CN109593847A - 检测微卫星nr24位点稳定性的引物对、试剂盒及方法 - Google Patents

检测微卫星nr24位点稳定性的引物对、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测微卫星NR24位点稳定性的引物对、试剂盒及方法，其是分别以结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的DNA作为模板，采用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列的引物对进行荧光定量PCR反应，收集荧光信号，绘制熔解曲线；比较结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的熔解曲线。本发明的检测方法与金标准方法相比，结果准确可靠，具有高敏感性、高特异性，且耗时短，成本低。

Description

检测微卫星NR24位点稳定性的引物对、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地说，本发明涉及一种肿瘤细胞检测微卫星NR24位点稳定性的引物对、试剂盒及方法。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的消化道恶性肿瘤,在我国发病率和病死率呈上升趋势。结直肠癌遗传学研究显示约15％的原发性结直肠癌系MSI所致,其中约20％(总体结直肠癌的2％～4％)是林奇综合征,在大部分林奇综合征和大约15％散发性结直肠的发病机制中MSI起到了决定性的作用。微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,MSI)在多种恶性肿瘤中广泛存在，在结直肠癌、肺癌、肝癌、食管癌、淋巴瘤、泌尿系肿瘤、生殖系统肿瘤、儿童胚胎性肿瘤等肿瘤中已报道存在MSI。
2017年，美国国家癌症综合治疗联盟(NCCN)在《直肠癌临床实践指南》(2017.V2)指出：1)所有结直肠癌病史者均应行常规的MMR或MSI检查，以鉴定林奇综合症。2)MSI-H直肠癌Ⅱ期患者的预后较好且不能从5-FU辅助治疗获益。另外，2017年FDA批准新药Keytruda用于所有具有高度微卫星不稳定性(MSI-H)或者错配修复缺陷(dMMR)实体瘤患者的治疗。因此，临床上对MSI的检测需求日益增加。
NR24是微卫星不稳定性检测的重要位点之一，当发生不稳定时单核苷酸重复数会出现改变。目前检测微卫星不稳定性的方法包括MMR蛋白免疫组化法、片段分析法、高效液相色谱技术、HRM法等。片段分析法是目前公认的金标准方法，但该方法成本较高，检测时间较长，并且必须在价格昂贵的测序仪上进行分析，大部分实验室无法开展检测。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种针对检测结直肠癌微卫星位点-NR24位点稳定性的引物对、试剂盒及HRM检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种检测微卫星NR24位点稳定性的方法，包括以下步骤：
(1)、分别以结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的DNA作为模板，采用如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列的引物对进行荧光定量PCR反应及HRM分析，收集荧光信号；
(2)、比较结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的熔解曲线，若肿瘤组织的熔解曲线显示出两个及以上的熔解峰，而正常组织的熔解曲线仅显示出一个熔解峰，则判断两者的峰型不一致，表示该患者NR24位点不稳定性，从而判断该患者为微卫星不稳定(MSI)型患者，反之，则表示该患者NR24位点稳定。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述荧光定量PCR的反应体系为：DNA模板1-5μL、10×Buffer 2-2.5μL、dNTP 2-2.5μL、Eva Green 1-1.25μL、SEQ ID NO:1引物1-1.25μL、SEQID NO:2引物1-1.25μL、Taq酶0.2-0.25μL、无酶水加至20-25μL。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃10min→95℃20s、55℃20s、72℃20s，40cycles→熔解温度75-87℃。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述收集荧光信号的频率为12次/℃。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述模板的浓度为50-100ng/μL。
本发明还提供了一种检测微卫星位点-NR24位点稳定性的试剂盒，所述试剂盒包括具有如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列的引物对。
在其中一些实施例中，所述检测试剂盒还包括饱和荧光染料。
在其中一些实施例中，所述饱和荧光染料为Eva Green。
在其中一些实施例中，所述检测试剂盒还包括Buffer、dNTP和Taq酶。
在其中一些实施例中，所述检测试剂盒由如下体积比的组分组成：10×Buffer：dNTP：Eva Green：SEQ ID NO:1引物：SEQ ID NO:2引物：Taq酶：无酶水＝2-2.5：2-2.5：1-1.25：1-1.25：1-1.25：0.2-0.25：12-15。
本发明还提供了一种检测微卫星位点-NR24位点稳定性的引物对，所述引物对具有如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的碱基序列。
本发明还提供了一种检测微卫星位点-NR24位点稳定性的反应体系，所述反应体系包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列的引物对。
在其中一些实施例中，所述反应体系还包括Eva Green、dNTP和Taq酶。
在其中一些实施例中，所述反应体系由如下体积的组分组成：DNA模板1-5μL、10×Buffer 2-2.5μL、dNTP 2-2.5μL、Eva Green 1-1.25μL、SEQ ID NO:1引物1-1.25μL、SEQ IDNO:2引物1-1.25μL、Taq酶0.2-0.25μL、无酶水加至20-25μL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的发明人经过多次探索发现，本发明的引物对敏感性及特异性都较高，采用本发明的引物进行HRM法检测NR24位点的稳定性，与北京阅微基因技术有限公司MSI检测试剂盒(金标准方法)相比，本发明方法灵敏度为100％，特异性达100％，完全能满足临床需求，且对设备的要求也大大降低，无需使用基因分析仪，只需一台带有HRM功能的荧光定量PCR即可；
2、本发明的检测方法只需在常规PCR基础上增加一些饱和染料，通过熔解曲线的差异即可分辨，样品经PCR扩增后直接进行HRM分析，PCR产物无需再转入其它分析装置，实现闭管操作，具有快速、低成本、灵敏性高等优点，操作程序大大简化，每检测一个样本的时间相较金标准方法缩短了约1小时，且成本降低了80％。
附图说明
图1中A、B为样品1的NR24位点的HRM分析图；其是使用引物对1进行检测的，肿瘤组织和对应正常组织的熔解曲线均只显示出一个熔解峰的结果，表明NR24位点为稳定型；C、D为样品1的NR24位点的毛细管电泳法结果图，显示NR24位点为稳定型。
图2中A、B为样品2的NR24位点的HRM分析图；其是使用引物对1进行检测的，肿瘤组织显示两个熔解峰，正常显示一个熔解峰的结果，表明NR24位点为不稳定型；C、D为样品2的NR24位点的毛细管电泳法结果图，显示NR24位点为不稳定型。
图3为样品2的NR24位点的分析图；其是使用引物对2进行检测的，肿瘤组织和对应正常组织的熔解曲线均显示出一个熔解峰的结果，错误判读NR24位点为稳定型；
图4为样品2使用引物对4进行检测的结果图，其中NR24位点扩增效率差。
具体实施方式
以下通过附图和具体实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
以下实施例中的步骤除了特殊说明外，均为本领域常规操作步骤，以下实施例中所使用的原料，均来源于市售。
实施例1检测微卫星位点-NR24位点的稳定性的方法
1、引物
本发明的一种检测微卫星位点-NR24位点的稳定性的引物，具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的碱基序列。
上游引物SEQ ID NO.1:TCCTGACTCCAAAAACTCTTCTCTT
下游引物SEQ ID NO.2:GCATTCCAACCTGGGTGACAGAGTG
反应体系
使用Blend Taq Plus酶(Toyobo，CAT NO.BTQ-201)配制如下反应体系：
名称 用量(μL)
10×Buffer 2.5
dNTP 2.5
EvaGreen 1.25
SEQ ID NO:1引物 1.25
SEQ ID NO:2引物 1.25
Taq酶 0.25
无酶水 15
3、检测方法
(1)、样品来源及基因组DNA提取：所有结直肠癌患者肿瘤样品及正常样品均来自中山大学附属第六医院病理科，收集组织，使用石蜡样品提取试剂盒对基因组DNA进行提取。和正常组织的DNA模板浓度分别调整至50-100ng/ul。在上述反应体系中分别加入1ul的DNA模板。涡旋混匀后，使用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪进行检测，程序如下：95℃10min→(95℃20s→55℃20s→72℃20s)40cycles→熔解温度75-87℃，收集荧光信号的频率为12次/℃。
(2)、将肿瘤组织的熔解曲线与正常组织的熔解曲线进行对比，判读待测标本NR24位点的稳定性。若肿瘤组织的熔解曲线显示出两个及以上的熔解峰，而该病人正常组织的熔解曲线仅显示出一个熔解峰，则判断两者的峰型不一致，表示该患者NR24位点不稳定性，从而判断该患者为微卫星不稳定(MSI)型患者。反之，若肿瘤组织和正常组织的熔解曲线均为单峰，则判断两者的峰型一致，表示该患者NR24位点稳定。
实施例2检测微卫星位点-NR24位点的稳定性的试剂盒
本实施例的检测试剂盒包括以下组分：10×Buffer、dNTP、Eva Green、SEQ ID NO:1引物、SEQ ID NO:2引物、Taq酶。
试验例1采用不同引物对检测微卫星位点-NR24位点的稳定性的结果对比
发明人摸索了多组引物对，研究HRM法(实施例1的方法)对检测上述结直肠癌患者肿瘤NR24位点的实验结果的影响。表1为采用多组示例性引物，按实施例1的方法进行实验所得的结果。HRM法结果与片段分析法商品化试剂盒(北京阅微基因技术有限公司MSI检测试剂盒)结果进行比对。商品化试剂盒工作步骤参照产品说明书，此处不赘述)。实验证明，引物的最终选择关乎方法的可行性。
表1采用5对引物对和峰型、判读结果比较
注：上表采用HRM检测法，其PCR程序总共设置40个循环。样品扩增CT值以18-25为佳，若样品扩增CT值不在该范围内，则判读为该次PCR反应扩增效果不好或无法扩增，最后有可能会影响扩增产物的量和后续的HRM分析。
表1结果显示，样本2使用商品化试剂盒检测判读为NR24位点不稳定型，使用上述五对引物，分别按本发明实施例1所述HRM法进行检测。发现只有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示引物(即上列表中引物对1)可以准确判读样本2的NR24位点为不稳定型，其余四对引物(即上列表中引物对2-5)均无法准确判读。
试验例2本发明的方法与片段分析法试剂盒的检出率比较
1、样本
109对(即肿瘤组织及其对应正常组织，编号1-109)结直肠癌患者样品均来自于中山大学附属第六医院病理科。按照实施例1中所述方法分别提取基因组DNA。
2、方法
本发明方法
步骤如实施例1，采用的引物为：F:TCCTGACTCCAAAAACTCTTCTCTT(SEQ ID NO:1)R:GCATTCCAACCTGGGTGACAGAGTG(SEQ ID NO:2)，对109对样品一一进行检测。
片段分析商品化试剂盒方法
选用片段分析法商品化试剂盒北京阅微基因技术有限公司MSI检测试剂盒，其工作原理是以荧光PCR为基础结合毛细管电泳来检测微卫星不稳定性。工作步骤参照产品说明书，此处不赘述。该方法是目前现有技术中较受认可的方法，被称为金标准方法。
3、检测结果
对待测109例标本均进行了两种方法的检测，其中本发明所述HRM方法与商品化试剂盒结果完全一致，如表2所示。
表2本发明的HRM方法与商品化试剂盒的检测结果比较
由表2结果可知：109对标本中，本发明方法灵敏度＝81/(81+0)×100％＝100％，特异性＝28/(28+0)×100％＝100％，本发明方法与金标准方法相比特异性和敏感性均为100％，完全能满足临床检测需求。
试验例3本发明方法检测与毛细管电泳法试剂盒检测的时间及成本对比
计算方法：针对试验例2中使用两种方法均有检测结果的109对待测标本进行核算，结果如表3所示。
表3本发明方法与毛细管电泳法试剂盒的检测时间和成本的比较
HRM法 商品化试剂盒片段分析法
实验花费时间估算 2小时/标本 3小时/标本
实验成本估算 10元/标本 450元/标本
由表3结果可知，使用本发明方法进行微卫星不稳定性-NR24位点的检测，每个标本的检测时间比商品化试剂盒片段分析法缩短了33.3％，同时每个标本的检测成本降低了97.8％。使用本发明的所述方法进行微卫星不稳定性-NR24位点检测，可以大大节约检测时间和成本，更好的服务临床病人。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 傅新晖
林汉杰
陈志婷
黄京林
王磊
汪建平
<120> 检测微卫星NR24位点稳定性的引物对、试剂盒及方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
tcctgactcc aaaaactctt ctctt 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
gcattccaac ctgggtgaca gagtg 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
cttctcttcc ctgggcccag tccta 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
tgcagtgagc ggagattgtg ccatt 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
taacgtgatc cccattgctg aattt 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
gtgccattgc attccaacct gggtg 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
ccattgctga attttacctc ctgac 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
gcggagattg tgccattgca ttcca 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
atctgaatat ttaaggtctg cctta 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 10
cattccaacc tgggtgacag agtga 25

Claims (10)

1.一种检测微卫星NR24位点稳定性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、分别以结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的DNA作为模板，采用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列的引物对进行荧光定量PCR反应，收集荧光信号，绘制熔解曲线；
(2)、分析结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的熔解曲线。
2.根据权利要求1所述的检测微卫星NR24位点稳定性的方法，其特征在于，步骤(1)所述荧光定量PCR的反应体系为：DNA模板1-5μL、10×Buffer 2-2.5μL、dNTP 2-2.5μL、EvaGreen 1-1.25μL、SEQ ID NO:1引物1-1.25μL、SEQ ID NO:2引物1-1.25μL、Taq酶0.2-0.25μL、无酶水加至20-25μL。
3.根据权利要求1所述的检测微卫星NR24位点稳定性的方法，其特征在于，步骤(1)所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃10min→95℃20s、55℃20s、72℃20s，40cycles→熔解温度75-87℃。
4.根据权利要求1所述的检测微卫星NR24位点稳定性的方法，其特征在于，步骤(1)中收集荧光频率为12次/℃。
5.根据权利要求1所述的微检测卫星NR24位点稳定性的方法，其特征在于，步骤(1)所述模板的浓度为50-100ng/μL。
6.一种检测微卫星NR24位点稳定性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括具有如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列的引物对。
7.根据权利要求6所述的检测微卫星NR24位点稳定性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括饱和荧光染料。
8.根据权利要求7所述的检测微卫星NR24位点稳定性的试剂盒，其特征在于，所述饱和荧光染料为Eva Green。
9.根据权利要求8所述的检测微卫星NR24位点稳定性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Buffer、dNTP和Taq酶。
10.一种检测微卫星NR24位点稳定性的引物对，其特征在于，所述引物对具有如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的碱基序列。
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