CN105087794A - 一种检测结核病的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与结核病相关的microRNA标志物，该标志物为microRNA？451a，microRNA542，microRNA125b，microRNA146a，microRNA29c，microRNA365，microRNA889，microRNA335和microRNA342。可以通过核酸芯片、qPCR或者测序等技术对上述microRNA标志物进行定量检测，从而用于临床上对结核病的辅助诊断或者对治疗结果的评估等，提高结核病诊断的灵敏度和特异性，为临床治疗评估提供新的依据。
Description
技术领域
本发明涉及microRNA的检测及其运用，更具体的，本发明涉及microRNA451a，microRNA542，microRNA125b，microRNA146a，microRNA29c，microRNA365，microRNA889，microRNA335，microRNA342在结核病诊断及治疗评估中的作用。
背景技术
结核病是全球最严重的传染性疾病之一，给全人类的健康带来了重大的威胁。然而，目前却缺乏有效的诊断技术。结核诊断金标准-结核菌培养，耗时2-6周，检出率只有30%左右；痰涂片检出率不到30%左右；结核抗体快速检测（胶体金检测），虽然快速，但是检出率不到50%；核酸检测（GeneXpert）虽然方便快速，但是对于菌阴患者灵敏低且费用高；干扰素释放检测（IGRA），虽然灵敏，但是操作复杂，且价格昂贵，而且还不能却分潜伏感染和活性结核。因此，新的诊断技术对于结核病的防治具有重要的意义。
MicroRNA是一类长约19~24nt的非编码单链小RNA分子。在细胞内microRNA发挥了重要的作用，它可以通过与靶基因3’UTR区互补结合，抑制靶基因翻译，进而调控生物体的生长发育,并参与多种疾病过程。研究表明microRNA在细胞生长、凋亡、分化、极性形成、分泌、代谢等过程中发挥重要作用。通过对microRNA在不同组织和疾病中的表达谱分析发现，microRNA的表达谱具有明显的组织特异性，在一些疾病中microRNA的表达谱改变具有明显的特征，因此可以作为疾病诊断及治疗标志物。MicroRNAs作为分子标志物，克服了蛋白质分子标志物在抗体制备和定量分析上所遇到的瓶颈。尤其是血清microRNAs具有样本易于采集、保存期长及检测手段简便等特点，临床应用价值也更明显,已成为生物标志物及转化医学研究的热点领域。
关于microRNA与结核病的相关性，目前已经有些报道。但是目前还没有确定哪些microRNA和TB具有明确的相关，可以用于TB的诊断或者治疗评估。本专利公开了几个与TB相关的microRNA，及其检测引物和在TB诊断和治疗评估中的运用。
发明内容
为了解决以上问题，本发明公开了与结核病相关的microRNA序列及其检测引物和探针，以及在结核病的检测、预后中的运用。
本发明的目的在于提供一种检测结核病的试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种检测结核病的试剂盒，该试剂盒含有对microRNA451a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889中至少一种microRNA进行定量检测的试剂。
microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889联合作为结核病检测和/或预后的生物标记物的应用。
一种检测结核病的试剂盒，该试剂盒含有对microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂。
进一步的，该试剂盒含有对microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行荧光定量PCR检测引物SEQIDNO:10~27。
进一步的，该试剂盒中含有对microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行反转录的引物SEQIDNO:1~9。
进一步的，该试剂盒中含有如下探针序列SEQIDNO:28~36。
一种检测结核病的核酸芯片该芯片含有对microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂。
一种结核病的预后诊断试剂盒，该试剂盒含有对microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂。
一种结核病的预后诊断核酸芯片，其特征在于：该芯片含有对microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂。
本发明的有益效果是：
本发明为结核病提供了新的诊断和预后评估的方法。本发明检测血浆/血清中的稳定的microRNA，而传统潜在分子诊断方案检测蛋白质，在定量测定方面，microRNA的定量精度和灵敏度非常高，使用qPCR技术甚至可以达到单分子检测的能力；而传统方法检测蛋白质，灵敏度较低，且定量精度较差。
附图说明
图1为microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889在结核病不同阶段的表达情况；
图2为microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA8895单独区分TB感染者和健康者的ROC曲线；
图3为microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA8895联合区分TB感染者和健康者的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
样本：健康人血清50份，结核菌潜伏感染者血清50份，活动性结核病患者血清50份，结核病治愈者血清50份；
本实施例对上述样本血清中的microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测，具体操作步骤如下：
1）血清microRNA提取：提取试剂盒：GIAGEN公司的miRNeasySerum/PlasmaKit。
）逆转录：将上步提取的microRNA利用Tiangen生物科技有限公司的逆转录试剂盒QuantqRT-PCRkit(SYBRGreen)进行逆转录；逆转录引物如下：
microRNA125b逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACgtccca（SEQIDNO:1）；
microRNA146a逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACaaccca（SEQIDNO:2）；
microRNA29C逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACtaaccg（SEQIDNO:3）；
microRNA365逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACataagg（SEQIDNO:4）；
microRNA335逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACacattt（SEQIDNO:5）；
microRNA542逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACtttcag（SEQIDNO:6）；
microRNA342逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACacgggt（SEQIDNO:7）；
microRNA889逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACacaatg（SEQIDNO:8）；
microRNA451a逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACaactca（SEQIDNO:9）；
其中选择microRNA29C作为内参基因。
）荧光定量PCR：取上步反转录产物作为模板，分别对microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行qPCR定量检测，qPCR的操作按照Tiangen生物科技有限公司的试剂盒SuperRealPreMixPlus(SYBRGreen)进行操作；qPCR的引物如下：
microRNA125b-F：CGCTCACAAGTCAGGCTCT（SEQIDNO:10），
microRNA125b-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQIDNO:11）；
microRNA146a-F：CGCCGTGAGAACTGAATTCCA（SEQIDNO:12），
microRNA146a-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQIDNO:13）；
microRNA29c-F：CGCCGTAGCACCATTTGAAAT（SEQIDNO:14），
microRNA29c-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQIDNO:15）；
microRNA365-F：CGCCGTAATGCCCCTAAAAAT（SEQIDNO:16），
microRNA365-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQIDNO:17）；
microRNA335-F：CGCCGTCAAGAGCAATAACG（SEQIDNO:18），
microRNA335-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQIDNO:19）；
microRNA542-F：CGCCGTGTGACAGATTGATAA（SEQIDNO:20），
microRNA542-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQIDNO:21）；
microRNA342-F：CGCTCTCACACAGAAATCGC（SEQIDNO:22），
microRNA342-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQIDNO:23）；
microRNA889-F：CGCCGTTAATATCGGACAAC（SEQIDNO:24），
microRNA889-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQIDNO:25）；
microRNA451a-F：CGCCGAAACCGTTACCATTAC（SEQIDNO:26）,
microRNA451a-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQIDNO:27）。
检测探针分别为：
microRNA125b-P：CGCTCACAAGTCAGGCTCT（SEQIDNO:28）；
microRNA146a-P：GCCGTGAGAACTGAATTCCA（SEQIDNO:29）；
microRNA29c-P：CGCCGTAGCACCATTTGAAAT（SEQIDNO:30）；
microRNA365-P：CGCCGTAATGCCCCTAAAAAT（SEQIDNO:31）；
microRNA335-P：CGCCGTCAAGAGCAATAACG（SEQIDNO:32）；
microRNA542-P：CGCCGTGTGACAGATTGATAA（SEQIDNO:33）；
microRNA342-P：CGCTCTCACACAGAAATCGC（SEQIDNO:34）；
microRNA889-P：CGCCGTTAATATCGGACAAC（SEQIDNO:35）；
microRNA451a-P：CGCCGAAACCGTTACCATTAC（SEQIDNO:36）；
荧光定量PCR反应条件：50℃2min；95℃2min；95℃15s，60℃32s，40循环；获取溶解曲线。
）结果分析：
各样品中microRNA451a，microRNA542，microRNA125b，microRNA146a，microRNA29c，microRNA365，microRNA889，microRNA335和microRNA342的荧光定量PCR检测结果如图1所示，从图1中可看出所检测的9个microRNA在结核病患者外周血清中显著上调，在治愈的TB患者外周血中又显著下调，说明microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889可以作为结核病检测和预后的生物标记物。
利用统计法，对上述9个microRNA单独作为临床诊断结核分枝杆菌感染指标的诊断进行效能评估，检测单个指标检测TB的灵敏度和特异性性，及对应的ROC曲线，如图2和表1所示。
表1为9种microRNA单独区分结核分枝杆菌感染者和健康者的效能评价
从图2和表1中可以看出，各microRNA诊断效能ROC(ReceiverOperatingCharacteristic)曲线下面积（AreaUndertheROCCurve，AUC）均在0.66以上，说明利用上述9种microRNA可用于检测结核分枝杆菌，可见这些指标在活动性结核的诊断上具有一定的意义。（请确认上述描述是不可行）
利用统计法，对上述9个microRNA联合作为临床诊断结核分枝杆菌感染的指标，对联合指标的诊断效能进行评估，检测联合指标检测TB的灵敏度和特异性性，及对应的ROC曲线，如图3和表2所示。
表2为9种microRNA联合区分结核分枝杆菌感染者和健康者的效能评价
从图3和表2中可以看出，其诊断效能为：ROC(ReceiverOperatingCharacteristic)曲线下面积（AreaUndertheROCCurve，AUC）为0.925，非常接近1，说明利用上述9种microRNA可用于检测结核分枝杆菌的正确率非常高。其区分的效能分别为敏感性95、特异性90，可见本发明9种microRNA的联合指标在活动性结核的检测上具有很好正确率、高灵敏性及高特异性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>广东省结核病控制中心
<120>一种检测结核病的试剂盒
<130>
<160>36
<170>PatentInversion3.5
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Claims (9)
1.一种检测结核病的试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有对microRNA451a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889中至少一种microRNA进行定量检测的试剂。
2.microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889联合作为结核病检测和/或预后的生物标记物的应用。
3.一种检测结核病的试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有对microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有对microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行荧光定量PCR检测引物SEQIDNO:10~27。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有对microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行反转录的引物SEQIDNO:1~9。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有如下探针序列SEQIDNO:28~36。
7.一种检测结核病的核酸芯片，其特征在于：该芯片含有对microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂。
8.一种结核病的预后诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有对microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂。
9.一种结核病的预后诊断核酸芯片，其特征在于：该芯片含有对microRNA451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂。
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2015
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| CN106544442B (zh) * | 2016-12-12 | 2020-06-02 | 吉林大学 | miR-181a特异性引物试剂在诊断奶牛脂肪肝的应用 |
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