CN109593849A - 一组与结直肠癌相关的血浆LncRNA标记物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测领域，具体涉及生物的分子检测，更具体涉及一组与结直肠癌相关的血浆LncRNA标记物及其应用。本发明所述的LncRNA标记物包括：ZFAS1、SNHG11、LINC00909和/LINC00654中的一种或多种；含有本发明所述标记物的产品可以更加准确、快速的判断受试者是否已患有结直肠癌或对是否存在患有结直肠癌的风险提供信息评估，以实现对结直肠癌的早发现，早治疗；在制备结直肠癌早期评估产品或筛选结直肠癌的肿瘤诊断药物中具有重要的应用前景。

Description

一组与结直肠癌相关的血浆LncRNA标记物及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及生物的分子检测，更具体地涉及一组与结直肠癌相关的血浆LncRNA标记物及其应用。

背景技术

结直肠癌(CRC)包括结肠癌和直肠癌，是近几十年来发病率和死亡率在世界大多数国家和地区上升最快的肿瘤之一。由于生活方式、生活环境和膳食结构的改变以及缺乏常规筛查方法，CRC的发病率正在稳步上升，已成为严重威胁人类健康和生命安全的重要杀手。CRC的发生，发展和转移是一个复杂的过程，其中涉及多个遗传和表观遗传改变。从正常肠上皮-增生性改变/微腺瘤-早期腺瘤-中晚期腺瘤-早期癌-癌肿浸润转移是一个缓慢的发展过程，完成这一进程大约需要5～15年时间。如果能在疾病进展的早期阶段或癌前病变阶段切除已发生病变的组织，如息肉、腺瘤或早期癌，大约90％的结直肠癌是可治愈的。然而在结直肠疾病早期却缺乏特异性的症状，大约25％的患者初诊时就已出现转移，因此有效的早期筛查对于发现CRC和癌前病变是非常有必要的。

当前用于筛查结直肠癌的分子标记物主要为糖链抗原、癌胚抗原等。尽管这些分子标记物对晚期结直肠癌有较好的诊断价值，但对于早期结直肠癌及癌前病变阶段的诊断，其敏感性和特异性均较低，因此在临床实践中尚未得到广泛的接受。目前临床上迫切需要寻找一种操作简便，标本易获取、非侵入性、且特异性及灵敏度均较高的结直肠癌早期评估方法。

近年来的研究表明长链非编码RNA(LncRNA)参与基因组印记及染色质修饰、转录激活、转录后调控、蛋白功能调节等多种重要的信号转导调控过程，并可通过表观遗传调控等方式影响肿瘤细胞的生长、凋亡、耐药与转移。研究发现，LncRNA可作为诊断和预后的生物学标记物，可以在组织、血清和尿液中检测出来。但迄今为止还没有找到可靠的特异性血浆LncRNA分子标记物用于诊断CRC，特别是已被证实为腺癌的CRC和/或正从良性腺瘤转变成为恶性肿瘤这一进程中的CRC。因此，通过分析、研究LncRNA在结直肠癌中的发生发展机制，对结直肠癌的早期筛查具有重要作用，并且为结直肠癌中的基因靶向治疗提供可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种与结直肠癌相关的LncRNA标记物，并提供扩增上述circRNA标记物的特异性引物对。本发明提供的LncRNA标记物，作为一种非创伤性替代指标，能实现结直肠癌早期检测筛查辅助评估或辅助诊断结直肠癌进程，对预后判断，疗效评估等具有临床意义。

本发明的另一目的在于提供一种具有高敏感性与特异性的用于早期筛查与诊断结直肠癌的试剂盒。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：在结直肠癌患者血液中高表达的LncRNA标记物，所述LncRNA标记物包括：ZFAS1、 SNHG11、LINC00909和/或LINC00654中的一种或多种的组合。所述的ZFAS1 的核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：1所示；所述的SNHG11的核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：2所示；所述的LINC00909的核苷酸序列如序列表中 SEQ.ID.NO：3所示；所述的LINC00654的核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO： 4所示。所述ZFAS1、SNHG11、LINC00909和/或LINC00654均从GeneCards(www.genecards.org)检索下载。其中，ZFAS1的GC id是GC20P049318， SNHG11的GC id是GC20P038446，LINC00909的GC id是GC18M074591， LINC00654的GC id是GC20M006215。

本发明还提供了所述LncRNA标记物ZFAS1的特异性引物对，其上游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：5所述，其下游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：6所述；所述LncRNA标记物SNHG11的特异性引物对，其上游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：7所述，其下游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：8所述；所述LncRNA标记物LINC00909的特异性引物对，其上游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：9所述，其下游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：10所述；所述LncRNA标记物LINC00654的特异性引物对，其上游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：11所述，其下游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：12所述。

本发明中检测上述LncRNA标记物的内参基因5sRNA的引物对，其上游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：13所述，其下游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：14所述。

所述引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验，根据LncRNA标记物的核苷酸序列，所设计的特异性引物。

本发明还提供了所述的LncRNA标记物的应用，所述LncRNA标记物在制备结直肠癌早期评估产品或在筛选结直肠癌的肿瘤诊断产品中应用。

优选地，本发明中所述产品包括试剂盒、检测试纸或检测试剂。

另一方面，本发明还提供一种试剂盒，所述的试剂盒包括上述LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、LINC00909和/或LINC00654中的一种或多种的组合。进一步地，所述试剂盒包括特异性扩增LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、 LINC00909和/或LINC00654的一组或多组引物序列。

本发明所公开的试剂盒还包括：5SRNA内参特异性引物、RNA提取系统、逆转录试剂及PCR扩增试剂。进一步地，所述RNA提取系统包括裂解液、RNA 吸附柱和RNA漂洗液；所述的逆转录试剂包括M-MLV(H-)逆转录酶、5×逆转录缓冲液、RNase抑制剂、dNTP Mix和无酶水；所述PCR扩增试剂包括2× ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Low ROX Premixed)和无酶水。

更进一步地，本发明所述试剂盒，用于获取结直肠癌早期检测筛查辅助评估或结直肠癌预后判断评估信息的收集。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一类与结直肠癌相关的血浆LncRNA生物标记物，与传统的肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA19-9)相比，其对结直肠癌的灵敏度及诊断效能均较高。可应用于制备结直肠癌辅助评估或结直肠癌早期评估产品中，有利于进一步阐明脑卒中的发生发展机理、信号通路等，极具应用前景和理论价值。

附图说明

图1是LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、LINC00909和LINC00654在结直肠不同疾病组的血浆表达水平图(*：P<0.05,**：P<0.01,ns:P>0.05)；

图2是LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、LINC00909和LINC00654在结直肠癌患者术前和术后血浆中的表达水平图。

具体实施方式

下面结合附图，进一步阐释本发明，这些实施例用于说明本发明而不用于限制本发明范围；实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，实施例中所使用的试剂盒试剂的量仅是示例性的，本领域技术人员可以根据实际情况作相应调整；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：样本收集与制备收集2016年10月至2017年7月在江苏大学附属医院住院的结直肠良性息肉患者血液样本17例，其中男性7例，女性7例；年龄27～75岁，平均年龄(56.93 ±12.36)岁；结直肠腺瘤患者血液样本30例，其中男性20例，女性10例；年龄45～84岁，平均年龄(62.40±10.83)岁；结直肠癌患者术前血液样本90例，其中男性45例，女性45例；年龄38～86岁，平均年龄(65.98±10.65)岁；以及来自配对的同一结直肠癌患者术后2-3周的血液样本29例。所有患者均经组织病理学确诊。其中，良性息肉组样本的病理类型均为混合性息肉伴部分腺体低级别上皮内瘤变。结直肠癌患者术前血液样本中TNM分期按照国际抗癌联盟 (UICC)第七版标准进行：TNM I/II期40例，TNM III/IV期50例。标本收集前患者均未接受任何抗肿瘤治疗。

42例健康对照组血液样本来自同期在本院体检中心健康体检者，其中男性23例，女性19例；年龄37～85岁，平均年龄(63.55±10.82)岁。

采集患者及健康体检者清晨空腹状态下静脉血约5mL，置于EDTA-K2抗凝真空管中，3h内先于4℃，16000g/min，离心10min，移上清液于无RNA酶的1.5mL EP管中，4℃条件下1600g/min再次离心10min彻底去除细胞成分，重新收集上层血浆至新的无RNA酶的EP管中，-80℃保存备用。同时利用医院数据库收集患者及健康体检者的临床资料用于病理参数的分析。上述所有血液样本的收集依照协议由医院伦理委员会批准，所有样本采集前均征得患者知情同意。

实施例2：总RNA的提取与逆转录将血液样本置于冰上解冻后，取400μL样本按照试剂说明书使用Trizol Reagent (Life公司)试剂提取总RNA：

(1)400μL血浆，加600μLTrizol至1.5ml无核酸酶管中,涡旋混匀，室温静置 10min；

(2)加200μL氯仿，大力摇匀15s(涡旋震荡)，室温静置3min；

(3)4℃,12000rcf离心15min，取上层无色水相；

(4)水相转移至新的1.5ml无核酸酶管中，加等体积(500μL)异丙醇，轻轻混匀，室温静置15min；

(5)4℃,12000rcf,离心10min，弃上清；

(6)加1ml 75％乙醇洗涤，颠倒混匀，4℃,7500rcf，离心5min；

(7)弃上清，干燥10min，加20μL DEPC水溶解，轻轻混匀，60℃孵育10min (促进RNA溶解)，测浓度，-80℃保存。

采用NanoDrop 2000紫外分光光度仪(美国赛默飞世尔公司)测定提取 RNA的浓度和纯度。选取A260nm/A280nm在1.8～2.0的样品进行逆转录。

表1.逆转录反应试剂

按照表1中体积进行目标LncRNA的逆转录反应。

逆转录反应条件为：25℃10min，42℃45min，70℃15min。cDNA样本置于-20℃保存备用。

实施例3：荧光定量PCR(qPCR)

具体引物序列设计如下：

LncRNA标记物ZFAS1的特异性引物对上游引物核苷酸序列如SEQ.ID.NO：5所述，下游引物核苷酸序列如SEQ.ID.NO：6所述。

LncRNA标记物SNHG11的特异性引物对上游引物核苷酸序列如 SEQ.ID.NO：7所述，其下游引物核苷酸序列如SEQ.ID.NO：8所述。

LncRN9所述，其下游引物核苷酸序列如SEQ.ID.NO：10所述。

LncRNA标记物LINC00654的特异性引物对上游引物核苷酸序列如 SEQ.ID.NO：11所述，其下游引物核苷酸序列如SEQ.ID.NO：12所述。

内参基因5sRNA的引物对上游引物核苷酸序列如SEQ.ID.NO：13所述，其下游引物核苷酸序列如SEQ.ID.NO：14所述。

qPCR所用试剂如表2所示：

表2.qPCR反应试剂

反应程序为(95℃，1min)；40循环×(95℃10s，60℃30s)；95℃15sec, 60℃1min和95℃5s。最后得到扩增曲线和融解曲线，读取各样本中目的 LncRNA及内参5sRNA的循环阈值(Ct值)，即扩增产物量达到临界阈值时所对应的循环数，通过ΔCt方法计算各目的基因的相对表达值，作为评估目的 LncRNA在疾病组和正常对照组中表达差异的指标。ΔCt值越小表示该目的 LncRNA在血浆中的相对表达水平越高，以对照组为参照，低/高的ΔCt值表明其在血浆中表达上调/下调。

采用2-△△Ct方法计算CRC患者术前和术后血浆中各候选LncRNA的相对表达水平。ΔCt＝Ct目的基因－Ct内参基因，△△Ct＝△Ct疾病组－△Ct 对照组，疾病组包括患有结直肠癌的癌症患者组和患有结直肠良性息肉或结直肠腺瘤的癌前病变患者组，对照组为健康体检组。以96孔板进行样本筛选，每个样本设3个复孔，结果取平均值。

采用SPSS 23.0统计软件进行统计学处理。所有数据进行正态性检验。符合正态分布的数据以均数±标准差表示，统计分析采用两独立样本t检验；非正态分布资料采用非参数统计学分析，数据以中位数(四分位数)[M(P25， P75)]表示，两组间比较采用非参数(Mann-Whiney U)检验，多组间比较采用克鲁斯卡沃利斯测试(Kruskal-Wallis H)检验。采用配对样本t检验分析术前与术后血浆中LncRNA表达水平。利用Mann-Whitney检验、方差分析或卡方检验分析血浆LncRNA表达量与CRC患者及肿瘤的临床参数的关系。运用受试者工作特征曲线(ROC)评估血液样本候选LncRNA、传统肿瘤标记物(CEA、CA19-9)单独及联合检测对CRC的诊断效能，同时计算其相应的敏感度、特异度。Youden 指数＝敏感度+特异度－1，该指标用于确定Cut-off值。P＜0.05(双侧)为差异有统计学意义，P＜0.01视为差异显著。相应的实验数据图采用GraphPad Prism 5.0软件绘制。

采用△Ct方法计算ZFAS1、SNHG11、LINC00909和LINC00654在验证组90例CRC患者血浆中的相对表达值，利用血浆lncRNA的相对表达值作ROC 曲线分析；

表3.LncRNA标记物和肿瘤标记物CEA、CA19-9的诊断效能对照表

	AUC	SEN(％)	SPE(％)	95％可信区间
					ZFAS1	0.850	76.7	78.6	0.786-0.915
SNHG11	0.868	93.3	71.4	0.787-0.948
					LINC00909	0.886	77.8	85.7	0.832-0.941
LINC00654	0.734	74.4	66.7	0.635-0.832
					CEA	0.791	45.8	100	0.708-0.875
CA19-9	0.601	53.0％	84.8％	0.501-0.700

由表3可见，ZFAS1、SNHG11和LINC00909的AUC值均大于CEA、CA19-9， LINC00654的AUC值在4条血浆lncRNA中最低，其AUC值小于CEA，但大于CA19-9。ZFAS1、SNHG11、LINC00909和LINC00654对CRC诊断的敏感性 (SEN)均高于CEA、CA19-9，但特异性(SPE)均低于CEA；除LINC00909 诊断特异性稍高于CA19-9外，其余三条lncRNA对CRC诊断的特异性均低于CA19-9。可知，血浆LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、LINC00909和LINC00654 对结直肠癌和TNMⅠ/Ⅱ期结直肠癌均有较高的诊断效能，可以作为潜在的结直肠癌诊断分子标记物。

表4.LncRNA标记物分别联合CEA的ROC曲线AUC值

表5.LncRNA标记物分别联合CA19-9的ROC曲线AUC值

	AUC	SEN(％)	SPE(％)	95％CI	P-Val<sub>ue</sub>
						ZFAS1+CA19-9	0.893	70.2	97.0	0.837-0.949	<0.001
SNHG11+CA19-9	0.894	85.7	81.8	0.828-0.961	<0.001
						LINC00909+CA19-9	0.908	72.6	100	0.858-0.959	<0.001
LINC00654+CA19-9	0.760	71.4	72.7	0.664-0.855	<0.001

将验证组90例CRC患者血浆中ZFAS1、SNHG11、LINC00909和LINC00654的相对表达值分别与CEA、CA19-9的临床检测值联合后作ROC曲线分析，由表 4、表5可见，联合传统肿瘤标记物后LncRNA标记物对CRC诊断的AUC值均大于任何一条单个lncRNA或单一CEA、CA19-9。联合CEA后，尽管除了 LINC00909对CRC诊断的敏感性较单一LINC00909升高外，其余三条lncRNA诊断CRC的敏感性均较单一指标下降，但它们对CRC诊断的特异性均明显提高。联合CA19-9后，ZFAS1、SNHG11、LINC00909和LINC00654诊断CRC的敏感性均下降，但特异性均提高。可知，将ZFAS1、SNHG11、LINC00909和 LINC00654分别与CEA、CA19-9联合后可提高对结直肠癌的诊断效能。

对由LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、LINC00909和LINC00654构成的4-LncRNA在验证组90例CRC患者血浆中的相对表达值作联合ROC曲线分析，由表6可知，4-LncRNA的AUC值为0.937(95％CI：0.892-0.982)，该值高于任意一条单个LncRNA标记物的AUC值。可知，由ZFAS1、SNHG11、 LINC00909和LINC00654构成的4-LncRNA组合可作为CRC诊断的血浆分子标志物。

表6.4-LncRNA联合ROC曲线的AUC值

	AUC	SEN(％)	SPE(％)	95％CI	P-Value
						4-LncRNA	0.937	92.2	83.3	0.892-0.982	<0.001

表7.TNMⅠ/Ⅱ期结直肠癌血浆中LncRNA标记物分开及联合的ROC曲线的AUC值及灵敏度、特异性值

由表7可知，ZFAS1、SNHG11、LINC00909和LINC00654对结直肠癌，特别是 TNMⅠ/Ⅱ期结直肠癌均有较高的诊断效能，可以作为潜在的结直肠癌诊断分子标志物。

ROC曲线分析显示，ZFAS1、SNHG11、LINC00909和LINC00654诊断TNMⅠ/Ⅱ期结直肠癌的AUC值均小于4-LncRNA组合的AUC值，在截断值 (Cut-off)值为0.735时，4-LncRNA组合诊断TNMⅠ/Ⅱ期CRC的敏感性为81.0％，特异性为92.5％。

图1是LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、LINC00909和LINC00654在结直肠不同疾病组的血浆表达水平图(*：P<0.05,**：P<0.01,ns:P>0.05)；其中，图A是LncRNA标记物ZFAS1的血浆表达水平图，图B是LncRNA标记物SNHG11的血浆表达水平图，图C是LncRNA标记物LINC00909的血浆表达水平图，图D是LncRNA标记物LINC00654的血浆表达水平图；由图1可见， LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、LINC00909或LINC00654均可作为诊断结直肠癌的血浆分子标志物，其中ZFAS1或SNHG11还可以作为诊断结直肠癌前病变的血浆分子标志物，特别是血浆SNHG11的检测有利于临床上早期发现良性息肉患者。

图2是LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、LINC00909和LINC00654在结直肠癌患者术前及术后2～3周血浆中的表达水平对比图，其中，图A是LncRNA 标记物ZFAS1，图B是LncRNA标记物SNHG11，图C是LncRNA标记物 LINC00909，图D是LncRNA标记物LINC00654；由图2可见，LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、LINC00909和LINC00654在结直肠癌患者术后血浆中的表达量较术前均明显下降，提示其均可作为结直肠癌患者手术治疗后疗效评价的指标。

本实施例验证LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、LINC00909或 LINC00654在结直肠癌患者血浆中均表达上调，结直肠腺瘤患者血浆中ZFAS1 或SNHG11的表达水平都明显高于健康对照组，SNHG11在良性息肉患者的血浆中也呈显著的差异性表达；血浆LncRNA标记物ZFAS1或SNHG11可用于结直肠癌前病变的诊断；将血浆LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、LINC00909和 LINC00654与CEA、CA19-9联合后对结直肠癌的诊断效能提高；

将血浆LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、LINC00909和LINC00654进行4- LncRNA联合后诊断结直肠癌的效能明显高于任意单一LncRNA标记物和CEA、 CA19-9的诊断效能。血浆LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、LINC00909或 LINC00654均可作为结直肠癌患者手术治疗后疗效评价的指标。

实施例4：

利用本发明所提供试剂盒进行检测

(1)提取血浆样品的总RNA，并逆转录成cDNA溶液；

(2)检测溶液：包括ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Low ROX Premixed)(2X)、上游引物5μM、下游引物5μM；

(3)反应体系：取1μL步骤(1)中所得的cDNA溶液，与6μL检测溶液混合，并加入无菌超纯水至反应体积10μL；加入到实时荧光反应管中，进行离心；

(4)将步骤(3)的反应体系按照下述条件进行实时荧光PCR检测：95℃预变性1min，1次循环；95℃变性10s，60℃延伸30s，40次循环；反应完成后是 95℃15sec,60℃1min和95℃15s进入熔解曲线分析。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，不偏离本发明精神的基础上所做的修改和改进，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏大学附属医院

<120> 一组与结直肠癌相关的血浆LncRNA标记物及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11083

<212> DNA

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 1

cgggggccca gggtggagag cacgagggcc tggcccaggc acggccggcg cctccgccct 60

cgaggagggc gtcacctcag ctccccccgg cggcggagcc ggcgggctca ggcgggcgcg 120

gctgagggga gcggaccgcg gggggcggga gatgactgcg cccaaggcct ttgcgggcct 180

cagccggccc cagaggaagg ggaacccgtc gagcggtttg gtgcgtgtga agcgcgacat 240

ggcgaggaag cggacaagcc cgggtggccc ggcgtgtaga gggaaggggg cggggctaga 300

cgcggcctgg acaactacta gagcgcctcg ggctgtgctg ctcgagacta catttcccag 360

agcgacgcgc gcggagcggg cgggaaagag agcgtttcgg gtccagtgcg caggtgcgaa 420

agccatcttt ggttatataa gggaggttca ggaagccatt cgttctttcg cgtctgcggt 480

gcccggagtg tggtacttct cctagttgca gtcaggcttc atacgctatt gtcctgcccg 540

taagttcccg ttttgtgtgt ggtgagtgga aactccatgt tcttcgttgg agacctctgg 600

tcctcccttc ccttctttgt gccgtcgtct ctgcggccag ccctaatctc cttctcgtgg 660

cttctccgtc tctgacccca aataggcctt aagggcgtgg gagaaatgag tttctggagc 720

tggaaaagcc actgccttct gcacgggcct gagaagccct tggctggtgt aaatgatgac 780

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gaagagggag tcaccactgg acctccaagg aagccacgtg cagacatcta caaccttcga 1020

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cattcttcct gtgtgttggg gcgcttaaat ttccaagtgg agggatgatt tattgacata 1680

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gaacacatgt gaagcttatt gttccagatt gttcttttgt caggtaactt gtggtaactt 1860

gtgttaaaat gcaatctctt ggtacttgtt cacttcccaa ctcagtaaat gccaactact 1920

tcctcaactc ttccagccac actggcttct atcatgggcc tgtactcaga gtgtaagcac 1980

tgaagacagg ggtgtttggt ttggctacca agttattgcc agctacagga tacaacacag 2040

aagtgctcaa acaccgaatg caaatttgca aatatgaagc ataccaacca aatcttactc 2100

ctcatggctt tcaaatctta ctcctcactc aagaacttcc tgctggcata tatgatgact 2160

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tgatatgcca gcttgagcag ctcctttgtc ccagctcccc tgggcatcta gctgatggga 2280

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gaaattagaa gcttaactga atgatgcgag ggaggattga ggaagatttt ggtgggtgag 3540

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gaaataccag ggtgaaaggg agatagccaa ttggattaga gctcaagtgc cacgccaagt 4440

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ttgtttagaa ggggatgaag ggggtggggg aacaatgaag cgcatttcga aagatcctgt 5040

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cgctcgcttc gcactcagtt gtgcgtctca ttgacacact ttcaacctct aaaatgccct 8640

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tgagctccca aattgttggc aataagagct cagagttgca aagaaaatga tctccaaaag 8940

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cttctgtgtt ctatccccat tggctagagt ccaatctaaa ctagtcctga ttggctattt 9120

taaacaggag gggtgtgggt tacagcagtg ggaagagcag ttgccacgag cgagggagac 9180

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<210> 2

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<212> DNA

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 2

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tggctctggg gacttgggat ccagagttga agacccttca gctggctctg ccctgccagt 4080

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aa 6062

<210> 4

<211> 8530

<212> DNA

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 4

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atcctgactc cacctgctgt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtccaatgc ccaagtgaga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccatgtttca cctgcaaggc 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtctacggcc ataccaccct gaa 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aagcctacag cacccggtat tcc 23

Claims (10)

1.一种与结直肠癌相关的LncRNA标记物，其特征在于，所述LncRNA标记物包括：ZFAS1、SNHG11、LINC00909和/或LINC00654中的一种或多种，所述ZFAS1的核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：1所示；所述的SNHG11的核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：2所示；所述的LINC00909的核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：3所示；所述的LINC00654的核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：4所示。

2.根据权利要求1所述的LncRNA标记物，其特征在于，所述的ZFAS1的特异性引物对，其上游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：5所示，其下游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：6所示。

3.根据权利要求1所述的LncRNA标记物，其特征在于，所述的SNHG11的特异性扩增引物对，其上游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：7所示，其下游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：8所示。

4.根据权利要求1所述的LncRNA标记物，其特征在于，所述的LINC00909的特异性扩增引物对，其上游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：9所示，其下游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：10所示。

5.根据权利要求1所述的LncRNA标记物，其特征在于，所述的LINC00654的特异性扩增引物对，其上游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：11所示，其下游引物核苷酸序列如序列表中SEQ.ID.NO：12所示。

6.根据权利要求1-5任一项所述的血浆LncRNA标记物的应用，其特征在于，所述的LncRNA标记物在制备结直肠癌早期评估产品或筛选结直肠癌的肿瘤诊断药物中应用。

7.根据权利要求1-5任一项所述的血浆LncRNA标记物的应用，其特征在于，所述的LncRNA标记物在结直肠癌患者术后疗效评估辅助评估信息中应用。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增LncRNA标记物ZFAS1、SNHG11、LINC00909和/或LINC00654的一组或多组引物序列。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括5SRNA内参特异性引物、RNA提取系统、逆转录试剂及PCR扩增试剂。

10.如权利要求8-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于获取结直肠癌早期检测筛查辅助评估或结直肠癌预后判断评估信息的收集。