CN113373233A - 一种基于数字pcr检测eml4-alk融合基因的反应体系及其应用 - Google Patents
一种基于数字pcr检测eml4-alk融合基因的反应体系及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113373233A CN113373233A CN202110769548.2A CN202110769548A CN113373233A CN 113373233 A CN113373233 A CN 113373233A CN 202110769548 A CN202110769548 A CN 202110769548A CN 113373233 A CN113373233 A CN 113373233A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alk
- eml4
- detecting
- fusion
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 117
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 92
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 62
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 29
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 claims abstract description 25
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 28
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 28
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 14
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 11
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 11
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 9
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 8
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 7
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 abstract description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 102100027100 Echinoderm microtubule-associated protein-like 4 Human genes 0.000 description 9
- 101001057929 Homo sapiens Echinoderm microtubule-associated protein-like 4 Proteins 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 108091092259 cell-free RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- VERWOWGGCGHDQE-UHFFFAOYSA-N ceritinib Chemical compound CC=1C=C(NC=2N=C(NC=3C(=CC=CC=3)S(=O)(=O)C(C)C)C(Cl)=CN=2)C(OC(C)C)=CC=1C1CCNCC1 VERWOWGGCGHDQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001602 ceritinib Drugs 0.000 description 1
- 108091092240 circulating cell-free DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011337 individualized treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于数字PCR检测EML4‑ALK融合基因的反应体系及其应用。所述检测体系包含EML4‑ALK融合基因的特异性引物和探针，通过筛选优化PCR扩增体系中引物探针序列和浓度比例组合，提高了融合突变的检出率，辅助特殊的RNA样本前处理过程，进一步减小了假阳性概率，同时使用数字PCR平台，显著提高了各种类型样本的检出率，本发明对游离核酸和外泌体RNA等微量样本的检测表现出较高的灵敏度和检测成功率。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系及其应用。
背景技术
随着生物分析技术的进步及信息化技术的发展，以及对基于基因医学理解的深入，精准医学（Precision Medicine）的概念从系统医学、转化医学等概念中提炼出来，成为一种高度综合且细致的医学新模式，有望提高疾病预防和疾病的治疗水平。随着世界许多主要国家提出精准医学的战略，精准医学已经成为未来医学的发展方向，2015年作为精准医学的元年，具有重要的历史意义，时至今日，精准医学已成不可以逆转的发展趋势。
EML4-ALK融合基因是在2007年由日本学者SODA等发现，研究表明不同的EML4-ALK融合基因亚型都具有恶性转化和致癌性能力。研究表明3%-13%的非小细胞肺癌患者含有此基因，它为非小细胞肺癌的个体化治疗提供了一个新的靶点。EML4-ALK融合基因几种常见亚型包括亚型1（49.6%）、亚型2（10%）、亚型3a和3b（25.6%）、亚型4、亚型5a和5b、亚型6和亚型7。EML4-ALK融合基因亚型1（E13;A20）由EML4第13外显子和ALK第20外显子融合而成；EML4-ALK融合基因亚型2（E20;A20）由EML4第20外显子和ALK第20外显子融合而成；EML4-ALK融合基因亚型3a（E6;A20）由EML4第6外显子和ALK第20外显子融合而成；EML4-ALK融合基因亚型3b（E6ins33;A20）由EML4第6外显子和ALK第20外显子融合而成 ,第6外显子中插入了一段33bp片段；EML4-ALK融合基因亚型4（E14;ins11del49A20）由EML4第14个外显子和ALK第20外显子融合而成，第20外显子中插入了一段11bp片段，删除了一段49bp片段；EML4-ALK融合基因亚型5a（E2;A2）0由EML4第2外显子和ALK第20外显子融合而成；EML4-ALK融合基因亚型5b（E2;ins117A20）由EML4第2外显子和ALK第20外显子融合而成，第20外显子插入了一段117bp片段；EML4-ALK融合基因亚型6（E3;ins69A20）由EML4第3外显子和ALK第20外显子融合而成，第20外显子插入了一段69bp片段；EML4-ALK融合基因亚型7（E14;del12A20）由EML4第14外显子和ALK第20外显子融合而成，第20外显子删除了一段12bp片段。
目前国内已上市了包括克挫替尼、塞瑞替尼、阿来替尼在内的多种ALK抑制剂，因此，提供一种灵敏度高、准确性高、步骤简单、成本较低的检测EML4-ALK融合基因的反应体系，在相关癌症的诊疗应用中具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，所述体系通过优化EML4-ALK融合基因的引物探针特异性，提高了融合突变的检出率，辅助特殊的RNA样本前处理过程，进一步减小了假阳性概率，综合上述特点及优势，本发明所述的检测体系可以在一个反应中实现三种EML4-ALK融合突变位点的同步检测，对于微量样本的检测具有巨大的应用价值，弥补了临床上取样困难、样本量少等不足。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，包含引物探针混合物，所述引物探针混合物由四条检测EML4-ALK融合基因的特异性引物和三条检测EML4-ALK融合基因的特异性探针组成：
（1）所述特异性引物包括：
ALK-DF1正向引物：5’-AACTACTGTAGAGCCCACACCT-3’，
ALK-DF2正向引物：5’-ACATCACACACCTTGACTGGTC-3’，
ALK-DF3正向引物：5’-GTTACCAAAACTGCAGACAAGCA-3’，
ALK-DR反向引物：5’-CTTGCTCAGCTTGTACTCAGGG-3’，
（2）所述特异性探针包括：
ALK-DP1融合探针：5’-CCTAAAGTGTACCGCCGG-3’，
ALK-DP2融合探针：5’-TTGTACTTGTACCGCCGG-3’，
ALK-DP3融合探针：5’-AACCAAGTGTACCGCCGG-3’。
优选地，所述的四条检测EML4-ALK融合基因的特异性引物序列跨EML4-ALK融合基因序列的融合断点，正向引物和反向引物之间的待扩增区域包含EML4-ALK融合基因的融合断点。
优选地，所述的三条检测EML4-ALK融合基因的特异性探针5’端具有FAM荧光基团修饰，3’末端位修饰MGB非荧光淬灭基团。
优选地，所述的三条检测EML4-ALK融合基因的特异性探针序列跨EML4-ALK融合基因的融合断点。
优选地，所述反应体系由10×引物探针混合物、dPCR-酶反应液、cDNA模板和去离子水组成。
例如，本发明中，若所述反应体系的总体积为20μL，则其中10×引物探针混合物2.0μL、dPCR-酶反应液10μL、cDNA模板1-8μL，去离子水补齐至20μL。
优选地，所述引物探针混合物的浓度分别为：
ALK-DF1正向引物浓度为4.0-8.5 μmol/L；
ALK-DF2正向引物浓度为2.5-5.0μmol/L；
ALK-DF3正向引物浓度为3.5-6.5μmol/L；
ALK-DR反向引物浓度为5.5-10.0μmol/L；
ALK-DP1融合探针浓度为2.5-3.2μmol/L；
ALK-DP2融合探针浓度为2.1-3.0μmol/L；
ALK-DP3融合探针浓度为2.2-3.0μmol/L。
第二方面，本发明提供一种基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系的应用，所述检测体系用于检测肿瘤组织、外周血、血浆、外泌体等样本中EML4-ALK基因融合变异。
优选的，检测肿瘤组织、外周血、血浆、外泌体等样本中EML4-ALK基因融合变异方法包括如下步骤：
(1)提取样本中的RNA；
(2)将上述提取的RNA进行逆转录反应，得到cDNA；
(3)采用由10×引物探针混合物、dPCR-酶反应液、cDNA模板和去离子水组成的检测体系配制扩增反应；
(4)按照如下扩增条件进行反应：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60-63℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束；
(5)通过数字PCR仪采集荧光信号，分析得到检测样本中EML4-ALK基因融合变异情况，给出判定结果。
优选的，述步骤（2）中RNA逆转录反应的参数为：
（1）变性反应：RNA样本在72℃变性3min，然后冰浴冷却；
（2）逆转录反应：48℃，60分钟；50℃，2分钟，48℃，2分钟，进行10个循环；70℃酶失活，15分钟；4℃保温，反应结束。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明提供的EML4-ALK基因融合变异的数字PCR检测体系，具有较高的特异性和灵敏性，相比市场上其他公司的产品在特异性检测中灵敏度、准确性方面均有较大程度的提高；检测的假阳性率大幅度降低，检测结果准确度高；
（2）本发明提供的EML4-ALK基因融合变异的数字PCR检测体系，可以应用于肿瘤组织、外周血、血浆、外泌体等多种生物样本类型，同时一个反应可以同步检测三种融合突变类型（占EML4-ALK基因融合变异亚型的85%以上），检测成功率高，针对微量模板的检测具有明显的优势，在临床检验中具有较高的应用价值。
（3）本发明提供的扩增体系操作简单，节省原料，且整个扩增流程所需时间短，方便操作，结果直观，便于分析，检测结果更为准确、灵敏；本发明提供的检测体系可大规模用于分析临床样本，提供准确稳定的检测结果。
附图说明
图1为采用本发明检测的外周血RNA样本1中EML4-ALK基因融合变异的结果；
图2为采用本发明检测的外周血RNA样本2中EML4-ALK基因融合变异的结果；
图3为采用本发明检测的肿瘤组织RNA样本1中EML4-ALK基因融合变异的结果；
图4为采用本发明检测的肿瘤组织RNA样本2中EML4-ALK基因融合变异的结果；
图5为采用本发明检测的血浆游离RNA样本1中EML4-ALK基因融合变异的结果；
图6为采用本发明检测的血浆游离RNA样本2中EML4-ALK基因融合变异的结果；
图7为采用本发明检测的外泌体RNA样本1中EML4-ALK基因融合变异的结果；
图8为采用本发明检测的外泌体RNA样本2中EML4-ALK基因融合变异的结果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1 EML4-ALK基因融合变异的数字PCR检测体系的设计与建立
1.引物探针组合的设计
首先，根据文献报道的EML4-ALK基因融合变异的亚型，对其中多种亚型进行分析，选取了三种最主要的融合变异类型（占EML4-ALK基因融合变异亚型的85%以上）。在跨融合断点区域设计多组引物和探针进行特异性筛选。
引物设计原则：本发明中用于检测EML4-ALK基因融合变异的引物对是由Primer5和NCBI Blast软件设计完成；引物长度在18-25个核苷酸之间，引物的GC含量在40%-60%之间，引物的Tm值≥60℃。各引物的Tm值大致接近，以确保引物对能在同一退火温度下高效扩增。设计完成后将各引物用NCBI Blast软件进行比对，确保各引物在合适范围内能够特异比对到目标区域。引物的扩增产物大小在100-150bp范围内。所设计的引物用Auto Dimer软件分析引物二聚体情况，确保特异性和避免二聚体的出现。
探针设计的原则：本发明中用于检测EML4-ALK基因融合变异的特异性探针，在3’末端均经过修饰以阻断探针在扩增过程中延伸，同时3’末端位修饰MGB非荧光淬灭基团；探针5’端具有FAM荧光基团修饰用于检测融合区域的变异情况。
EML4-ALK基因融合变异类型与引物/探针序列如表1所示：
表1
2. 检测系统建立
2.1 将上述设计的引物探针按照不同的浓度比例配制10×引物探针混合物，具体的各引物和探针的浓度如表2所示：
表2
2.2 按照数字PCR反应体系配制扩增反应：其中dPCR-酶反应液10μL、10×引物探针混合物2.0μL、cDNA模板1-8μL和去离子水补齐至20μL。
2.3 使用Bio-Rad QX200 AutoDG Droplet Digital PCR系统中的AutomatedDroplet Generator 微滴发生器对dPCR反应体系进行“油包水”微滴生成，待微滴体系完成则可进行下一步PCR反应。
2.4 将微滴体系置于PCR仪上进行扩增反应，扩增条件参数如下：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；63℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束。
2.5 将扩增产物置于数字PCR仪器内进行荧光信号读取，分析得到检测样本中EML4-ALK基因融合变异情况，给出判定结果。
在建立EML4-ALK基因融合变异检测体系测试中，本发明使用了两例肿瘤病人外周血样本进行检测。血液样本使用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit进行RNA提取，使用Qubit进行RNA浓度及质量检测，备用。
由图1和2可知，根据数字PCR结果图谱，可以比较直观地观察到待检测样本EML4-ALK基因融合变异情况。
图1外周血RNA样本的检测结果为EML4-ALK发生基因融合变异，其中FAM检测的信号copies为78 copies/20μL；
图2外周血RNA样本的检测结果为EML4-ALK未发生基因融合变异，样本为野生型，其中FAM检测的信号copies为0 copies/20μL。
本发明所述的EML4-ALK基因融合变异的数字PCR检测体系，使用单色荧光标记检测样本的EML4-ALK基因融合变异情况，可以在结果图谱中直观的观察到样本是否存在变异情况，从而直观的判断检测样本的阴阳性结果。
实施例2 肿瘤组织样本的检测
选取了2例肿瘤组织样本，采用本发明的检测体系，对其RNA进行检测，具体操作步骤如下：
1. 肿瘤组织样本RNA提取
使用QIAGEN公司的RNeasy FFPE Kit分别对2例肿瘤组织样本进行RNA提取，使用Qubit进行RNA浓度及质量检测，备用。
2. RNA进行逆转录反应，得到cDNA。
2.1 RNA样本在72℃变性3min，然后冰浴冷却；
2.2 逆转录反应：48℃，60分钟；50℃，2分钟，48℃，2分钟，进行10个循环；70℃酶失活，15分钟；4℃保温，反应结束。
3. PCR扩增
3.1 dPCR扩增体系配制
按照数字PCR反应体系配制扩增反应：其中dPCR-酶反应液10μL、10×引物探针混合物2.0μL、cDNA模板1μL、去离子水7μL，补齐至20μL。
3.2 使用Bio-Rad QX200 AutoDG Droplet Digital PCR系统中的AutomatedDroplet Generator 微滴发生器对dPCR反应体系进行“油包水”微滴生成，待微滴体系完成则可进行下一步PCR反应。
3.3 将微滴体系置于PCR仪上进行扩增反应，扩增条件参数如下：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；63℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束。
3.4 将扩增产物置于数字PCR仪器内进行荧光信号读取。根据实际读取到的FAM信号值对2例样本进行信号统计，最终判断该样本EML4-ALK基因融合变异情况。
由图3和4可知，根据数字PCR结果图谱，可以比较直观地观察到待检测的肿瘤组织样本EML4-ALK基因融合变异情况。
图3肿瘤组织RNA样本1的检测结果为EML4-ALK发生基因融合变异，其中FAM检测的信号copies为2120 copies/20μL；
图4肿瘤组织RNA样本2的检测结果为EML4-ALK未发生基因融合变异，样本为野生型，其中FAM检测的信号copies为0 copies/20μL。
实施例3 血浆游离核酸样本的检测
选取了2例肺癌病人的血浆样本，采用本发明的检测体系，对其血浆cfRNA进行检测，具体操作步骤如下：
1. 血浆cfRNA提取
使用QIAGEN公司的QIAamp ccfDNA/RNA Kit分别对2例血浆样本进行RNA提取，使用Qubit进行RNA浓度及质量检测，备用。
2.RNA进行逆转录反应，得到cDNA。
2.1 RNA样本在72℃变性3min，然后冰浴冷却；
2.2 逆转录反应：48℃，60分钟；50℃，2分钟，48℃，2分钟，进行10个循环；70℃酶失活，15分钟；4℃保温，反应结束。
3. PCR扩增
3.1 dPCR扩增体系配制
按照数字PCR反应体系配制扩增反应：其中dPCR-酶反应液10μL、10×引物探针混合物2.0μL、cDNA模板8μL，补齐至20μL。
3.2 使用Bio-Rad QX200 AutoDG Droplet Digital PCR系统中的AutomatedDroplet Generator 微滴发生器对dPCR反应体系进行“油包水”微滴生成，待微滴体系完成则可进行下一步PCR反应。
3.3 将微滴体系置于PCR仪上进行扩增反应，扩增条件参数如下：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；63℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束。
3.4 将扩增产物置于数字PCR仪器内进行荧光信号读取。根据实际读取到的FAM信号值对2例样本进行信号统计，最终判断该样本EML4-ALK基因融合变异情况。
由图5和6可知，根据数字PCR结果图谱，可以比较直观地观察到待检测的血浆游离RNA样本中EML4-ALK基因融合变异情况。
图5血浆游离RNA样本1的检测结果为EML4-ALK发生基因融合变异，其中FAM检测的信号copies为274 copies/20μL；
图6血浆游离RNA样本2的检测结果为EML4-ALK发生基因融合变异，其中FAM检测的信号copies为34 copies/20μL。
实施例4 外泌体样本的检测
选取了2例肺癌病人的血浆样本，采用本发明的检测体系，对其外泌体RNA进行检测，具体操作步骤如下：
1. 外泌体RNA提取
使用QIAGEN公司的exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit分别对2例血浆样本进行外泌体RNA提取，使用安捷伦4200的RNA分析试剂盒进行外泌体RNA浓度及质量检测，备用。
2. RNA进行逆转录反应，得到cDNA。
2.1 RNA样本在72℃变性3min，然后冰浴冷却；
2.2 逆转录反应：48℃，60分钟；50℃，2分钟，48℃，2分钟，进行10个循环；70℃酶失活，15分钟；4℃保温，反应结束。
3. PCR扩增
3.1 dPCR扩增体系配制
按照数字PCR反应体系配制扩增反应：其中dPCR-酶反应液10μL、10×引物探针混合物2.0μL、cDNA模板8μL，补齐至20μL。
3.2 使用Bio-Rad QX200 AutoDG Droplet Digital PCR系统中的AutomatedDroplet Generator 微滴发生器对dPCR反应体系进行“油包水”微滴生成，待微滴体系完成则可进行下一步PCR反应。
3.3 将微滴体系置于PCR仪上进行扩增反应，扩增条件参数如下：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；63℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束。
3.4 将扩增产物置于数字PCR仪器内进行荧光信号读取。根据实际读取到的FAM信号值对2例样本进行信号统计，最终判断该样本EML4-ALK基因融合变异情况。
由图7和8可知，根据数字PCR结果图谱，可以比较直观地观察到待检测的外泌体RNA样本中EML4-ALK基因融合变异情况。
图7外泌体RNA样本1的检测结果为EML4-ALK发生基因融合变异，其中FAM检测的信号copies为10.7 copies/20μL；
图8外泌体RNA样本2的检测结果为EML4-ALK发生基因融合变异，其中FAM检测的信号copies为9.8 copies/20μL。
综上所述，本发明提供的EML4-ALK基因融合变异的数字PCR检测体系，特异性好，灵敏性高，相比市场上其他公司的产品在特异性检测中灵敏度、准确性方面均有较大程度的提高；检测的假阳性率大幅度降低，检测结果准确度高。同时本发明提供的检测体系，可以应用于肿瘤组织、外周血、血浆、外泌体等多种生物样本类型，同时一个反应可以同步检测三种融合突变类型（占EML4-ALK基因融合变异亚型的85%以上），检测成功率高针对微量模板的检测具有明显的优势，在临床检验中具有较高的应用价值。
序列表
<110> 远辰生物科技（苏州）有限公司
<120> 一种基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系及其应用
<130> 20210701
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
aactactgta gagcccacac ct 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
acatcacaca ccttgactgg tc 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gttaccaaaa ctgcagacaa gca 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cttgctcagc ttgtactcag gg 22
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
cctaaagtgt accgccgg 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ttgtacttgt accgccgg 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
aaccaagtgt accgccgg 18
Claims (9)
1.一种基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，包含引物探针混合物，其特征在于，所述引物探针混合物由四条检测EML4-ALK融合基因的特异性引物和三条检测EML4-ALK融合基因的特异性探针组成：
（1）所述特异性引物的序列，其特征在于：
ALK-DF1正向引物：5’-AACTACTGTAGAGCCCACACCT-3’，
ALK-DF2正向引物：5’-ACATCACACACCTTGACTGGTC-3’，
ALK-DF3正向引物：5’-GTTACCAAAACTGCAGACAAGCA-3’，
ALK-DR反向引物：5’-CTTGCTCAGCTTGTACTCAGGG-3’；
（2）所述特异性探针的序列，其特征在于：
ALK-DP1融合探针：5’-CCTAAAGTGTACCGCCGG-3’，
ALK-DP2融合探针：5’-TTGTACTTGTACCGCCGG-3’，
ALK-DP3融合探针：5’-AACCAAGTGTACCGCCGG-3’。
2.根据权利要求1所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，其特征在于，所述的四条检测EML4-ALK融合基因的特异性引物序列跨EML4-ALK融合基因的融合断点，正向引物和反向引物之间的待扩增区域包含EML4-ALK融合基因的融合断点。
3.根据权利要求1所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，其特征在于，所述的三条检测EML4-ALK融合基因的特异性探针5’端具有FAM荧光基团修饰，3’末端位修饰MGB非荧光淬灭基团。
4.根据权利要求1所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，其特征在于，所述的三条检测EML4-ALK融合基因的特异性探针序列跨EML4-ALK融合基因的融合断点。
5.根据权利要求1所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，其特征在于，所述反应体系由10×引物探针混合物、dPCR-酶反应液、cDNA模板和去离子水组成。
6.根据权利要求5所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，其特征在于，所述引物探针混合物的浓度分别为：
ALK-DF1正向引物浓度为4.0-8.5 μmol/L；
ALK-DF2正向引物浓度为2.5-5.0μmol/L；
ALK-DF3正向引物浓度为3.5-6.5μmol/L；
ALK-DR反向引物浓度为5.5-10.0μmol/L；
ALK-DP1融合探针浓度为2.5-3.2μmol/L；
ALK-DP2融合探针浓度为2.1-3.0μmol/L；
ALK-DP3融合探针浓度为2.2-3.0μmol/L。
7.根据权利要求5或6所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系的应用，其特征在于，所述检测体系用于检测肿瘤组织、外周血、血浆、外泌体等样本中EML4-ALK基因融合变异。
8.根据权利要求7所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系的应用，其特征在于，检测肿瘤组织、外周血、血浆、外泌体等样本中EML4-ALK基因融合变异方法包括如下步骤：
提取样本中的RNA；
将上述提取的RNA进行逆转录反应，得到cDNA；
采用由10×引物探针混合物、dPCR-酶反应液、cDNA模板和去离子水组成的检测体系配制扩增反应；
按照如下扩增条件进行反应：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60-63℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束；
通过数字PCR仪采集荧光信号，分析得到检测样本中EML4-ALK基因融合变异情况，给出判定结果。
9.根据权利要求8所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系的应用，其特征在于，所述步骤（2）中RNA逆转录反应的参数为：
（1）变性反应：RNA样本在72℃变性3min，然后冰浴冷却；
（2）逆转录反应：48℃，60分钟；50℃，2分钟，48℃，2分钟，进行10个循环；70℃酶失活，15分钟；4℃保温，反应结束。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110769548.2A CN113373233A (zh) | 2021-07-07 | 2021-07-07 | 一种基于数字pcr检测eml4-alk融合基因的反应体系及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110769548.2A CN113373233A (zh) | 2021-07-07 | 2021-07-07 | 一种基于数字pcr检测eml4-alk融合基因的反应体系及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113373233A true CN113373233A (zh) | 2021-09-10 |
Family
ID=77581416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110769548.2A Pending CN113373233A (zh) | 2021-07-07 | 2021-07-07 | 一种基于数字pcr检测eml4-alk融合基因的反应体系及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113373233A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103468813A (zh) * | 2013-09-17 | 2013-12-25 | 广州达健生物科技有限公司 | Eml4-alk融合基因荧光定量pcr检测试剂盒 |
| CN103805684A (zh) * | 2012-11-09 | 2014-05-21 | 益善生物技术股份有限公司 | Eml4-alk融合基因检测的pcr引物、试剂盒和液相芯片 |
| CN104818318A (zh) * | 2014-07-02 | 2015-08-05 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系和试剂盒 |
| CN107653320A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-02-02 | 深圳华大生命科学研究院 | Eml4‑alk融合基因无创检测试剂盒 |
| CN108315429A (zh) * | 2018-04-25 | 2018-07-24 | 北京恩泽康泰生物科技有限公司 | 基于囊泡检测eml4-alk融合基因的引物和试剂盒 |
| CN110157806A (zh) * | 2019-05-30 | 2019-08-23 | 深圳海普洛斯医学检验实验室 | 一种检测eml4-alk的试剂盒及其检测方法和应用 |
| CN112852967A (zh) * | 2021-03-23 | 2021-05-28 | 上海真固生物科技有限公司 | 一种基于ddPCR定量检测ALK、RET和ROS1融合基因的试剂盒 |
-
2021
- 2021-07-07 CN CN202110769548.2A patent/CN113373233A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103805684A (zh) * | 2012-11-09 | 2014-05-21 | 益善生物技术股份有限公司 | Eml4-alk融合基因检测的pcr引物、试剂盒和液相芯片 |
| CN103468813A (zh) * | 2013-09-17 | 2013-12-25 | 广州达健生物科技有限公司 | Eml4-alk融合基因荧光定量pcr检测试剂盒 |
| CN104818318A (zh) * | 2014-07-02 | 2015-08-05 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系和试剂盒 |
| CN107653320A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-02-02 | 深圳华大生命科学研究院 | Eml4‑alk融合基因无创检测试剂盒 |
| CN108315429A (zh) * | 2018-04-25 | 2018-07-24 | 北京恩泽康泰生物科技有限公司 | 基于囊泡检测eml4-alk融合基因的引物和试剂盒 |
| CN110157806A (zh) * | 2019-05-30 | 2019-08-23 | 深圳海普洛斯医学检验实验室 | 一种检测eml4-alk的试剂盒及其检测方法和应用 |
| CN112852967A (zh) * | 2021-03-23 | 2021-05-28 | 上海真固生物科技有限公司 | 一种基于ddPCR定量检测ALK、RET和ROS1融合基因的试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| YOSHIDA ET AL等: "Highly sensitive detection of ALK resistance", 《BMC CANCER》 * |
| 吴菡等: "非小细胞肺癌EGFR 基因突变与EML4⁃ALK 融合基因的表达及其临床病理特征", 《实用医学杂志》 * |
| 李秀忠等: "微滴数字PCR与ARMS法检测非小细胞肺癌", 《宁夏医学杂志》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107365852B (zh) | 血清外泌体中肺癌相关microRNA分子标记的应用及其检测试剂盒 | |
| CN110724741B (zh) | 一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物、探针及其试剂盒 | |
| CN110305948A (zh) | 一种检测自闭症相关基因ube3a拷贝数的试剂和方法 | |
| CN107841566B (zh) | 快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用 | |
| CN111733291A (zh) | 数字pcr检测新型冠状病毒核酸的方法及试剂盒 | |
| CN113718021A (zh) | 一种定量检测bcr-abl1融合基因的引物、探针及其试剂盒 | |
| CN106498028B (zh) | Egfr的t790m突变的诊断方法及试剂盒 | |
| CN106498029B (zh) | 提高egfr的t790m突变的诊断效率的方法 | |
| CN112481384A (zh) | 一种检测人met基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用 | |
| CN109402259B (zh) | 一种检测白血病融合基因和基因突变的试剂盒 | |
| CN113930500A (zh) | 人pik3ca基因突变的数字pcr检测方法及应用 | |
| CN116751865A (zh) | 一种用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒、其方法和应用 | |
| CN108728538B (zh) | Alk基因融合检测引物、方法及试剂盒 | |
| CN108531598B (zh) | Ros1基因融合检测引物、方法及试剂盒 | |
| CN106755330B (zh) | 癌症相关基因表达差异检测试剂盒及其应用 | |
| CN115960997A (zh) | 基于数字PCR平台检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的引物探针组合及试剂盒 | |
| CN113373233A (zh) | 一种基于数字pcr检测eml4-alk融合基因的反应体系及其应用 | |
| CN112481379B (zh) | 一种检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合与试剂盒 | |
| CN110951857B (zh) | 基于数字pcr无创产前检测胎儿21、18、13三体综合征的方法及试剂盒 | |
| EP3279338A1 (en) | Gene mutation detection method and fluorescence-labeled oligonucleotide used in same | |
| CN116949143A (zh) | 一种用于检测mthfr和mtrr基因的序列组合物、试剂盒及应用 | |
| CN113718020A (zh) | 人白血病flt3基因内部串联重复突变检测的引物探针组合、试剂盒及应用 | |
| CN106811537A (zh) | 一种检测表皮生长因子受体基因t790m低频突变引物及其应用 | |
| CN113930501A (zh) | 人egfr基因突变的数字pcr检测方法及应用 | |
| CN111440876A (zh) | 用于定量检测人类mgmt基因甲基化程度的试剂盒和方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210910 |