CN102925580A - Notch1基因突变的快速检测方法 - Google Patents
Notch1基因突变的快速检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102925580A CN102925580A CN2012104616583A CN201210461658A CN102925580A CN 102925580 A CN102925580 A CN 102925580A CN 2012104616583 A CN2012104616583 A CN 2012104616583A CN 201210461658 A CN201210461658 A CN 201210461658A CN 102925580 A CN102925580 A CN 102925580A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- wild
- mutant
- notch1
- type
- template
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 101150079595 Notch1 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 6
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 title claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 102000001759 Notch1 Receptor Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108010029755 Notch1 Receptor Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 39
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 17
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 claims description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 claims description 7
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 3
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 claims description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 3
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 claims description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 28
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 5
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 108700037638 Neurogenic locus notch homolog protein 1 Proteins 0.000 description 8
- 102100023181 Neurogenic locus notch homolog protein 1 Human genes 0.000 description 7
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 description 7
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010027344 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000018720 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 101150030367 cls gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
本发明提供了一种Notch1基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤：在NOTCH1基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；分别设计了NOTCH1的NOTCH1-6的野生型引物和突变型，引物分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；不同比例混合这两种片段，用HRM方法进行区分；与其它方法相比，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。
背景技术：
Notch基因最早发现于果蝇，其在哺乳动物中的同系基因编码单次跨膜的受体蛋白，分子量约300KD；而Notch信息途径除该受体外，尚有DSL/Jagged配体蛋白、以及具DNA结合活性的辅助因子CSL等成分（4）。当配体分子和相邻细胞膜上的Notch分子结合后，Notch被蛋白酶降解，释放出具有核定位信号的胞质区ICN（Intracellular domain of Notch），进入细胞核与CLS结合而调节基因表达；该过程可概括如下：配体→Notch→酶切→ICN→进入细胞核→形成CLS-ICN复合体→促进基因转录。Notch信号的靶基因多为碱性螺旋-环-螺旋类转录因子（basic helix-loop-helix，bHLH），它们又调节其它与细胞分化直接相关的基因的转录。Notch信息途径广泛存在于多种动物体内，在进化过程中高度保守，主要介导细胞的分化抑制信号,在胚胎发育、血细胞发育、肿瘤形成等生理病理过程中起重要作用。
人类具有的4个Notch基因产物中（Notch1-4）的Notch-1，在肿瘤发生过程中（如乳腺癌、胃癌、白血病等）的作用已为研究工作所证实。此外，Notch-1还与肿瘤耐药密切相关。Notch-1广泛表达于多种肿瘤细胞,通过促进上皮间质转换（epithelial-mesenchymal transition,EMT)、肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)表型的发生和调节微小RNA（microRNAs,miRNA）等途径,导致肿瘤对多种化疗药物产生抗药性。因此,Notch-1是对抗肿瘤耐药的潜在靶点,特异性抑制肿瘤细胞Notch-1活性，联合化疗药物的应用有望成为有效的肿瘤治疗策略。
更进一步地，Notch-1基因突变也与肿瘤发生相关，如约11％的慢性淋巴细胞性白血病（CLL）患者含有Notch-1基因突变；而在超过50％的T细胞性-急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者体内的Notch-1基因发生突变。
高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸:它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR与专门的分析算法。使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)。
SYBRTM Green I对PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应扩增有毒性，因此必需使用低浓度的染料，又因为它是非饱和态结合，染料在熔解过程中可重新结合，使其无法适用于HRM。
罗氏开发了一种新的适用于HRM的染料ResoLight或LC Green，它有三个优点：饱和染料毒性低；高浓度可以使DNA达到饱和；降低了染料位置重组的可能。
而PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应产物的高分辨率熔解曲线HRM的要求包括:
仪器:高分辨率高均一性的仪器，确保结果差异仅受DNA模板的影响
试剂:稳定可靠的PCR与HRM染料，确保获取高分辨率熔解曲线
软件:高分辨率熔解曲线分析专用软件
罗氏荧光定量PCR系统LightCycler Nano System具有光源好、温控好、检测好、加热快的优点，完全能满足检测的要求，这台仪器也于近期通过了国家药监局的审批，适用于临床诊断检测。
LightCycler Nano System是LightCycler 480System的缩小版，
480在HRM领域发表的文献是当前发表文献最多的实时定量PCR系统：应用领域包括人类疾病、植物、微生物、病毒、药理、毒理、生理、诊断等；影响因子10分以上5篇，包括Nature,Nature Methods,NatureGenetics，影响因子5－10分10篇，5分以上文章占总数的18％逐年上升趋势明显，已经成为当前qPCR扩展应用的热点目前常常使用测序法来检测是否存在突变，但是总结下来，现有的测序法有三个缺点：
第一：灵敏度不高，低比例突变（＜20%）无法检测；
第二：耗时长，一般需要2-3天；
第三：成本高。
鉴于以上的问题，一种灵敏度高、耗时短、成本低、可操作性能更高的实NOTCH1基因突变的快速检测方法的发明是势在必行的。
发明内容：
本发明要解决的技术问题主要是：现有的测序法有三个缺点：
第一：灵敏度不高，低比例突变（＜20%）无法检测；
第二：耗时长，一般需要2-3天；
第三：成本高。
为了解决以上问题，本发明提供了一种Notch1基因突变的快速检测方法，本发明技术在突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物，两者分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型(Tm的不同)：PCR产物的Tm取决于GC含量.
高Tm G∶C>A∶T>G∶G>G∶T=G∶A＞T:T=A∶A>T:C>A∶C>C∶C低Tm
将纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线分析，得到相似峰形的熔解曲线；当然，包括野生型纯合子或突变纯合子。
将杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线分析，得到不同峰形的熔解曲线.
本发明分别设计了NOTCH1的NOTCH1-6的野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/100，最后用HRM方法进行区分。
本发明提供了一种NOTCH1基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤：
在NOTCH1基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；
分别设计了NOTCH1的NOTCH1-6的野生型引物和突变型，引物分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；
不同比例混合这两种片段，用HRM方法进行区分。
所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量。
所述纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线.
所述不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/100最后用HRM方法进行区分。
所述的一种NOTCH1基因突变的快速检测方法，其包括如下步骤：
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；DNA提取：取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；
qPCR-HRM检测，包括：对照孔的设立和检测重复孔；10μL反应体系构成；在八连管中依照次序加入各试剂，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。
所述qPCR-HRM检测的程序包括：95℃变性10分钟；95℃变性10秒钟；退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；72℃延伸30秒钟；重复第2步到第四步45个循环;95℃变性60秒钟；40℃
变性60秒钟；设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s）。所述NOTCH1-6_L1601P突变型目的片段的获取：突变型目的片段的获取分为两步，第一步利用带有突变位点的突变引物（NOT1F,NOT6MR；和NOT6MF,NOT1R两对引物）获得突变位点前后两段突变片段；第二步将这两段突变片段连接起来，构成NOTCH1-6_L1601P突变型目的片段。
所述NOTCH1-6_L1601P突变型目的片段的获取包括：
突变第一步PCR：以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以NOT1F,NOT6MR；以及NOT6MF,NOT1R两对引物进行两组实验，获得两个条带单一的片段；突变第一步产物稀释：将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL；
突变第二步PCR：以稀释后的第一步两段产物为模板，以NOT1F+NOT1R为引物进行第二步PCR，获得条带单一的片段；
突变第二步产物稀释：将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL。
所述M/W＝1/100阳性对照模板的获取包括：混合99μL野生型模板和1μL突变型模板，配制100μL突变型/野生型（M/W)=1％的混合模板，作为检测用1％阳性对照模板。
所述NOTCH1-6_L1601野生型目的片段的获取：以已知未突变基因组为模板、NOT1F+NOT1R为引物进行实验，获得条带单一的特异性NOTCH1-6_L1601野生型目的片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL，作为检测野生型阴性对照模板用。
本发明的有益效果是：本发明分别设计了NOTCH1的NOTCH1-6野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/100，最后用HRM方法进行区分，采用了高分辨率熔解曲线法（HRM法）；与其它方法相比，本发明的HRM法能检出0.1％的突变、检测时间只需要1小时、每样品试剂耗材成本<￥7.00，即，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。
附图说明：
图1为本发明NOTCH1基因HRM检测分析结果示意图。
具体实施方式：
本发明应用于生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。
如图1所示，设计一对引物将包括待突变位点在内的基因序列扩增出来作为野生型模板（wt）；再设计引物在将待突变位点改变成所需碱基的同时，将上述DNA片段在待突变分为两段，且在待突变位点附近有少量重复序列；最后利用部分重复的两个DNA片段混合起来作为模板，而利用最开始的那对引物将两个小片段连接起来，其产物尽管与wt大小完全相同，但却含有所期望的突变点。
下面以Cat-F和Cat-R为例，说明具体的操作。
1样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存。
2DNA提取：取200μL抗凝血用QIAmp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取DNA。采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测。
3、qPCR-HRM检测的体系
1)对照的设立和检测重复孔
每个样本的检测必须同时设有对照实验，包括野生型阴性对照和m/w(突变/野生=1％)阳性对照。对照和样本均采用复孔。
2）10μL反应体系构成（引物序列见附表）如下(以4管反应为例)：
A先按下表配制MasterMix,混匀后短暂离心，然后吸取4.5μL加至每管8联管中，计4管：
| MasterMix组成： | (1x) | (5x) |
| 25mMMgCl2 | 1.2μl | 6μl |
| 2μM NOT1F primer | 1μl | 5μl |
| 2μM NOT1R primer | 1μl | 5μl |
| H2O | 1.3μl | 6.5μl |
| Σ= | 4.5μl | 22.5μl |
B向每管中加入0.5μL（约5-10ng）模板DNA。
C向每管中加入5μL 2x HRM荧光Master（罗氏Cat#04 909 631 001）；Σ=10μL。
3）混合均匀，盖上8联管盖。
4）将8联管置于LightCycler Nano仪器中，注意仪器中A组与D组平衡，合上仪器盖子。
4、qPCR-HRM检测的程序：
1)95℃变性10分钟；
2)95℃变性10秒钟；
3)退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；
4)72℃延伸30秒钟；
5)重复第2步到第四步45个循环;
6)95℃变性60秒钟；
7)40℃变性60秒钟；
8)设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s）。
5、结果分析：
1)设置好样本名称、检测靶点和所使用的荧光染料。
2)通过各孔的熔解曲线图可以查看各孔PCR条带特异性；以野生型样品孔为基线，通过高分辨率熔解曲线，可以查看阳性对照孔与样本孔图谱。
3)结果判定
在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。
4)获取结果图。
6、NOTCH1-6_L1601野生型目的片段的获取：
以已知未突变基因组为模板、NOT1F+NOT1R为引物进行实验，参照步骤2及步骤3的反应体系及程序，获得条带单一的特异性NOTCH1-6_L1601野生型目的片段。
将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL，作为检测野生型阴性对照模板用。
7、NOTCH1-6_L1601P突变型目的片段的获取
突变型目的片段的获取分为两步，第一步利用带有突变位点的突变引物（NOT1F,NOT6MR；和NOT6MF,NOT1R两对引物）获得突变位点前后两段突变片段；第二步将这两段突变片段连接起来，构成NOTCH1-6_L1601P突变型目的片段。
突变第一步PCR
以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以NOT1F,NOT6MR；以及NOT6MF,NOT1R两对引物进行两组实验，实验体系及程序参照步骤2及步骤3，获得两个条带单一的片段。
突变第一步产物稀释
将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL。
突变第二步PCR
以稀释后的第一步两段产物为模板，以NOT1F+NOT1R为引物进行第二步PCR，实验体系及程序参照步骤2及步骤3，获得条带单一的片段。
突变第二步产物稀释
将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL。
M/W＝1％阳性对照模板的获取
混合99μL野生型模板和1μL突变型模板，配制100μL突变型/野生型（M/W)=1％的混合模板，作为检测用1％阳性对照模板。
8、结果分析
通过HRM方法，我们能区分含1/100突变型的模板，证明了这个方法的高特异性和高灵敏度，而且，整个操作时间只需要1小时。
附表：NOTCH1-6_L1601P_4802T＞C HRM检测引物序列：
| 引物名称 | 引物序列（5’-3’） |
| NOT1F | GAGCATGTACCCGAGAGGC |
| NOT1R | GAAGATCATCTGCTGGCCGT |
| NOT6MF | ACGTGGTCTCCAAGCGTGAC |
| NOT6MR | GTCACGCTTGGAGACCACGT |
与其它方法相比，本发明技术具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低！
上述优选实施例的描述使本领域的技术人员能制造或使用本发明。这些实施例的各种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的，这里定义的一般原理可以被应用于其它实施例中而不背离本发明的精神或范围。因此，本发明并不限于这里示出的实施例，而要符合与这里揭示的原理和新颖特征一致的最宽泛的范围。
Claims (10)
1.一种NOTCH1基因突变的快速检测方法，其特征在于，其包括如下实现步骤：
在NOTCH1基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；
分别设计了NOTCH1的NOTCH1-6的野生型引物和突变型，引物分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；
不同比例混合这两种片段，用HRM方法进行区分。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/100最后用HRM方法进行区分。
5.根据权利要求1所述的一种NOTCH1基因突变的快速检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存； DNA提取：取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；
qPCR-HRM检测，包括：对照孔的设立和检测重复孔；10μL反应体系构成；在八连管中依照次序加入各试剂，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述qPCR-HRM检测的程序包括：95℃变性10分钟；95℃变性10秒钟；退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；72℃延伸30秒钟；重复第2步到第四步45个循环;95℃变性60秒钟；40℃
变性60秒钟；设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s）。
7.根据权利要求1或5任一所述的方法，其特征在于:所述NOTCH1-6_L1601P突变型目的片段的获取：突变型目的片段的获取分为两步，第一步利用带有突变位点的突变引物（NOT1F,NOT6MR；和NOT6MF,NOT1R两对引物）获得突变位点前后两段突变片段；第二步将这两段突变片段连接起来，构成NOTCH1-6_L1601P突变型目的片段。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述NOTCH1-6_L1601P突变型目的片段的获取包括：
突变第一步PCR：以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以NOT1F,NOT6MR；以及NOT6MF,NOT1R两对引物进行两组实验，获得两个条带单一的片段；
突变第一步产物稀释：将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL；
突变第二步PCR：以稀释后的第一步两段产物为模板，以NOT1F+NOT1R为引物进行第二步PCR，获得条带单一的片段；
突变第二步产物稀释：将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL。
9.根据权利要求4-8任一所述的方法，其特征在于：所述M/W＝1/100阳性对照模板的获取包括：混合99μL野生型模板和1μL突变型模板，配制100μL突变型/野生型（M/W)=1％的混合模板，作为检测用1％阳性对照模板。
10.根据权利要求1或5任一所述的方法，其特征在于：所述NOTCH1-6_L1601野生型目的片段的获取：以已知未突变基因组为模板、NOT1F+NOT1R为引物进行实验，获得条带单一的特异性NOTCH1-6_L1601野生型目的片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度约为10-20ng/μL，作为检测野生型阴性对照模板用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210461658.3A CN102925580B (zh) | 2012-11-16 | 2012-11-16 | Notch1基因突变的快速检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210461658.3A CN102925580B (zh) | 2012-11-16 | 2012-11-16 | Notch1基因突变的快速检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102925580A true CN102925580A (zh) | 2013-02-13 |
| CN102925580B CN102925580B (zh) | 2014-12-17 |
Family
ID=47640503
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210461658.3A Expired - Fee Related CN102925580B (zh) | 2012-11-16 | 2012-11-16 | Notch1基因突变的快速检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102925580B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103409429A (zh) * | 2013-07-29 | 2013-11-27 | 新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心 | 一种克隆绵羊Notch1基因胞内结构域NICD的方法 |
| CN104498611A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-04-08 | 西北农林科技大学 | 检测黄牛 Notch1 基因 SNP 位点的 RFLP 方法及试剂盒 |
| CN106755425A (zh) * | 2016-12-26 | 2017-05-31 | 国风 | 一种慢性淋巴细胞白血病患者notch1基因突变检测组合物 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100821457B1 (ko) * | 2006-11-24 | 2008-04-11 | (주)아모레퍼시픽 | Ｉｄｈ３ａ 프로모터 및 루시퍼라제 함유 벡터로형질전환된 세포주, 및 그를 이용한 비만억제 후보물질검색방법 |
| CN102732633A (zh) * | 2012-07-06 | 2012-10-17 | 广州好芝生物科技有限公司 | 人idh基因突变的检测引物和试剂盒 |
-
2012
- 2012-11-16 CN CN201210461658.3A patent/CN102925580B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100821457B1 (ko) * | 2006-11-24 | 2008-04-11 | (주)아모레퍼시픽 | Ｉｄｈ３ａ 프로모터 및 루시퍼라제 함유 벡터로형질전환된 세포주, 및 그를 이용한 비만억제 후보물질검색방법 |
| CN102732633A (zh) * | 2012-07-06 | 2012-10-17 | 广州好芝生物科技有限公司 | 人idh基因突变的检测引物和试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《Nature Medicine》 20061217 Tomas Vilimas et al. Targeting the NF-B signaling pathway in Notch1-induced T-cell leukemia 70 - 77 第13卷, 第1期 * |
| 沈薇等: "高分辨率熔解曲线及其在分子诊断中的应用", 《检验医学》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103409429A (zh) * | 2013-07-29 | 2013-11-27 | 新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心 | 一种克隆绵羊Notch1基因胞内结构域NICD的方法 |
| CN104498611A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-04-08 | 西北农林科技大学 | 检测黄牛 Notch1 基因 SNP 位点的 RFLP 方法及试剂盒 |
| CN106755425A (zh) * | 2016-12-26 | 2017-05-31 | 国风 | 一种慢性淋巴细胞白血病患者notch1基因突变检测组合物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102925580B (zh) | 2014-12-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200056244A1 (en) | Methods of treating a subject with a high gleason score prostate cancer | |
| CN104946739B (zh) | Egfr基因突变检测试剂盒及其应用 | |
| CN104818320A (zh) | 一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系和试剂盒 | |
| CN104818318A (zh) | 一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系和试剂盒 | |
| CN107312770A (zh) | 一种用于高通量测序检测的肿瘤brca1/2基因变异文库的构建方法及其应用 | |
| CN103525901B (zh) | Mek1基因突变的快速检测方法 | |
| WO2023024508A1 (zh) | 基于全基因组分析的真核生物物种鉴定方法及应用 | |
| CN109593847A (zh) | 检测微卫星nr24位点稳定性的引物对、试剂盒及方法 | |
| CN102925580B (zh) | Notch1基因突变的快速检测方法 | |
| CN104073569A (zh) | 用于诊断手足口病极重症的分子标记物及其检测方法与试剂盒 | |
| CN101921864A (zh) | 一种肝癌外周血基因诊断模型及诊断试剂盒 | |
| CN107177676B (zh) | 长链非编码rna nonhsat113026用于肾癌诊断分子标志物的用途 | |
| CN107641649B (zh) | 检测微卫星nr27位点稳定性的引物对、试剂盒及方法 | |
| CN103397080A (zh) | Pten基因突变的快速检测方法 | |
| CN107022620A (zh) | N‑ras基因突变检测引物探针及其试剂盒 | |
| CN103571959B (zh) | 用于检测基因位点突变的引物、探针、试剂盒 | |
| US20170051332A1 (en) | Methods and compositions for detecting expression of target genes | |
| CN105603117B (zh) | miR-3613用于区分肺鳞癌转移与非转移的miRNA标志物 | |
| CN109554475A (zh) | 用于肺结节良恶性鉴别的基因突变/融合组合及试剂盒 | |
| CN103436593B (zh) | p53基因突变的快速检测方法 | |
| CN102925582B (zh) | β-Catenin基因突变的快速检测方法 | |
| CN107029238B (zh) | Linc01094在诊治缺血性脑卒中的应用 | |
| CN111440868A (zh) | 喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其检测方法和应用 | |
| CN101671728B (zh) | 一种检测癌胚抗原mRNA表达量的方法及专用试剂盒 | |
| CN102925579B (zh) | Idh2基因突变的快速检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SHANGHAI SAIAN MEDICAL TEST INSTITUTE CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: SHANGHAI SAIAN BIOLOGICAL MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20141102 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 200032 BAOSHAN, SHANGHAI TO: 201900 BAOSHAN, SHANGHAI |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20141102 Address after: 201900, Shanghai, Baoshan District, Shanghai Road, No. 1888, first floor Applicant after: SHANGHAI SHINE MEDICAL INSTITUTE Co.,Ltd. Address before: 200032 209D room, No. 668, Da Dao, Baoshan District, Shanghai Applicant before: SHANGHAI SHINES PHARMACEUTICAL CO.,LTD. |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PP01 | Preservation of patent right |
Effective date of registration: 20200407 Granted publication date: 20141217 |
|
| PP01 | Preservation of patent right | ||
| PD01 | Discharge of preservation of patent |
Date of cancellation: 20230407 Granted publication date: 20141217 |
|
| PD01 | Discharge of preservation of patent | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141217 |