况。

本发明优点在于：

本发明提供了染色体特异位点筛选流程及利用这些特异位点进行染色体非整倍体检测的方法，由于可测定特定染色体上的特异位点，克服了现有检测技术针对整个基因组的所有染色体进行高通量测序需要测量大量无关数据的缺陷，可显著的提高检测的通量，从而降低检测成本。如目前利用Life公司的Ion proton测序仪，一个泳道最多能够分析14个样品，而利用本发明的方法一个泳道可以运行80-100个样品，显著提高了检测的通量，降低了胚胎植入前检测成本。本发明的方法有助于染色体非整倍体检测的大规模推广。

附图说明

图1为本发明中各位点在100个样本中的标准方差(SD)的分布情况。

图2为本发明实施例2利用特异性位点进行染色体非整倍体检测流程图。

图3A、图3B、图3C、图3D为本发明实施例2检测阳性样本分析结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明的利用染色体特异位点在单细胞扩增基础上进行染色体非整倍体检测的方法，其流程为：

步骤一，染色体特异位点的初步筛选：根据已经公布的人类基因组序列，从待检测的染色体上筛选出2000-3000个特异位点。所述初筛位点序列满足以下条件：

(1)序列长度的取值范围150-200bp；

(2)GC含量在45％～55％之间；

(3)序列中不包含字符“N”；

(4)与单核苷酸多态性位点库进行比较，序列中不存在任何单核苷酸多态性位点；

(5)与基因组变异数据库中拷贝数变异信息进行比较，位点不能包含在任何已知的拷贝数变异中；

(6)位点片段之间在Tm值以及互补方面具有较大的兼容性，即两位点片段间不能有超过10bp的同源序列，片段间的Tm值相差在4度以内。

步骤二，选取100名健康人群的口腔上皮细胞的单细胞样本。

步骤三，单细胞扩增：

1.设计全基因组扩增随机引物，采用6碱基随机引物；

2.对单细胞样本进行等温置换扩增，6碱基随机引物在多位点和模板结合，利用phi29DNA聚合酶实现在恒温环境下的全基因组扩增，可提高扩增效率，减少扩增偏好性。

步骤四，目标区域引物设计：

1.根据不同染色体上筛选出的位点设计引物，引物设计利用life公司的在线设计软件“Ion Ampliseq Designer”；

2.将单细胞扩增后的口腔上皮细胞样本利用设计好的引物进行Ampliseq文库构建并进行高通量测序。

步骤五，位点筛选：测序结果进行比对分析，统计不同人同一位点上获得的数据量，选择出数据量比较均一的位点。

步骤六，染色体非整倍体检测：

1.对待测样本进行等温置换扩增8个循环；

2.针对最终选择的数据量比较均一的位点设计Ampliseq引物；

3.进行Ampliseq文库构建并进行高通量测序；

4.根据不同染色体上各位点的reads数差异判断染色体非整倍性。

实施例1 染色体特异位点筛选

1.合成引物：

根据初步筛选结果，从21、18、13号染色体上共选择了5224个位点进行引物设计，引物设计利用life公司的在线设计软件“Ion Ampliseq Designer”。

2.选取100名志愿者，提取口腔上皮细胞，在体视镜下用PBS缓冲液清洗3遍，用口吸管分离单个细胞置于0.2mL PCR管中，置于冰上。

3.裂解细胞及单细胞扩增：

在含有单细胞的PCR管中加入细胞裂解液5μL，65℃加热8-12min，裂解细胞，释放染色体DNA，然后进行单细胞扩增，30℃反应3小时，反应体系如下(其中随机引物由苏州金唯智生物技术有限公司合成，随机引物即由4个碱基随机组合，是4⁶条引物的混合溶液)：

组分	反应体积
		DNA样本	5μL
随机引物混合物	5μL
		聚合酶buffer	3μL
phi29DNA聚合酶	1μL
		水	16μL

4.文库构建和上机测序：

使用合成的5224对Ampliseq引物，根据常规的Ampliseq文库构建流程对100个样本进行文库构建，质检合格后，采用Ion Proton测序系统进行测序。

5.数据分析和位点筛选：

(1)对100个样本的测序原始数据进行比对，并对比对后的数据进行均一化分析；

(2)统计100个样本数据在5224个位点得到的测序序列分布情况；

(3)计算每个位点在100个样本中的标准方差(SD)的分布情况，结果如下图1所示；

(4)最终统计标准方差≤20的位点作为后续实验所需的标准位点。

实施例2 利用筛选出的染色体特异位点进行胚胎非整倍体的检测

利用实施例1筛选出的染色体特异位点进行胚胎非整倍体的检测，包括以下步骤(流程参见图2)：

1.合成引物：

根据筛选出结果，从21、18、13号染色体上选择了4125个位点进行引物设计，引物设计利用life公司的在线设计软件“Ion Ampliseq Designer”。

2.分离囊胚滋养外胚层细胞：

选择试管婴儿中的高危人群(年龄≥35，反复种植失败，反复流产)的体外受精胚胎共26份，采用常规胚胎活检方法获取囊胚滋养外胚层细胞。在胚胎发育到D3阶段时用激光进行透明带打孔，继续培养至D5阶段，此时滋养外胚层细胞挤出透明带，用平口显微操作针吸取部分滋养外胚层细胞(5-10个)，用激光切断。吸取的细胞转移至PBS溶液中洗涤3遍。

3.裂解细胞及单细胞扩增：

洗涤好的细胞转移至0.2mL的PCR管，加入细胞裂解液5μL，65℃加热8-12min，裂解细胞，释放染色体DNA，然后进行单细胞扩增，30℃反应3小时，反应体系如下：

4.文库构建和上机测序：

使用合成的4125对Ampliseq引物，根据常规的Ampliseq文库构建流程对这些特异性位点进行文库构建，质检合格后，采用Ion Proton测序系统进行测序。

5.数据分析：

将获得的测序结果与选择的位点进行匹配分析，分别统计21、18、13号染色体上每个位点片段数量，对每个染色体的所有位点数量求平均值。

数据分析过程主要包含低质量测序结果的过滤；根据样品条形码进行样品分类；统计每个片段的数量；通过值平滑(Median Polish)算法对每个位点的片段数量进行标准化。

最后根据如下公式计算每个样品的值，区分染色体三体患者。

Z_{j} = \frac{p_{j} - p_{0}}{\sqrt{\frac{p_{0} (1 - p_{0})}{n_{j}}}}

其中，p_j：21号染色体(或13、18号染色体)上位点的标准化后的平均片段数量除以21号、13号以及18号染色体上位点总和的标准化后的平均片段数量。平均片段数量是按照20％切尾均值方法计算，即去除掉10％的最低值以及10％的最高值；

p₀：一个测序泳道中所有样品p_j的中值；

n_j：21号、13号以及18号染色体上位点平均片段数量的总和；

Z_j：样本j的21号(或13号、18号)染色体值。

结果显示，26份胚胎样本中检测出4份存在21号染色体数目异常，1份存在18号染色体数目异常(参考图3A、图3B、图3C、图3D)。每个样本中正常染色体的读数十分接近。

实施例3 利用筛选出的染色体特异位点进行未受精卵非整倍体的检测

采用0.1％Tween20/0.01mol/L HCl制备人未受精卵间期核，研究该间期核制备方法与13、18、21号染色体非整倍体发生率之间的关系。按照实施例2的方法，未受精卵间期核制备完成后，裂解细胞，进行单细胞扩增，再使用Ampliseq引物进行文库构建，质检合格后，采用Ion Proton测序系统进行测序，对获得的测序结果进行数据分析。结果为：36个未受精卵中，正常13号单体24枚、二体7枚、三体5枚；正常18号单体27枚、二体4枚、三体5枚；正常21号单体29枚、二体6枚、三体1枚。

同时设计合成人类13、18、21号染色体端粒探针，进行荧光原位杂交，以对上述未受精卵染色体的倍数进行验证。检测结果与本发明方法一致，表明本发明方法的准确性为100％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种非治疗目的的利用染色体特异位点在单细胞扩增基础上进行染色体非整倍体检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

b)选取健康人群的单细胞样本；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的初筛特异位点符合以下标准：

a)序列长度的范围为150-200bp；

b)GC含量在45％～55％之间；

c)序列中不包含字符“N”；

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)中，所述的单细胞样本是口腔上皮细胞的单细胞样本。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)中，所述的单细胞样本的数目大于或等于100个。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的复筛特异位点在所有单细胞样本中的标准方差≤20。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤f)中，统计不同染色体上各复筛特异位点的reads数时，通过值平滑算法对每个复筛特异位点的片段数量进行标准化，最后根据如下公式计算待测样本的其中一条待测染色体值：

Z_{j} = \frac{p_{j} - p_{0}}{\sqrt{\frac{p_{0} (1 - p_{0})}{n_{j}}}}

p₀：一个测序泳道中所有样本p_j的中值；

n_j：各条待测染色体上复筛特异位点平均片段数量的总和；

Z_j：样本j的其中一条待测染色体值。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的平均片段数量是按照20％切尾均值方法计算，即去除掉10％的最低值以及10％的最高值。