CN111440868A - 喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其检测方法和应用 - Google Patents
喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其检测方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111440868A CN111440868A CN202010153995.0A CN202010153995A CN111440868A CN 111440868 A CN111440868 A CN 111440868A CN 202010153995 A CN202010153995 A CN 202010153995A CN 111440868 A CN111440868 A CN 111440868A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- circ
- hsa
- laryngeal squamous
- molecular marker
- cell carcinoma
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 206010023856 Laryngeal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 55
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 claims abstract description 55
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 8
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 7
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 7
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 7
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 108091026815 Competing endogenous RNA (CeRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003026 hypopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其检测方法和应用，所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169应用在喉鳞癌的检测及预后中；喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169应用在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中；本发明提供了hsa_circ_0018169的siRNA的序列，该hsa_circ_0018169的siRNA用于敲降喉鳞癌细胞中hsa_circ_0018169的表达，具有抑制喉鳞癌细胞的恶性增殖，用于喉鳞癌药物的制备；hsa_circ_0018169的引物特异性强，结果稳定，为hsa_circ_0018169的生物学研究提供基础；本发明设计的siRNA可有效使hsa_circ_0018169表达量降低，具有高效性，作用迅速的特点。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分子生物技术领域，具体涉及一种喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其检测方法和应用。
背景技术
头颈部恶性肿瘤是全球六大肿瘤之一，而喉鳞癌是最常见的头颈部恶性肿瘤之一，主要集中在包括山西在内的北方地区高发。目前主要治疗方式为手术与放化疗等。尽管近年来喉鳞癌的诊断和治疗取得了巨大的进展，但发病率仍然呈上升趋势，而喉鳞癌原位复发导致恶性增殖仍是严重影响其预后水平提升的主要不良因素之一，对患者的生存率和生活质量具有极大的影响。
近年来，随着生物学技术的不断发展，越来越多的研究者探索各类生物小分子与肿瘤的关系，而circRNA是一种非编码RNA，广泛存在于多种真核生物体内，主要位于细胞质或外泌体中，表达稳定且不易降解，参与了多种疾病的发生发展。因此，筛选出差异表达的circRNA作为疾病的生物标记物，可以更好的了解疾病的发病机理，为疾病诊断和预后的提升提供有力地依据。通常circRNA作为ceRNA竞争性结合miRNA调控机理被证实后，circRNA逐渐被越来越多的科研工作者所研究。小干扰RNA是一个长20到25个核苷酸的双链RNA，可以通过外源或内源性双链RNA的介导，特异性降解靶向基因，导致基因沉默。siRNA是一种特异性强的高效基因阻断技术，随着技术的不断发展，逐渐成为细胞生物学的有力工具，但若设计不合理很容易产生脱靶效应。
为了检测或验证circRNA的存在及表达量，实时荧光定量的引物设计至关重要，引物设计不合理，特异性不强，会导致测定结果不准确。
发明内容
针对上述现有技术现状，本发明所要解决的一个技术问题是提供一种喉鳞癌分子标记物，利用该标记物可以简单、快捷的进行喉鳞癌的诊断。
本发明所要解决的另一个技术问题是通过设计hsa_circ_0018169的实时荧光定量引物，提供一种检测喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169表达量的方法。
本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种hsa_circ_0018169的siRNA序列及其在喉鳞癌中的应用，利用该siRNA可以简单、高效地敲降喉鳞癌细胞中hsa_circ_0018169的表达；并通过CCK8证明在喉鳞癌细胞中hsa_circ_0018169的siRNA抑制其恶性增殖。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明提供的一种喉鳞癌分子标记物，所述喉鳞癌分子标记物为hsa_circ_0018169，其序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供的一种喉鳞癌分子标记物的应用，所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169可应用在喉鳞癌的检测及预后中。
进一步地，所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169应用在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中。
本发明还提供一种检测喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169表达量的方法，包括以下步骤：
(1)收集喉癌样品；
(2)RNA的提取及反转录；
(3)实时荧光定量；
(4)通过2-△△CT法检测hsa_circ_0018169的表达量。
进一步地，所述步骤(3)实时荧光定量中的上游引物为AGACCTCAGAGCCCACG；所述下游引物为AGCATCTGCCGTCACAA。
本发明又提供一种hsa_circ_0018169的siRNA序列，利用该siRNA可以快速、高效地敲降hsa_circ_0018169的表达。所述hsa_circ_0018169的siRNA序列为：
正义链：5’-CCUGUAGACAGGUAAAUAC-3’
反义链：5’-GUAUUUACCUGUCUACAGG-3’。
本发明又提供一种hsa_circ_0018169的siRNA在喉鳞癌中的应用，用于敲降喉鳞癌细胞中hsa_circ_0018169的表达。所述hsa_circ_0018169的siRNA序列为：
正义链：5’-CCUGUAGACAGGUAAAUAC-3’
反义链：5’-GUAUUUACCUGUCUACAGG-3’。
进一步地，本发明所提供的hsa_circ_0018169的siRNA，在喉鳞癌细胞中通过CCK8实验证明hsa_circ_0018169的siRNA抑制喉鳞癌细胞的恶性增殖，可用于喉鳞癌药物的制备。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的hsa_circ_0018169的引物特异性强，结果稳定，为hsa_circ_0018169的生物学研究提供基础。
2、本发明提供的hsa_circ_0018169可以作为喉癌检测的标志物，为喉癌的检测及应用提供基础。
3、本发明提供的检测hsa_circ_0018169分子表达量的方法，采用实时荧光定量PCR检测手段，无需曾设探针即可同时检测目的环状RNA和内参基因，具有经济、方便、检测效率高的优点。
4、本发明提供的hsa_circ_0018169的siRNA具有高效性、作用迅速等特点。
5、本发明提供的hsa_circ_0018169的siRNA能够特异性地抑制喉鳞癌细胞的恶性增殖，在喉鳞癌的治疗和预后中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例中溶解曲线检测该引物具有特异性；
图2为本发明实施例中在喉癌组织中hsa_circ_0018169的表达量；
图3为实施例中扩增产物部分测序结果。
图4为本发明实施例中实时荧光定量检测hsa_circ_0018169的表达量；
图5为本发明实施例中CCK8检测喉鳞癌细胞活力。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1：
一种喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其表达量的检测方法和应用。
一种喉鳞癌分子标记物，该标志物为hsa_circ_0018169，其序列如SEQ ID NO：1所示。
所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169可应用在喉鳞癌的检测及预后中。
所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169应用在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中。
一种检测喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169分子表达量的方法，是设计hsa_circ_0018169的实时荧光定量引物，采用实时荧光定量检测法获得hsa_circ_0018169的表达量。包括如下步骤：
(1)收集喉癌样品；
本实施例中的111对喉癌和癌旁组织收集于山西医科大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科，样本置于液氮中保存，储存备用，所有研究对象均知情同意参加本项实验，且过程经医院伦理委员会审查批准。
(2)RNA的提取及反转录；
(3)实时荧光定量；
(4)结果分析。
其中，所述步骤(2)RNA的提取及反转录；具体过程如下：
(a)将收集的组织样品用研磨仪充分研磨，加入适量trizol溶液，混匀，室温放置5分钟；
(b)每1ml trizol加入200ul氯仿，剧烈震荡30s，室温静置5分钟；
(c)4度14000rcf离心15分钟，吸取上层水相移至新的离心管；
(d)加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，负20度过夜沉淀；
(e)4度12000rcf离心15分钟，弃上清；
(f)加入1ml 75％乙醇，12000rcf离心5分钟，弃上清，在超净台中吹干；
(g)核酸微量检测仪测定RNA浓度及纯度；
(h)反转录获得cDNA；
(i)将cDNA按1:4比例稀释，然后放入负20度保存。
其中，所述步骤(h)反转录获得cDNA；具体过程如下：
在PCR离心管中加入以下试剂：
2x RT Mix：10ul，HiScript II Enzyme Mix：2ul，Oligo(dT)：1ul，Randomhexamers：1ul，RNA：1ug，加入RNase free ddH2O至20ul；
按照以下反应程序反转录：
在PCR仪器上设置：第一步25℃反应5min；第二步50℃，反应15min；第三步85℃，反应2min；
将cDNA按1:4比例稀释，然后放入负20度保存。
其中，所述步骤(3)实时荧光定量；具体过程如下：
在PCR离心管中加入以下试剂：
SYBR Green Master Mix:10ul,上游引物:0.4ul，下游引物:0.4ul，cDNA:1ul,加入ddH2O至20ul
按照以下反应程序进行实时荧光定量：
所述上游引物为AGACCTCAGAGCCCACG；
所述下游引物为AGCATCTGCCGTCACAA。
首先，通过溶解曲线检测该引物hsa_circ_0018169具有特异性。
通过溶解曲线检测该引物具有特异性，结果显示溶解曲线呈现单一峰，表明本发明引物具有特异性，检测hsa_circ_0018169的表达量具有稳定性和可靠性(如图1所示)。
其次，通过2-△△CT法计算hsa_circ_0018169的表达量，结果显示在喉鳞癌组织中hsa_circ_0018169的表达量高于癌旁组织，且p值小于0.001，具有显著性差异(如图2所示)。
最后，将扩增产物测序，测序结果清晰明了的显示出环化位点AGGT，进一步证明hsa_circ_0018169的存在(如图3所示)。
综上所述，所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0004547应用在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中。
实施例2：
利用本发明的喉癌分子标记物hsa_circ_0018169合成hsa_circ_0018169的siRNA。
首先，合成hsa_circ_0018169的siRNA。
根据siRNA设计原则，合成序列中包含环状RNA的环化位点，片段长度大小为18-25bp的序列作为候选靶点序列，原则GC含量在40％-50％左右的siRNA，并通过数据库与人类基因组序列进行比对，确保无同源性。本发明所设计的siRNA序列如下：
正义链：5’-CCUGUAGACAGGUAAAUAC-3’
反义链：5’-GUAUUUACCUGUCUACAGG-3’
将上述siRNA序列送到苏州吉玛公司通过化学法合成，增同时在3’端加增加两个脱氧核糖核苷酸dTdT，以增加siRNA的稳定性，以防降解。
其次，对喉鳞癌细胞进行siRNA转染。
喉鳞癌细胞TU-177按铺于6孔板中，待细胞汇合密度为60％左右时转染，用lipofectamine 3000转染试剂将siRNA及NC转染喉鳞癌细胞，6小时换液。
再次，检测喉鳞癌细胞中hsa_circ_0018169的表达量。其所用方法与实施例1中的一种检测喉癌分子标记物hsa_circ_0018169表达量的方法，区别仅在于：
本实施是收集转染后喉鳞癌细胞，不是裂解组织，而是裂解细胞，提取细胞中总RNA。
通过2-△△CT法检测hsa_circ_0018169的表达量。结果显示hsa_circ_0018169的siRNA在喉鳞癌细胞中的敲降效率达到79.9％，因此本发明提供的siRNA序列能够有效抑制hsa_circ_0018169的表达，如图4所示。
最后，通过CCK8证明在喉鳞癌细胞中hsa_circ_0018169的siRNA抑制其恶性增殖，可用于喉鳞癌药物的制备。具体过程如下：
(a)将转染siRNA和NC的喉鳞癌细胞胰酶分别消化，1000g离心5分钟，DMEM完全培养基吹打混匀制成细胞悬液，细胞计数，将5000个/100ul细胞悬浮液铺于96孔板中，每组3个重复，分别在0h、12h、24h、36h、72h检测细胞活力。
(b)每孔加入10ul CCK8，孵育1小时后，酶标仪读板，CCK8检测读取450nm吸光度值。
(c)计算：
(1)细胞活力(％)＝(处理组-空白值)/(未处理组-空白值)×100
(2)生长曲线＝(规定时间点OD值-空白值)/(刚接种细胞时的OD值-空白值)，依据此做出细胞在不同时间的增长曲线，结果显示在喉鳞癌细胞中转染所述siRNA后，通过CCK8实验发现在12h时siRNA组的细胞活力是对照组的0.88倍，随着时间的增加在36h时siRNA组的细胞活力是对照组的0.61倍，如图5所示。因此本发明所提供的hsa_circ_0018169的siRNA在喉鳞癌细胞中能够抑制细胞的活力，可为喉鳞癌的应用提供理论指导。
综上所述，hsa_circ_0018169的siRNA喉鳞癌药物的制备。
SEQ ID NO：1：
GTAAATACCAGCTGTCCCCTACAGTGAATATGCCCCAAGATGACACTGTCATTATAGAAGATGACAGGTTGCCAGTGCTTCCTCCACATCTCTCTGACCAGTCCTCTTCCAGCTCCCATGATGATGTGGGGTTTGTGACGGCAGATGCTGGTACTTGGGCCAAGGCTGCAATCAGTGATTCAGCCGACTGCTCTTTGAGTCCAGATGTTGATCCAGTTCTTGCTTTTCAACGAGAAGGATTTGGACGTCAGAGTATGTCAGAAAAACGCACAAAGCAATTTTCAGATGCCAGTCAATTGGATTTCGTTAAAACACGAAAATCAAAAAGCATGGATTTAGGTATAGCTGACGAGACTAAACTCAATACAGTGGATGACCAGAAAGCAGGTTCTCCCAGCAGAGATGTGGGTCCTTCCCTGGGTCTGAAGAAGTCAAGCTCGTTGGAGAGTCTGCAGACCGCAGTTGCCGAGGTGACTTTGAATGGGGATATTCCTTTCCATCGTCCACGGCCGCGGATAATCAGAGGCAGGGGATGCAATGAGAGCTTCAGAGCTGCCATCGACAAATCTTATGATAAACCCGCGGTAGATGATGATGATGAAGGCATGGAGACCTTGGAAGAAGACACAGAAGAAAGTTCAAGATCAGGGAGAGAGTCTGTATCCACAGCCAGTGATCAGCCTTCCCACTCTCTGGAGAGACAAATGAATGGAAACCAAGAGAAAGGTGATAAGACTGATAGAAAAAAGGATAAAACTGGAAAAGAAAAGAAGAAAGATAGAGATAAGGAGAAGGATAAAATGAAAGCCAAGAAGGGAATGCTGAAGGGCTTGGGAGACATGTTCAGGTTTGGCAAACATCGAAAAGATGACAAGATTGAGAAAACGGGTAAAATAAAAATACAGGAATCCTTTACATCAGAAGAGGAGAGGATACGAATGAAGCAGGAGCAGGAGAGGATTCAAGCCAAAACTCGAGAATTTAGGGAACGACAAGCTCGAGAGCGTGACTATGCTGAAATTCAAGATTTTCATCGGACATTTGGCTGTGATGATGAGTTAATGTATGGGGGAGTTTCTTCTTATGAAGGTTCCATGGCTCTCAACGCTAGACCTCAGAGCCCACGAGAAGGGCATATGATGGATGCTTTGTATGCCCAAGTCAAGAAGCCGCGGAATTCCAAACCCTCACCTGTAGACAG
序列表
<110> 山西医科大学第一医院
吴勇延
高伟
<120> 喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其检测方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1201
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
gtaaatacca gctgtcccct acagtgaata tgccccaaga tgacactgtc attatagaag 60
atgacaggtt gccagtgctt cctccacatc tctctgacca gtcctcttcc agctcccatg 120
atgatgtggg gtttgtgacg gcagatgctg gtacttgggc caaggctgca atcagtgatt 180
cagccgactg ctctttgagt ccagatgttg atccagttct tgcttttcaa cgagaaggat 240
ttggacgtca gagtatgtca gaaaaacgca caaagcaatt ttcagatgcc agtcaattgg 300
atttcgttaa aacacgaaaa tcaaaaagca tggatttagg tatagctgac gagactaaac 360
tcaatacagt ggatgaccag aaagcaggtt ctcccagcag agatgtgggt ccttccctgg 420
gtctgaagaa gtcaagctcg ttggagagtc tgcagaccgc agttgccgag gtgactttga 480
atggggatat tcctttccat cgtccacggc cgcggataat cagaggcagg ggatgcaatg 540
agagcttcag agctgccatc gacaaatctt atgataaacc cgcggtagat gatgatgatg 600
aaggcatgga gaccttggaa gaagacacag aagaaagttc aagatcaggg agagagtctg 660
tatccacagc cagtgatcag ccttcccact ctctggagag acaaatgaat ggaaaccaag 720
agaaaggtga taagactgat agaaaaaagg ataaaactgg aaaagaaaag aagaaagata 780
gagataagga gaaggataaa atgaaagcca agaagggaat gctgaagggc ttgggagaca 840
tgttcaggtt tggcaaacat cgaaaagatg acaagattga gaaaacgggt aaaataaaaa 900
tacaggaatc ctttacatca gaagaggaga ggatacgaat gaagcaggag caggagagga 960
ttcaagccaa aactcgagaa tttagggaac gacaagctcg agagcgtgac tatgctgaaa 1020
ttcaagattt tcatcggaca tttggctgtg atgatgagtt aatgtatggg ggagtttctt 1080
cttatgaagg ttccatggct ctcaacgcta gacctcagag cccacgagaa gggcatatga 1140
tggatgcttt gtatgcccaa gtcaagaagc cgcggaattc caaaccctca cctgtagaca 1200
g 1201
Claims (8)
1.一种喉鳞癌分子标记物，其特征在于：所述喉鳞癌分子标记物为hsa_circ_0018169，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种喉鳞癌分子标记物的应用，其特征在于：所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169可应用在喉鳞癌的检测及预后中。
3.根据权利要求2所述的一种喉鳞癌分子标记物的应用，其特征在于：所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169应用在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中。
4.一种检测如权利要求1-3任一项所述的喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169表达量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)收集喉癌样品；
(2)RNA的提取及反转录；
(3)实时荧光定量；
(4)通过2-△△CT法检测hsa_circ_0018169的表达量。
5.根据权利要求4所述的一种检测喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169表达量的方法，其特征在于：所述步骤(3)实时荧光定量中的上游引物为AGACCTCAGAGCCCACG；所述下游引物为AGCATCTGCCGTCACAA。
6.一种hsa_circ_0018169的siRNA，其特征在于：所述hsa_circ_0018169的siRNA序列为：
正义链：5’-CCUGUAGACAGGUAAAUAC-3’
反义链：5’-GUAUUUACCUGUCUACAGG-3’。
7.一种hsa_circ_0018169的siRNA在喉鳞癌中的应用，其特征在于：用于敲降喉鳞癌细胞中hsa_circ_0018169的表达，所述hsa_circ_0018169的siRNA序列为：
正义链：5’-CCUGUAGACAGGUAAAUAC-3’
反义链：5’-GUAUUUACCUGUCUACAGG-3’。
8.根据权利要求7所述的一种hsa_circ_0018169的siRNA在喉鳞癌中的应用，其特征在于：所述的siRNA具有抑制喉鳞癌细胞的恶性增殖，可用于喉鳞癌药物的制备。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010153995.0A CN111440868B (zh) | 2020-03-07 | 2020-03-07 | 喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其检测方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010153995.0A CN111440868B (zh) | 2020-03-07 | 2020-03-07 | 喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其检测方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111440868A true CN111440868A (zh) | 2020-07-24 |
| CN111440868B CN111440868B (zh) | 2023-09-05 |
Family
ID=71627303
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010153995.0A Active CN111440868B (zh) | 2020-03-07 | 2020-03-07 | 喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其检测方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111440868B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112322729A (zh) * | 2020-09-09 | 2021-02-05 | 山西医科大学第一医院 | 一种喉鳞癌环状rna分子标记物及其检测方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110014603A1 (en) * | 2006-06-28 | 2011-01-20 | The Cleveland Clinic Foundation | Targets for use in diagnosis, prognosis and therapy of cancer |
| CN108728540A (zh) * | 2018-06-11 | 2018-11-02 | 北京大学人民医院 | 定量检测pard3基因表达的引物和探针及其应用 |
| US20190203253A1 (en) * | 2016-07-05 | 2019-07-04 | University Of Saskatchewan | Methods of identifying and treating cancer patients with an ephb6 deficiency |
-
2020
- 2020-03-07 CN CN202010153995.0A patent/CN111440868B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110014603A1 (en) * | 2006-06-28 | 2011-01-20 | The Cleveland Clinic Foundation | Targets for use in diagnosis, prognosis and therapy of cancer |
| US20190203253A1 (en) * | 2016-07-05 | 2019-07-04 | University Of Saskatchewan | Methods of identifying and treating cancer patients with an ephb6 deficiency |
| CN108728540A (zh) * | 2018-06-11 | 2018-11-02 | 北京大学人民医院 | 定量检测pard3基因表达的引物和探针及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GAO W等: "circPARD3 drives malignant progression and chemoresistance of laryngeal squamous cell carcinoma by inhibiting autophagy through the PRKCI-Akt-mTOR pathway" * |
| NIH: "hsa_circ_0018169" * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112322729A (zh) * | 2020-09-09 | 2021-02-05 | 山西医科大学第一医院 | 一种喉鳞癌环状rna分子标记物及其检测方法和应用 |
| CN112322729B (zh) * | 2020-09-09 | 2024-01-19 | 深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院(深圳市耳鼻咽喉研究所、深圳市龙岗区口腔医学研究所) | 一种喉鳞癌环状rna分子标记物及其检测方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111440868B (zh) | 2023-09-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107519193B (zh) | 食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用 | |
| CN114921551B (zh) | 人Circ-FIRRE在食管鳞癌中的应用及试剂盒 | |
| CN109055564B (zh) | 用于慢性淋巴细胞白血病诊断及预后评估的CircRNA标志物 | |
| CN107177676B (zh) | 长链非编码rna nonhsat113026用于肾癌诊断分子标志物的用途 | |
| CN111440868B (zh) | 喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其检测方法和应用 | |
| CN111378664B (zh) | 一种环状rna及其应用 | |
| CN111334577A (zh) | 喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0004547及检测方法和应用 | |
| CN111643516A (zh) | LncRNA XIST及与其结合的miR-132作为抑制胃癌细胞增殖、侵袭与转移的用途 | |
| CN107190005A (zh) | lncRNA作为生物标志物在肺腺癌诊治中的应用 | |
| CN114438207B (zh) | 一种乳腺癌的环状rna生物标志物及其应用 | |
| CN110964831A (zh) | 一种用于检测黑色素瘤的长非编码rna及其应用 | |
| CN107312778B (zh) | 一种癌症诊断试剂盒以及治疗用药物组合物 | |
| CN105603117B (zh) | miR-3613用于区分肺鳞癌转移与非转移的miRNA标志物 | |
| CN111118007B (zh) | 一种长非编码rna在制备治疗宫颈癌药物中的应用 | |
| CN102925580A (zh) | Notch1基因突变的快速检测方法 | |
| CN107893119B (zh) | Zcchc12在骨肉瘤中的应用 | |
| CN111534587A (zh) | 分子标志物5-tRF-His、乳腺癌检测试剂盒及其应用 | |
| CN111763735B (zh) | 肿瘤差异表达基因及其应用 | |
| CN105603115B (zh) | 肺鳞癌转移诊治标志物 | |
| CN110577952A (zh) | 一种长非编码rna在诊断和治疗乳腺癌中的应用 | |
| CN114958856B (zh) | 长链非编码rna cyp1b1-as1作为乳腺癌生物标志物和治疗靶点的应用 | |
| CN110628909B (zh) | 一种与子宫内膜癌相关的miRNA分子miR-4500及其应用 | |
| CN110923313B (zh) | LncRNA的检测及其在骨质疏松诊治中的应用 | |
| CN104726454B (zh) | hsa‑miR‑1280在非小细胞肺癌中的作用及其应用 | |
| CN111118139B (zh) | 一种骨质疏松的分子靶标及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231219 Address after: No. 3004, Longgang Avenue, Longcheng street, Longgang District, Shenzhen, Guangdong 518000 Patentee after: Shenzhen Longgang District Ear Nose and Throat Hospital (Shenzhen Ear Nose and Throat Research Institute Shenzhen Longgang District Stomatology Research Institute) Patentee after: Wu Yongyan Patentee after: Gao Wei Address before: 030001 No. 85 Jiefang South Road, Yingze District, Shanxi, Taiyuan Patentee before: FIRST HOSPITAL OF SHANXI MEDICAL University Patentee before: Wu Yongyan Patentee before: Gao Wei |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240131 Address after: 030001 No. 85 Jiefang South Road, Yingze District, Shanxi, Taiyuan Patentee after: FIRST HOSPITAL OF SHANXI MEDICAL University Country or region after: China Patentee after: Wu Yongyan Patentee after: Gao Wei Address before: No. 3004, Longgang Avenue, Longcheng street, Longgang District, Shenzhen, Guangdong 518000 Patentee before: Shenzhen Longgang District Ear Nose and Throat Hospital (Shenzhen Ear Nose and Throat Research Institute Shenzhen Longgang District Stomatology Research Institute) Country or region before: China Patentee before: Wu Yongyan Patentee before: Gao Wei |
|
| TR01 | Transfer of patent right |