CN111440868B - 喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其检测方法和应用，所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169应用在喉鳞癌的检测及预后中；喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169应用在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中；本发明提供了hsa_circ_0018169的siRNA的序列，该hsa_circ_0018169的siRNA用于敲降喉鳞癌细胞中hsa_circ_0018169的表达，具有抑制喉鳞癌细胞的恶性增殖，用于喉鳞癌药物的制备；hsa_circ_0018169的引物特异性强，结果稳定，为hsa_circ_0018169的生物学研究提供基础；本发明设计的siRNA可有效使hsa_circ_0018169表达量降低，具有高效性，作用迅速的特点。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分子生物技术领域，具体涉及一种喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其检测方法和应用。
背景技术
头颈部恶性肿瘤是全球六大肿瘤之一，而喉鳞癌是最常见的头颈部恶性肿瘤之一，主要集中在包括山西在内的北方地区高发。目前主要治疗方式为手术与放化疗等。尽管近年来喉鳞癌的诊断和治疗取得了巨大的进展，但发病率仍然呈上升趋势，而喉鳞癌原位复发导致恶性增殖仍是严重影响其预后水平提升的主要不良因素之一，对患者的生存率和生活质量具有极大的影响。
近年来，随着生物学技术的不断发展，越来越多的研究者探索各类生物小分子与肿瘤的关系，而circRNA是一种非编码RNA，广泛存在于多种真核生物体内，主要位于细胞质或外泌体中，表达稳定且不易降解，参与了多种疾病的发生发展。因此，筛选出差异表达的circRNA作为疾病的生物标记物，可以更好的了解疾病的发病机理，为疾病诊断和预后的提升提供有力地依据。通常circRNA作为ceRNA竞争性结合miRNA调控机理被证实后，circRNA逐渐被越来越多的科研工作者所研究。小干扰RNA是一个长20到25个核苷酸的双链RNA，可以通过外源或内源性双链RNA的介导，特异性降解靶向基因，导致基因沉默。siRNA是一种特异性强的高效基因阻断技术，随着技术的不断发展，逐渐成为细胞生物学的有力工具，但若设计不合理很容易产生脱靶效应。
为了检测或验证circRNA的存在及表达量，实时荧光定量的引物设计至关重要，引物设计不合理，特异性不强，会导致测定结果不准确。
发明内容
针对上述现有技术现状，本发明所要解决的一个技术问题是提供一种喉鳞癌分子标记物，利用该标记物可以简单、快捷的进行喉鳞癌的诊断。
本发明所要解决的另一个技术问题是通过设计hsa_circ_0018169的实时荧光定量引物，提供一种检测喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169表达量的方法。
本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种hsa_circ_0018169的siRNA序列及其在喉鳞癌中的应用，利用该siRNA可以简单、高效地敲降喉鳞癌细胞中hsa_circ_0018169的表达；并通过CCK8证明在喉鳞癌细胞中hsa_circ_0018169的siRNA抑制其恶性增殖。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明提供的一种喉鳞癌分子标记物，所述喉鳞癌分子标记物为hsa_circ_0018169，其序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供的一种喉鳞癌分子标记物的应用，所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169可应用在喉鳞癌的检测及预后中。
进一步地，所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169应用在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中。
本发明还提供一种检测喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169表达量的方法，包括以下步骤：
(1)收集喉癌样品；
(2)RNA的提取及反转录；
(3)实时荧光定量；
(4)通过2-△△CT法检测hsa_circ_0018169的表达量。
进一步地，所述步骤(3)实时荧光定量中的上游引物为AGACCTCAGAGCCCACG；所述下游引物为AGCATCTGCCGTCACAA。
本发明又提供一种hsa_circ_0018169的siRNA序列，利用该siRNA可以快速、高效地敲降hsa_circ_0018169的表达。所述hsa_circ_0018169的siRNA序列为：
正义链：5’-CCUGUAGACAGGUAAAUAC-3’
反义链：5’-GUAUUUACCUGUCUACAGG-3’。
本发明又提供一种hsa_circ_0018169的siRNA在喉鳞癌中的应用，用于敲降喉鳞癌细胞中hsa_circ_0018169的表达。所述hsa_circ_0018169的siRNA序列为：
正义链：5’-CCUGUAGACAGGUAAAUAC-3’
反义链：5’-GUAUUUACCUGUCUACAGG-3’。
进一步地，本发明所提供的hsa_circ_0018169的siRNA，在喉鳞癌细胞中通过CCK8实验证明hsa_circ_0018169的siRNA抑制喉鳞癌细胞的恶性增殖，可用于喉鳞癌药物的制备。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的hsa_circ_0018169的引物特异性强，结果稳定，为hsa_circ_0018169的生物学研究提供基础。
2、本发明提供的hsa_circ_0018169可以作为喉癌检测的标志物，为喉癌的检测及应用提供基础。
3、本发明提供的检测hsa_circ_0018169分子表达量的方法，采用实时荧光定量PCR检测手段，无需曾设探针即可同时检测目的环状RNA和内参基因，具有经济、方便、检测效率高的优点。
4、本发明提供的hsa_circ_0018169的siRNA具有高效性、作用迅速等特点。
5、本发明提供的hsa_circ_0018169的siRNA能够特异性地抑制喉鳞癌细胞的恶性增殖，在喉鳞癌的治疗和预后中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例中溶解曲线检测该引物具有特异性；
图2为本发明实施例中在喉癌组织中hsa_circ_0018169的表达量；
图3为实施例中扩增产物部分测序结果。
图4为本发明实施例中实时荧光定量检测hsa_circ_0018169的表达量；
图5为本发明实施例中CCK8检测喉鳞癌细胞活力。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1：
一种喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其表达量的检测方法和应用。
一种喉鳞癌分子标记物，该标志物为hsa_circ_0018169，其序列如SEQ ID NO：1所示。
所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169可应用在喉鳞癌的检测及预后中。
所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169应用在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中。
一种检测喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169分子表达量的方法，是设计hsa_circ_0018169的实时荧光定量引物，采用实时荧光定量检测法获得hsa_circ_0018169的表达量。包括如下步骤：
(1)收集喉癌样品；
本实施例中的111对喉癌和癌旁组织收集于山西医科大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科，样本置于液氮中保存，储存备用，所有研究对象均知情同意参加本项实验，且过程经医院伦理委员会审查批准。
(2)RNA的提取及反转录；
(3)实时荧光定量；
(4)结果分析。
其中，所述步骤(2)RNA的提取及反转录；具体过程如下：
(a)将收集的组织样品用研磨仪充分研磨，加入适量trizol溶液，混匀，室温放置5分钟；
(b)每1ml trizol加入200ul氯仿，剧烈震荡30s，室温静置5分钟；
(c)4度14000rcf离心15分钟，吸取上层水相移至新的离心管；
(d)加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，负20度过夜沉淀；
(e)4度12000rcf离心15分钟，弃上清；
(f)加入1ml 75％乙醇，12000rcf离心5分钟，弃上清，在超净台中吹干；
(g)核酸微量检测仪测定RNA浓度及纯度；
(h)反转录获得cDNA；
(i)将cDNA按1:4比例稀释，然后放入负20度保存。
其中，所述步骤(h)反转录获得cDNA；具体过程如下：
在PCR离心管中加入以下试剂：
2x RT Mix：10ul，HiScript II Enzyme Mix：2ul，Oligo(dT)：1ul，Randomhexamers：1ul，RNA：1ug，加入RNase free ddH2O至20ul；
按照以下反应程序反转录：
在PCR仪器上设置：第一步25℃反应5min；第二步50℃，反应15min；第三步85℃，反应2min；
将cDNA按1:4比例稀释，然后放入负20度保存。
其中，所述步骤(3)实时荧光定量；具体过程如下：
在PCR离心管中加入以下试剂：
SYBR Green Master Mix:10ul,上游引物:0.4ul，下游引物:0.4ul，cDNA:1ul,加入ddH2O至20ul
按照以下反应程序进行实时荧光定量：
所述上游引物为AGACCTCAGAGCCCACG；
所述下游引物为AGCATCTGCCGTCACAA。
首先，通过溶解曲线检测该引物hsa_circ_0018169具有特异性。
通过溶解曲线检测该引物具有特异性，结果显示溶解曲线呈现单一峰，表明本发明引物具有特异性，检测hsa_circ_0018169的表达量具有稳定性和可靠性(如图1所示)。
其次，通过2-△△CT法计算hsa_circ_0018169的表达量，结果显示在喉鳞癌组织中hsa_circ_0018169的表达量高于癌旁组织，且p值小于0.001，具有显著性差异(如图2所示)。
最后，将扩增产物测序，测序结果清晰明了的显示出环化位点AGGT，进一步证明hsa_circ_0018169的存在(如图3所示)。
综上所述，所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0004547应用在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中。
实施例2：
利用本发明的喉癌分子标记物hsa_circ_0018169合成hsa_circ_0018169的siRNA。
首先，合成hsa_circ_0018169的siRNA。
根据siRNA设计原则，合成序列中包含环状RNA的环化位点，片段长度大小为18-25bp的序列作为候选靶点序列，原则GC含量在40％-50％左右的siRNA，并通过数据库与人类基因组序列进行比对，确保无同源性。本发明所设计的siRNA序列如下：
正义链：5’-CCUGUAGACAGGUAAAUAC-3’
反义链：5’-GUAUUUACCUGUCUACAGG-3’
将上述siRNA序列送到苏州吉玛公司通过化学法合成，增同时在3’端加增加两个脱氧核糖核苷酸dTdT，以增加siRNA的稳定性，以防降解。
其次，对喉鳞癌细胞进行siRNA转染。
喉鳞癌细胞TU-177按铺于6孔板中，待细胞汇合密度为60％左右时转染，用lipofectamine 3000转染试剂将siRNA及NC转染喉鳞癌细胞，6小时换液。
再次，检测喉鳞癌细胞中hsa_circ_0018169的表达量。其所用方法与实施例1中的一种检测喉癌分子标记物hsa_circ_0018169表达量的方法，区别仅在于：
本实施是收集转染后喉鳞癌细胞，不是裂解组织，而是裂解细胞，提取细胞中总RNA。
通过2-△△CT法检测hsa_circ_0018169的表达量。结果显示hsa_circ_0018169的siRNA在喉鳞癌细胞中的敲降效率达到79.9％，因此本发明提供的siRNA序列能够有效抑制hsa_circ_0018169的表达，如图4所示。
最后，通过CCK8证明在喉鳞癌细胞中hsa_circ_0018169的siRNA抑制其恶性增殖，可用于喉鳞癌药物的制备。具体过程如下：
(a)将转染siRNA和NC的喉鳞癌细胞胰酶分别消化，1000g离心5分钟，DMEM完全培养基吹打混匀制成细胞悬液，细胞计数，将5000个/100ul细胞悬浮液铺于96孔板中，每组3个重复，分别在0h、12h、24h、36h、72h检测细胞活力。
(b)每孔加入10ul CCK8，孵育1小时后，酶标仪读板，CCK8检测读取450nm吸光度值。
(c)计算：
(1)细胞活力(％)＝(处理组-空白值)/(未处理组-空白值)×100
(2)生长曲线＝(规定时间点OD值-空白值)/(刚接种细胞时的OD值-空白值)，依据此做出细胞在不同时间的增长曲线，结果显示在喉鳞癌细胞中转染所述siRNA后，通过CCK8实验发现在12h时siRNA组的细胞活力是对照组的0.88倍，随着时间的增加在36h时siRNA组的细胞活力是对照组的0.61倍，如图5所示。因此本发明所提供的hsa_circ_0018169的siRNA在喉鳞癌细胞中能够抑制细胞的活力，可为喉鳞癌的应用提供理论指导。
综上所述，hsa_circ_0018169的siRNA喉鳞癌药物的制备。
SEQ ID NO：1：
GTAAATACCAGCTGTCCCCTACAGTGAATATGCCCCAAGATGACACTGTCATTATAGAAGATGACAGGTTGCCAGTGCTTCCTCCACATCTCTCTGACCAGTCCTCTTCCAGCTCCCATGATGATGTGGGGTTTGTGACGGCAGATGCTGGTACTTGGGCCAAGGCTGCAATCAGTGATTCAGCCGACTGCTCTTTGAGTCCAGATGTTGATCCAGTTCTTGCTTTTCAACGAGAAGGATTTGGACGTCAGAGTATGTCAGAAAAACGCACAAAGCAATTTTCAGATGCCAGTCAATTGGATTTCGTTAAAACACGAAAATCAAAAAGCATGGATTTAGGTATAGCTGACGAGACTAAACTCAATACAGTGGATGACCAGAAAGCAGGTTCTCCCAGCAGAGATGTGGGTCCTTCCCTGGGTCTGAAGAAGTCAAGCTCGTTGGAGAGTCTGCAGACCGCAGTTGCCGAGGTGACTTTGAATGGGGATATTCCTTTCCATCGTCCACGGCCGCGGATAATCAGAGGCAGGGGATGCAATGAGAGCTTCAGAGCTGCCATCGACAAATCTTATGATAAACCCGCGGTAGATGATGATGATGAAGGCATGGAGACCTTGGAAGAAGACACAGAAGAAAGTTCAAGATCAGGGAGAGAGTCTGTATCCACAGCCAGTGATCAGCCTTCCCACTCTCTGGAGAGACAAATGAATGGAAACCAAGAGAAAGGTGATAAGACTGATAGAAAAAAGGATAAAACTGGAAAAGAAAAGAAGAAAGATAGAGATAAGGAGAAGGATAAAATGAAAGCCAAGAAGGGAATGCTGAAGGGCTTGGGAGACATGTTCAGGTTTGGCAAACATCGAAAAGATGACAAGATTGAGAAAACGGGTAAAATAAAAATACAGGAATCCTTTACATCAGAAGAGGAGAGGATACGAATGAAGCAGGAGCAGGAGAGGATTCAAGCCAAAACTCGAGAATTTAGGGAACGACAAGCTCGAGAGCGTGACTATGCTGAAATTCAAGATTTTCATCGGACATTTGGCTGTGATGATGAGTTAATGTATGGGGGAGTTTCTTCTTATGAAGGTTCCATGGCTCTCAACGCTAGACCTCAGAGCCCACGAGAAGGGCATATGATGGATGCTTTGTATGCCCAAGTCAAGAAGCCGCGGAATTCCAAACCCTCACCTGTAGACAG
序列表
<110> 山西医科大学第一医院
吴勇延
高伟
<120> 喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169及其检测方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1201
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
gtaaatacca gctgtcccct acagtgaata tgccccaaga tgacactgtc attatagaag 60
atgacaggtt gccagtgctt cctccacatc tctctgacca gtcctcttcc agctcccatg 120
atgatgtggg gtttgtgacg gcagatgctg gtacttgggc caaggctgca atcagtgatt 180
cagccgactg ctctttgagt ccagatgttg atccagttct tgcttttcaa cgagaaggat 240
ttggacgtca gagtatgtca gaaaaacgca caaagcaatt ttcagatgcc agtcaattgg 300
atttcgttaa aacacgaaaa tcaaaaagca tggatttagg tatagctgac gagactaaac 360
tcaatacagt ggatgaccag aaagcaggtt ctcccagcag agatgtgggt ccttccctgg 420
gtctgaagaa gtcaagctcg ttggagagtc tgcagaccgc agttgccgag gtgactttga 480
atggggatat tcctttccat cgtccacggc cgcggataat cagaggcagg ggatgcaatg 540
agagcttcag agctgccatc gacaaatctt atgataaacc cgcggtagat gatgatgatg 600
aaggcatgga gaccttggaa gaagacacag aagaaagttc aagatcaggg agagagtctg 660
tatccacagc cagtgatcag ccttcccact ctctggagag acaaatgaat ggaaaccaag 720
agaaaggtga taagactgat agaaaaaagg ataaaactgg aaaagaaaag aagaaagata 780
gagataagga gaaggataaa atgaaagcca agaagggaat gctgaagggc ttgggagaca 840
tgttcaggtt tggcaaacat cgaaaagatg acaagattga gaaaacgggt aaaataaaaa 900
tacaggaatc ctttacatca gaagaggaga ggatacgaat gaagcaggag caggagagga 960
ttcaagccaa aactcgagaa tttagggaac gacaagctcg agagcgtgac tatgctgaaa 1020
ttcaagattt tcatcggaca tttggctgtg atgatgagtt aatgtatggg ggagtttctt 1080
cttatgaagg ttccatggct ctcaacgcta gacctcagag cccacgagaa gggcatatga 1140
tggatgcttt gtatgcccaa gtcaagaagc cgcggaattc caaaccctca cctgtagaca 1200
g 1201
Claims (2)
1.一种喉鳞癌分子标记物的应用，其特征在于：所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169应用在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中，所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0018169的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种hsa_circ_0018169的siRNA在喉鳞癌中的应用，其特征在于：所述hsa_circ_0018169的siRNA序列为：
正义链：5’-CCUGUAGACAGGUAAAUAC-3’
反义链：5’-GUAUUUACCUGUCUACAGG-3’；
所述的siRNA用于制备抑制喉鳞癌细胞恶性增殖的喉鳞癌药物。
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