一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系和试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体地涉及肺癌多重基因的引物、探针及检测体系。
背景技术
肺癌是恶性肿瘤中发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%左右。我国是肺癌发病率最高的国家,每年约有60万人被确诊为肺癌。在过去的30年里,肺癌的病死率增加了464.84%,据世界卫生组织(WHO)估计,截至2025年,我国每年肺癌死亡病例将达到100万。目前化疗仍是肺癌最主要治疗手段,虽然随着新一代化疗药物的出现,肺癌疗效有了一定程度的提高,但肺癌患者的总生存率仍然较低,究其原因,主要是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术以及与之相匹配的科学的治疗方案,从而失去了治疗的最佳时机。近年来,分子靶向治疗已经成为肺癌研究热点,越来越多分子靶点的发现及靶向药物的研发给肺癌患者长期生存带来了希望。随着肿瘤个体化治疗理念的提倡、分子检测技术的进步和靶向治疗药物的不断推出,肺癌核酸标志物检测指导治疗方案引起了众多学者的关注和探讨,其研究热点主要集中于EGFR、BRAF、KRAS、ALK、ROS1等靶点。
目前,从法国报道的1000例的肺癌BM项目研究、美国LCMC项目等项目显示肺癌分子靶点的多基因检测和筛查意义重大,有助临床实践和临床试验,能显著改善患者生存质量。然而,目前大多每次只能检测一个突变或一段基因的突变,检测通量低,只能逐个筛查,耗时长。同时,由于晚期患者取材较难,样本量较少,往往不能满足逐个筛查的需要,且临床上尚无能够同时、一次性完成对此5个热点基因进行检测的试剂盒。
本发明提供一种高灵敏度和高特异性的用于一次性检测多重肺癌基因的引物、探针、试剂盒及引物分配方式。该检测试剂盒利用DNA样本进行基因突变和RNA样本进行基因融合的检测,特异性和灵敏度高,检测结果重复性好,而且引入了荧光检测技术,克服了传统PCR产物遗留污染的问题,操作简便快捷,为临床EGFR、BRAF、KRAS、ALK和ROS1基因突变/融合的检测提供了一种快速可靠的检测方法。该方法可以实现一次性检测肺癌的多重基因,大大缩短了检测的时间,提高了肺癌基因检测的灵敏度和准确率,从而实现指导肺癌临床治疗方案制定及化疗预后。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于一次性检测多重肺癌基因的引物、探针,包括EGFR、BRAF、KRAS、ALK和ROS1等热点基因的引物、探针及分配方式,其序列如表1:
表1引物、探针以及序列号
本发明的另一目的在于提供一次性检测多重肺癌基因的试剂盒。本试剂盒包括两个部分:RNA融合基因检测和DNA基因突变检测,包含EGFR、KRAS、BRAF、ALK、ROS1等突变基因的特异性引物、新型探针,还包括PCR缓冲液、UNG酶等。试剂盒采用12联PCR反应条设计,其中RNA融合基因检测由12联PCR反应条的1-3号孔组成,其中1号孔由ALK融合基因检测试剂和内控检测试剂组成,2和3号孔都由ROS1融合基因检测试剂和内控检测试剂组成。1-3号孔融合基因检测试剂由FAM信号指示,内控检测试剂用于监控样本RNA质量及加入情况,由HEX(VIC)信号指示;DNA基因突变检测由12联PCR反应条的4-12号孔组成,其中4-7号孔由EGFR基因突变检测试剂和内控检测试剂组成,8-10号孔由KRAS基因突变检测试剂和内控检测试剂组成,11号孔由BRAF基因突变检测试剂和内控检测试剂组成,12号孔由扩增EGFR外显子的检测试剂组成。其中4-11号孔基因突变检测试剂由FAM信号指示,内控检测试剂用于监控样本DNA加入情况,由HEX(VIC)信号指示;12号孔的检测试剂用于监控样本DNA质量,由FAM信号指示。
每一样本检测需要1条12联PCR反应条。本试剂盒组成详见表2和表3。本发明通过一次性对样本DNA中基因突变和RNA中基因融合的检测,指导肺癌临床治疗方案制定和化疗预后。
表2试剂盒组成
表3EARKB12联PCR反应条组成成分
表4试剂盒检测所有融合和突变类型信息
本发明另一方面提供一种用于一次性检测肺癌基因检测的反应体系,具体如下:
①融合基因
其中,EARKB混合酶A的组成如表5:
表5EARKB混合酶A组成
物料 |
浓度 |
用量(μL) |
Hs-taq酶 |
5U/μL |
0.20-0.35 |
UNG酶 |
1U/μL |
0.01-0.05 |
逆转录酶 |
|
0.1-1.0 |
优选地,EARKB混合酶A的组成为Hs-taq酶0.28μL,UNG酶0.02μL,逆转录酶0.5μL;
②突变基因
其中,EARKB混合酶A的组成如表6:
表6EARKB混合酶B组成
物料 |
浓度 |
用量(μL) |
Hs-taq酶 |
5U/ μL |
0.15-0.30 |
UNG酶 |
1U/μL |
0.02-0.07 |
优选地,EARKB混合酶B的组成为Hs-taq酶0.25μL,UNG酶0.05μL。
本发明试剂盒的使用方法包括以下步骤:
1.提取检测样本中的DNA和RNA,包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织或石蜡切片、全血、血液、血浆胸腔积液等组织中的DNA和RNA。
2.配制各反应荧光PCR扩增突变基因反应体系。
3.根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果:
(1)样本1~3号孔ALK融合基因和ROS1融合基因阴阳性判定:
①样本1~3号孔HEX信号扩增曲线:
a.若三孔Ct值均≤25,则继续分析;
b.若任意一孔Ct值均>25,说明RNA可能存在片段化或降解或抑制剂或漏加,若FAM扩增信号升起且落在阳性区域,试验结果仍然可信,否则建议重新检测或重新提取RNA后再进行检测。
②样本1~3号孔FAM信号扩增曲线:
a.若1号孔FAM信号Ct值<35,则该样本含有ALK融合基因,否则,不含ALK融合基因;
b.若2~3号孔FAM信号Ct值<35,则该样本含有ROS1融合基因,否则,不含ROS1融合基因。
(2)样本4~11号孔EGFR、KRAS和BRAF基因突变阴阳性判定:
①样本4~11号孔HEX信号和12号孔FAM信号扩增曲线:
a.若20≤12号孔FAM信号的Ct值≤26且4~11号孔HEX信号扩增曲线均有升起,则继续分析。
b.若12号孔FAM信号的Ct值<20,说明加入的DNA过量,应减少DNA加入量再进行试验。但突变信号无升起或者落在阴性区,该试验结果仍然可信;
c.若12号孔FAM信号的Ct值>26,说明加入的DNA可能存在片段化或降解或抑制剂或漏加,若突变信号有升起且落在强阳区域,试验结果仍然可信,否则建议增加DNA上样量重新检测或重新提取DNA后再进行检测。
(3)样本4~12号孔FAM信号扩增曲线:
首先确定样本4~11号孔FAM信号各自的Ct值,然后确定该样本12号孔FAM信号的Ct值。由于样本中突变百分含量各不相同,所得到的突变Ct值也各不相同。根据不同的突变Ct值,把样本检测结果分为阴性、弱阳及强阳。具体判定见表7。
a.当样本突变Ct值大于或等于阴性临界值时,则该样本为阴性或低于本试剂盒的检测下限。
b.当样本突变Ct值小于阴性临界值时,进行下列判断:
i当某个反应管的突变Ct值小于强阳性临界值时,则该样本为该反应管对应的突变阳性,即强阳。
ii当反应管的突变Ct值大于或等于强阳性临界值时,则计算该反应管的ΔCt值。若反应管的ΔCt值小于相对应的ΔCt Cut-off值,则该样本也为该反应管对应的突变阳性,即弱阳;反之则为阴性或低于本试剂盒的检测下限。
c.ΔCt值的计算:ΔCt值=突变Ct值-外控Ct值。突变Ct值是指样本突变信号(FAM信号)对应的Ct值;外控Ct值是指样本对应的外控信号(FAM信号)的Ct值。
表7EGFR/KRAS/BRAF基因突变结果判定
本发明的有益效果是:
本发明采用了特异性引物和新型探针技术,可以特异性地检出肺癌突变基因。此方法:(1)建立了实时PCR体系可以一次性检测肺癌多重基因,包括EGFR基因18种突变、KRAS基因7种突变和BRAF V600E基因突变、ALK5种融合基因和ROS19种融合基因(见表4);可以为临床医生对肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。根据各基因突变和各基因融合的发生率,本试剂盒包含的检测位点可覆盖约70%的非小细胞肺癌患者。
本发明根据所检测的多个突变/融合位点的检测难易程度、引物之间的相互影响、竞争等多方面综合因素,将81条序列(包括引物和探针)分组,分装于12联条中,其优点在于:(1)经过分组之后,同组引物之间不会互相干扰;(2)共用的上游或下游引物的设计;使得识别同样多的突变位点(例如n个),所用的引物条数最少(只需n+1个,而通常需要2n个),可以节约成本。(3)采用12联条,一次性检测多个突变/融合位点,且建立了12联管各管通用的扩增程序,使各管扩增程序一致、操作一致、可以节约大量时间。(4)12管中含有内控和外控检测体系,作为对试剂、样本DNA质量、样本RNA质量以及操作本身的质控,选择的检测区域是人类基因相对保守的区段,约100bp,这样即便DNA/RNA有降解,外控和内控仍然能够最真实地反应EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1基因有效的DNA和RNA量;(5)灵敏度高,对1%的基因突变DNA和50拷贝的融合基因RNA可以检出;(6)特异性强,10ng的野生型基因组DNA和5μg的野生型RNA不会产生非特异性信号;(7)检测时间短,检测过程只需要120分钟即可完成;(8)采用预分装,并进行封蜡处理,可提高运输过程的安全性,同时可使试验过程操作简便。
附图说明
图1为实施例1中各检测质粒的PCR图的一部分,其中:
图1-1ALK融合基因—EML4exon13;ALK exon20
图1-2ROS1融合基因—SLC34A2exon14del;ROS1exon32
图1-3ROS1融合基因—TPM3exon8;ROS1exon35
图1-4EGFR基因突变—E746_A750del(2235_2249del15)
图1-5EGFR基因突变—L858R
图1-6EGFR基因突变—T790M
图2为实施例1中各检测质粒的灵敏度图的一部分,其中:
图2-1ALK融合基因EML4exon13;ALK exon20
图2-2ROS1融合基因SLC34A2exon14del;ROS1exon32
图2-3ROS1融合基因TPM3exon8;ROS1exon35
图2-4EGFR基因突变E746_A750del(2235_2249del15)
图2-5EGFR基因突变L858R
图2-6EGFR基因突变T790M
图3为实施例2中临床样本检测结果阳性PCR图的一部分,其中:
图3-1样本1(5#EGFR基因突变)
图3-2样本2(10#KRAS基因突变)
图3-3样本3(1#ALK融合基因)
图3-4样本4(4#ROS1融合基因)
图3-5样本5(6#EGFR基因突变)
图3-6样本6(4#EGFR基因突变)
图3-7样本7(4#EGFR基因突变)
图3-8样本8(7#EGFR基因突变)
图3-9样本9A、1#ALK融合基因;B、9#KRAS基因突变
图3-10样本10(11#BRAF基因突变)
其中,各图的横坐标均为循环数(cycles);纵坐标均为荧光值,Fluorescence(dR)。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明进一步阐述。应理解,这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明,本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。
实施例1
根据Cosmic数据公布的人类EGFR,KRAS,BRA,ALK和ROS1为野生型基因序列,以EGFR,KRAS,BRA,ALK和ROS1的驱动性突变位点及融合位点为基础,来设计特异性引物和和新型探针(见表1)。
本实施例分别以EML4exon13;ALK exon20(ALK融合基因)、SLC34A2exon14del;ROS1exon32(ROS1融合基因)、TPM3exon8;ROS1exon35(ROS1融合基因)、E746_A750del(2235_2249del15)(EGFR基因突变)、L858R(EGFR基因突变)、T790M(EGFR基因突变)、G719A(EGFR基因突变)、G12S(KRAS基因突变)、G12C(KRAS基因突变)、G13D(KRAS基因突变)、V600E(BRAF基因突变)为例来阐述本发明的荧光PCR检测上述肺癌基因。
实验分别用含上述融合基因的装甲RNA及各突变的质粒模板,其荧光PCR检测包括以下步骤:
(一)质粒、装甲RNA处理与提取:
各质粒及装甲RNA的提取采用提取试剂盒进行提取,具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。DNA和RNA提取结束后,立即使用紫外分光光度计检测DNA和RNA浓度与纯度。DNA和RNA OD260/OD280应介于1.8~2.1;RNA浓度应介于50~500ng/μL。
(二)建立PCR扩增反应体系:
将上述所得模板,用作实时荧光PCR扩增的模板,按照如下扩增体系进行PCR扩增:
①融合基因
②突变基因
实时PCR反应条件为:
第一阶段:42℃5min,95℃5min,1个循环;
第二阶段:95℃25s,64℃20s,72℃20s,10个循环;
第三阶段:93℃25s,60℃35s,72℃20s,36个循环;
信号收集:第三阶段60℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号,执行实时PCR,保存文件。
(三)检测结果的判断:根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果。
(1)样本1~3号孔ALK融合基因和ROS1融合基因阴阳性判定:
①样本1~3号孔HEX信号扩增曲线:
a.若三孔Ct值均≤25,则继续分析;
b.若任意一孔Ct值均>25,说明RNA可能存在片段化或降解或抑制剂或漏加,若FAM扩增信号升起且落在阳性区域,试验结果仍然可信,否则建议重新检测或重新提取RNA后再进行检测。
②样本1~3号孔FAM信号扩增曲线:
a.若1号孔FAM信号Ct值<35,则该样本含有ALK融合基因,否则,不含ALK融合基因;
b.若2~3号孔FAM信号Ct值<35,则该样本含有ROS1融合基因,否则,不含ROS1融合基因。
(2)样本4~11号孔EGFR、KRAS和BRAF基因突变阴阳性判定:
①样本4~11号孔HEX信号和12号孔FAM信号扩增曲线:
a.若20≤12号孔FAM信号的Ct值≤26且4~11号孔HEX信号扩增曲线均有升起,则继续分析。
b.若12号孔FAM信号的Ct值<20,说明加入的DNA过量,应减少DNA加入量再进行试验。但突变信号无升起或者落在阴性区,该试验结果仍然可信;
c.若12号孔FAM信号的Ct值>26,说明加入的DNA可能存在片段化或降解或抑制剂或漏加,若突变信号有升起且落在强阳区域,试验结果仍然可信,否则建议增加DNA上样量重新检测或重新提取DNA后再进行检测。
(3)样本4~12号孔FAM信号扩增曲线:
首先确定样本4~11号孔FAM信号各自的Ct值,然后确定该样本12号孔FAM信号的Ct值。由于样本中突变百分含量各不相同,所得到的突变Ct值也各不相同。根据不同的突变Ct值,把样本检测结果分为阴性、弱阳及强阳。具体判定见表7。
灵敏度分析:取经定量后浓度为1000个拷贝的样品RNA/DNA,进行10倍稀释,然后分别对3个浓度进行检测,每次反应加入RNA/5μL DNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高,10拷贝DNA基因组即可检出,部分结果如图2。
检测结果表明,本发明的检测体系可以一次性准确检测肺癌多重基因,检测的灵敏度可达到5-10拷贝。
实施例2
取2013年12月~2014年4月送我公司的65例临床肺癌石蜡包埋组织样本进行一次性多重肺癌基因突变检测。
1、检测样本DNA和RNA的提取:DNA和RNA的提取可使用厦门艾德生物医药科技有限公司的FFPE样品DNA/RNA共分离试剂盒(闽厦食药监械(准)字2013第1400070号),CatNo.ADx-FF03或QIAGEN石蜡组织DNA提取试剂盒,Cat NO.56404;按照提取试剂盒的说明进行操作。DNA和RNA提取结束后,立即使用紫外分光光度计检测DNA和RNA浓度与纯度。DNA和RNA OD260/OD280应介于1.8~2.1;RNA浓度应介于50~500ng/μL。将上述提取的DNA和RNA用作肺癌基因的荧光PCR扩增模板。
2、将上述所提各DNA和RNA,分别按照如下扩增体系进行PCR扩增:
①融合基因
②突变基因
实时PCR反应条件为:
第一阶段:42℃5min,95℃5min,1个循环;
第二阶段:95℃25s,64℃20s,72℃20s,10个循环;
第三阶段:93℃25s,60℃35s,72℃20s,36个循环;
信号收集:第三阶段60℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号,执行实时PCR,保存文件
3、检测结果的判断:根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果。
(1)样本1~3号孔ALK融合基因和ROS1融合基因阴阳性判定:
①样本1~3号孔HEX信号扩增曲线:
a.若三孔Ct值均≤25,则继续分析;
b.若任意一孔Ct值均>25,说明RNA可能存在片段化或降解或抑制剂或漏加,若FAM扩增信号升起且落在阳性区域,试验结果仍然可信,否则建议重新检测或重新提取RNA后再进行检测。
②样本1~3号孔FAM信号扩增曲线:
a.若1号孔FAM信号Ct值<35,则该样本含有ALK融合基因,否则,不含ALK融合基因;
b.若2~3号孔FAM信号Ct值<35,则该样本含有ROS1融合基因,否则,不含ROS1融合基因。
(2)样本4~11号孔EGFR、KRAS和BRAF基因突变阴阳性判定:
①样本4~11号孔HEX信号和12号孔FAM信号扩增曲线:
a.若20≤12号孔FAM信号的Ct值≤26且4~11号孔HEX信号扩增曲线均有升起,则继续分析。
b.若12号孔FAM信号的Ct值<20,说明加入的DNA过量,应减少DNA加入量再进行试验。但突变信号无升起或者落在阴性区,该试验结果仍然可信;
c.若12号孔FAM信号的Ct值>26,说明加入的DNA可能存在片段化或降解或抑制剂或漏加,若突变信号有升起且落在强阳区域,试验结果仍然可信,否则建议增加DNA上样量重新检测或重新提取DNA后再进行检测。
(3)样本4~12号孔FAM信号扩增曲线:
首先确定样本4~11号孔FAM信号各自的Ct值,然后确定该样本12号孔FAM信号的Ct值。由于样本中突变百分含量各不相同,所得到的突变Ct值也各不相同。根据不同的突变Ct值,把样本检测结果分为阴性、弱阳及强阳。具体判定见表7。
a.当样本突变Ct值大于或等于阴性临界值时,则该样本为阴性或低于本试剂盒的检测下限。
b.当样本突变Ct值小于阴性临界值时,进行下列判断:
i当某个反应管的突变Ct值小于强阳性临界值时,则该样本为该反应管对应的突变阳性,即强阳。
ii当反应管的突变Ct值大于或等于强阳性临界值时,则计算该反应管的ΔCt值。若反应管的ΔCt值小于相对应的ΔCt Cut-off值,则该样本也为该反应管对应的突变阳性,即弱阳;反之则为阴性或低于本试剂盒的检测下限。
c.ΔCt值的计算:ΔCt值=突变Ct值-外控Ct值。突变Ct值是指样本突变信号(FAM信号)对应的Ct值;外控Ct值是指样本对应的外控信号(FAM信号)的Ct值。
表8临床样本检测阳性结果
备注:+,阳性;-,阴性。
表9本发明检测结果与直接测序法比较
检测结果表明,本发明荧光PCR反应可一次性同时检测多重肺癌基因,检测方便快捷,准确性高,可满足肺癌基因的快速诊断。该荧光PCR方法和传统测序方法结果的符合率为100%,荧光PCR灵敏度也高于传统测序方法。