CN103562218A

CN103562218A - 显性负性hsp110突变体及其在预测和治疗癌症中的用途

Info

Publication number: CN103562218A
Application number: CN201280025365.9A
Authority: CN
Inventors: 卡芒·加里多; 亚历克斯·杜尔
Original assignee: NATIONAL HEALTH AND MEDICINE INST; Universite de Bourgogne
Current assignee: NATIONAL HEALTH AND MEDICINE INST; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Bourgogne
Priority date: 2011-03-24
Filing date: 2012-03-26
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2032-03-26
Also published as: EP2688907B1; IL228552A0; JP6045563B2; CA2830787C; WO2012127062A1; US20150377892A1; JP2014512174A; EP2688907A1; ES2575980T3; US20140038900A1; AU2012230259B2; IL228552B; AU2012230259A1; US10175244B2; CN103562218B; CA2830787A1; DK2688907T3

Abstract

本发明涉及缺乏其底物结合域的突变的热休克蛋白110(HSP110)，其不表现出其伴侣活性和／或不能结合热休克蛋白70(HSP70)和／或热休克蛋白27(HSP27)，但是它能够结合野生型HSP110。这种突变的热休克蛋白110可(i)用于预测患有癌症，更特别是患有易于具有微卫星不稳定性(MSI)表型的癌症，如结肠直肠癌(CRC)的患者的生存率和／或对治疗的反应的方法，及(ii)用于治疗癌症。

Description

显性负性HSP110突变体及其在预测和治疗癌症中的用途

技术领域

本发明涉及缺乏其底物结合域的突变的热休克蛋白110(HSP110)，其不展现其伴侣活性和／或不能结合热休克蛋白70(HSP70)和／或热休克蛋白27(HSP27)，但是其能够结合野生型HSP110。这种突变的热休克蛋白110可(i)用于预测患有癌症，更特别地患有易于具有微卫星不稳定性(MSI)表型的癌症，如结肠直肠癌(CRC)的患者的生存率和／或对治疗的反应的方法，及(ii)用于治疗癌症。

背景技术

HSP蛋白和HSP110

热休克蛋白(HSP)是一类功能上相关的蛋白质，被称为伴侣蛋白，当细胞暴露于高温或其它应力，如感染、炎症、运动、细胞接触毒素(乙醇、砷、痕量金属和紫外线，等等)、饥饿、缺氧(氧不足)、缺氮(植物中)或缺水时，它们的表达增加。因此，热休克蛋白也被称为应激蛋白，且其上调有时更普遍地被描述为应激反应的一部分。HSP蛋白的伴侣活性由它们的ATP结合域介导且是蛋白质折叠、蛋白质复合物的形成、蛋白质的跨膜转运和将它们中的一些靶向溶酶体降解所必不可少的。在人类中，至少有八个HSP蛋白，包括HSP70和HSP110。自20世纪90年代中期，已知HSP70癌细胞(细胞系和肿瘤)中以与较差分化、在转移和耐各种细胞毒性剂的倾向中的高增殖能力相关的模式大量表达。

像其它的应力可诱导热休克蛋白一样，HSP110，也被称为HSP105，保护细胞免受不利条件。然而，由于在酵母和果蝇中的HSP110基因敲除是致死的，HSP110还提供特定的重要功能(Trott等，Genetics170(3)，1009(2005))。HSP110不仅作为HSP70的核苷酸交换因子(Andreasson等，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America105(43)，16519(2008))，还具有伴侣抗聚集活性。它结合和稳定变性的蛋白质底物的效率是HSC70和HSP70的约四倍(Wang等，Cancer research63(10)，2553(2003))。此外，已知HSP110可以作为HSP70的诱导剂，从而与HSP70一起在保护细胞抵御有害的应激物中发挥了重要的作用。最近，已经证明，HSP110在癌细胞中异常积聚，据信这提高了其生存率((Yamagishi等，The FEBS journal275(18)，4558(2008)；Hosaka等，Cancer science97(7)，623(2006)；Yamagishi等，Experimental cell research312(17)，3215(2006)；Siatskas等，Faseb J19(12)，1752(2005))。HSP110在结肠癌细胞中特别强烈地表达(Kai等，Oncology reports10(6)，1777(2003))，且微卫星稳定(MSS)原发性结肠直肠癌(CRC)的基因表达谱分析已将HSP110表达与转移和不良预后相联系(Slaby等，Oncology reports21(5)，1235(2009))。

微卫星不稳定表型和微卫星稳定表型

癌症的一个亚组的特征在于错配修复(MMR)缺陷，特别是因为灭活改变MMR基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2。其结果是，这些肿瘤表现出一个特定的表型，称为“微卫星不稳定性，，或“MSI”，其特征在于影响微卫星重复序列的整体不稳定现象。具有MSI表型的肿瘤可发生在罕见的遗传性综合征的情况下，如Lynch综合征或构成性错配修复缺陷(CMMR-D)或散发性地发生在10％至15％的结肠直肠癌、胃癌和子宫内膜癌中和在其它许多肿瘤中的较轻程度(Duval和Hamelin，Annales de génétique45：71-75(2002))。

Lynch综合征是由于参与DNA复制过程中的错配修复的被称为“MMR基因”的四个基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS2之一中的常染色体突变。患Lynch综合征的患者在他们成年时有70％的风险发展为结肠癌和影响子宫内膜、卵巢、胃、小肠、肝、上泌尿系统、脑和皮肤的各种癌症。

此外，CMMR-D／Lynch3综合征是由于MMR基因中双等位基因有害种系突变(Ricciardone等，Cancer Res.59：290-3(1999)；Wang等，Cancer Res.59：294-7(1999))，且其特征在于儿童肿瘤的发展和患者之间非常不同的极大的临床谱。肿瘤主要是淋巴瘤、白血病、星形胶质细胞源性脑肿瘤和／或非常早发性结直肠肿瘤。其它症状，称为呼叫症状，如非典型“咖啡牛奶斑”点，通常在CMMR-D患者中观察到，但是也存在于一般群体的健康受试者中。它们允许在癌症出现之前识别，即使不是特异性的，在一般群体中有CMMR-D综合征风险的个体。

在散发性MSI癌症，如结肠直肠癌、胃癌或子宫内膜癌中，MMR缺陷是由于无论肿瘤的初始位点，通过超过90％的情况下其启动子位点的从头甲基化，MLH1表观遗传和双等位基因沉默(Kane等，CancerResearch57：808-811(1997))。散发性MSI癌症并非限于结肠直肠癌、胃癌或子宫内膜癌，也可以包含膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、胶质母细胞瘤，星形细胞瘤和神经母细胞瘤。

MMR系统的正常功能是识别和修复DNA复制和重组过程中产生的碱基的错误插入、缺失和错误掺入，以及修复DNA损伤的一些形式。现在已经完全确定，MMR缺陷本身不是直接转化事件，且MSI肿瘤通过其特征在于整个基因组的众多微卫星重复序列的遗传不稳定性的独特的分子途径发展(Duval和Hamelin，Cancer research62(9)，2447(2002))。大部分关于引起MSI癌变的机制的公开文章已经涉及结肠直肠癌(CRC)的研究。这些文章揭示MSI CRC包含主要肿瘤类型的独特和可选择组，称为CIN(对于“染色体不稳定性，，；对于“微卫星稳定的”，也称为MSS)(Walther等，Gut57(7)，941(2008))。除了编码重复序列的遗传不稳定性，MSI肿瘤细胞积聚整个基因组的非编码微卫星重复序列的数百个改变(Giannini等，Oncogene23(15)，2640(2004))，但癌变中的这些突变的功能性后果尚未进行彻底研究。

给定的肿瘤的MSI状态可以通过查看一组5个微卫星遗传标志物：BAT25、BAT26、NR21、NR24和NR27中的微卫星不稳定性来确定。在这些标志物中的两个或更多个具有不稳定性的肿瘤被定义为高MSI(.MSI-H)，而一个标志物具有不稳定性或不表现不稳定性的肿瘤分别定义为低MSI(MSI-L)和微卫星稳定(MSS)的肿瘤。MSI-H癌症与MSI-L和MSS肿瘤具有不同的临床病理特征，MSI-L和MSS肿瘤被认为具有相同的临床和分子特征，且MSI-H和MSI-L／MSS肿瘤之间的区别对其预后和治疗是非常重要的(Duval和Hamelin，Annales de génétique45：71-75(2002))。例如，已知结肠直肠癌的MSI状态(即肿瘤分类为MSI-H或MSI-L／MSS)是在II期和III期结肠癌中用氟尿嘧啶的基于佐剂的化疗的优势的预测(Ribic等，N Engl JMed349：247(2003))。因此，将结直肠肿瘤识别和分类为MSI状态为医生提供了关于患者的诊断、预后和最佳治疗方案的关键信息。

虽然MSI癌症现在被认为代表一个不同的肿瘤实体，但目前还没有考虑到这些肿瘤中观察到的细胞转化的独特模式的具体的治疗方法。此外，MSI CRC已经一贯被报道为显示对化疗剂的不同的预后和反应(Sargent等，J Clin Oncol28(20)，3219(2010)；Zaanan等，Ann Oncol21(4)，772(2010))，其仍无法进行评估。

因此，需要鉴定用于预测患有癌症，更具体地患有易于具有MSI表型的癌症的患者的生存率、和用于评估他们对治疗的反应的标志物。还需要开发特别适于MSI和MSS癌症的治疗，考虑其临床和分子的特异性。

发明描述

发明人在MSI CRC细胞系和原发性肿瘤或腺瘤中意外地鉴定了突变形式的HSP110蛋白，其由缺乏外显子9的异常剪接的mRNA产生，因此缺乏野生型HSP110的氨基酸381至858。发明人还鉴定了影响位于HSPH1基因，即编码HSP110蛋白的基因的内含子8的剪接受体位点中的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列的缺失。已经发现，影响所述微卫星重复序列的缺失长度与突变的HSP110mRNA和蛋白的表达水平相关，从而表明，微卫星重复序列的缺失是导致突变的HSP110异常表达的致病事件。此外，已经发现，突变的HSP110的表达损害HSP110的正常细胞定位和其与其它HSP的相互作用，从而以显性负性的方式消除其分子伴侣活性和其抗凋亡功能。

令人惊奇地发现，突变的HSP110不仅丧失其抗凋亡性能，而且与野生型HSP110相关，从而以剂量依赖的方式阻断野生型HSP110的抗凋亡功能。也就是说，突变的HSP110蛋白是一种显性负性突变体。

不受任何理论的约束，发明人认为，突变的HSP110的该促凋亡作用，特别是当突变的HSP110的表达水平相似于或高于野生型HSP110的表达水平时所观察到的，是由于这样的事实：即每分子突变的HSP110与一个分子的野生型HSP110形成复合物，从而以显性负性的方式中和野生型HSP110的活性。因此，表达突变的HSP110的细胞对细胞凋亡更加敏感，特别是化疗药物诱导的细胞凋亡。

其结果是，可以将突变的HSP110施用于患有癌症，特别是具有MSI或MSS表型的癌症，和更特别地结肠直肠癌的患者，从而增加对细胞凋亡和／或对化疗药物的敏感性。

此外，已经发现，突变的HSP110的表达谱可用作预测生存率和对治疗的反应的早期和可靠的标志物。事实上，突变的HSP110的高表达水平与良好的预后和对治疗的积极响应相关。

定义

术语“野生型HSP110”是指热休克110kDa蛋白。野生型HSP110的氨基酸序列如SEQ ID NO：2(Swiss-Prot登录号Q92598，更新于2011年3月8日，版本119)所示。术语“野生型HSP110”涵盖SEQ IDNO：2(全长和成熟的同种型)的蛋白质，以及在其它物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体、剪接变体和其等位基因变体。

术语“癌症”是指或描述典型特征在于失控的细胞生长的哺乳动物中的生理病症。据说癌症可以是散发性或遗传性癌症。所述癌症可以是腺瘤(即良性肿瘤，其可能演变成为恶性)或恶性肿瘤(即原发性肿瘤或转移瘤)。癌症的实例包括，但不限于，肉瘤、癌、白血病、淋巴瘤、生殖细胞肿瘤和母细胞瘤。

在一个优选的实施方式中，所述癌症是易于具有MSI表型的癌症。“易于具有MSI表型的癌症”是指其中可能存在(MSI)或不存在(MSS)微卫星不稳定性的散发性或遗传性癌症。检测是否存在微卫星不稳定性，可以例如通过对微卫星标志物，如BAT25、BAT26、NR21、NR24和NR27进行基因分型，例如，如Buhard等，J Clin Oncol24(2)，241(2006)中和在EP11305160.1号欧洲专利申请中所描述的。如果在至少2个微卫星标志物中检测到不稳定性，则将癌症定义为具有MSI表型。相反，如果在一个微卫星标志物中检测到不稳定性或没有在微卫星标志物中检测到不稳定性，则所述癌症具有MSS表型。

易于具有MSI表型的癌症的实例包括腺瘤或原发性肿瘤，如结肠直肠癌(也称为结肠癌或大肠癌)、胃癌、子宫内膜癌、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤和神经母细胞瘤。优选地，癌症是结肠直肠癌。仍然优选地，癌症是II期或III期结肠直肠癌。

散发性癌症易于具有MSI表型可以指由于错配修复(MMR)基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2之一的体细胞遗传改变的癌症。例如，易于具有MSI表型的散发性癌症可以是由于MLH1基因的启动子的从头双等位基因甲基化引起的癌症。

易于具有MSI表型的遗传性癌症可以指发生在Lynch综合征或构成性错配修复缺陷(CMMR-D)的情况下的癌症。

患有Lynch综合征的患者被定义为具有四个基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS2之一中常染色体突变的患者。

患有CMMR-D的患者被定义为具有四个基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS2之一中种系双等位基因突变的患者。

“II期结肠直肠癌”是指无淋巴结扩散和无远处侵入的肿瘤(American Joint Comittee on Cancer”2010，第14章173-201页)。

“III期结肠直肠癌”是指具有淋巴结扩散的肿瘤(American JointComittee on Cancer”2010，第14章173-201页)。

如本文所使用，患者是人或非人哺乳动物，特别是啮齿动物、猫科、犬科、牛科或羊科哺乳动物。在一个优选的实施方式中，患者是人患者。更特别的是，患者是孩子、成人、男人或女人。

“治疗”是指，但不限于，化疗治疗和／或放射治疗和／或手术治疗。如本文所用，术语“治疗”涵盖治疗方法，例如旨在治愈、改善患者的病症和／或延长患有癌症的患者的寿命。它也涵盖预防疾病的方法，如旨在预防转移的出现或扩散的方法，以及旨在预防复发的方法。化疗治疗可以例如与烷化剂，例如，如奥沙利铂一起进行。化疗治疗也可以是佐剂化疗治疗，例如使用5-氟尿嘧啶试剂的化疗治疗。在一些实施方式中，所述化疗治疗可结合至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或最多10、9、8、7、6、5、4、3、2种试剂，如，例如奥沙利铂、5-氟尿嘧啶和亚叶酸的组合，即FOLFOX治疗，或5-氟尿嘧啶和亚叶酸的组合，即FUFOL或LV5FU2治疗。

如本文所用，术语“位于编码热休克蛋白110(HSP110)的基因的内含子8的剪接受体位点中的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列”是指序列SEQ ID NO：9：GAAAACCCTGTCCATCCATTGGAATTGAGTTTTATATTAAAAGATGACTGGGAAGTGTTCATGTGCTCATGATTTTTTTTTTTTTTTTTAAGTGTGCAATACTTTCCCCTTTCCCCGGCATTTAAAGTTAGAGAATTTTCCGTCACAGATGCAGTTCCTTTTCC的第73位和第89位之间包含的胸苷重复。

突变的热休克蛋白110

本发明的第一个方面是突变的热休克蛋白110(HSP110)，其中所述蛋白质：

a)不展现分子伴侣活性和／或不能结合热休克蛋白70(HSP70)和／或热休克蛋白27(HSP27)；和

b)能够结合SEQ ID NO：2的野生型HSP110蛋白。

在一个优选的实施方式中，突变的HSP110蛋白缺乏SEQ ID NO：2的氨基酸381至858所组成的结构域。在另一个优选的实施方式中，突变的HSP110蛋白由缺乏外显子9的mRNA编码。编码HSP110的基因的外显子9例如描述在NCBI参考序列NM_006644.2(2010年12月27日公布的版本)中位置1536和1642之间。

在另一个优选的实施方式中，突变的HSP110蛋白包含或由至少80％与SEQ ID NO：1相同的氨基酸序列组成，优选至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％与SEQ ID NO：1相同。最优选地，突变的HSP110蛋白包含或由SEQ ID NO：1组成。

具有至少，例如，95％与本发明的目标(query)氨基酸序列“相同的”氨基酸序列的蛋白质意欲指主题蛋白质的氨基酸序列与目标序列相同，除了主题蛋白质序列在目标氨基酸序列的每100个氨基酸可包括最多5个氨基酸的改变。换句话说，为了获得与目标氨基酸序列有至少95％相同的氨基酸序列的蛋白质，主题序列中的最高达5％(100个中的5个)的氨基酸残基可被插入、缺失或被另一个氨基酸取代。

在本申请的范围中，同一性百分比使用总体序列对比(即，两个序列以其整个长度进行比较)来计算。用于比较两个或更多个序列的同一性和同源性的方法在本领域中是众所周知的。例如可以使用《needle》程序，它使用Needleman-Wunsch总体序列对比算法(Needleman和Wunsch，1970J.Mol.Biol.48：443-453)当考虑其整个长度时找出两个序列的最佳比对(包括缺口)。needle程序例如可在ebi.ac.uk万维网站上获得。根据本发明的同一性百分比优选使用EMBOSS：：needle(总体)程序用“Gap Open”参数等于10.0，“GapExtend”参数等于0.5，和Blosum62矩阵来计算。

包含或者由“至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％与参考序列相同的”氨基酸序列组成的蛋白质与参考序列相比可以包含突变，如缺失、插入和／或取代。在取代的情况下，优选取代对应于保守取代，如下表所示。在一个优选的实施方式中，包含或由至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％与参考序列相同的氨基酸序列组成的蛋白质只有保守取代与参考序列不同。在另一个优选的实施方式中，包含或由至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％与参考序列相同的氨基酸序列组成的蛋白质对应于参考序列的天然存在的等位基因变体。在又一个优选的实施方式中，包含或由至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％与参考序列相同的氨基酸序列组成的蛋白质对应于来自于除参考序列以外的另一种非人类的哺乳动物物质的同源序列。

根据本发明的突变的HSP110蛋白不表现出伴侣活性和／或不能结合热休克蛋白70(HSP70)和／或热休克蛋白27(HSP27)，但它们能够结合SEQ ID NO：2的野生型HSP110蛋白。

“伴侣活性”是指，不限于，使蛋白质折叠、蛋白质复合物形成、蛋白质的跨膜转运和将它们中的一些靶向溶酶体降解的能力。本领域技术人员可以容易地确定突变的HSP110是否具有伴侣活性。例如，可以使用如实施例1的题为“HSP110伴侣活性”的段落中所描述的蛋白质热敏性分析来测定伴侣活性。

在整个本说明书中，术语“结合”具有其在本领域中的通常含义。特别是，术语“结合”是指特异性结合，与非特异性结合相对。本领域技术人员可以容易地确定突变的HSP110是否能够结合HSP70、HSP27和／或野生型HSP110。例如，突变的HSP110结合HSP70、HSP27和／或野生型HSP110的能力可以通过如实施例1的题为“免疫沉淀和Western印迹”的段落中所描述的免疫沉淀分析来测定。

本发明进一步涉及包含或由至少80％与SEQ ID NO：1相同的氨基酸序列组成的突变的HSP110蛋白的片段，优选至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％与SEQ ID NO：1相同，条件是所述片段保留了与突变的HSP110蛋白相同的生物活性(即它们不表现出伴侣活性和／或不能结合HSP70／或HSP27，但它们能够结合SEQ ID NO：2的野生型HSP110蛋白)。这些片段优选包含或由上述突变的HSP110蛋白的至少5个相连的(连续的)氨基酸组成。优选地，所述片段包含或由至少6、8、10、12、15、18、20、25、30、50、75、100、125、150、200、250、275、300、325、350、375个突变的HSP110的连续的氨基酸组成。还优选地，所述片段是肽，即，它由至多50个氨基酸组成。

本发明还涉及根据本发明的突变的HSP110蛋白的肽模拟物或片段。如本文所用，术语“肽模拟物”是指含有模拟根据本发明的突变的HSP110蛋白的生物作用的非肽结构成分的化合物。用于设计和合成给定的蛋白质的肽模拟物的方法在本领域中是熟知的，并且包括例如，在Ripka和Rich，Curr Opin Chem Biol2(4)：441-52(1998)和在Patch和Barron，Curr Opin Chem Biol6(6)：872-7(2002)中所描述的那些。

本发明进一步涉及分离的核酸，其包含或由编码如上文描述的突变的HSP110序列组成。

在一个优选的实施方式中，分离的核酸包含或由至少80％与SEQID NO：3相同的核苷酸序列组成，优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％与SEQ IDNO：3相同，更优选分离的核酸包含或由SEQ ID NO：3组成。

“核酸分子”是指或单链形式或双链螺旋的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或其任何磷酸酯类似物，如硫代磷酸酯和硫酯。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，特别是DNA或RNA分子，仅仅是指分子的初级和次级结构，并且不限于任何特定的三级形式。因此，该术语包括双链DNA环，以及，线性(例如，限制片段)或环状DNA分子、质粒和染色体。在讨论特定的双链DNA分子结构中，本文根据仅给出沿非转录的DNA链的5′到3′方向的序列的正常惯例描述序列(即，具有与mRNA同源的序列的链)。“重组DNA分子，，是已经经历分子生物学操作的DNA分子。

本发明的另一个方面提供了载体，例如，表达载体，包含本发明的核酸分子。在另一个实施方式中，本发明提供了含有和／或表达这种载体的宿主细胞(例如，细菌、酵母、真菌或哺乳动物宿主细胞)。本发明还提供了用于通过在合适的介质中培养如本发明的宿主细胞而产生根据本发明的重组突变的HSP110蛋白的方法。所述方法可以进一步包括纯化根据本发明的重组突变的HSP110的步骤，和任选地将其配制成药物组合物。

这种核酸意欲使用腺病毒载体，和／或在基因治疗范围内向患者施用。

本发明还涉及特异性地识别根据本发明的突变的HSP110蛋白的抗体。

在一些实施方式中，所述抗体能够识别根据本发明所述的突变的HSP110蛋白，但是不能识别野生型HSP110蛋白，如序列SEQ ID NO：2的野生型HSP110蛋白。

优选地，所述抗体能够识别序列SEQ ID NO：1的突变的HSP110蛋白。

“特异性结合”靶蛋白的抗体以比结合其它蛋白质或表位(即使是密切相关的蛋白质或表位)更大的亲和力和／或亲和性结合所述靶蛋白。优选地，本发明的抗体以比其结合序列SEQ ID NO：2的野生型HSP110蛋白更大的亲和力和／或亲和性结合如本文所述的突变的HSP110蛋白，如包含或由SEQ ID NO：1的序列组成的蛋白质。通常，当通过表面等离子体共振(SPR)技术在Biacore3000仪器中使用突变的HSP110作为配体和使用抗体作为分析物所测定的，抗体以对应于约10^-7M或更小，如约10^-8M或更小，例如约10^-9M或更小，约10^-10M或更小，或约10^-11M或更小的K_D的亲和力结合。抗体可以以对应于以下K_D的亲和力结合靶标，所述K_D比它结合非特异性抗原(例如，野生型HSP110，BSA，酪蛋白)的亲和力低至少10倍，如低至少100倍，例如低至少1000倍，如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍。亲和力较低的量依赖于抗体的K_D，这样，当抗体的K_D非常低时(即，该抗体是高度特异性的)，则对于该抗原的亲和力的量比对于非特异性抗原的亲和力可以低至少10,000倍。

本文中短语“识别抗原的抗体”和“抗原的特异性抗体”可以与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。

如本文所用，术语“K_d”(sec^-1)，意欲指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡速率常数。所述值也称为K_off值。

如本文所用，术语“K_a”(M^-1×sec^-1)，意欲指特定的抗体-抗原相互作用的结合平衡速率常数。

如本文所用，术语“K_D”(M)，意欲指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。

如本文所用，术语“K_A”(M^-1)，意欲指特定的抗体-抗原相互作用的结合平衡常数，且通过k_a除以k_d获得。

如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类型(例如IgG1、1gG2、1gG3、1gG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。

术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，术语抗体不仅涵盖整个抗体分子，也涵盖抗体片段以及抗体变体，包括衍生物，例如，人源化抗体。在天然抗体中，两条重链通过二硫键彼此连接，且每条重链通过二硫键与轻链链接。有两种类型的轻链，λ(λ)和κ(κ)。有五种主要的重链类型(或同种型)，其确定抗体分子：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE的功能活性。每一条链包含不同的序列域。轻链包括两个结构域，可变区(VL)和恒定区(CL)。重链包括四个结构域，一个可变区(VH)和三个恒定区(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区确定与抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区赋予重要的生物学特性，如抗体链结合、分泌、跨胎盘活动性、补体结合和结合Fc受体(FcR)。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-端部分，且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补。抗体结合位点由主要来自高度可变区或互补决定区(CDR)的残基所组成。有时，来自非高度可变区或框架区(FR)的残基影响整体的域结构，并因此影响结合位点。互补决定区(CDR)是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有3个CDR，分别称为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原结合位点包括6个CDR，包含来自每一个重链和轻链V区的CDR组。

框架区(FR)是指插在CDR之间的氨基酸序列，即是指免疫球蛋白轻链和重链可变区的那些部分，其在单一物种中的不同免疫球蛋白间是相对保守的，由Kabat等所定义(Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1991)。如本文所用，“人框架区”是与天然存在的人抗体的框架区基本相同(约85％或更多，特别是90％、95％或100％)的框架区。

如本文所使用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指单个氨基酸组成的抗体分子，其对抗特异性抗原，并且可以由B细胞或杂交瘤的单个克隆产生。单克隆抗体也可以是重组的，即由蛋白质工程所产生。

术语“嵌合抗体”是指含有来自于非人类的动物的抗体的VH区和VL区的工程抗体，与另一种抗体特别是人抗体的CH区和CL区相关。作为非人类动物，可以使用任何动物如小鼠、大鼠、仓鼠、兔或类似动物。嵌合抗体也可以指具有至少两种不同的抗原特异性的多特异性抗体。

术语“人源化抗体”是指与母体免疫球蛋白相比，其中框架区或“互补决定区”(CDR)已被修饰以包含来自不同特异性的供体免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选的实施方式中，将小鼠CDR移植到人抗体的框架区来制备“人源化抗体”。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fv、Fab、F(ab′)2、Fab′、dsFv、scFv、sc(Fv)2、由抗体片段形成的双抗体和多特异性抗体。

术语“Fab”表示具有约为50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中用蛋白酶、木瓜蛋白酶处理IgG获得的片段中约一半的H链的N-端侧链和整个L链通过二硫键结合在一起。

术语“F(ab′)₂”是指具有约为100,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，在用蛋白酶、胃蛋白酶处理IgG获得的片段中，其略大于通过铰链区的二硫键结合的Fab。

术语“的Fab′”是指具有约为50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其通过切割F(ab′)₂的铰链区的二硫键获得。

单链Fv(“scFv”)多肽为共价连接的VH：：VL异源二聚体，其通常从包括编码由编码肽的接头连接的基因的VH和VL的基因融合表达。本发明的人scFv片段包括优选通过使用基因重组技术而保持在适当的构象中的CDR。“dsFv”是通过二硫键稳定的VH：：VL异源二聚体。二价和多价抗体片段可以通过自发地结合单价的scFv而形成，或可以通过由肽接头如二价的sc(Fv)₂耦合单价scFv而产生。

术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含的重链可变区(VH)连接同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变区(VL)。通过使用足够短的接头，以使得同一链上的两个区之间不能配对，该区被迫与另一链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。

根据本发明的预测方法和用途

已经发现，位于编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体位点中的17个胸苷的微卫星重复序列的核苷酸的缺失，和突变的HSP110存在于MSI CRC，且缺失的长度影响突变的HSP110的表达。更确切地，已经发现3个胸苷的缺失与突变的HSP110mRNA和蛋白的低表达相关，且8个胸苷的缺失与突变的HSP110mRNA和蛋白的高表达相关。还发现突变的HSP110的表达水平与预测生存率和／或对治疗的反应相关。此外，已经发现，突变的HSP110能够与野生型HSP110以显性负性方式形成复合物，从而阻断其抗凋亡作用。更具体地，已经发现，突变的HSP110蛋白能与野生型HSP110蛋白以显性负性方式形复合物，从而阻断其抗凋亡作用。因此，表达高水平的突变的HSP110的肿瘤细胞(其通常是具有MSI表型的肿瘤)对细胞凋亡，尤其对化疗治疗诱导的细胞凋亡更加敏感。

也已经发现，位于编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体位点中17个胸苷的微卫星重复序列的长度与预测生存率和／或对治疗的反应相关。已经发现，患有具有MSI表型的III期结肠直肠癌并携带大缺失的患者有着良好的生存率预后。此外，已被发现，用化疗治疗的患有具有MSI表型的II期或III期结肠直肠癌并在所述的微卫星重复序列中携带大缺失，即缺失至少5个胸苷的患者，也有着良好的生存率和／或对化疗的反应的预后。

当然，可以通过测定17个胸苷的微卫星重复序列的胸苷重复长度，即重复中胸苷的数目来测定缺失的大小。

如本文所用，测定所述的17胸苷核苷酸的微卫星重复序列的胸苷重复的长度，相当于测定在所述的17胸苷核苷酸的微卫星重复序列内胸苷缺失的长度。

因此，本发明的一个方面涉及使用位于编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体位点中17个胸苷的微卫星重复序列和／或突变的HSP110(即mRNA和／或蛋白质)和／或如上文所描述的片段作为用于预测患有癌症，特别是患有易于具有MSI表型的癌症的患者的生存率和／或对治疗的反应的生物标志物。突变的HSP110(即mRNA和／或蛋白)增加量指示生存率和／或对治疗的反应的良好预后。小的胸苷缺失，即3或4个胸苷，指示生存率和／或对治疗的反应的不良预后，和大的胸苷缺失，即5至8个胸苷，指示生存率和／或对治疗的反应的良好预后。

在一些实施方式中，本发明还涉及使用位于编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体位点中17个胸苷的微卫星重复序列和／或如上文所描述的突变的HSP110核酸和／或HSP110蛋白和／或如上文所描述的其片段，作为预测患有癌症，特别是患有易于具有MSI表型的癌症的患者的生存率和／或对治疗的反应的生物标志物。

在一些实施方式中，等于或小于4个缺失的小的胸苷缺失指示生存率和／或对治疗的反应的不良预后，和大的胸苷缺失，即等于或大于5个胸苷，指示生存率／或对治疗的反应的良好预后。

“用作生物标志物”是指体外用途，其中可例如使用配体、抗体、探针和／或引物来检测突变的HSP110，和其中可通过基因分型或测序来检测胸苷缺失的长度。因此，本发明还涉及使用用于检测患有癌症的患者的生物样品中微卫星重复序列和／或突变的HSP110的胸苷缺失的长度的工具。

本发明还涉及用于预测患有癌症的患者的生存率和／或对治疗的反应的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)测量所述患者的生物样品中如上所述的突变的热休克蛋白110(HSP110)的表达水平；和／或

b)测定位于所述患者的生物样品中的编码热休克蛋白110(HSP110)的基因内含子8的剪接受体位点中的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列的胸苷重复的长度；

c)和将在步骤a)测量的表达水平和／或在步骤b)中鉴定的胸苷重复的长度与所述患者的预后相关联，从而推断所述患者的预后。

在一些实施方式中，用于预测患有癌症的患者的生存率和／或对治疗的响应的方法包括以下步骤：

a)测量所述患者的生物样品中根据本发明的突变的HSP110蛋白的表达；和／或

b)测量所述患者的生物样品中根据本发明的突变的HSP110mRNA的表达；和／或

c)测定位于所述患者的生物样品中编码热休克蛋白110(HSP110)的基因的内含子8的剪接受体位点的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列的胸苷重复的长度；

d)和将步骤a)和／或b)测量的表达水平和／或在步骤c)中测定的胸苷重复的长度与所述患者的预后相关联，由此推断所述患者的预后。

事实上，如在实施例中所证实，突变的HSP110的高表达水平与生存率和／或对治疗的响应的良好预后相关。

此外，如在实施例中所证实，重复内的少的胸苷缺失(即3或4个胸苷，或更少)，指示生存率和／或对治疗的反应的不良预后，且重复内的大量胸苷缺失(即5至8个胸苷，或更多)，指示生存率和／或对治疗的反应的良好预后。这就是说，重复内的至少5个胸苷缺失指示生存率和／或对治疗的反应的良好预后。在一些实施方式中，重复内的至少5个胸苷缺失表示，相对于具有重复内的少的胸苷缺失的患者，所述患者治疗后复发的风险较低，或所述患者治疗后不会复发。在一些实施方式中，重复内的5个或更多个胸苷缺失指示，相对于具有重复内的少的胸苷缺失的患者，所述患者更有可能响应治疗。

在一个具体实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤：

a)测量所述患者的生物样品中如上所述的突变的HSP110的表达；

b)测量阴性对照样品中如上所述的突变的HSP110的表达；

其中在步骤a)中测量的突变的HSP110的表达显著高于在步骤b)中测量的表达，指示生存率和／或对治疗的反应的良好预后。

如果患者的生物样品中突变的HSP110的表达水平增加2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或是阴性对照样品中突变的HSP110水平的至少30％、40％、50％、60％、70％或75％，则较高的表达被认为是统计学显著的。在一个优选的实施方式中，如果患者的生物样品中突变的HSP110的表达水平增加至少75％，则较高的表达被认为是统计学显著的。

在另一个具体的实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤：

b)测量在所述生物样品中野生型HSP110的表达；

c)比较步骤(a)和(b)测得的表达，从而推断所述患者的预后。

事实上，当突变的HSP110以类似于或高于野生型HSP110的水平表达，预后将是良好的。特别地，在本实施方式的范围中，突变的HSP110的表达水平高于或等于野生型HSP110表达水平的50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％可以例如指示良好的预后和／或患者很可能响应治疗。

可以通过计算表达比对步骤a)和b)测量的表达进行比较，例如用下式：比例=突变的HSP110的表达水平／野生型HSP110的表达水平。例如，高于或等于0.75的表达比可以指示良好预后和／或患者可能响应治疗。

在又一具体实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤：

a)测量所述患者的生物样品中如上文所描述的突变的HSP110和野生型HSP110的表达；

b)分析步骤a)获得的表达以生成表达比；

c)测量阴性对照生物样品中如上文所描述的突变的HSP110和野生型HSP110的表达；

d)分析步骤c)获得的表达以产生表达比；

其中步骤b)产生的表达比显著高于步骤d)产生的表达比指示患者具有良好的生存率预后和／或患者可能响应治疗。

如果步骤(b)产生的比例比步骤(d)产生的比例增加至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，则所述较高的表达比被认为是统计学显著的。在一个优选的实施方式中，如果患者的生物样品中的表达比增加至少7.5倍，则所述比例被认为是统计学显著的。

用于测量突变的HSP110和野生型HSP110的表达水平的方法是本领域公知的。可以通过定量mRNA或通过定量蛋白质来测量表达水平。合适的方法包括，例如，免疫化学、Elisa法、Western印迹、流式细胞术、Northern印迹、PCR(例如RT-PCR和QRT-PCR)、连接酶链反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、扩增阻滞突变系统(ARMS)和高分辨率熔解曲线分析(HRM PCR)。

扩增阻滞突变系统(ARMS)是一种扩增策略，其中聚合酶链反应(PCR)引物这样设计，使得它能够区分不同之处为单个核苷酸残基的模板。ARMS也称为等位基因特异的PCR或特定等位基因的PCR扩增(PASA)。因此，ARMS引物可设计为扩增多等位基因系统中的特定成员，而来自前者的小至单个碱基的另一个等位基因仍然难以扩增。ARMS的主要优点是，扩增步骤和诊断步骤相结合，其中扩增产物的存在表示特定的等位基因的存在，反之亦然。对于常规诊断，ARMS的这种特性意味着其是非常具有时效性的方法。

高分辨率熔解(HRM)分析是分子生物学中用于检测双链DNA样品中的突变、多态性和表观遗传差异的强大的技术。HRM分析在双链DNA样品上进行。通常在HRM分析之前使用聚合酶链反应(PCR)从而扩增其中存在目标突变的DNA区域。从本质上讲，PCR过程将微小量的目标DNA区域转变成大的量，这样该量足够大以用于更好的分析。在管中，现在有许多目标DNA区域的副本。此被扩增的区域被称为扩增子。PCR过程之后，开始HRM分析。该过程仅仅是扩增子DNA精确地从约50℃加热至95℃。在此过程期间的一些点，达到扩增子的熔解温度，且DNA的两条链分开或“熔解”开。HRM的秘诀是实时监视该过程的发生。这通过使用荧光染料实现。用于HRM的染料被称为插入染料，并具有独特的性质。它们特异性结合双链DNA且当它们结合时，它们明亮地发荧光。在不存在双链DNA的情况下，它们没有东西可以结合，且它们只以低水平发荧光。在HRM分析开始时，由于数十亿的扩增子拷贝，样品中有着高水平的荧光。但是，当将样品加热且DNA的两条链熔解开，存在的双链DNA减少，从而荧光减少。HRM机器具有通过测量荧光观察该过程的照相机。然后该机器简单地将该数据绘制为图表，称为熔解曲线，显示荧光强度与温度的水平。两条DNA链分开时的扩增子的熔解温度是完全可预测的。它依赖于DNA碱基的序列。如果比较来自两个不同的人的两个样品，它们应该给出正好相同形状的熔解曲线。然而，如果其中一个人在扩增的DNA区域中具有突变，那么这将改变DNA链熔解分离时的温度。所以现在两个熔解曲线出现差异。这种差异可能是微小的，也许一定程度的一小部分，但由于HRM机器能够以“高分辨率”监控该过程，可以准确地记录这些变化，并因此鉴定突变是否存在。

上述方法允许预测对任何治疗的反应。在一个具体实施方式中，所述治疗是用烷化剂，如，例如，奥沙利铂的治疗，或用5-氟尿嘧啶的治疗，或FOLFOX治疗，或FUFOL治疗。

在一个优选的实施方式中，测量突变的HSP110的表达水平通过使用正向引物、反向引物和探针的QRT-PCR进行，其可用于检测突变的HSP110的存在。特别是，正向引物可以具有序列5′-GCTACACGAATTCCAGCTGTGA-3′(SEQ ID NO：4)，反向引物可以具有序列5′-GAGCAGCATGGTTTCGACTAAA-3′(SEQ ID NO：5)，和与突变的HSP110特异性杂交的荧光探针可以是序列为5′-ATGTGCATTACAGTGTTC-3′(SEQ ID NO：6)的HSP110deIE9探针。

在另一个优选的实施方式中，测量野生型HSP110的表达水平通过使用使用正向引物、反向引物和探针的QRT-PCR进行，其可用于检测野生型HSP110的存在。特别是，正向引物可以具有序列SEQ IDNO：4，反向引物可具有序列SEQ ID NO：5，和与突变的HSP110特异性杂交的荧光探针可以是序列5′-TACAGTGTGCAATACTT-3′(SEQ ID NO：7)的HSP110wt探针。

优选地，用至少一种荧光标记或染料标记所述探针。荧光染料可以是本领域中已知的各种各样的染料，包括6-FAM^TM、

TET^TM、NED^TM、

HEX、TAMRA、DABCYL、BHQ^TM、DDQ等。

更优选的是，用报告染料和淬灭染料标记该探针。还更优选地，所述探针在其5′端用报告染料标记和在其3′端用淬灭染料标记。报告染料可以是荧光染料，它可以是例如6-FAM^TM、

TET^TM、NED^TM、

HEX等。淬灭染料可以是非荧光染料(例如MGB^TM)或荧光染料，其可以是TAMRA、DABCYL、BHQ^TM、DDQ等。

在一个更优选的实施方式中，HSP110delE9探针在其5′端用报告染料VIC^TM标记和在其3′末端用淬灭染料TAMRA标记，且HSP110wt探针在其5′端用报告染料6-FAM^TM标记和在其3′末端用淬灭染料TAMRA标记。

在一个优选的实施方式中，QRT-PCR包括初始变性步骤，然后是变性-退火-延伸步骤的循环。

初始变性步骤可以在90℃至105℃的加热条件下进行15秒到15分钟。优选地，所述加热条件为92℃到102℃，更优选为95℃至100℃，还更优选地，加热条件是在95℃。优选地，初始变性步骤进行1分钟至15分钟，更优选8分钟至12分钟，还更优选5分钟至10分钟，并且还更优选地，初始变性步骤进行10分钟。

在一个优选的实施方式中，初始变性步骤在95℃下进行10分钟。

变性-退火-延伸步骤的每个循环包括在加热条件下的变性阶段，然后是在允许引物和探针与将被扩增的序列杂交的条件下进行的退火阶段，以及在使得聚合酶从每个与待扩增的序列退火的引物合成延伸产物的条件下进行的延伸阶段。

变性阶段可以在90℃至105℃之间，优选为92℃至100℃，更优选在94℃至98℃之间进行10秒至4分钟，优选10秒至2分钟，更优选15秒至1分钟。

退火阶段可以在35℃至70℃之间，优选在40℃至65℃，更优选为45℃至60℃之间，还更优选为50℃至60℃之间进行10秒至2分钟，优选20秒至1.5分钟，更优选30秒至1分钟。

延伸阶段可以在40℃至80℃之间，优选在50℃至75℃之间，更优选在55℃至65℃之间，还更优选在58℃至62℃之间进行10秒到5分钟，优选20秒至3分钟，更优选30秒到1分钟，还更优选30秒至45秒。

在一个优选的实施方式中，变性阶段在95℃下进行15秒，退火阶段和延伸阶段相结合并在60℃进行1分钟。变性-退火-延伸步骤可以重复30到60个循环，优选是35至50个循环，更优选40至45个循环。还更优选地，变性-退火-延伸步骤重复40个循环。

或者，可通过western印迹或通过免疫组织化学进行突变的HSP110的表达的测量。

如本文所用，western印迹是指将蛋白质(或多肽)固定到载体，如硝化纤维或膜上的分析。首先在丙烯酰胺凝胶上分离包含至少一种蛋白质的混合物，然后将分离的蛋白质从凝胶转移到固体载体，如硝化纤维素或尼龙膜上。使固定化的蛋白质与至少一种具有抗至少一种目标抗原的反应性的抗体接触。可通过各种方法检测结合的抗体，包括使用放射性标记的抗体。优选地，用于检测突变的HSP110或者野生型HSP110的抗体可识别蛋白质的N-端部分。例如，这种抗体可以是来自

的兔多克隆抗体ab24503。也可以使用来自

的兔多克隆抗体SPA-11101识别野生型HSP110。

优选地，在根据本发明的方法中测量突变的HSP110和野生型HSP110的表达水平使用相同的技术来进行。举例来说，如果通过QRT-PCR进行突变的HSP110的表达水平的测量，就通过QRT-PCR进行野生型HSP110的表达水平的测量。

更优选地，以竞争的方式进行突变的HSP110和野生型HSP110的表达水平的测量，即在相同的生物样品中同时进行突变的HSP110和野生型HSP110的表达水平的测量。特别是，以竞争的方式，使用如上所述的能够与突变的HSP110和野生型HSP11杂交的正向和反向引物，和两个探针，其每一个如上文所述地能够特异性地与突变的HSP110或野生型HSP110杂交，通过QRT-PCR进行突变的HSP110和野生型HSP110的表达水平的测量。在一个优选的实施方式中，QRT-PCR包含初始变性步骤，然后是如上所述的变性-退火-延伸步骤的循环。

在另一个优选的实施方式中，可以在蛋白质水平上对突变的HSP110和野生型HSP110的表达进行测量。

可以使用任何在本领域中众所周知的方法计算表达比。优选地，表达比是如下获得：

-如上所述通过QRT-PCR在所述患者的生物样品中测量突变的HSP110的表达，以获得Ct值；

-如上所述通过QRT-PCR在所述患者的生物样品中测量野生型HSP110的表达，以获得Ct值；

-使用公式：E=2^{-(野生型HSP110Ct-突变的HSP110Ct)}计算表达比(E)。

如本文所用，生物样品可以由血液样品、血清样品、血浆样品、粪便样品或癌症活检组成。优选的生物样品可以由腺瘤或原发性癌症的活检组成。还更优选的生物样品可以由选自结肠直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤和神经母细胞瘤的腺瘤或原发性癌症的活检组成。优选地，所述生物样品是结肠直肠癌的活检。

当使用阴性对照样品时，阴性对照样品可以是例如，对应于来自健康或MSS个体(优选来自与癌细胞相同的组织)的组织样品、对应于来自患者的健康组织(例如，癌组织周围的健康组织)的样品、或对应于含有一定量的指示健康或MSS个体中突变的和／或野生型HSP110的表达水平的突变的和／或野生型HSP110的样品。在一个特定的实施方式中，阴性对照样品是与患者的生物样品相同类型的样品。例如，如果患者的生物样品是血液，则阴性对照样品是血液。在另一个实例中，如果患者的生物样品是结肠直肠癌的活检，则阴性对照样品是具有微卫星稳定性(MSS)表型的结肠直肠癌的活检。

在一些实施方式中，根据本发明的方法包括测定位于所述患者的生物样品中编码热休克蛋白110(HSP110)的基因的内含子8的剪接受体位点的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列的胸苷重复的长度的步骤，其中鉴别重复内的5个胸苷或更多个胸苷的缺失指示生存率和／或对治疗的反应的良好预后。

可以通过在本领域中已知的方法进行对所述胸苷重复的长度的测定。例如，可以通过基因分型进行。基因分型17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列可以通过本领域的技术人员已知的方法进行。例如，如实施例1的段落“突变分析”中描述的基因分型，或说明书中的段落“根据本发明的诊断方法”中所描述的。可以通过本领域的技术人员已知的方法进行17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列的基因分型。例如，可以通过扩增所述的微卫星重复序列和通过毛细管电泳分离扩增产物进行17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列的基因分型。可以使用实施例1的段落“突变分析”中所描述的常规的聚合酶链反应(PCR)技术进行所述的微卫星重复序列的扩增。合适的方法还可以包括扩增阻滞突变系统(ARMS)，和高分辨率熔解曲线分析(HRM PCR)。

在一些实施方式中，所述患者是患有具有MSI表型的II期或III期结肠直肠癌的患者，和优选地是患有具有MSI表型的III期结肠直肠癌。在一些实施方式中，所述患者是接受化疗治疗，如辅助化疗治疗的患者。在一个优选的实施方式中，所述患者是接受辅助化疗治疗的患有具有MSI表型的II期或III期结肠直肠癌的患者。

根据本发明的诊断方法

发明人惊讶地发现，位于编码HSP110蛋白的HSPH1基因(NCBI基因ID：10808)的内含子8的剪接受体位点的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列在MSI CRC细胞系和原发性肿瘤中几乎总是突变的。此外，所述微卫星重复序列也经常在MSI腺瘤中突变。因此当诊断方法无效时，可以使用所述的微卫星重复序列分析，从而在非常早期诊断腺瘤和原发性肿瘤中的MSI表型。

因此，本发明还提供了一种用于诊断肿瘤的微卫星不稳定性表型(MSI)的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)基因分型位于可能受到具有MSI表型的癌症侵袭的患者的生物样品中编码热休克蛋白110(HSP110)的基因的内含子8的剪接受体位点中的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列；

b)检测所述微卫星重复序列上存在或不存在不稳定性，

其中在患者的生物样品中检测到所述的微卫星重复序列上的不稳定性表示患者患有具有MSI表型的癌症。

如本文所用，生物样品可以是培养的细胞或培养的永生化细胞，和／或选自结肠直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤和神经母细胞瘤的腺瘤或原发性肿瘤的活检。优选地，所述生物样品是结肠直肠癌的活检。

基因分型17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列可以通过本领域的技术人员已知的方法进行。例如，基因分型17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列可以通过扩增所述微卫星重复序列和通过毛细管电泳分离扩增产物来进行。可以使用实施例1的段落“突变分析”中所描述的常规的聚合酶链反应(PCR)技术来进行所述微卫星重复序列的扩增。合适的方法还可以包括扩增阻滞突变系统(ARMS)、高分辨率熔解曲线分析(HRM PCR)。

在一个优选的实施方式中，用于微卫星重复序列基因分型的正向引物和反向引物分别具有序列5′-CCCTGTCCATCCATTGGAATTGA-3′(SEQ ID NO：10)和5′-GGAACTGCATCTGTGACGGAA-3′(SEQ ID NO：11)。

在一个优选的实施方式中，微卫星标志物的扩增包含初始变性步骤，接着是变性-退火-延伸步骤的循环和最终的延伸步骤。

初始变性步骤可以在90℃至105℃的加热条件下进行15秒到5分钟。优选地，所述加热条件是92℃到102℃，更优选的加热条件是在94℃下。优选地，初始变性步骤进行20秒至2分钟，更优选25秒至1分钟和还更优选初始变性步骤进行30秒。

在一个优选的实施方式中，初始变性步骤在94℃下进行30秒钟。

变性-退火-延伸步骤的每个循环包括在加热条件下的变性阶段，然后是在允许引物与将被扩增的序列杂交的条件下进行的退火阶段，以及在使得聚合酶从每个与待扩增的序列退火的引物合成延伸产物的条件下进行的延伸阶段。

退火阶段可以在35℃至70℃之间，优选在40℃至65℃，更优选为45℃至60℃之间，还更优选为50℃至60℃之间进行10秒至2分钟，优选20秒至1.5分钟，更优选25秒至45秒。

延伸阶段可以在40℃至80℃之间，优选在50℃至75℃之间，更优选在60℃至72℃之间进行10秒到5分钟，优选20秒至3分钟，更优选40秒至2分钟，还更优选30秒至1分钟。

在一个优选的实施方式中，变性阶段在94℃下进行30秒，退火阶段在57℃下进行30秒，和延伸阶段在72℃下进行1分钟。变性-退火-延伸步骤可以重复30到60个循环，优选32至45个循环，更优选35到42个循环。还更优选地，变性-退火-延伸步骤重复40个循环。

最终延伸步骤可以在40℃至80℃之间，优选为50℃至75℃之间，更优选在60℃至72℃之间进行1分钟至10分钟，优选3分钟至8分钟，更优选5分钟至7分钟。

在一个优选的实施方式中，最终的延伸步骤在72℃下进行7分钟。

所谓“不稳定性”是指胸苷核苷酸的重复模式的缺失或添加。

在特定实施方式中，当在所述生物样品中检测到至少一个核苷酸的缺失或添加时，存在不稳定性。优选地，当在所述生物样品中检测到至少3个胸苷核苷酸缺失时，存在不稳定性。更优选的是，当在所述生物样品中检测到3至8个胸苷核苷酸缺失时，存在不稳定性。

本发明还提供了一种用于诊断肿瘤的微卫星不稳定性表型(MSI)的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)检测位于可能受具有MSI表型的癌症侵袭的患者的生物样品中编码热休克蛋白110(HSP110)的基因的内含子8的剪接受体位点中的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列上存在或不存在不稳定性；

b)检测可能受具有MSI表型的癌症侵袭的患者的生物样品中选自微卫星BAT26、NR21、NR27、NR24和BAT25的至少一个微卫星上存在或不存在不稳定性；

其中在患者的生物样品中在步骤a)中在所述微卫星重复序列上检测到不稳定性和在步骤b)中在至少一个微卫星重复序列上检测到不稳定性表示患者患有具有MSI表型的癌症。

生物样品可以是培养的细胞或培养的永生化细胞，和／或选自结肠直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤和神经母细胞瘤的腺瘤或原发性肿瘤的活检。优选地，所述生物样品是结肠直肠癌的活检。

在一些实施方式中，在位于编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体位点的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列上和在选自微卫星重复序列BAT26、NR21、NR27、NR24和BAT25中的至少2、3、4或5个微卫星重复序列上检测到不稳定性表示患者患有具有MSI表型的癌症。

优选地，在位于编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体位点的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列上和在五个微卫星重复序列BAT26、NR21、NR27、NR24和BAT25上检测到不稳定性表示患者患有具有MSI表型的癌症。

BAT26微卫星标志物是位于hMSH2基因的内含子5中的26A重复序列，和在例如NCBI参考序列NG_0007110.1的位置16298和16323之间发现。更优选地，BAT26微卫星标志物具有包含在20A至26A之间的重复模式。

NR21微卫星标志物是位于SLC7A8基因的5′非翻译区中的21T重复序列，和在例如NCBI参考序列NM_012244.2的位置483和503之间发现。更优选地，NR21微卫星标志物具有包含在16T至21T之间的重复模式。

NR27微卫星标志物是位于BIRC3基因的5′非翻译区中的26A重复序列，和在例如NCBI参考序列NM_001165.3的位置1031和1056之间发现。更优选地，NR27微卫星标志物具有包含在23A到26A之间的重复模式。

NR24微卫星标志物是位于ZNF2基因的3′非翻译区中的23T重复序列，和在例如NCBI参考序列NM_021088.2的位置3248和3270之间发现。更优选地，NR24微卫星标志物具有包含在18T至23T之间的重复模式。

BAT25微卫星标志物是位于C-KIT基因的内含子16中的25T重复序列，和在例如NCBI参考序列NG_007456.1的位置74118和74142之间发现。更优选地，BAT25微卫星标志物具有包含在19T至25T之间的重复模式。

根据本发明，在步骤a)和b)可以通过在本领域中众所周知的任何方法进行存在或不存在不稳定性的检测。例如，通过测序或基因分型检测存在或不存在不稳定性。合适的方法还可以包括扩增阻滞突变系统(ARMS)、和高分辨率熔解曲线分析(HRM PCR)。

可以通过扩增微卫星和通过毛细管电泳分离扩增产物进行基因分型。可以使用常规的聚合酶链反应(PCR)技术进行微卫星扩增，和更优选地，通过多重PCR扩增微卫星。合适的方法还可以包括扩增阻滞突变系统(ARMS)、和高分辨率熔解曲线分析(HRM PCR)。

在一个优选的实施方式中，可以如上所述地进行位于编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体位点中的17个胸苷核苷酸的所述微卫星重复序列的扩增。

在一个优选的实施方式中，选自微卫星重复序列BAT26、NR21、NR27、NR24和BAT25的所述的至少一个微卫星的扩增包括初始变性步骤，随后是变性-退火-延伸步骤的循环和最后的延伸步骤。

初始变性步骤可以在90℃至105℃范围的加热条件下进行15秒到15分钟。优选地，所述加热条件是92℃到102℃，更优选为从95℃至100℃，还更优选地，加热条件是在95℃。优选地，初始变性步骤进行1分钟至15分钟，更优选2分钟至12分钟，还更优选5分钟至10分钟，并且还更优选地，初始变性步骤进行5分钟。

在一个优选的实施方式中，初始变性步骤在95℃下进行5分钟。

变性阶段可以在90℃至105℃之间，优选92℃至100℃，更优选在94℃至98℃之间进行10秒至4分钟，优选10秒至2分钟，更优选15秒至1分钟。

延伸阶段可以在40℃至80℃之间，优选在50℃至75℃之间，更优选在60℃至72℃之间进行10秒到5分钟，优选20秒至3分钟，更优选25秒至1分钟，还更优选30秒至45秒。

在一个优选的实施方式中，变性阶段在95℃下进行30秒，退火阶段在55℃下进行30秒，和延伸阶段在72℃下进行30秒。变性-退火-延伸步骤可以重复30到60个循环，优选32至40个循环，更优选35到40个循环。还更优选地，变性-退火-延伸步骤重复35个循环。

最终延伸步骤可以在40℃至80℃之间，优选为50℃至75℃之间，更优选在60℃至72℃之间进行1分钟至10分钟，优选3分钟至8分钟，更优选4分钟至6分钟。

在一个优选的实施方式中，最终的延伸步骤在72℃下进行5分钟。

可以使用具有序列5′-CTGCGGTAATCAAGTTTTTAG-3′(SEQ IDNO：14)的正向引物和具有序列5′-AACCATTCAACATTTTTAACCC-3′(SEQ ID NO：15)的反向引物进行微卫星标志物BAT26的扩增。

可以使用具有序列5′-GAGTCGCTGGCACAGTTCTA-3′(SEQ IDN0：16)的正向引物和具有序列5′-CTGGTCACTCGCGTTTACAA-3′(SEQ ID NO：17)的反向引物进行微卫星标志物NR21的扩增。

可以使用具有序列5′-AACCATGCTTGCAAACCACT-3′(SEQ IDNO：18)的正向引物和具有序列5′-CGATAATACTAGCAATGACC-3′(SEQ ID NO：19)的反向引物进行微卫星标志物NR27的扩增。

可以使用具有序列5′-GCTGAATTTTACCTCCTGAC-3′(SEQ IDNO：20)的正向引物和具有序列5′-ATTGTGCCATTGCATTCCAA-3′(SEQ ID NO：21)的反向引物进行微卫星标志物NR24的扩增。

可以使用具有序列5′-TACCAGGTGGCAAAGGGCA-3′(SEQ IDNO：22)的正向引物和具有序列5′-TCTGCATTTTAACTATGGCTC-3′(SEQ ID NO：23)的反向引物进行微卫星标志物BAT25的扩增。

“位于编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体位点中的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列上的不稳定性”是指胸苷核苷酸的重复模式的缺失或添加。如本文所述，当在所述生物样品中检测到至少3个胸苷核苷酸缺失时，可认为存在不稳定性。如本文所述，当在所述生物样品中检测到3至8个胸苷核苷酸缺失时，可认为存在不稳定性。

“选自微卫星重复序列BAT26、NR21、NR27、NR24和BAT25的至少一个微卫星标志物上的不稳定性”是指单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸的重复模式的缺失或添加。

在一个示例性实施方式中，当BAT26微卫星由大于26A或小于20A的重复模式组成时，认为存在BAT26微卫星上的不稳定性。

在一个示例性实施方式中，当NR21微卫星由大于21T或小于16T的重复模式组成时，认为存在NR21微卫星上的不稳定性。

在一个示例性实施方式中，当NR27微卫星由大于26A或小于23A的重复模式组成时，认为存在NR27微卫星上的不稳定性。

在一个示例性实施方式中，当NR24微卫星由大于23T或小于18T的重复模式组成时，认为存在NR24微卫星标志物上的不稳定性。

在一个示例性实施方式中，当BAT25微卫星由大于25T或小于19T的重复模式组成时，认为存在BAT25微卫星标志物上的不稳定性。

优选地，当在等位基因上，和更优选在两个等位基因上检测到缺失或添加时，认为存在不稳定性。

在一个特定的实施方式中，所述方法进一步包括在步骤a)和b)中与对照样品相比较。当使用阴性对照样品时，阴性对照样品可以例如对应于来自健康或MSS个体(优选来自与癌细胞相同的组织)的组织样品，对应于来自患者的健康组织(例如，癌组织周围的健康组织)的样品。在一个特定的实施方式中，阴性对照样品是与患者的生物样品相同类型的样品。例如，如果患者的生物样品是血液，则阴性对照样品是血液。在另一个实例中，如果患者的生物样品是结肠直肠癌的活检，则阴性对照样品是具有微卫星稳定性(MSS)表型的结肠直肠癌的活检。

本发明还涉及一种用于诊断肿瘤的微卫星不稳定性(MSI)表型的体外方法，所述方法包括以下步骤：如上所述在所述患者的生物样品中检测存在或不存在突变的热休克蛋白110(HSP110)，其中在患者的生物样品中检测到存在所述的突变的HSP110表示患者患有具有MSI表型的癌症。

在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：

b)测量所述患者的生物样品中根据本发明的突变的HSP110mRNA的表达，

其中在患者的生物样品中检测到存在所述突变的HSP110蛋白和／或mRNA表示患者患有具有MSI表型的癌症。

在一个具体实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤：

b)测量阴性对照样品中如上所述的突变的HSP110的表达；

其中在步骤a)中测量的突变的HSP110的表达显著高于在步骤b)中测量的表达指示生存率和／或对治疗的反应的良好预后。

在步骤a)和b)，可以通过测量如上所述的突变的HSP110蛋白和／或突变的HSP110mRNA进行突变的HSP110的表达的测量。

在另一个具体实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤：

b)测量所述生物样品中野生型HSP110的表达；

c)比较在步骤(a)及(b)中测得的表达，从而推断MSI表型的诊断。

在步骤a)中，可以通过测量如上所述的突变的HSP110蛋白和／或突变的HSP110mRNA进行突变的HSP110的表达的测量。

在步骤b)中，可以通过测量如上所述的野生型HSP110蛋白和／或野生型HSP110mRNA进行野生型HSP110的表达的测量。

事实上，突变的HSP110的表达水平大于或等于野生型HSP110表达水平的50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％表示患者患有具有MSI表型的癌症。

可以通过计算表达比，对在步骤a)和b)中测量的表达进行比较，例如用下式：比例=突变的HSP110的表达水平／野生型HSP110的表达水平。例如，高于或等于0.75的表达比可以表示患者患有具有MSI表型的癌症。

在又一具体实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤：

b)分析在步骤a)中获得的表达以生成表达比；

c)测量阴性对照样品中如上文所描述的突变的HSP110和野生型HSP110的表达；

d)分析在步骤c)中获得的表达以产生表达比；

其中在步骤b)中产生的表达比显著高于在步骤d)中产生的表达比表示患者患有具有MSI表型的癌症。

在步骤a)和c)中，可以通过测量如上所述的突变的HSP110蛋白和／或突变的HSP110mRNA进行突变的HSP110的表达的测量，和通过测量如上所述的野生型HSP110蛋白和／或野生型HSP110mRNA进行野生型HSP110的表达的测量。

如果在步骤(b)中产生的比例比在步骤d)中产生的比例增加至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，该较高的表达比被认为是统计学显著的。在一个优选的实施方式中，如果患者的生物样品中的表达比增加至少7.5倍，该比例被认为是统计学显著的。

用于测量突变的HSP110和野生型HSP110的表达水平的方法是在本领域中公知的。可以通过定量mRNA或通过定量蛋白质来测量表达水平。合适的方法包括，例如，免疫化学、Elisa、Western印迹、流式细胞术、Northern印迹、PCR(例如RT-PCR和QRT-PCR)、连接酶链反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)和核酸序列扩增(NASBA)。合适的方法还可以包括扩增阻滞突变系统(ARMS)和高分辨率熔解曲线分析(HRM PCR)。

在一些实施方式中，使用如上文在章节“根据本发明的预测方法和用途”中描述的方法进行突变的HSP110和野生型HSP110的表达水平的测量。

如本文所用，生物样品可以由血液样品、血清样品、血浆样品、粪便样品或癌症活检组成。优选的生物样品可以由腺瘤或原发性癌的活检组成。还更优选的生物样品可以由选自结肠直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤和神经母细胞瘤的腺瘤或原发性癌的活检组成。优选地，所述生物样品是结肠直肠癌的活检。

用于确定合适的治疗方案的方法

上述方法可用于确定和／或选择适用于治疗患有易于具有MSI表型的癌症的受试者的治疗方案。

因此，本发明还涉及一种用于确定适用于治疗患有易于具有MSI表型的癌症的受试者的治疗方案的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)测定位于所述患者的生物样品中编码热休克蛋白110(HSP110)的基因的内含子8的剪接受体位点中的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列的胸苷重复的长度；和

b)在所述胸苷重复长度的基础上推断和／或选择用于受试者的合适的治疗方案。

本发明还涉及使用位于编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体位点中17个胸苷的微卫星重复序列作为用于确定合适的治疗方案的生物标志物。

在一些实施方式中，所述易于具有MSI表型的癌症可以是结肠直肠癌，优选II期或III期结肠直肠癌。

“合适的治疗方案”可以指适于治疗患有易于具有MSI表型的癌症的受试者的手术、化疗和／或放疗。

少的胸苷缺失，即3或4个胸苷或更少，表示合适的治疗方案可以是化疗治疗，其结合至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或至多10、9、8、7、6、5、4、3、2种试剂，例如，如奥沙利铂、5-氟尿嘧啶和亚叶酸的组合，即FOLFOX治疗，或5-氟尿嘧啶和亚叶酸的组合，即FUFOL或LV5FU2治疗。

大的胸苷缺失，即5至8个胸苷或者更多，表示合适的治疗方案可以是用单一试剂如5-氟尿嘧啶的化疗治疗。

测定所述胸苷重复的长度可以通过本领域的技术人员已知的方法来进行。例如，可以通过基因分型进行。17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列的基因分型可以通过本领域的技术人员已知的方法进行。例如，如实施例1的段落“突变分析”中描述的基因分型，或说明书中的段落“根据本发明的诊断方法”中所描述的。可以通过本领域的技术人员已知的方法进行17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列的基因分型。例如，可以通过扩增所述的微卫星重复序列和通过毛细管电泳分离扩增产物进行17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列的基因分型。可以使用实施例1的段落“突变分析”中所描述的常规的聚合酶链反应(PCR)技术进行所述的微卫星重复序列的扩增。合适的方法还可以包括扩增阻滞突变系统(ARMS)，和高分辨率熔解曲线分析(HRMPCR)。

根据本发明的试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，其包含或由正向引物、反向引物和探针组成，其可以用于检测如上文所定义的突变的HSP110的存在。该试剂盒可进一步包含正向引物、反向引物和探针，其可用于检测野生型HSP110。

特别是，本发明提供一种试剂盒，其包含能够与突变的HSP110和野生型HSP110杂交的正向和反向引物，和两个能够与如上所述的突变的HSP110或野生型HSP110特异性杂交的探针。

根据本发明的正向引物具有的核苷酸序列可以包含或由SEQ IDNO：4或者通过一个或两个核苷酸取代不同于序列SEQ ID NO：4的序列组成。

根据本发明的反向引物具有的核苷酸序列可以包含或由SEQ IDNO：5或者通过一个或两个核苷酸取代不同于序列SEQ ID NO：5的序列组成。

与突变的HSP110特异性杂交的探针具有的核苷酸序列可以包含或由SEQ ID NO：6或者通过一个或两个核苷酸取代不同于序列SEQID NO：6的序列组成。

与野生型HSP110特异性杂交的探针具有的核苷酸序列可以包含或由SEQ ID NO：7或者通过一个或两个核苷酸取代不同于序列SEQID NO：7的序列组成。

优选地，所述探针被标记。例如，可以用该领域中已知的各种标记以共价或非共价的方式标记探针，包括半抗原标记(例如生物素)、质量标签标记(例如，稳定的同位素标记)、放射性标记、金属螯合标记、发光标记(如荧光、磷光和化学发光标记)，等等。

优选地，用至少一种荧光标记或染料标记探针。荧光染料可以是本领域中已知的各种各样的染料，包括6-FAM^TM、

、TET^TM、NED^TM、

、HEX、TAMRA、DABCYL、BHQ^TM、DDQ等。

更优选地，用报告染料和淬灭染料标记探针。还更优选地，在其5′端用报告染料和在其3′端用淬灭染料标记探针。报告染料可以是荧光染料，它可以是例如6-FAM^TM、

、TET^TM、

、HEX，等。淬灭染料可以是非荧光染料(例如，MGB^TM)或荧光染料，它可以是例如，TAMRA、DABCYL、BHQ^TM、DDQ等。

在一个更优选的实施方式中，与突变的HSP110特异性杂交的探针在其5′端用报告染料VIC^TM标记和在其3′末端用淬灭染料TAMRA标记，和与野生型HSP110特异性杂交的探针在其5′端用报告染料6-FAM^TM标记和在其3′末端用淬灭染料TAMRA标记。

根据本发明的正向和反向引物和探针优选是17至30个核苷酸长，更优选17至25个核苷酸长。特别地，所述的正向和反向引物和探针可以，彼此独立地，是17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸长。

所述正向和反向引物在高度严格性和特定的杂交条件下分别与序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8或与序列SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：8的反向序列杂交。此外，所述与根据本发明的突变的HSP110杂交的探针与序列SEQ ID NO：3杂交，和所述与根据本发明的野生型HSP110杂交的探针与序列SEQ ID NO：8杂交。

温度和离子强度的条件确定了杂交的“严格性”。

本发明还提供了一种试剂盒，包含或由正向引物和反向引物组成，其可用于检测如上所述的微卫星重复序列中胸苷缺失的长度。

根据本发明的正向引物具有的核苷酸序列可以包含或由SEQ IDNO：10或者通过一个或两个核苷酸取代不同于序列SEQ ID NO：10的序列组成。

根据本发明的反向引物具有的核苷酸序列可以包含或由SEQ IDNO：11或者通过一个或两个核苷酸取代不同于序列SEQ ID NO：11的序列组成。

所述正向和反向引物在高度严格性和特定的杂交条件下与序列SEQ ID NO：9或与序列SEQ ID NO：9的反向序列杂交。

温度和离子强度的条件确定了杂交的“严格性”。高度严格性杂交条件对应于在60℃至75℃之间的高Tm。杂交要求两种核酸含有互补序列，但根据杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。

本发明还提供了一种试剂盒，包含或由抗体组成，其可用于检测如上文所定义的突变的HSP110的存在，即特异性识别根据本发明的突变的HSP110蛋白的抗体。该试剂盒可进一步包含可用于检测野生型HSP110的抗体。

在一些实施方式中，本发明提供了包含如上所述特异性识别突变的HSP110蛋白的抗体和特异性识别野生型HSP110的抗体的试剂盒。

在一些实施方式中，所述的特异性识别突变的HSP110蛋白的抗体和所述的特异性识别野生型HSP110的抗体是相同的。例如，所述抗体可以是来自Abcam的Ab24503抗体。

在一些实施方式中，所述的特异性识别突变的HSP110蛋白的抗体和所述的特异性识别野生型HSP110的抗体是不同的。例如，所述的特异性识别突变的HSP110蛋白的抗体能够识别序列SEQ ID NO：1的突变的HSP110蛋白，和所述的特异性识别野生型HSP110的抗体可以是来自Stressgen的SPA-1101抗体。

本发明还提供了一种试剂盒，其包含或由以下组成：

a)用于检测如上文所定义的突变的HSP110的存在的工具，和／或

b)用于检测野生型HSP110的工具，和／或

c)用于检测如上所述的微卫星重复序列中胸苷缺失的长度的工具。

在一些实施方式中，所述的用于检测突变的HSP110的存在的工具可以是如上所述的正向引物、反向引物和探针，和／或特异性识别如上所定义的突变的HSP110蛋白的抗体。在一些实施方式中，所述用于检测野生型HSP110的存在的工具可以是如上所述的正向引物、反向引物和探针，和／或特异性识别如上所定义的野生型HSP110蛋白的抗体。

在一些实施方式中，所述用于检测微卫星重复序列中胸苷缺失的长度的工具可以是如上文所定义的正向引物和反向引物。

“检测微卫星重复序列中胸苷缺失的长度”也可以指“检测所述微卫星重复序列的不稳定性”。

化合物和药物组合物

已知HSP110是一种在癌细胞中异常积聚，从而提高它们的生存率的蛋白质(Yamagishi等，The FEBS journal275(18)，4558(2008)；Hosaka等，Cancer science97(7)，623(2006)；Yamagishi等，Experimentalcell research312(17)，3215(2006)；Siatskas等，FasebJ19(12)，1752(2005))。此外，HSP110特别强烈地在结肠癌细胞中表达(Kai等，Oncology reports10(6)，1777(2003))，且MSS原发性CRC的基因表达谱分析已经将HSP110表达与转移和较差预后相关联(Slaby等人，Oncology reports21(5)，1235(2009))。

在这里，已经发现突变的HSP110能够对肿瘤细胞中的野生型HSP110具有显性负性作用，从而阻断其抗凋亡作用以及敏化肿瘤细胞使其凋亡。

因此，本发明还涉及选自如下的化合物：

a)如上所述的突变的热休克蛋白110(HSP110)；和／或

b)包含或由至少80％与SEQ ID NO：1相同的氨基酸序列组成的突变的热休克蛋白(HSP110)的至少6个连续氨基酸的片段，优选至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％与SEQ ID NO：1相同；和／或

c)a)的突变的HSP110或b)的片段的肽模拟物；和／或

d)编码a)的突变的HSP110或b)的片段的核酸；和／或

e)无义介导的mRNA降解(NMD)抑制剂；

用于治疗癌症。

在一个优选的实施方式中，根据本发明的化合物由如上文所描述的突变的热休克蛋白110(HSP110)和无义介导的mRNA降解(NMD)抑制剂的组合组成。

无义介导的mRNA降解(NMD)是mRNA质量控制过程，其降解含有提前终止密码子(PTC)以避免产生对细胞具有潜在的有害影响的截短蛋白的mRNA。

所鉴别的突变的HSP110由缺乏外显子9的mRNA产生，从而导致存在PTC。发明人发现，突变的HSP110在MSI肿瘤细胞中通过NMD过程被部分降解。因此，建议抑制NMD，以恢复内源性突变的HSP110在表达这种蛋白质的肿瘤中的表达，和／或避免施用给患者的突变的HSP110降解。

如本文所用，NMD抑制剂可以是吲哚衍生物化合物，优选地是已经在国际专利申请WO2008／101935中描述的吲哚衍生物化合物。特别地，所述NMD抑制剂可以是具有专利申请WO2008／101935的权利要求16的式II的吲哚衍生物化合物。优选地，所述NMD抑制剂可以是选自如在专利申请WO2008／101935的权利要求21中所定义的6-氯-5，10-二甲基-11H-吡啶并[3′，2′：4，5]吡咯并[3，2-g]异喹啉、5，10-二甲基-11H-吡啶并[3′，2′：4，5]吡咯并[3，2-g]异喹啉、5，8-二甲基-6-(吡啶-2-基氨基)-2H-异喹啉-1-酮、6-(3-甲氧基-吡啶-2-基氨基)-异喹啉-1-酮、5，8-二甲基-6-(5-甲基-吡啶-2-基氨基)-异喹啉的吲哚衍生物。更优选的是，所述NMD抑制剂可以是6-氯-5，10-二甲基-11H-吡啶并[3′，2′：4，5]吡咯并[3，2-g]异喹啉。该化合物在科学文献中也被称为NMDI1(Durant等，The Journal of Cell Biology178：1145-1160(2007))。

用于获得所述化合物的方法是本领域的技术人员已知的。例如，用于获得所述化合物的方法在专利申请WO2008／101935中描述。

最优选的是，所述癌症是易于具有MSI表型的癌症。所述癌可以是，但不限于，选自结肠直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤和神经母细胞瘤的癌症。优选地，所述癌症是结肠直肠癌。优选地，所述癌症可以是原发性肿瘤或腺瘤。

最优选的是，所述癌症是具有MSS表型的癌症。事实上，这些癌症表达低水平的突变的HSP110。据信施用突变的HSP110和／或另一种野生型HSP110的抑制剂(即如上文所描述的肽模拟物或片段)将恢复它们的细胞凋亡的敏感性。

或者癌症可以有MSI表型。

发明人发现表达突变的HSP110的细胞对凋亡，特别是化疗药物诱导的凋亡更加敏感。因此，本发明还涉及如上所述的化合物和化疗药物的组合，用于同时或顺次使用以治疗癌症。“化疗药物”是指具有用于治疗癌症的上市许可的药物或正在进行治疗癌症的临床或临床前试验的药物。

可以将本文所描述的化合物配制成药物组合物。因此，本发明预期一种药物组合物，含有上述化合物中的任何一种和生理上可接受的载体。生理上可接受的载体可以通过本领域技术人员已知的任何方法制备。

包含至少一种本发明化合物的药物组合物包括其中所述的化合物以能有效地达到预期作用的量而包含的所有的组合物。此外，药物组合物可以含有适当的药学上可接受的赋形剂，包含便于将活性化合物加工成可以药用的制剂的赋形剂和辅助物。合适的药学上可接受的载体在本领域中是众所周知的，和在例如Remington′s PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Company，Easton，USA，1985)中描述，这是这一领域中的标准参考文本。药学上可接受的载体可以根据施用方式、肽的溶解性和稳定性而常规选择。例如，用于静脉内施用的制剂可以包括无菌水溶液，其还可以包含缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂。文献中公开了用于药物递送的生物材料和其它聚合物的使用，以及验证特定的施用方式的不同的技术和模型。

可以通过任何达到预期目的的手段来施用本发明的化合物。例如，施用可以通过多个不同的途径实现，包括，但不限于皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内、颅内、鞘内、鼻内、口服、直肠、经皮、口腔、局部、局部、吸入或皮下使用。

施用剂量取决于个人的需要、所需的效果和选择的施用途径。应了解，施用剂量将取决于接受者的年龄、性别、健康和重量、同时进行的治疗(如果有的话)、治疗频率和所期望的效果的性质。可以通过多剂量或单剂量施用每次治疗所需的总剂量。

根据预期的递送途径，可以将所述化合物配制成液体(例如，溶液、悬浮液)、固体(例如，丸剂、片剂、栓剂等)或半固体形式(例如，霜剂、凝胶)形式。

在一个优选的实施方式中，所述组合物以单位剂量形式存在，以促进准确的给药。术语“单位剂量形式”是指物理上分离的单位，适于作为单一剂量用于人受试者或其它哺乳动物，每一单位含有经计算能产生预期的治疗效果的预先确定的活性物质的量，以及合适的药物赋形剂。典型的单位剂量形式包括液体组合物的预充式、预先测量的安瓿或注射器、或在固体组合物的情况下丸剂、片剂、胶囊剂等。在这种组合物中，本发明的化合物通常是较少的组分(约0.1％至约50％重量或优选约1至约40％重量)，以及其余部分为各种赋形剂或载体和有助于形成所需的剂量形式的加工助剂。

本发明化合物也可以以持续释放形式施用或来自持续释放药物递送系统。

本发明还预期一种药物组合物，以例如通过基因疗法治疗的范围含有编码本发明的突变的HSP110的核酸。在这种情况下，所述核酸优选存在于载体上，将编码肽的序列在允许其表达的表达信号(例如，启动子、终止子和／或增强子)的控制下置于其上。所述载体可以是例如对应于病毒载体，如腺病毒或慢病毒载体。

本发明还提供了含有药物组合物的试剂盒，所述组合物含有本发明的化合物和关于施用方式的说明书。这些说明书可以例如表示医疗指示和／或施用途径和/或剂量，和／或待治疗的患者群体。

本发明还提供了一种用于治疗癌症的方法，其中所述方法包括向需要它们的个体施用有效量的选自以下的化合物：

a)如上所述的突变的热休克蛋白110(HSP110)；和／或

b)包含或由至少80％与SEQ ID NO：1相同的至少6个连续氨基酸组成的片段，优选至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％与SEQ ID NO：1相同；和／或

c)a)的突变的HSP110或b)的片段的肽模拟物；和／或

d)编码a)的突变的HSP110或b)的片段的核酸；和／或

e)无义介导的mRNA降解(NMD)抑制剂。

在一个优选的实施方式中，所述方法包括如上所述施用突变的热休克蛋白110(HSP110)和无义介导的mRNA降解(NMD)抑制剂。

以“有效量”，即足以治疗癌症的量施用所述化合物。应理解，该量将随使用的治疗剂的有效性、使用的任何载体的性质、疾病的严重性和患者的年龄而变化。用于任何给定的组合物的适当量的确定是在本领域的技能范围内的，通过为评估合适的治疗水平而设计的标准系列测试。

“需要它们的个体”是指患有癌症的个体，或已经患有癌症后缓解中的个体。

在本发明的范围中，个人优选为人类个体。然而，也可以预期根据本发明的多肽和药物的兽医用途。因此，个体也可以对应于非人类的个体，优选非人类的哺乳动物。

术语“治疗”意味着涵盖治疗和预防方法，即针对患有癌症的个体的治愈、改善病症和／或延长寿命的方法。它也指旨在预防转移的出现或扩散的方法，以及旨在预防复发的方法。

本文所引用的所有参考文献，包括期刊论文或摘要、公开或者未公开的专利申请，已授权专利或其它任何参考文献通过引用整体引入，包括引用的参考文献中提出的所有数据、表格、附图和正文。

虽然具有不同的含义，术语“包含”、“具有”、“含有”和“由......组成”在整个本说明书中可互换使用，并可以彼此替换。

本发明将根据以下实施例和附图进一步评价。

附图简要说明

图1描绘了筛选大量系列的含有其不稳定性由于MSI可能会产生外显子跳跃或外显子保留的内含子的DNA重复序列的候选基因。显示了用于选择候选基因的标准(IR：内含子重复。IEJ：内含子-外显子交界处)。所有选择的基因在CRC中表达。在45个候选基因中，有两个显示异常的RT-PCR图，其提示在显示MSI的CRC细胞系，即MRE11和HSP110中的外显子跳跃。

图2描绘了用于14个CRC细胞系的MSI肿瘤样品中检测到的特定、额外的HSP110RT-PCR产物的存在的分析。它的大小提示了HSP110mRNA中的外显子9跳跃。我们未能检测到其在MMR-精通的细胞系，如在7个MSS CRC细胞系和4个MSS LBL细胞系中的表达。结果证实了分别是MSI或MSS的一系列4和7个原发性CRC(T)，以及它们匹配正常的黏膜(N)。

图3描绘了野生型的HSP110和突变的HSP110蛋白的结构。

图4描绘了在内含子HSP110T₁₇的若干个MSI CRC细胞系和原发性肿瘤和对照(MSS CRC和LBL细胞系)的等位基因图。MSS样品呈弱多态性，而MSI CRC细胞系和原发性肿瘤总是显示下降到多态区(阴影区)以外的异常等位基因。观察到3到8个碱基对大小的各种等位基因缺失。在MSI CRC细胞系中观察到的缺失大多是双等位基因。在MSI原发性肿瘤中，等位基因图在大多数情况下高度提示双等位基因突变，如图所示。数字表示MSI肿瘤样品中(碱基对)HSP110T₁₇缺失的大小。

图5描绘了内含子HSP110T₁₇的突变频率分析。在MSI原发性CRC(100％)和前恶性腺瘤(53％)中比在任何编码微卫星的改变中更频繁地检测到重复序列的突变。数字表示MSI肿瘤或腺瘤样品中HSP110T₁₇缺失的大小。

图6描绘了通过RT-PCR分析HSP110wt和HSP110delE9表达的图表。显示了对应于HSP110wt和HSP110delE9QRT-PCR产物的扩增曲线。它们通过使用相同的PCR引物，但使用不同的对于HSP110wt或HSP110delE9转录物特异性的内探针，通过定量RT-PCR以竞争方式扩增。结果将(E)表示为HSP110delE9相对于HSP110wt表达(deltaCt)的N倍差，其中在每种情况下，通过从HSP110wt mRNA的平均Ct值减去HSP110delE9mRNA的平均Ct值来测定deltaCt。

图7描绘了在MSS和MSI细胞系中和原发性CRC中HSP110wt和HSP110delE9表达的定量。为14个MSI CRC细胞系和43个原发性肿瘤样品计算E比值(E_HSP110delE9／E_HSP110wt)。作为对照，我们还测试了MSS LBLs(N=20)，MSS CRC细胞系(N=7；ALA、COLO320、SW480、FET、GLY、FRI、EB)和MSS原发性CRC(N＝20)。在涉及HSP110delE9表达(P=8.5×10^-5；Student t检验)的MSI和MSS原发性CRC之间观察到高度显著的差异。每一种情况下，通过黑条显示平均E值。

图8描绘了T₁₇重复序列长度与HSP110delE9mRNA表达的相关性。阴影条和白条对应于其中HSP110delE9mRNA表达分别是低或高(即低于或高于在我们的肿瘤系列中计算的中间值)的CRC。T₁₇缺失的大小在这两组肿瘤之间明显不同(P=1.1×10^-13；Student t检验)。HSP110delE9mRNA通常在显示少的T₁₇缺失，即3或4个碱基对的MSI肿瘤中或在没有突变的MSS肿瘤中以低水平表达。相反，在显示较大的T₁₇缺失，即从5到8个碱基对的MSI肿瘤中高度表达。

图9描绘了HSP110delE9表达对蛋白质聚集的影响。从用HSP70、HSP110和／或HSP110delE9转染的MEF HSF1^-/-细胞中提取的蛋白质在55℃下加热1小时。允许热休克之前和之后可溶性蛋白质的初始量之比用于蛋白质聚集定量。每个条是4个不同实验的平均值。*P<0.05。

图10描绘了HSP110delE9对野生型HSP110的分析。用识别HSP110的C-端的HSP110对来自经GFP标记的HSP110和／或HSP110delE9转染的HCT116的细胞裂解液进行免疫沉淀。迁移后，用GFP抗体对膜进行免疫印迹。输入：总细胞裂解液中的蛋白质水平。

图11描绘了HSP110delE9对凋亡的影响。用重组TRAIL配体(5h)以指定的剂量处理经GFP标记的HSP110、HSP110delE9或空载体(GFP)转染的HCT116细胞。通过半胱天冬酶3活性的FACS分析测量凋亡。

图12描绘了增加剂量的HSP110delE9对凋亡的影响。用重组TRAIL配体(60ng／ml，5小时)处理经GFP标记的HSP110和增加剂量的HSP110delE9或空载体(GFP)转染的HCT116细胞，并通过DAPI染色(染色质凝聚)测定凋亡百分比。

图13描绘了HSP110delE9对用化疗剂处理的肿瘤细胞的促凋亡影响。用HSP110wt(1.5μg)转染和用两种不同剂量(0.5和1μg)的GFP-空载体或HSP110delE9共转染HCT116(MSI)或SW480(MSS)细胞。用奥沙利铂(OXA，40μM，48小时)处理后，用FACS分析评估凋亡。*P<0.05。

图14描绘了患有MSI或MSS CRC的患者中的无病生存率(DFS)的Kaplan-Meier单变量分析。对于统计分析，只显示了最初的5年。预期地，患有MSI或MSS CRC的患者接下来的临床病理特征是不同的，即Dukes期(P＝2.6×10^-4；Fisher精确检验)、诊断时的年龄(P=2.9×10^-5)和肿瘤位置(P=5×10^-4)。

图15描述了根据HSP110表达，在不同组的CRC患者中的DFS的Kaplan-Meier估计。如图1所示进行单变量分析。以下患有MSI-HSP110delE9^高(N=9；24％)或MSI-HSP110delE9^低(N＝29；76％)肿瘤的患者的临床病理特征并不显著不同，即Dukes期、肿瘤部位、性别、BRAF、KRAS和PIK3CA基因突变状态、CIMP和CIN状态、MSI的靶基因中的移码突变、MLH1和MGMT甲基化状态。

图16描绘了405MSS CRC中HSP110T₁₇基因型的分布。

图17描绘了MSI CRC中突变的HSP110T₁₇等位基因的分布。

图18描绘了根据在HSP110T₁₇DNA重复序列中缺失的大小，对来自初始组群的II期和III期MSI CRC患者的生存率分析。根据在HSP110的T₁₇内含子重复序列中缺失的大小将患者分为两组(ΔT≥5bp，T₁₁、T₁₀、T₉用于MSI HSP110Del^L患者；0≤ΔT<5，T₁₇至T₁₂用于MSI HSP110Del^S患者)。

图19描绘了根据在HSP110T₁₇DNA重复序列中缺失的大小，对来自验证组群的II期和III期MSI CRC患者的生存率分析。根据在HSP110的T₁₇内含子重复序列中缺失的大小将患者分为两组(ΔT≥5bp，T₁₁、T₁₀、T₉用于MSI HSP110Del^L患者；0≤ΔT<5，T₁₇至T₁₂用于MSI HSP110Del^S患者)。

图20描绘了根据在HSP110T₁₇DNA重复序列中缺失的大小，对II期和III期MSI CRC患者的生存率分析(患者总组群)。根据在HSP110的T₁₇内含子重复序列中缺失的大小将患者分为两组(ΔT≥5bp，T₁₁、T₁₀、T₉用于MSI HSP110Del^L患者；0≤ΔT<5，T₁₇至T₁₂用于MSI HSP110Del^S患者)。

图21描绘了根据在HSP110T₁₇DNA重复序列中缺失的大小的生存率分析。在每个生存率分析中，根据在肿瘤DNA中T₁₇缺失的大小将患者分为两组(左上图：ΔT≥2bp，T₁₄至T₉，即MSI HSP110Del^LCRC的患者，0≤ΔT<2，T₁₇至T₁₅，即MSI HSP110Del^S。右上图：ΔT≥3bp，T₁₃至T₉，即MSI HSP110Del^L CRC患者，0≤ΔT<3，T₁₇至T₁₄，即MSI HSP110Del^S。左下图：ΔT≥4bp，T₁₂至T₉，即MSI HSP110Del^LCRC患者，0≤ΔT<3，T₁₇至T₁₃，即MSI HSP110Del^S。右下图：ΔT≥5bp，T₁₁至T₉，即MSI HSP110Del^L CRC患者，0≤ΔT<5，T₁₇至T₁₂，即MSI HSP110Del^S。

图22描绘了根据在HSP110T₁₇DNA重复序列中缺失的大小，用化疗治疗的II期和III期MSI CRC患者的生存率分析。根据在HSP110的T₁₇内含子重复序列中缺失的大小将患者分为两组(ΔT≥5bp，T₁₁、T₁₀、T₉用于MSI HSP110Del^L患者；0≤ΔT<5，T₁₇至T₁₂用于MSIHSP110Del^S患者)。

图23描绘了根据在HSP110T₁₇DNA重复序列中缺失的大小，用5-氟脲嘧啶治疗的II期和III期MSI CRC患者的生存率分析。根据在HSP110的T₁₇内含子重复序列中缺失的大小将患者分为两组(ΔT≥5bp，T₁₁、T₁₀、T₉用于MSI HSP110Del^L患者；0≤ΔT<5，T₁₇至T₁₂用于MSI HSP110Del^S患者)。

序列说明

SEQ ID NO：1是指突变的HSP110蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2是指野生型HSP110蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是指突变的HSP110的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4、5、6、7、10、11、12至23是指引物和探针序列。

SEQ ID NO：8是指野生型HSP110的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9是指位于编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体位点的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列。

具体实施方式

实施例1：材料和方法

肿瘤样品和细胞系

CRC细胞系购自American Type Culture Collection，并保存在含有10％胎牛血清(Invitrogen)和谷氨酰胺的DMEM(LifeTechnologies)中。从经历CRC手术的患者获得原发性肿瘤和正常结肠组织。所有病例均经组织病理证实为腺癌。通过包含五个准单态性(quasimonomorphic)单核苷酸重复序列(BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27)的荧光多重PCR测定MSI状态，如在Buhard等，JClin Oncol24(2)，241(2006)中所述的。

突变分析

根据制造商的说明，使用QIAamp DNA组织试剂盒(Qiagen)提取来自冷冻样品的肿瘤DNA。使用e-primer3(http：／／bioweb.pasteur.fr／seqanal／interfaces／eprimer3.html)为HSP110内含子8设计特异性引物。用于突变分析的正向引物与反向引物分别具有序列5′-CCCTGTCCATCCATTGGAATTGA-3′(SEQ ID NO：10)和5′-GGAACTGCATCTGTGACGGAA-3′(SEQ ID NO：11)。在含有100ng的基因组DNA、0.15-0.40μM的每种引物和1单位的HotStarTaqDNA聚合酶(Qiagen)的终体积20μl中进行PCR反应。热循环条件包括在94℃下进行10分钟初始变性步骤，和在94℃下30秒和57℃下30秒进行40个循环。将荧光PCR产物的充分稀释物与甲酰胺和GeneScan^TM400HD ROX^TMSize Standard(Applied Biosystems)混合，热变性并使用GeneMapper3.7软件(Applied Biosystems)在ABI3130遗传分析仪上在含有GS性能优化聚合物4的短毛细管上运行。

实时定量RT-PCR(QRT-PCR)分析

按照制造商的说明(Invitrogen)，使用Trizol试剂分离总RNA。使用RNA6000Nano LabChip试剂盒(Agilent)，在2100生物分析仪上评估RNA完整性。只有具有完整RNA的样品用于基因表达分析(28S／18S RNA比>1.6，RNA图谱上无异常峰)。按照制造商的说明(Applied Biosystems)使用High Capacity cDNA Archive试剂盒合成cDNA。对于QRT-PCR实验，根据制造商使用Applied SDS Biosystems分析软件，从与PCR产物的指数扩增相关的信号的增加开始被检测到的Ct数得到表达值。用Primer Express设计引物(正向5′-GCTACACGAATTCCAGCTGTGA-3′(SEQ ID NO：4)和反向5′-GAGCAGCATGGTTTCGACTAAA-3′(SEQ ID NO：5))和内探针并由Applied Biosystems合成。专门设计内探针以扩增野生型HSP110(以下称为HSP110wt)(5′-6FAM-TACAGTGTGCAATACTT-3′(SEQID NO：7))或突变的HSP110(以下称为HSP110delE9)(5′-VIC-ATGTGCATTACAGTGTTC-3′(SEQ ID NO：6))转录物。用于无模板对照和无逆转录酶对照(逆转录酶阴性)的分析产生可忽略的信号(通常为Ct>35)，且用于确认不存在引物-二聚体形成和基因组DNA污染。使用ABI Prism7900序列检测系统和TaqMan PCRmaster mix(Applied Biosystems)一式三份进行PCR反应。结果表示为HSP110ΔE9相对于HSP110wt表达(ΔCt)的N倍差异，其中在每种情况下通过从HSP110wt mRNA的平均Ct值减去HSP110delE9mRNA的平均Ct值确定ΔCt。热循环条件包括在95℃下进行10分钟的初始变性步骤，和在95℃进行15秒和在60℃下进行1分钟的40个循环。

细胞、质粒、转染和材料

将HCT116细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、美国典型培养物保藏中心，ATCC)和HSF1^-/-MEF在DMEM／10％FBS(胎牛血清，Lonza，Basel，Switzerland)中培养。(Ribeil等，Nature445：102-105(2007)；Brunet等，BMC Med Gene10：144(2009))之前描述了HSP70和HSP27的构造。从Addgene(Cambridge，England)获得GFP-HSP110构造。使用以下引物：5′CGC GCG CGC AAG ATC TAC ATG TCGGTG GTG GGG3′(BgI II)(SEQ ID NO：12)和5′CGC GCG CGC AAGCTT TCA TGA ACA CTG TAA TGC ACA TCC3′(HindIII)(SEQ IDNO：13)从GFP-HSP110载体由PCR产生HSP110突变体。经过酶BgI II和HindIII消化后，将突变体HSP110cDNA克隆入EGFp C2载体。使用Jet PEI试剂(Ozyme，Saint-Quentin-en-Yvelines，France)进行转染。奥沙利铂购自Sigma-Aldrich(原液5mg／ml)。重组His-TRAIL是来自Olivier Micheau(INSERM U866，France)的馈赠。

免疫沉淀和Western印迹

首先在裂解缓冲液(50mM Hepes(pH7.6)，150mM氯化钠，5mM EDTA和0.1％NP40)中裂解转染的细胞，然后通过使用GFP-标记的抗体进行免疫沉淀。在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离免疫沉淀物，然后使用湿转移装置(BioRad，Hercules，California，USA)将其转移到PVDF膜。首先使用初级抗体将膜探测过夜：HA-标记的抗体来自Covance(Eurogentec，Angers，France)，14-3-3来自Santa-Crnz(TebuBio，Le Perray en Yvelines，France)和GFP-标记的抗体来自Millipore(Molsheim，France)。接着用耦合辣根过氧化物酶(JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PE)的适合的次级抗体将膜温育1小时，并用ECL(Amersham，Les Ullis，France)显示。

细胞死亡分析

将贴壁细胞铺板于12孔培养板(1.5×10⁵个细胞／孔)上的完全培养基中。指示时，用TRAIL(150ng/ml或500ng／ml)处理细胞4小时并通过Hoechst33342染色(Sigma-Aldrich)测量细胞死亡。在用奥沙利铂(OxaPt，20和40μM)处理48小时后，通过Apo2.7染色检测凋亡的细胞。简单地说，收获细胞，在PBS中洗涤并用洋地黄皂苷(100mg/ml，在4℃下10分钟)渗透。用抗Apo2.7抗体孵育细胞并使用LSR2流式细胞仪(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)通过流式细胞术分析凋亡的细胞。

HSP110伴侣活性

使用蛋白质热敏性分析评价HSP110伴侣活性。在55℃下将来自已经用HSP70(阳性对照)、HSP27(阴性对照)、HSP110或突变的HSP110(Dc Assay Kits，Bio-Rad，France)转染的HSF1^-/-MEF的总蛋白(2mg／ml)加热1小时。离心去除聚集的蛋白质后，定量上清液中剩余的天然蛋白。可溶性蛋白的初始量与在加热后得到的量之间的比例允许蛋白质聚集的定量。

细胞核/细胞质提取

在蛋白酶抑制剂的存在下，在包含0.2％的NP-40的裂解缓冲液(20mM的Hepes pH为7.4，10mM KCl，1mM EDTA，10％的甘油)中，将5-10×10⁶个细胞在冰上裂解10分钟之后，获得细胞质和细胞核的提取物。在14，000rpm下将细胞裂解液离心10分钟，小心地收集上清液(细胞质组分)。将沉淀物洗涤一次，并重悬于裂解缓冲液(20mM的Hepes pH为7.4，10mM KCl，1mM EDTA，20％甘油，350mM NaCl，蛋白酶抑制剂)中，并在离心(14000rpm，10分钟)后获得的细胞核组分。

免疫荧光染色

在PBS-多聚甲醛(4％)中将GFP转染的细胞固定15分钟，然后用PBS洗涤(Cambrex，Emerain ville，France)。使用细胞观察站(Zeiss，Germany)评估GFP荧光。

患者

来自回顾性研究的患者经历根治性手术切除病理证实Dukes’2或Dukes’3CRC。这项研究根据机构当局的建议进行。患者在Saint-Antoine医院或Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan进行手术。Dukes’3CRC患者接受用包括FL(氟尿嘧啶+亚叶酸)和奥沙利铂(FOLFOX4)的药物的辅助化疗。

统计分析

根据情况，用Chi-2或Fisher精确检验评估变量之间的差异。采用Student t检验评估变量之间的平均值的对比。主要结果是无病生存率。采用Kaplan-Meier评估获得生存率曲线。使用log-rank检验用5年终点评估生存率曲线之间的差异。

实施例2：结果

由于在CRC细胞系和原发性肿瘤中的MSI的异常剪接事件调查

为了在MSI驱动的癌变中找到具有假定作用的新的突变体，我们通过非定量RT-PCR分析位于内含子下游的45个候选的外显子的表达模式，所述内含子含有至少8个核苷酸的单核苷酸重复序列并在剪接受体位点的附近。图1中显示了用于选择这些候选基因的详细标准。通过非定量RT-PCR使用一套人MSI和MSS CRC细胞系(N=21；14MSI，7MSS)进行搜索。使用与每个目标外显子的上游和下游序列匹配的引物，43个在MSI和MSS癌细胞系中显示相同的表达模式。这些被(N＝10)或没被(N=33)选择性剪接。在剩下的2例(MRE11和HSP110)中，在MSI和MSS样品之间的表达模式明显不同。这是由于存在额外的PCR产物，这是MSI CRC细胞系中唯一可检测到的，和由于MRE11中的外显子5跳跃(结果未示出)，正如Giannini等，Oncogene23(15)，2640(2004)中已经报道的，和HSP110中的外显子9跳跃(图2未示出)。也发现这个额外的HSP110RT-PCR产物的存在对于MSI原发性肿瘤样品是特异性的(图2)。在一系列的非肿瘤人细胞系中没有检测到作为额外的MMR健全型对照(淋巴母细胞系[LBLs]，N=20)(图2)。在具有MSI CRC的患者当中，我们观察到额外的RT-PCR产物的扩增受限于MSI肿瘤组织，并从未在匹配的正常粘膜样品中观察到(图2)。

HSP110T₁₇内含子DNA微卫星在MSI CRC细胞系和原发性肿瘤中总是突变的

接着，我们确定了位于上游和内含子8中的剪接受体位点附近的HSP110T₁₇DNA重复序列的突变状态。使用荧光基因分型，在我们的MSI和MSS CRC细胞系和原发性肿瘤的面板中以及对照LBL中分析非编码重复序列的等位基因谱，以评估此序列的多态状态(表2)。

表2：MSI和MSS细胞系和原发性肿瘤中和在对照淋巴母细胞(LBL)中的T17重复序列的等位基因谱和HSP110delE9表达水平。*在每一种情况下，通过减去最短的HSP110等位基因的大小至146来计算，**相对于HSP110wt表达(定量RT-PCR)。

总体而言，这个序列在MMR健全型样品中是弱多态性的(图4)，而在14／14(100％)MSI CRC细胞系和在43／43(100％)MSI CRC原发性肿瘤中是系统突变的。范围从3到8个碱基对的等位基因缺失超出多态性区域(图4和表2)。HSP110T₁₇的突变比MSI原发性CRC中报道的所有编码微卫星更频繁(图5)。这种突变也在9／17(53％)显示MSI的腺瘤中检测到，虽然比MSI原发性CRC所观察的具有较少的等位基因缺失。HSP110T₁₇的突变与在这种预恶性结肠病变中影响TGFBR2的突变一样频繁(图5)。

MSI CRC细胞系和原发性肿瘤中外显子9负性HSP110mRNA(HSP110delE9)的过表达

首先，我们通过定量RT-PCR证实，两个在MSI癌细胞系中观察到的HSP110PCR产物对应于含有或缺乏外显子9的HSP110替代mRNA(图6)。将含有外显子9的HSP110mRNA(HSP110wt)和缺乏外显子9的HSP110mRNA(HSP110delE9)都以竞争方式在MSI和MSS CRC细胞系中以及在MSS LBL中量化(表2)。我们观察到，HSP110delE9mRNA在MSS CRC细胞系中弱表达，即，低于HSP110wt mRNA10-20倍(图7)。相反，HSP110delE9mRNA表达在MSI CRC细胞系中较高，且在MSI(N=43)和MSS(N＝20)原发性CRC之间显著不同(P=8.5×10^-5，图6和表2)。

CRC中HSP110delE9表达与HSP110T₁₇的DNA重复序列的等位基因状态相关

我们调查HSP110T₁₇内含子DNA重复序列的突变是否可能影响HSP110在我们的原发性CRC系列中的表达。T₁₇缺失的长度与HSP110delE9mRNA的显著增加的表达相关，与HSP110wt转录的损害相关(图8，P=1.1×10^-13)。通过量化在T₁₇重复序列(3至8个碱基)中显示出可变等位基因位移的10位MSI原发性CRC中HSP110wt和HSP110delE9的量，在蛋白质水平上证实了这些结果。这里再一次，用Western印迹在HSP110delE9的表达水平和微卫星缺失的长度之间观察到密切的关系(图9)。我们断定HSP110内含子T₁₇微卫星的突变可能是导致在结肠直肠肿瘤中该伴侣的异常表达的致病事件。

HSP110delE9显示改变的伴侣功能

HSP110外显子9的跳跃是移码的，且因此在HSP110delE9mRNA的外显子10中产生提前终止密码子。HSP110delE9是一种截短蛋白质，它包含N-端ATP结合域，但没有底物结合域(图3)。我们进行了若干个功能检测，以便更好地了解MSI CRC细胞系中HSP110delE9表达增加的作用。首先使用蛋白热敏性试验研究了伴侣活性，所述试验测量HSP110在体外阻断通过使用鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的热休克蛋白诱导的蛋白质聚集。虽然HSP110wt相对于其它丧失这种伴侣活性的HSP如HSP70、HSP110delE9显示抗聚集活性(图9)。有趣的是，这种影响是显性负性的，因为如果在同一时间中加入HSP110dele9，则HSP110wt的抗聚集活性被取消(图9)。HSP110已被证明与其它分子伴侣如HSP70联合，且这有助于整个细胞伴侣网络。我们在此确认在HCT116细胞中HSP110wt有效地与HSP70和与HSP27，但不与HSP90相互作用。相反，HSP110delE9丧失与HSP70和HSP27联合的能力，但是与HSP110wt强烈的联合，符合其显性负性影响(图10)。最后，HSP110delE9相比HSP110wt显示改变的细胞定位。而后者在细胞核和细胞质中被发现，而HSP110delE9限于细胞质。

HSP110delE9阻断HSP110wt抗凋亡功能和使得癌细胞对奥沙利铂敏感

大量的研究之前已经描述了HSP110的抗凋亡作用。因此，我们研究由于外显子9跳跃导致的HSP110截断对凋亡的影响。用HSP110wt或HSP110delE9转染HCT116细胞并使用细胞死亡因子TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)触发细胞凋亡。如所预期的，TRAIL诱导剂量依赖性细胞凋亡且HSP110wt发挥保护作用，如出现众所周知的凋亡标志物，包括caspase-8裂解、caspase-3活性、caspase-3靶PARP裂解、线粒体膜渗透和核固缩(nuclear condensation)所证实的(图11)。相反，HSP110delE9不仅缺乏HSP110wt的保护性能，但也能够以剂量依赖性方式阻断其抗凋亡功能(图12)。或许因此，各种MSI(HCT116，LoVo)以及MSS(SW480)CRC细胞系中HSP110delE9的过度表达增加其对抗癌药物，如奥沙利铂，一种在CRC患者的辅助治疗中常用的药物的敏感性(图13)。

HSP110delE9影响患者的生存率和对化疗的反应

接下来，我们通过评估CRC中HSP110delE9mRNA相对于HSP110wt转录物的表达来研究HSP110delE9是否有临床意义。共计具有临床数据的38个MSI和58个MSS CRC患者被纳入这项研究。我们根据HSP110delE9表达的水平将MSI肿瘤分为两组，即MSI-HSP110delE9^高(N＝9；24％)和MSI-HSP110delE9^低(N=29；76％)肿瘤，其中HSP110delE9／HSP110wt mRNA比分别高于和低于75％(图6)。如所预期的，患者的无病生存率(DFS)与它们的肿瘤MSI状态呈正相关(图14)。此外，MSI-HSP110delE9^高患者显示了优异的DFS和对化疗的反应，与不表达HSP110delE9的MSS-HSP110delE9^Neg患者和MSI-HSP110delE9^低患者相反(图15)。重要的是，在具有MSI-HSP110delE9^高和MSI-HSP110delE9低肿瘤的患者的临床病理特征中没有观察到显著差异，包括Dukes期、患者年龄和性别、原发性肿瘤位置和KRAS和BRAF突变状态(见表3)。

表3：MSI CRC中临床病理可变因素和HSP110del9表达之间的关联(Fisher精确检验p-值，t-检验，年龄p值)；NA：不适用。*微卫星编码序列MSI(靶基因)的突变。

实施例3：讨论

像其它应力可诱导HSP一样，HSP110保护细胞免受不利条件。然而，HSP110还提供特定的重要功能，因为在酵母和果蝇中的HSP110基因敲除都是致命的(Trott等，Genetics170(3)，1009(2005))。HSP110不仅作为用于HSP70的核苷酸交换因子(Andreasson等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica105(43)，16519(2008))，还具有伴侣抗聚集活性。它结合和稳定变性的蛋白质底物的效率是HSC70和HSP70的约四倍(Wang等，Cancer research63(10)，2553(2003))。由于其强大的伴侣(或支持物)功能，HSP110是一种非常好的抗原载体，且因此被用作疫苗制剂的胞外蛋白(Manjili等，Cancer research62(6)，1737(2002)；Manjili等，JImmunol171(8)，4054(2003))。HSP110伴侣活性是ATP非依赖性的，但需要蛋白质的底物结合域。由于在这里在MSI CRC中鉴定的外显子9跳跃造成的截短的HSP110形式(HSP110delE9)缺乏底物结合域。其结果是，它丧失了其HSP110抗聚集的伴侣功能，且不能结合HSP70，从而也丧失其作为用于HSP70蛋白的核苷酸交换因子的功能。

在CRC细胞中HSP110过度表达的一种可能的解释(Kai等，Oncology reports10(6)，1777(2003))是，它们必须将代谢和信号转导途径广泛重新连接，从而变得依赖于正常细胞的存活非必需的蛋白质。HSP110的致肿瘤性，虽然没有完全理解，可以部分地由其抗凋亡性质来解释(Ceballos等，Oncogene24(28)，4559(2005)；Gotoh等，FEBS letters560(1-3)，19(2004))。已经证明HSP110的过度表达防止不同的细胞模型，包括结肠癌中的凋亡性细胞死亡。相反，小干扰RNA介导的HSP110贫化诱导HCT116细胞凋亡(Hosaka等，Cancerscience97(7)，623(2006))。有趣的是，我们在这项工作中表明，HCT116细胞中的凋亡的类似诱导通过突变体HSP110delE9的过度表达实现。HSP110delE9表达的显著水平被限制在显示MSI的结肠癌细胞，从而不利于它们的生存。事实上，HSP110delE9不仅丧失了正常的HSP110抗凋亡特性，也与HSP110以剂量依赖性方式来阻断这些保护性功能相关。此外，当在MSI和MSS CRC细胞中过表达时，HSP110delE9使得这些细胞对化疗药物诱导的细胞凋亡敏感。值得一提的是，当HSP110delE9表达与HSP110wt的表达相似或更高时，特别观察到这些促凋亡作用，如我们的转染实验所示。这可能是由于以下事实，即每个HSP110delE9分子与一个HSP110wt分子形成复合体，从而以显性方式中和其功能。

还不清楚MSI CRC中内源性HSP110delE9显性负性促凋亡突变体的选择和表达的原因。一种可能的解释是，长非编码单核苷酸重复序列如位于HSP110内含子8的T17往往是由于MMR缺陷的MSI肿瘤中的突变的热点(Suraweera等，Gastroenterology123(6)，1804(2002)；Buhard等，J Clin Oncol24(2)，241(2006))。而大多数这些微卫星是无功能的，有几个被赋予了生物活性。尽管它们导致肿瘤抑制效果，这些序列的频繁突变可以发生，如在目前的工作中显示的，从而代表MSI驱动的致肿瘤过程中的致命弱点。本文测试的所有MSI肿瘤样品在HSP110的T₁₇重复序列突变以及以可变水平显示HSP110delE9积聚。那些具有高表达水平的HSP110delE9mRNA，即高于HSP110wt的75％阈值，代表MSI结肠肿瘤的约25％。与我们的体外结果一致，它们与优异的生存率和对化疗的反应相关。另一方面，具有MSI-HSP110delE9^低的CRC患者与MSI-HSP110delE9^高和MSSCRC患者相比，显示中等的生存率。

总的来说，这些结果是CRC中HSP110delE9表达的剂量依赖性临床效果的高度提示。使用较大系列的CRC患者的进一步研究有必要了解这种突变的内源性表达如何能影响它们的预后和对治疗的反应。我们预计，HSP110delE9也应该显示来自其它原发性位点，如胃、子宫内膜及其它更多最近报道的位点的MSI癌症中的异常表达(Duval等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America101(14)，5002(2004))。此外，HPS的靶向已经成为在肿瘤治疗中的一个有趣的敏化策略。这是由HSP可能具有致癌基因样功能和介导必须适应敌对微环境的应力肿瘤细胞的“非致癌基因成瘾”的知识来驱动的。不同的HSP90抑制剂(如17-烯丙基氨基、17-去甲氧基格尔德霉素、17AAG)、HSP27(如寡核苷酸OGX-427)和HSP70(如HSP70肽适体(Rerole等，Cancer research71(2)，484(2011)))目前正在癌症患者中评估，其中有一些已经处于II／III期临床试验(Jego等，Cancer letters)。有趣的是，目前的工作是细胞内源性产生的HSP抑制剂的第一份报告。目前，我们正在设计模仿HSP110delE9的敏化功能的小分子肽，且因此可以容易地适用于癌症治疗。

实施例4

HSP110delE9转录物含有提前终止密码子(PTC)。因此，它部分地通过肿瘤细胞中的NMD系统降解。进行了实验表明，HSP110delE9转录物部分地通过NMD系统降解，如同通过MSI结肠癌细胞中的MSI产生的其它PTC+mRNA。因此HSP110delE9的再表达引起MSI结肠肿瘤细胞系的细胞凋亡(数据未示出)。模仿肿瘤细胞中的HSP110delE9活性，尤其是模仿其抗凋亡作用的化学或生物化合物的合成可能在CRC治疗中具有主要的治疗意义。以同样的方式，易于促进HSP110delE9在肿瘤细胞中的表达的化合物的用途会引起极大的兴趣。尤其是抑制无义介导的mRNA降减(NMD)系统的化合物的情况下。目前可获得不同的NMD药理抑制剂。它们可以用于在体外在不同的细胞模型和动物模型中(第一线异种移植有MSI CRC的裸小鼠)重现这些实验。

实施例5

方法

患者和标本

本研究中鉴定了365位在6个临床中心(

Saint-Antoine，Paris，France；CHU de Dijon，Dijon，France；CHU de Toulouse Purpan，Toulouse，France；Centre Antoine Lacassagne，Nice，France；St John ofGod Pathology，Subiaco，Australia；National University Hospital，Singapore)之一中经历了组织学证实为显示明确的MSI显型的结肠直肠腺癌的手术切除的患者。对于这些患者，临床数据是可用的且肿瘤组织可以从肿瘤收集物中回收。这项研究根据机构当局的建议进行。患有MSI CRC的患者经5-氟脲嘧啶+亚叶酸治疗，单独或与其它药物，如奥沙利铂的组合。在手术后的第一个3年的每3个月，然后每6个月进行2年，和然后每年均匀地评估复发性，即用生物测试的物理检测和癌胚抗原水平、肺X-射线和腹部超声或计算机断层扫描测量。患者随访定义为手术和最后的医院接触或疾病复发之间的时间。在这项研究中，在一组282位匹配年龄、性别、原发性肿瘤部位及肿瘤分期的MSS CRC患者中检查无复发生存率(表4至7)。

表4：II期和III期MSI和MSS CRC患者的单变量分析

表5：II期和III期MSI和MSS CRC患者的多变量分析

表6：III期MSI和MSS CRC患者的单变量分析。

表7：III期MSI和MSS CRC患者的多变量分析。

HSP110中T₁₇重复序列的微卫星不稳定性分析

使用QIAamp DNA组织试剂盒(Qiagen)从样品中提取肿瘤DNA。为了评估MSI或MMR缺陷状态，分别使用MLH1、MSH2、MSH6或PMS2主要抗体对福尔马林固定的肿瘤组织进行五重PCR或免疫过氧化物酶染色。通过PCR和荧光基因分型在365个MSI CRC样品系列和405个MSS结肠肿瘤样品的对照系列(包括我们用于在MSSCRC患者中检查无复发生存率的282个CRC)中评估HSP110T₁₇的突变状态，如在Dorard和al.Nature Medicine17：1283-1289(2011)中描述的。

统计分析

对于与患者结果相关的分析，使用无复发生存率，且定义为从手术到首次复发(复发或死亡)的时间。根据Kaplan和Meier的方法获得生存率曲线并使用五年为终点通过log-rank检验评估生存率分布之间的差异。采用Cox比例风险回归计算单变量和多变量模型。对于多变量分析，因为必须在待比较的同一样品上评估所有的变量，仅适用于样品的亚组的变量不包括在多变量模型中。

为发现与临床结果相关的HSP110中的T₁₇缺失的最小尺寸，对来自在Dorard和al.Nature Medicine17：1283-1289(2011)中描述的之前研究组群中的III期患者进行分析。测试所有定义两类缺失尺寸(从2至5个碱基对)的阈值。选定的阈值是显示与结果最显著相关的阈值。因此将所有肿瘤分为两类，代表大(DEL^L)和小(Del^S)的HSP110缺失。以相同的方式对小的缺失肿瘤种类之中的再分进行了研究，但使用III期患者用于整个数据集，以便有充足的样品量。

使用Fisher精确检验用于分类变量，或使用非配对Student′s t检验用于连续变量，测试HSP110缺失尺寸组和其它临床注释之间的差异的统计学显著性。

如上所述对于两个HSP110尺寸组，通过评估MSI状态和其它临床注释之间的差异，确认将MSS CRC群体调整至II和III期MSI CRC。

对于所有分析，P值小于0.05被认为表明统计学显著性。

结果

MSI和MSS CRC的HSP110T₁₇状态

研究群体由使用既定的标准明确显示MSI的经病理证实为结肠直肠腺癌的连续的、多中心的、回顾系列的365位患者组成。

在405位MSS CRC的对照系列(5.2％0期，18.5％I期，20.5％II期，21.7％III期，14.3％IV期，19.8％未知)中评估HSP110T₁₇的状态。如图16所示，在报告的多态区⁶内所有情况下等位基因长度为T₁₆或T₁₇。在365例MSI肿瘤中，353例(96.7％)显示了多态性区域以外的多达7个碱基对的缺失。MSI CRC中不同的HSP110突变T₁₇等位基因的频率和分布如图17所示。

MSI CRC患者的HSP110T₁₇突变状态和生存率

研究了II期和III期MSI CRC中HSP110T₁₇突变的公认的临床相关性。这首先在初始组群的98个II期或III期肿瘤中检查。将患者分为两组，显示大的缺失(ΔT≥5个bp，包含T₁₁、T₁₀和T₉；HSP110Del^L)，或小的缺失(0≤ΔT<5，包含T₁₇、T₁₆、T₁₅、T₁₄、T₁₃和T₁₂；MSIHSP110Del^S)。虽然III期HSP110Del^L病例数少(N=8)，这些患者比HSP110Del^S病例表现出极好的生存率(P=0.065；图18)。在II期病例生存率中没有出现这样的差异(图18)。在231位II期或III期MSI CRC患者的多中心验证组群中获得了类似的结果(图19)。当两个组群被合并，在III期MSI HSP110Del^L和HSP110Del^S CRC患者之间的生存率差异达到显著性(P=0.013；图20)。使用其它截止点来分类突变体(ΔT=2、3或4bp)并没有导致显著不同的生存率组(图21)。在多变量分析中，HSP110T₁₇突变状态与II期和III期MSI CRC中的无复发生存率显著相关(表8至13)。

表8：II期和III期MSI CRC患者的单变量Cox分析中得出的临床和分子注释的关系(无复发生存率)。CRC，结肠直肠癌；MSI，微卫星不稳定性；Y，年；LC，左结肠；RC右结肠；F，女；M，男；RFS，无复发生存率。HNPCC和化疗类型不包括在多变量模型中，因为它们的样品量较小。

表9：II期和III期MSI CRC患者的多变量Cox分析中得出的临床和分子注解的关系(无复发生存率)。CRC，结肠直肠癌；MSI，微卫星不稳定性；Y，年；LC，左结肠；RC右结肠；F，女；M，男；RFS，无复发生存率。HNPCC和化疗类型不包括在多变量模型中，因为它们的样品量较小。

表10：III期MSI-CRC患者的单变量分析。

表11：III期MSI-CRC患者中的多变量分析。

表12：MSI CRC患者在化疗下的单变量分析。

表13：MSI CRC患者在化疗下的多变量分析。

在临床参数当中，仅在HSP110Del^L和近端肿瘤位置之间观察到正相关(P=0.027；表14和表15)。

表14：II期和III期MSI CRC患者中临床注释与HSP110缺失状态的联系。CRC，结肠直肠癌；MSI，微卫星不稳定性；LC，左结肠；RC右结肠；F，女；M，男；RFS，无复发生存率。N：注释患者的总数；n=给定形式的患者数；HNPCC推断，具有MSI CRC的年轻患者(<50岁)。P值：Fisher精确检验P值。无直肠*P值在2和3期患者中和在3期患者中分别0.039和0.088。

表15：III期MSI CRC患者中临床注释与HSP110缺失状态的联系。CRC，结肠直肠癌；MSI，微卫星不稳定性；LC，左结肠；RC右结肠；F，女；M，男；RFS，无复发生存率。N：注释患者的总数；n=给定形式的患者数；HNPCC推断，具有MSI CRC的年轻患者(<50岁)。P值：Fisher精确检验P值。无直肠*P值在2和3期患者中和在3期患者中分别0.039和0.088。

HSP110T₁₇突变状态和5-氟尿嘧啶治疗的MSI CRC患者的生存率

已经表明，HSP110DE9突变的伴侣引起结肠癌细胞在体外对化疗剂包括5-氟尿嘧啶和奥沙利铂敏感。在本研究中，对经基于5-氟尿嘧啶的辅助化疗治疗的CRC患者的无复发生存率与HSP110T₁₇突变状态的相关性进行了研究。在整个患者组群中，接受辅助化疗的MSIHSP110Del^L CRC受试者比HSP110Del^S患者显示出明显更好的无复发生存率(P=0.026；图22)。MSI HSP110Del^L CRC受试者显示出优异的生存率，无论是否使用辅助化疗方案。由于已报告MSI CRC患者没有从单独使用5-氟尿嘧啶的辅助化疗中获益，接下来研究在该MSI CRC患者的特殊组中的HSP110T₁₇突变状态。具有MSIHSP110Del^L CRC的患者与MSI HSP110Del^S患者相比显示优异的生存率(图23)。多变量模型证实，经化疗治疗的MSI CRC患者的生存率依赖于HSP110T₁₇突变状态(表10至15)。

讨论

本文给出了来自365位MSI CRC患者的大的、连续的、多中心的和回顾系列的分析结果。使用灵敏的、已建立的和高度可重复的PCR-荧光基因分型方法，测定HSP110T₁₇微卫星内的缺失(Buhard等，J ClinOncol，24：241-251，(2006))。使用这种方法，并根据HSP110T₁₇缺失的大小进一步分类MSI CRC，观察到两组III期患者具有非常不同的无复发生存率。与超过40％的HSP110Del^S患者(ΔT=0-4bp)相比，具有大的缺失(HSP110Del^L；ΔT=5-7bp)和占所有III期MSICRC的约20％的患者表现出优异的预后，只有2／22(9％)在5年后复发。因此，总体而言这些数据表明，HSP110的T₁₇重复序列中大的缺失是III期MSI CRC患者的生存率改善的预测。使用其它截止点分类突变并没有导致显著不同的生存率组。然而，小和大的缺失之间截止点越接近5，III期CRC无复发生存率的区别更显著。在任何情况下，5是唯一的允许鉴别III期MSI CRC患者的无复发组的截止值。

另一个重要的问题是，HSP110T₁₇的突变状态是否为III期MSIHSP110Del^L和HSP110Del^S患者中观察到的不同的生存率提供了一种机械的链接(mechanistic link)。具有II期和III期MSIHSP110Del^L肿瘤的患者表现出优异的生存率，不管他们接受的辅助化疗是否为单独的5-氟尿嘧啶或与其它药物合用。因此，确定HSP110T₁₇状态可以是受益于辅助化疗的MSI CRC患者的有价值的预测标记物。值得指出的是，当用5-氟尿嘧啶单独治疗时，MSI HSP110Del^L CRC患者显示优异的生存率，且当与MSIHSP110Del^S CRC受试者相比，生存率的差异仍然显著。重要的是，在HSP110突变状态和患者的年龄或最近建议作为MSI CRC中影响对这种抗癌剂的反应的标准的HNPCC状态之间没有任何关联。这些发现对于在CRC患者中使用辅助治疗具有重要的临床意义。如果通过具有很好特征的患者组群的额外的分析或通过前瞻性、随机、对照研究证实，它们会表明HSP110T₁₇突变状态可以用于引导MSI CRC中的合理的辅助化疗。在本组群中，当用FOLFOX治疗时，MSI HSP110Del^L CRC患者显示优异的生存率，但与MSI HSP110De1^S CRC受试者相比较时，生存率的差异并没有达到显著性。

上述调查结果提供了用于与HSP110突变状态相关的MSI结肠癌中临床异质性额外层的证据。因此将MSI HSP110Del^S和HSP110Del^LCRC患者的生存率与282位年龄、性别、肿瘤部位和期数匹配的MSS患者组群的生存率相比较。III期且经辅助治疗的患者组中MSIHSP110Del^L患者的生存率明显优于MSS HSP110^WT患者。在MSSHSP110^WT与MSIHSP110Del^S患者组之间没有观察到生存率差异。对于以5-氟尿嘧啶作为唯一的化疗剂治疗的患者，在MSI和MSS组的生存率之间没有观察到显著的差异。然而，MSIHSP110Del^S患者显示与经5-氟尿嘧啶治疗的MSS HSP110^WT病例类似的生存率，而MSIHSP110Del^L患者的生存率明显更好。在包括MSI和MSS CRC患者的多变量模型中，HSP110T₁₇突变状态与CRC患者中的无复发生存率显著相关(表4)。这些最后的结果表明，HSP110T₁₇突变状态可能在作为预测生物标志物方面优于MSI。它们强调CRC中的临床异质性的问题，如果通过前瞻性研究证实，可以更普遍地导致MSI和MSS结肠直肠肿瘤的临床行为的复议。

这里给出的数据表明，HSP110T₁₇重复序列的基因型分析提供了MSI CRC临床特点的新的见解。这种简单的方法可以用于确定新鲜或石蜡包埋的肿瘤DNA样品的HSP110突变状态。因此，它可以被常规推荐在预期的、随机的、对照研究中与调查微卫星不稳定性表型一起，以确认在结肠肿瘤中HSP110T₁₇的突变状态可以用于帮助临床医生选择最有可能受益于细胞毒素辅助化疗的患者的亚组。

Claims

1.一种突变的热休克蛋白110(HSP110)，其中所述蛋白：

a)不展现伴侣活性和／或不能结合热休克蛋白70(HSP70)和／或热休克蛋白27(HSP27)；和

b)能够结合SEQ ID NO：2的野生型HSP110蛋白。

2.如权利要求1所述的突变的HSP110，其中所述突变的HSP110蛋白缺乏由SEQ ID NO：2的氨基酸381至858组成的结构域。

3.如权利要求1或2所述的突变的HSP110蛋白，其中所述的蛋白由至少由80％与SEQ ID NO：1相同的氨基酸序列组成。

4.如权利要求1或2所述的突变的HSP110蛋白，其中所述的蛋白由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

5.一种分离的核酸，包含编码如权利要求1至4中任一项所述的突变的HSP110的序列。

6.一种化合物，选自：

a)如权利要求1至4中任一项所述的突变的HSP110；和/或

b)如权利要求3或4所述的突变的HSP110的至少5个连续的氨基酸的片段；和／或

c)a)的突变的HSP110的肽模拟物或b)的片段；和／或

d)编码a)的突变的HSP110的核酸或b)的片段；和／或

e)无义介导的mRNA降解(NMD)抑制剂，用于治疗癌症。

7.如权利要求6所述的化合物，其中所述化合物是NMD抑制剂，即6-氯-5，10-二甲基-11H-吡啶并[3′，2′：4，5]吡咯并[3，2-g]异喹啉。

8.如权利要求2至4中任一项所述的突变的HSP110和／或位于编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体部位中的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列作为用于预测患有癌症的患者的存活率和／或对治疗的响应的生物标志物的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其中所述癌症选自结肠直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤和神经母细胞瘤。

10.一种用于预测患有癌症的患者的生存率或和／或对治疗的反应的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)测量所述患者的生物样品中如权利要求2至4中任一项所述的突变的HSP110的表达；和／或

b)测定位于编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体部位中的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列的胸苷重复的长度；

c)和将在步骤a)测量的表达水平和／或在步骤b)鉴定的胸苷缺失的长度与所述患者的预后相关联，从而推断所述患者的预后。

11.如权利要求10所述的体外方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)测定位于编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体部位中的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列的胸苷缺失的长度；

b)和将在步骤a)鉴定的胸苷重复的长度与所述患者的预后相关联，从而推断所述患者的预后。

12.如权利要求10或11的体外方法，其中所述重复内至少5个胸苷的缺失指示存活率和／或对治疗的反应的良好预后。

13.如权利要求10的体外方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)测量所述患者的生物样品中如权利要求2至4中的任一项所述的突变的HSP110的表达；

b)测量阴性对照样品中如权利要求2至4中的任一项所述的突变的HSP110的表达；

其中在步骤a)测量的突变的HSP的表达显著高于在步骤b)测量的表达指示存活率和／或所述患者可能响应治疗的良好预后。

14.如权利要求10的体外方法，其中所述方法包括以下步骤：

b)测量所述生物样品中野生型HSP110的表达；

c)比较在步骤a)和b)测得的表达，从而推断所述患者的预后。

15.如权利要求10的体外方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)测量所述患者的生物样品中突变的HSP110和野生型HSP110的表达；

b)分析步骤a)得到的表达值以产生表达比；

c)测量阴性对照样品中突变的HSP110和野生型HSP110的表达；

d)分析步骤c)得到的表达值以产生表达比；

其中步骤b)产生的表达比显著高于步骤d)产生的表达比指示患者具有良好的预后和／或患者可能响应治疗。

16.一种用于诊断肿瘤的MSI表型的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)基因分型位于可能受具有MSI表型的癌症影响的患者的生物样品中编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体位点中的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列；

b)检测所述微卫星重复序列上存在或不存在不稳定性，其中在患者的生物样品中所述的微卫星重复序列上检测到不稳定性表示患者患有具有MSI表型的癌症。

17.本发明还提供了一种试剂盒，其包含或由以下组成：

a)用于检测根据本发明的突变的HSP110的存在的工具；和／或

b)用于检测检测野生型HSP110的工具；和／或

c)用于检测位于编码HSP110的基因的内含子8的剪接受体位点中的17个胸苷核苷酸的微卫星重复序列的长度的工具。

18.一种用于确定适用于治疗患有易于具有MSI表型的癌症的受试者的治疗方案的体外方法，其中所述方法包括以下步骤：

b)在所述胸苷重复长度的基础上推断用于所述受试者的合适的治疗方案。