CN109609620A - 用于辅助诊断血行播散型肺结核的试剂盒 - Google Patents

用于辅助诊断血行播散型肺结核的试剂盒 Download PDF

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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Abstract

本发明公开了一种用于辅助诊断血行播散型肺结核的试剂盒。本发明还保护用于检测microRNA‑451a丰度的物质、用于检测microRNA‑451a相对水平的物质、用于检测microRNA‑451a基因的物质、用于检测microRNA‑451a基因表达水平的物质、用于检测microRNA‑451a基因相对表达水平的物质在制备试剂盒中的应用。试剂盒的用途为：诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；从肺结核中诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；鉴别或辅助鉴别继发性肺结核和血行播散型肺结核。本发明的发明人在研究工作中发现microRNA‑451a与血行播散型肺结核的发生有关，并且能预警血行播散型肺结核的发生，为及时调整临床治疗方案提供可靠依据。

Description

用于辅助诊断血行播散型肺结核的试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于辅助诊断血行播散型肺结核的试剂盒。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)感染引起的一种慢性传染性疾病，世界人口的三分之一存在感染，每年约有900万新发病例，因此结核病依然是危害公众健康的最大杀手之一。M.tb侵染机体后可长期潜伏，发病时主要侵染肺部，此外，除了指甲、毛发和牙齿，结核病可累及全身的各个脏器和组织。血行播散型肺结核，是由于结核分枝杆菌侵入了血液循环系统，随血液在肺部定植，多起病急，病死率高。当菌体播散到全身多器官时，称为血行播散结核病，临床该类型结核病常伴有结核性脑膜炎或结核性脑炎，累及中枢系统时病情一般较为严重，且病死率高，可以说是结核病中最凶险的一种。
临床上对于血行播散型肺结核的诊断方法，主要依靠血液、脑脊液的细菌学培养以及临床表现和影像学征象进行诊断，这些诊断方法均存在诊断效能低、诊断及时性差等问题，且无法预警细菌血行播散的发生。
发明新的分子诊断方法，可及时鉴别或预警血行播散型结核病发生，有利于临床对病人病情进展的全面掌握和及时控制。目前国际上尚无关于鉴别血行播散型肺结核分子诊断的方法，因此亟待开展相关研究以填补这一空白。
MicroRNAs长度为21-25nt，具有高度保守性，稳定性较好，适合作为分子诊断方法的靶标。microRNA可以通过对基因进行转录后调控，参与天然免疫应答。已有研究表明miRNAs在调节巨噬细胞、DC细胞、NK细胞所介导的固有免疫中发挥着重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于辅助诊断血行播散型肺结核的试剂盒。
本发明保护用于检测microRNA-451a丰度的物质在制备试剂盒中的应用。所述microRNA-451a丰度具体可为外周血单个核细胞中的microRNA-451a丰度。所述用于检测microRNA-451a丰度的物质具体可为通过实时荧光定量PCR实现检测microRNA-451a丰度的物质。
本发明还保护用于检测microRNA-451a相对水平的物质在制备试剂盒中的应用。所述microRNA-451a相对水平具体可为外周血单个核细胞中的microRNA-451a相对水平。所述用于检测microRNA-451a相对水平的物质具体可为通过实时荧光定量PCR实现检测microRNA-451a相对水平的物质。
本发明还保护用于检测microRNA-451a基因的物质在制备试剂盒中的应用。所述microRNA-451a基因具体可为外周血单个核细胞中的microRNA-451a基因。所述用于检测microRNA-451a基因的物质具体可为通过实时荧光定量PCR实现检测microRNA-451a基因的物质。
本发明还保护用于检测microRNA-451a基因表达水平的物质在制备试剂盒中的应用。所述microRNA-451a基因表达水平具体可为外周血单个核细胞中的microRNA-451a表达水平。所述用于检测microRNA-451a基因表达水平的物质具体可为通过实时荧光定量PCR实现检测microRNA-451a基因表达水平的物质。
本发明还保护用于检测microRNA-451a基因相对表达水平的物质在制备试剂盒中的应用。所述microRNA-451a基因相对表达水平具体可为外周血单个核细胞中的microRNA-451a基因相对表达水平。所述用于检测microRNA-451a基因相对表达水平的物质具体可为通过实时荧光定量PCR实现检测microRNA-451a基因相对表达水平的物质。
本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测microRNA-451a丰度的物质。所述microRNA-451a丰度具体可为外周血单个核细胞中的microRNA-451a丰度。所述用于检测microRNA-451a丰度的物质具体可为通过实时荧光定量PCR实现检测microRNA-451a丰度的物质。
本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测microRNA-451a相对水平的物质。所述microRNA-451a相对水平具体可为外周血单个核细胞中的microRNA-451a相对水平。所述用于检测microRNA-451a相对水平的物质具体可为通过实时荧光定量PCR实现检测microRNA-451a相对水平的物质。
本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测microRNA-451a基因的物质。所述microRNA-451a基因具体可为外周血单个核细胞中的microRNA-451a基因。所述用于检测microRNA-451a基因的物质具体可为通过实时荧光定量PCR实现检测microRNA-451a基因的物质。
本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测microRNA-451a基因表达水平的物质。所述microRNA-451a基因表达水平具体可为外周血单个核细胞中的microRNA-451a表达水平。所述用于检测microRNA-451a基因表达水平的物质具体可为通过实时荧光定量PCR实现检测microRNA-451a基因表达水平的物质。
本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测microRNA-451a基因相对表达水平的物质。所述microRNA-451a基因相对表达水平具体可为外周血单个核细胞中的microRNA-451a基因相对表达水平。所述用于检测microRNA-451a基因相对表达水平的物质具体可为通过实时荧光定量PCR实现检测microRNA-451a基因相对表达水平的物质。所述试剂盒还包括记载有如下判断标准的载体：将47.40作为miroRNA-451a基因的相对表达量的阈值，如果大于阈值判断为阳性，如果小于等于阈值判断为阴性；阳性即为血行播散肺结核患者，阴性即为非血播型肺结核患者。
以上任一所述检测microRNA-451a基因的物质具体可包括：microRNA-451a-F、miScriptⅡRT Kit和miScript SYBR Green PCR Kit。
以上任一所述检测microRNA-451a基因表达水平的物质具体可包括：microRNA-451a-F、miScriptⅡRT Kit和miScript SYBR Green PCR Kit。
以上任一所述microRNA-451a基因相对表达水平具体可为microRNA-451a基因相对于内参基因的表达水平。所述内参基因为在细胞中稳定表达的基因。所述内参基因具体可为U6基因。
以上任一所述检测microRNA-451a基因相对表达水平的物质包括检测microRNA-451a基因的物质和检测内参基因的物质。所述内参基因为在细胞中稳定表达的基因。所述内参基因具体可为U6基因。检测microRNA-451a基因的物质具体可包括：microRNA-451a-F(序列表的序列2)、miScriptⅡRT Kit和miScript SYBR Green PCR Kit。检测内参基因的物质具体可包括：内参基因特异性上游引物、miScriptⅡRT Kit和miScript SYBR GreenPCR Kit。内参基因特异性上游引物具体可为U6-F(序列表的序列3)。
以上任一所述microRNA-451a为序列表的序列1所示的microRNA。
以上任一所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：
(a)诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(b)从肺结核中诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(c)鉴别或辅助鉴别继发性肺结核和血行播散型肺结核。
本发明的发明人在研究工作中发现microRNA-451a与血行播散型肺结核的发生有关，并且能预警血行播散型肺结核的发生，为及时调整临床治疗方案提供可靠依据。
临床上对血行播散型肺结核的诊断多依靠临床表现以及血液和/或脑脊液的细菌学培养，同时结合影像学表现来进行综合分析，这种综合分析的诊断方法具有诊断特异度高的优点，但存在的巨大缺陷是诊断的及时性差且敏感性低，易延误患者病情。本发明提供的试剂盒应用于血行播散肺结核诊断，具有快速，高效，操作简单，易于推广的特点，可以提高血行播散肺结核的早期诊断率。
附图说明
图1为microRNA-451a基因在继发性肺结核患者和血行播散型肺结核患者中相对表达水平的散点图。
图2为ROC曲线。
具体实施方式
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
microRNA-451a(序列表的序列1)：5’-aaaccguuaccauuacugaguu-3’。
实施例、
各位受试者均为首都医科大学附属北京胸科医院就诊且确诊(根据2017年国家卫生计生委新发布的中华人民公共和国卫生行业标准)的患者，均为知情同意的志愿者。继发性肺结核组(TB)由56例继发性肺结核患者组成。血行播散型肺结核组(DTB)由24例血行播散型肺结核患者组成。各位受试者均排除糖尿病、HIV感染和其他自身免疫性疾病。
1、采集受试者的空腹外周血，从外周血中分离获得外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。
2、取外周血单个核细胞，提取总RNA。
3、取总RNA，进行反转录，得到cDNA。
反转录的反应体系(20μL)：含4μL 5×miScript HiSpec Buffer、2μL 10×miScript Nucleics Mix、2μL miScript Reverse Transcriptase Mix、1μg步骤2得到的总RNA，用RNase-free water补足体积。5×miScript HiSpec Buffer、10×miScriptNucleics Mix和miScript Reverse Transcriptase Mix均为miScriptⅡRT Kit(QIAGEN公司，货号218161)中的组件。
反转录的反应条件：37℃60min；95℃5min。
完成反应后，向反应体系中加入200μL ddH2O，混匀，即为产物，4℃保存。
4、实时荧光定量PCR
以cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测microRNA-451a基因。
采用U6基因为内参基因。
荧光定量PCR的反应体系(25μL)：12.5μL 2×QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mix、2.5μL 10×miScript Universal Primer、2.5μL上游引物溶液、2.5μL步骤3的产物(模板)，5μL RNase-free water。2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix和10×miScript Universal Primer均为miScript SYBR Green PCR Kit(QIAGEN公司，货号218076)的组件。反应体系中，上游引物的浓度为1μM。设置不加入模板的阴性对照。上游引物为microRNA-451a-F(用于检测microRNA-451a基因)或U6-F(用于检测U6基因)。microRNA-451a-F(序列表的序列2)：5′-AAACCGTTACCATTACTGAGTT-3′。U6-F(序列表的序列3)：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。
荧光定量PCR的反应条件：95℃预变性15min；94℃变性15s、55℃退火30s、70℃扩增30s，40个循环。荧光定量PCR采用ABI7500实时荧光定量PCR仪。
用ABI7500software v2.0.6对实时荧光定量PCR的结果进行分析，以U6基因为内参基因，通过2-△Ct的方法计算microRNA-451a基因的相对表达量。采用非参数检验(U检验)分析方法，阈值设为P<0.05，具有统计学差异。
结果见图1。图1中，TB为继发性肺结核患者，DTB为血行播散型肺结核患者，横线为中位数。结果表明，microRNA-451a基因在血行播散型肺结核患者中的表达水平显著高于继发性肺结核感染者的表达水平。
将47.40作为miroRNA-451a基因的相对表达量的阈值，如果大于阈值判断为阳性，如果小于等于阈值判断为阴性。阳性即为血行播散肺结核患者，阴性即为非血播型肺结核患者。在本实施例的80例受试者(包括56例继发性肺结核患者和24例血型播散型肺结核患者)中使用该判定方法诊断的敏感性为70.83％，特异性为76.79％。
ROC曲线见图2。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京市结核病胸部肿瘤研究所
<120> 用于辅助诊断血行播散型肺结核的试剂盒
<130> GNCYX190329
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aaaccguuac cauuacugag uu 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
aaaccgttac cattactgag tt 22
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ctcgcttcgg cagcaca 17

Claims (10)

1.用于检测microRNA-451a丰度的物质在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：
(a)诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(b)从肺结核中诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(c)鉴别或辅助鉴别继发性肺结核和血行播散型肺结核。
2.用于检测microRNA-451a相对水平的物质在制备试剂盒中的应用；
所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：
(a)诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(b)从肺结核中诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(c)鉴别或辅助鉴别继发性肺结核和血行播散型肺结核。
3.用于检测microRNA-451a基因的物质在制备试剂盒中的应用；
所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：
(a)诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(b)从肺结核中诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(c)鉴别或辅助鉴别继发性肺结核和血行播散型肺结核。
4.用于检测microRNA-451a基因表达水平的物质在制备试剂盒中的应用；
所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：
(a)诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(b)从肺结核中诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(c)鉴别或辅助鉴别继发性肺结核和血行播散型肺结核。
5.用于检测microRNA-451a基因相对表达水平的物质在制备试剂盒中的应用；
所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：
(a)诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(b)从肺结核中诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(c)鉴别或辅助鉴别继发性肺结核和血行播散型肺结核。
6.一种试剂盒，包括用于检测microRNA-451a丰度的物质；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：
(a)诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(b)从肺结核中诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(c)鉴别或辅助鉴别继发性肺结核和血行播散型肺结核。
7.一种试剂盒，包括用于检测microRNA-451a相对水平的物质；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：
(a)诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(b)从肺结核中诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(c)鉴别或辅助鉴别继发性肺结核和血行播散型肺结核。
8.一种试剂盒，包括用于检测microRNA-451a基因的物质；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：
(a)诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(b)从肺结核中诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(c)鉴别或辅助鉴别继发性肺结核和血行播散型肺结核。
9.一种试剂盒，包括用于检测microRNA-451a基因表达水平的物质；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：
(a)诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(b)从肺结核中诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(c)鉴别或辅助鉴别继发性肺结核和血行播散型肺结核。
10.一种试剂盒，包括用于检测microRNA-451a基因相对表达水平的物质；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：
(a)诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(b)从肺结核中诊断或辅助诊断血行播散型肺结核；
(c)鉴别或辅助鉴别继发性肺结核和血行播散型肺结核。
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