CN110257497B - 血清/血浆LncRNA标志物ENST00000449605.1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了血清/血浆LncRNA标志物ENST00000449605.1及其应用。ENST00000449605.1及其检测试剂在制备ICP辅助诊断试剂盒中的应用。发明人通过分离和研究初产、单胎妊娠的ICP病例和与其年龄匹配的健康孕妇对照血清/血浆中的LncRNAs，寻找一组与ICP发病高度相关的高特异性和敏感性的LncRNAs，并研制出可便于临床应用的ICP辅助诊断试剂盒，为ICP的筛查和诊断治疗提供实验室支持。

Description

血清/血浆LncRNA标志物ENST00000449605.1及其应用

分案说明

本发明是申请日为2019-02-22，申请号为2019101327263，发明名称为“一种与妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的血清/血浆LncRNA标志物组合及其应用”的中国发明专利的分案申请。

发明领域

本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及血清/血浆LncRNA标志物ENST00000449605.1及其应用。

背景技术

妊娠期肝内胆汁淤积症(Intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是一种妊娠期特发性肝病，对围产儿危害极大，临床上以胆汁酸升高、肝功能异常及皮肤瘙痒为特征。ICP全球发病率约为4.5％-15％，我国长江流域发病率为1％-4％，其中重庆、成都两地发病率超过5％。据报道ICP发病可引起胎膜早破、早产、羊水粪染、胎儿宫内窘迫及胎儿不明原因死亡和孕妇产后出血等母婴预后不良。各种临床治疗只能缓解孕妇的瘙痒等症状，并不能减轻对胎儿的危害。尽管有报道ICP的多种基因和蛋白会发生改变，可能通过细胞凋亡、氧化应激、脂质代谢、细胞生长和免疫应答等途径参与ICP的发生，但ICP的确切原因至今仍不明确。

对ICP人群进行早期诊断、早期干预及合理治疗可以有效降低该病的发病风险和母婴并发症，大大降低ICP给母婴和其家庭带来的疾病痛苦和经济压力。然而目前临床上ICP的监测手段非常有限，只能依赖于敏感度较低的胆汁酸筛查。因此研究ICP发生的敏感分子事件，进而筛选易感生物标志物(susceptible biomarker)可为ICP的早期诊断和实施干预提供有效手段，对促进人类母婴健康具有重大的科学意义。

长链非编码RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一类内源性非编码长链RNA，长度大于200个核苷酸(nt)，进化上高度保守。尽管起初被认为不具有生物学功能、转录后不编码蛋白质的RNA，但近年来已证实可由细胞释放到胞外，在不同组织及细胞间行使信息传递功能，发挥重要的生物学作用，且其功能几乎涉及到生命的所有领域。研究已经证实LncRNA无论在数量、种类、还是功能、作用模式上都更加丰富，且血清/血浆中的LncRNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性。而现有的成熟的技术，包括定性和定量LncRNAs分子的技术，表明利用血清LncRNAs作为分子生物标志物的方法比血清LncRNAs以及传统的特异蛋白分子标记方法将更加有效，为生物标志物开拓了新境界。

然而，目前还没有用于ICP辅助诊断的较为稳定的生物标志物的报道，若能筛选出ICP特异或异常表达的血清/血浆LncRNAs作为生物标志物，并研制相应的辅助诊断试剂盒，将极大改善我国ICP的诊断现状。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与ICP辅助诊断相关的血清/血浆LncRNA标志物。

本发明的第二个目的是提供上述血清/血浆LncRNA标志物的引物。

本发明的第三个目的是提供上述血清/血浆LncRNA标志物及其引物在制备ICP辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明第四个目的是提供用于ICP辅助诊断的试剂盒。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

与妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的血清/血浆LncRNA标志物或其组合，该标志物至少选自ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1中的任意一种。ENST00000449605.1的cDNA序列如SEQ ID No.7所示,ASO3480的cDNA序列如SEQ ID No.8所示,ENST00000505175.1的cDNA序列如SEQ ID No.9所示。

与妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的血清/血浆LncRNA标志物，该标志物选自ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1中的任意一种。

与妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的血清/血浆LncRNA标志物组合，该标志物优选自ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1中的任意两种。

与妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的血清/血浆LncRNA标志物组合，该标志物优选由ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1三种LncRNA组成。

用于妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的引物组合物，所述的引物或其组合物至少选自特异性扩增ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1中的任意一种的引物。

所述的引物组合物中ENST00000449605.1的引物优选如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示；ASO3480的引物优选如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；ENST00000505175.1的引物优选如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

用于妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的引物组合物，可以为特异性扩增ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1中的任意一种的引物。

用于妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的引物组合物，优选由特异性扩增ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1中的任意两种LncRNA的引物组成。

用于妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断相关的引物组合物，优选由特异性扩增ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1中的三种LncRNA的引物组成。

所述的血清/血浆LncRNA标志物或其组合作为检测靶标在制备妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断试剂盒中的应用。

检测本发明所述的血清/血浆LncRNA标志物或其组合的试剂在制备妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断试剂盒中的应用。

所述的检测本发明血清/血浆LncRNA标志物的试剂优选本发明所述的引物组合物。

一种妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断试剂盒，该试剂盒包含检测本发明所述的血清/血浆LncRNA标志物或其组合的试剂。

该试剂盒优选含有本发明所述的引物组合物。

该试剂盒优选还可以包括PCR反应常用的酶和试剂。

所述诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl₂，DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。

当所述的试剂盒是基于Taqman探针法检测本发明所述的血清/血浆LncRNA标志物或其组合的试剂盒时，还应该包含检测所述LncRNA标志物或其组合的Taqman探针。

具体地说，本发明血清/血浆LncRNA标志物通过以下方法筛选得到：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)血清/血浆LncRNA差异表达谱分析：选择ICP病例、与ICP病例年龄匹配的健康女性对照，检测ICP病例及对照血清/血浆LncRNA表达谱及含量，分析ICP病例和健康女性对照间血清/血浆LncRNA的共性和特性，筛选差异表达LncRNAs，进行进一步多阶段验证。(3)筛选疾病特异血清/血浆LncRNAs：对已筛选的血清/血浆差异表达LncRNAs在大样本人群中进行定量分析，确定ICP特异性血清/血浆LncRNAs。

本发明血清/血浆LncRNA筛查和辅助诊断试剂盒的研制是根据ICP病例和健康对照的特异血清/血浆LncRNA开发LncRNAs诊断试剂盒。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等(这些资料可用于判断疾病进展，患者年龄等因素对于发病的影响)，并采用了RT-PCR、Real-time PCR方法、CapitalBio Technology Human LncRNA Array v4芯片检测等。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究样本的选择

(1)纳入病例组：ICP诊断标准参照ICP患者诊疗指南(第一版)，具体标准如下：1)妊娠中晚期出现皮肤瘙痒，或伴有不同程度的黄疸；2)实验室检查：血清总胆汁酸(TBA)增高(>40μmol/L)，或伴转氨酶(ALT及AST)轻到中度升高，可伴胆红素升高；3)妊娠是引起皮肤瘙痒和生化异常的唯一原因；4)患者一般情况良好，无明显呕吐、食欲不佳、虚弱及其他疾病症状；5)分娩后上述症状、体征、血清生化指标迅速恢复正常。收集临床资料完整的ICP患者54例。

(2)纳入正常对照组：无妊娠并发症及合并症，剖宫产指征为臀位、骨盆异常和社会因素等，收集临床资料完整的正常孕妇54例。

(3)两组排除标准：1)患其它肝胆疾病；2)有其它妊娠并发症如妊娠期高血压疾病或有不能用ICP解释的血、尿或生化异常；3)有全身疾病如糖尿病、高血压、精神及神经疾病等；4)患有遗传性或免疫性疾病；5)有输血、移植或免疫治疗史者；6)有口服避孕药史者。

本研究共采用108例符合标准的样本进行研究。

2.Trizol试剂(Invitrogen,USA)提取血清/血浆总RNA，并进一步采用

RNA clean-up试剂盒(740.948.250)对总RNA进行过柱纯化。按常规方法操作。通常能得到～5μg RNA/50ml血清或血浆。

3.Human LncRNA Array v4(Capitalbio Technology公司)芯片检测

(1)总RNA通过逆转录反应得到cDNA样品

(2)Human LncRNA Array v4芯片检测，得到LncRNA的表达谱

(3)数据分析与处理

4.Real-time RT-PCR(Q-PCR)方法

(1)取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；

(2)设计引物；

(3)Sybrgreen荧光染料法进行LncRNA的定量检测；

(4)检测并比较ICP病例与健康对照血清/血浆样本中LncRNA的量的变化。

5.诊断试剂盒制备方法

Human LncRNA Array v4芯片检测方法综合确定ICP病例和健康对照中有表达差异的LncRNA，通过Q-PCR技术筛选在ICP病例和健康对照中表达量和差异程度大的一组血清/血浆LncRNA，作为ICP诊断的指标。最后筛选出的与ICP发病有关的血清/血浆LncRNA组成诊断试剂盒(ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1)。诊断试剂盒包括这些血清/血浆LncRNA组合的引物、探针、Taq酶以及dNTP等试剂。

6.统计分析方法

运用student t检验比较人口学特征，TAB(μmol/L)、ALT(IU/L)、AST(IU/L)水平和LncRNA平均表达水平在研究对象组间分布的差异。

我们在探索性样本人群(4例ICP病例和4例健康对照)中运用Human LncRNA Arrayv4芯片的研究结果初步筛选发现58个LncRNA上调85个LncRNA下调。然后验证差异表达的三种LncRNAs(ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1)与ICP发病情况的关联性。个体LncRNAs检测的不同表达水平以

表示，其中ΔCt＝C_T样本–C_T内参,以miR-39为外参基因，计算相对表达量。对有统计学显著差异的LncRNAs在另外54例病例和54例对照中进一步应用Q-PCR方法进行验证。

统计学分析均应用SPSS16.0统计学分析软件完成。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。

以下是本发明进一步的说明：

在上述4例符合条件的ICP病例及4例健康对照中，两组年龄按个体精确匹配。我们将这两组人群作为探索性样本经Human LncRNA Array v4芯片检测获得相关结果。

根据Human LncRNA Array v4芯片检测，本发明人检测到在“妊娠期肝内胆汁淤积症病例”组和“健康女性对照”组的血清中存在差异表达(表达差异(上调或下调)相对于对照组>2倍)的LncRNA包括：RNA95791|RNS_873_113，ENST00000584829.1，ENST00000446102.1，ENST00000523759.1，ENST00000534653.1，TCONS_00011955，TCONS_00009146，ENST00000449605.1，ENST00000439804.1，ENST00000604818.1，ENST00000609910.1，ENST00000600160.1，ASO3480，ENST00000536898.1，HIT000430355，ENST00000483023.1，TCONS_00006708，HIT000248174，ENST00000505175.1等。

选择Human LncRNA Array v4芯片中两组研究对象的CT值均不大于35且在各组样本个体间表达信号相对均一的LncRNAs用Q-PCR方法进一步验证，以提高检测效率。

满足上述条件的LncRNAs包括：ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1。

Sybrgreen荧光染料法Q-PCR结果发现在54例ICP病例和54例健康对照中，有3种LncRNAs(ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1)在“ICP病例”组和“健康对照”组中的表达情况存在显著性差异。

多因素Logistic回归分析结果表明，ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1均与ICP的发病存在着显著关联，这3种LncRNAs的组合作为ICP的生物标记物更加有效。

根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于ICP辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血清/血浆中稳定存在且可检测ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1的引物和其他检测试剂。

具体而言，这3种LncRNAs的组合，或者这3种LncRNAs的引物组合构成的相关诊断试剂盒有助于ICP的早期诊断，为临床医生准确诊断ICP，及时采取防治方案提供支持，从而最大限度地降低ICP导致不良妊娠结局的风险。

本发明的有益效果：

本发明提供的血清/血浆长链非编码RNA(LncRNAs)标志物作为ICP诊断的标志物的优越性在于：

发明人通过分离和研究初产、单胎妊娠的ICP病例和与其年龄匹配的健康孕妇对照血清/血浆中的LncRNAs，寻找一组与ICP发病高度相关的高特异性和敏感性的LncRNAs，并研制出可便于临床应用的ICP辅助诊断试剂盒，为ICP的筛查和诊断治疗提供实验室支持。

本发明初期采用Human LncRNA Array v4芯片检测获取疾病特异和异常表达的血清/血浆LncRNAs表达谱，并应用Q-PCR的方法在大样本中通过荧光染料法进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了血清/血浆LncRNAs生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

本发明通过控制年龄等对疾病发展的影响因素，研究血清/血浆LncRNAs在ICP诊断的应用前景，阐述异常表达的LncRNAs对于ICP进展的影响，揭示其对ICP的诊断价值。因此，本发明获得了ICP发病特异性血清/血浆LncRNAs表达数据库和特异性标志物；通过血清/血浆LncRNAs生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得ICP的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确诊断ICP及采取治疗措施奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

图1血清LncRNA对ICP的诊断价值

(A)ENST00000449605.1,(B)ASO3480,(C)ENST00000505175.1,(D)使用多重回归分析，3种LncRNA的组合的ROC曲线,(E)ENST00000449605.1+ENST00000505175.1联合的ROC曲线,(F)ASO3480+ENST00000505175.1联合的ROC曲线,(G)ASO3480+ENST00000449605.1联合的ROC曲线。三种LncRNA(ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1)的组合在ROC曲线(AUC)下产生最大的面积。

具体实施方式

实施例1样品的收集和样品资料的整理

发明人于2016年10月至2017年9月从南京医科大学附属无锡妇幼保健院收集了大量ICP患者及健康对照孕妇的外周血样品(用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一)，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了108例符合下列标准的样本作为HumanLncRNA Array v4芯片检测和后续一系列Q-PCR验证的实验样品：

1、上述研究对象在妊娠中晚期ICP筛查时(参照ICP患者诊疗指南(第一版))确认为ICP的孕妇定义为病例。

2、上述研究对象在妊娠中晚期孕周ICP筛查时未发生ICP，与病例组年龄、孕周匹配的健康孕妇定义为对照。

并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况。

实施例2血清/血浆中LncRNAs的Human LncRNA Array v4芯片检测

将上述符合条件的4例ICP病例和4例健康对照经Human LncRNA Array v4芯片检测获得相关结果。具体步骤为：

1.样本total RNA的提取和质检

采用合适的方法，比如Trizol(Invitrogen,USA)提取组织块或细胞中的总RNA。并进一步采用

RNA clean-up试剂盒(740.948.250)对总RNA进行过柱纯化。然后用分光光度计或Qubit等方法定量，用琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100等方法检测其完整性。

2.Total RNA合成cDNA

2.1反转录合成First Strand cDNA

在0.2mL无核酸酶的离心管中依次加入以下试剂：

2.1.1取5μL Total RNA(100-500ng)，加入到0.2mL无核酸酶的离心管中。

2.1.2加入相应体积的Agilent spike-in。全部样品加入Spike A(Agilent)2.0μL，或者加入Spike B(Agilent)2.0μL。

2.1.3在冰上配制反转录Master Mix，轻轻混匀，短暂离心放在冰浴上。

2.1.4取5μL反转录Master Mix，加到含有Total RNA样品的0.2mL离心管中。反转录最终反应体积为10μL。2.1.5轻柔吹吸混匀2-3次，瞬时离心，置于冰上。2.1.6将反转录离心管置于PCR仪上，25℃反应1h，42℃反应1h，4℃保持5min以上。取出反转录离心管，瞬时离心，置于冰上，准备进行Second Strand cDNA合成反应。

2.2合成Second Strand cDNA

2.2.1在冰上配制Second Strand Master Mix，轻轻混匀，短暂离心后冰浴。

2.2.2取50μL Second Strand Master Mix加到2.1.6步骤中的反应管中，混合体积为60μL；吹吸混匀2-3次，瞬时离心，置于冰上。

2.2.3将第二链合成离心管置于PCR仪上，16℃反应1h(关闭PCR仪盖加热功能)，65℃反应10min，4℃保持5min以上。

2.2.4反应结束后将反应管置于冰上继续合成反应，或者迅速冻存于-20℃。

3.体外转录合成cRNA

3.1cRNA合成

3.1.1配制体外转录Master Mix，轻轻混匀，短暂离心将溶液收集于管底。

3.1.2取30μL IVT Master Mix到2.2.4步骤的反应管中，吹吸混匀，瞬时离心冰上放置。

3.1.3将体外转录合成离心管置于PCR仪上，40℃反应16h，4℃保持。

3.1.4反应结束后，瞬时离心，使用

RNA clean-up试剂盒(MN公司，740.948.250)对产物进行纯化，并使用紫外分光光度计对纯化后的cRNA产物进行定量。

4.cRNA反转录

4.1cRNA反转录生成cDNA

4.1.1取cRNA纯化产物10μg，调整体积至22μL，加入到0.2mL无核酸酶离心管中，并加入2μL Random Primer混匀，置于PCR仪上，70℃5min，25℃5min，4℃2min，瞬时离心收集液体至管底，冰上放置。

4.1.2配制cRNA反转录Master Mix，轻柔混匀，短暂离心将溶液收集于管底。

4.1.3取16μL反转录Master Mix加入4.1.1步骤反应后的离心管中，总体积为40μL，吹吸混匀2-3次，瞬时离心。

4.1.4将cRNA反转录离心管置于PCR仪上，25℃反应10min，40℃反应1.5h，70℃反应10min，4℃反应5min，离心管冰上放置。

4.1.5冰上操作，在cRNA反转录离心管中加入2μL RNase H混匀，瞬时离心，置于PCR仪上，37℃反应45min，95℃反应5min，4℃维持5min。

4.1.6反应结束后，可在-20℃冻存过夜，或立即进行纯化操作。

4.1.7使用

Extract II(MN公司，Cat.No.740609.250)试剂盒进行cDNA纯化，并使用紫外分光光度计对纯化后的cRNA产物进行定量。

5.荧光标记

5.1荧光染料标记反应

5.1.1将反转录并纯化后得到的cDNA产物体积浓缩至14μL，加入4μL RandomPrimer混匀，短暂离心后置于PCR仪上，95℃变性3分钟，冰浴5分钟。

5.1.2依次加入相关试剂，使用秱液器吹打2-3次混匀。

5.1.3短暂离心后，置于PCR仪上，37℃反应1.5小时，70℃反应5分钟。4℃保持。

5.1.4荧光染料标记反应结束后，使用

Extract II(MN公司，Cat.No.740609.250)试剂盒进行cDNA纯化，并使用紫外分光光度计对纯化后的荧光标记产物进行荧光掺入量和核酸定量。

6.芯片杂交

6.1标记产物杂交准备

6.1.1经

Extract II试剂盒纯化后的标记产物，洗脱体积在30μL左右。

6.1.2将单管标记cy3-dCTP纯化洗脱产物抽真空浓缩或补水体积至27.5μL备用。

6.2杂交体系配制、杂交反应

6.2.1将6.1.步骤中准备好的标记产物，与相应试剂混合。

6.2.2取100μL杂交液加样至杂交盖片围栏中，“Agilent”标签面朝下轻轻盖上围栏，安装好Agilent杂交盒并旋紧后，可轻轻水平转动杂交盒，检查各个亚阵的杂交腔体内液体是否流动。

6.2.3将杂交盒安装在杂交炉的转子上，注意对称安装，同时在托盘中加入适量超纯水后，45℃杂交过夜。

7.芯片清洗及扫描

7.1结束后，取出芯片在博奥Slide Washer8芯片洗干仪进行清洗，清洗程序如下：

洗液I：0.2％SDS，2×SSC,42℃120S清洗2遍。洗液II：0.2％SDS，2×SSC,42℃80S清洗3遍。清洗程序完成后，离心甩干，待扫描。

7.2使用Agilent芯片扫描仪(G2565CA)对清洗后的芯片进行扫描，得到杂交图片。

8.芯片数据分析

使用Agilent Feature Extraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取数据。然后使用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析。

我们在4例ICP病例和4例健康对照中运用Human LncRNA Array v4芯片的研究结果初步筛选发现58个LncRNA上调，85个LncRNA下调；具体包含：RNA95791|RNS_873_113，ENST00000584829.1，ENST00000446102.1，ENST00000523759.1，ENST00000534653.1，TCONS_00011955，TCONS_00009146，ENST00000449605.1，ENST00000439804.1，ENST00000604818.1，ENST00000609910.1，ENST00000600160.1，ASO3480，ENST00000536898.1，HIT000430355，ENST00000483023.1，TCONS_00006708，HIT000248174，ENST00000505175.1等。

实施例3血清/血浆中LncRNA的Q-PCR实验

选择Human LncRNA Array v4芯片中两组研究对象的CT值均不大于35且在各组样本个体间表达信号相对均一的LncRNAs用Q-PCR方法进一步验证，以提高检测效率。

满足上述条件的LncRNAs包括：ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1。

根据上述Human LncRNA Array v4结果，选择LncR-371a-5p，LncR-6865-5p，LncR-1182，ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1设计逆转录和Q-PCR的引物，见表1。对“ICP病例”组和“健康对照”组的血清单个个体进行LncRNA的Q-PCR检测，结果见表2。

表1：引物序列

表2:ICP组和对照组LncRNA array检测LncRNA的差异表达(部分)

ICP(P)与健康孕妇(C)相比，大于2.0倍上调或下调的LncRNAs.

在整个研究过程中均实施严格的质控。每个样本连续检测三次。所有检测均采用盲法，即在不清楚样本背景的情况下完成以避免偏倚。LncRNA定量检测采用Sybrgreen荧光染料法。

1.RNA抽提

1.1取适量样300ul，转移样品于1.5mL离心管中；

1.2加入1000μL TRIzol

Reagent到1.5mL离心管中,剧烈震荡混匀，常温静置10mins。

1.3加200μL氯仿，旋涡振荡10秒。室温静置5mins。

1.4放入离心机中，4℃12000rpm离心15mins。

1.5将上清液转移至新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒至无丝状物可见，-20℃放置30mins。

1.6放入离心机中，4℃12000rmp离心10mins，弃上清。

1.7加入1000μL 75％的冰冷乙醇，上下颠倒洗涤，放入离心机中，4℃12000rpm离心10min。弃上清液。

1.8待沉淀干燥后，根据沉淀量加入适量DEPC-H20溶解。-80℃保存。

2.反转录

取一灭菌的无RNA酶的Eppendorf管，每个样本加入如下组分得到Mix I。

把Mix I 65℃温浴5分钟，然后立即放冰上1分钟。

在Mix I里加入如下成分。得到Mix II共20μL体系。

25℃处理5分钟。

42℃处理60分钟。

70℃处理15分钟。立即放置到冰上。

所得到的cDNA可以保存到-20℃保存半年。

3.QPCR扩增

QPCR体系中各组分的体积：

QPCR反应条件：

4、数据处理与分析

LncRNA定量PCR检测数据采用比较CT(△△CT)方法计算基因相对表达差异倍数。数据处理过程主要包括：

两组样品血清LncRNAs的表达量比值可用方程

表示，其中△Ct＝C_T样本–C_T内参,miR-39作为外参，计算相对表达量(miR-39:SEQ ID No.7和SEQ ID No.8)。

Sybrgreen荧光染料法Q-PCR结果显示在108例样本中，3种LncRNAs(ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1)在两组间的表达情况存在显著性差异，结果见表3。

表3:验证样本表达结果

多因素Logistic回归分析结果表明，ENST00000449605.1，ASO3480和ENST00000505175.1均与ICP的发病存在着显著关联，这3种LncRNAs的组合作为ICP的生物标记物更加有效(图1)。

实施例4用于ICP辅助早期诊断的LncRNA试剂盒的制作

LncRNA试剂盒的制作和操作流程是基于Human LncRNA Array v4芯片检测，RT-PCR和QPCR等技术。试剂盒包括血清/血浆LncRNA引物(包括下列引物ENST00000449605.1的引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；ASO3480的引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；ENST00000505175.1的引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)，还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl₂，去核酸酶水，荧光染料或探针、Taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的线虫LncR-39样本等)及正常参考值。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光或探针法检测LncRNA的变化趋势，再通过该趋势辅助早期诊断ICP，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断。

实施例5用于ICP辅助早期诊断的LncRNA试剂盒的制作

LncRNA试剂盒的制作和操作流程是基于Human LncRNA Array v4芯片检测，RT-PCR和QPCR等技术。试剂盒包括血清/血浆LncRNA引物(包括下列引物ENST00000449605.1的引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；ASO3480的引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；)，还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl₂，去核酸酶水，荧光染料或探针、Taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的线虫LncR-39样本等)及正常参考值。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光或探针法检测LncRNA的变化趋势，再通过该趋势辅助早期诊断ICP，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断。

实施例6用于ICP辅助早期诊断的LncRNA试剂盒的制作

LncRNA试剂盒的制作和操作流程是基于Human LncRNA Array v4芯片检测，RT-PCR和QPCR等技术。试剂盒包括血清/血浆LncRNA引物(包括下列引物ASO3480的引物为SEQID No.3和SEQ ID No.4；ENST00000505175.1的引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)，还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl₂，去核酸酶水，荧光染料或探针、Taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的线虫LncR-39样本等)及正常参考值。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光或探针法检测LncRNA的变化趋势，再通过该趋势辅助早期诊断ICP，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断。

实施例7用于ICP辅助早期诊断的LncRNA试剂盒的制作

LncRNA试剂盒的制作和操作流程是基于Human LncRNA Array v4芯片检测，RT-PCR和QPCR等技术。试剂盒包括血清/血浆LncRNA引物(包括下列引物ENST00000449605.1的引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；ENST00000505175.1的引物为SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6)，还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl₂，去核酸酶水，荧光染料或探针、Taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的线虫LncR-39样本等)及正常参考值。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光或探针法检测LncRNA的变化趋势，再通过该趋势辅助早期诊断ICP，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断。

实施例8用于ICP辅助早期诊断的LncRNA试剂盒的制作

LncRNA试剂盒的制作和操作流程是基于Human LncRNA Array v4芯片检测，RT-PCR和QPCR等技术。试剂盒包括血清/血浆LncRNA引物(包括下列任意一组引物ENST00000449605.1的引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；ASO3480的引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；ENST00000505175.1的引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)，还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl₂，去核酸酶水，荧光染料或探针、Taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的线虫LncR-39样本等)及正常参考值。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光或探针法检测LncRNA的变化趋势，再通过该趋势辅助早期诊断ICP，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断。

序列表

<110> 无锡市妇幼保健院

<120> 血清/血浆LncRNA标志物ENST00000449605.1及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caggctgggc aacatagtga 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctgggctca aacgatgct 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgatggctg gcagtgctc 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccatgttgag gcagcacatc 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggccagtgac cttgacctt 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgctgcctc ttatgctcac 20

<210> 7

<211> 7619

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 7

ggggaggaga gaaaaactgt gggacctagt gaaggatgta ggagaaagtt gttatcattg 60

ttttagcaat aggagaattg tgtgcatgtt tttggtgcta atggaaagga cccgagataa 120

aataattgag ggaagagatg ggagccaggg cacgatagag ccttcattaa gagggatgcc 180

ctttctaaga ggaggaaaaa tggatgcaag catagttgtc atggttttga tagagaacct 240

catgtggctg tccatcaaac atcacttgag tcataggtgt ctagaacact attttgcacc 300

ttagaaatat ttgaatagac accttagaaa tctttgctga gtaagacaga ttcctcgcat 360

agctgcaaga agcttagcca aacccatttc taaattaaaa ctaccagcaa agaggtactt 420

gagtaatagg cacagggtgc tcagctctgg gctaatagca ttgaatgtcc tgatttttag 480

aatgttctgt gcttaacttc tcaggcaaca caggctgaag tataagagtt gaagggattt 540

agaataagtc attgtttcat taaaaattat ttttggctga aggagaaata agatttggat 600

ggggacacag ctaaatcata tcatatacca tcttaattgg ggatggtatt tttttttttt 660

cttgagacag agtctttctc atgctattct cgtgatagtg aataagtctc atgagatctg 720

atggttttat aaagggatct tctcctgtac atgctgtctt gcctgccacc atgtaagaca 780

tgcctttgct cttccttcac attctgccat gattgtgagg ccttccccag ccatatggaa 840

ctgtgagtcc attaaacctc tttcctttat aaattaccca gtctgtccat taaacctctt 900

tcctttataa attatccagt ctcaggtgtg tttttattag cagcatgaaa atggactaat 960

acagtgtata agccccaaat tctaaccacc tccttgagtc acatttcctt gtgaatttcc 1020

atgccaacca acataattaa atgttgctgt ctcttgtgaa tctgtctttt atcagtttaa 1080

tttacagggc tccaagaaaa gaaccaaaga gggcagagga acagtttttc ctctctgaca 1140

gaataaaagg gcatgatgtt tgaagcttac ttccaaatgg ttctgagaga atgagctaat 1200

agagcaaatg tagcaaaaca ttaacaattg ttgaatctgg gtgaaggatt tgagggagtt 1260

tttggtactg ttcttgaaac ttttttttga aattatttca aaataaaatt atttttaaaa 1320

gaagaataag cttctgcatt tattcatcac ctctgctttt tttttttact ctatttccac 1380

tttcaacact tttttactca caacttccta tgagtggaaa ggatgaggaa tttgaaagac 1440

agggctgcct tttgggtttg tgcaaaatct ctgtgtctta atttgtctat ctgtaaaatg 1500

aggataatat cttcaaacgt ttgctacatg aactgagatg aggatacagt aggccctcaa 1560

taaatgttat tgcctaccct tctaagacca gttcaagtcc tatttccttt attaagtctt 1620

ccctcatcac atccatgata aaaatttatt ttatatcgta ccatacattt agctaaatgg 1680

ctttctcata cattacctca ttgaattatc ccaataacct tacaagttag gttatcattt 1740

tctctacatc atagataagg acatttaatg aagttaaaag atttggctaa aatcacacag 1800

tcggtcaata gaaataacag aatgaaaact caggttcttt tagccccaag ttgtatcctc 1860

tatgttatac cacaatttga tatttctcct actcaagtgt tttaagtgtg gtaagaatat 1920

acataacata aaatttacta tgttaacaat tttaaaatgc actgtttagt ggcattaagt 1980

actttcacgt tgttatgcaa ccactatcca tcactagaac tttttcatct tgcaaaaact 2040

gaaattctgt accatttcaa caccaactcc ccactcctcc cttcccccca gcccctggta 2100

accaccattc tactttctgt ctctatgaat ttgactgctg tagatataag tggaatcagg 2160

cctggtgtgg tggctcacac ctgtaattgc agcactctgg gaggccaagg cgggagggtt 2220

gcttgagctc aggagtttga gaccaggctg ggcaacatag tgagacctgt tgtctacaaa 2280

aaaattaaaa aattagctgg aagtggtggt gcatacctgt agtcccagct acttgggagg 2340

ctaaggcagg agcatcgttt gagcccagga ggtcaaggct gcagtgagct gtgatggcgc 2400

cactgcactc cagtctgggc aacagagcaa gaccctgcct caaaataaaa taaaataggc 2460

caggcgtggt ggctcacacc tgtaatccca gcattttggg aggccgaggt gggtggatca 2520

cctgaggtca gatgtttgac caacatgctg aaaccccatc tctattagaa atacaaaaaa 2580

aaaattatcc gggtgtggtg gcgggagtct gtagtctcag ctattcggga ggatgaggca 2640

agagaatcgc ttgaacctag gaagtgcagg ttgaagtgag ccaaaatcag gctacagcac 2700

tccagcctgg gcaacaagag caaaactcca tctcaaaaaa taaataaata aaataaaata 2760

aaaatttaaa actaaaaaat aattatacaa aaagggaatc atacagtatt tgtccttttg 2820

tgattggctg attccactta gcacgatgtc ctcaaggttc atttatgctg tagcatgtgt 2880

cttaagtttt ataaacactt gtgctcatgg cactcatgta caacttcgtg tgtccttatt 2940

ttctttcctg gtttataaac tccttggggg ctgaaatccc atgctttctc ttggtattgc 3000

cacgctcata gtgcctcgtt cataacagtg cccaatgaac tctcttgaat gggtagatac 3060

aggccactct aaagtagaaa acgatccctc tcctatactt gatgaaactt gtatacagtt 3120

tcatcactgc tgtcagctat tggagacaag gagctggaca agcataattg ttctccctac 3180

tattgaaacg ggagccagac gaattaagaa gattccccag gttggaagta tgacaggcag 3240

gtgaacttta gtcaagtaga attagctctc tgcccagtgt aaaaacgtat atgcagtatt 3300

cttcaaagag gaaaaaatct catcttttag tcatatgaag tgagagagag tttggtcgtg 3360

gctttttttt tttttttttt ttccctgaga aaaagaaatg agatctgtca agactgaact 3420

ttgcaggaga gaaatcatca atctttggtg tcatctgagt gcattggaaa tgcatttgcc 3480

ttgtcttgcg gtttgattgt tgtctaatcc ctgtaaacat taaaggataa aaacaggaga 3540

aatggaacaa gaaatatgtg ggatccaggt tttagctgtg ctgcccgctg gtgactttcg 3600

aggtgaagct ttcaggtccc ttctccctag cacacccatg cctccacctc tatgaagcaa 3660

tagagcttca agggcaaatc tggcctcaga gcccagaggg gaatatggcc acatcaggga 3720

ccaccccagg agactcaaag gcctgcatct ctttgtcttg caggagttgc tgctggacca 3780

catgacacca gtcccattct tgaagcagaa tgttcaaaga gtgtgtacaa aatgcagaag 3840

ccacccattt ccaagaaaaa cggctatgct tcaaccagcc taagtctact gcaagcaagg 3900

gcacccataa gagatggacc ttgagggatt caacctaact aactgtgagt aaggacgtct 3960

agcacatttt ggagagtact ggtatgagac agattccaaa taaaataacc ggaggcaggc 4020

tgggtgcagt ggctcatgcc tataatccca gctcttaggg aggcagaggc aggaggatag 4080

cttgagccca ggagttcgag acttgcctgg gcaatgtagc aagaccccat tctctacaaa 4140

aaggaaaaaa acaaacaaac aacaacaaca aaaaaaaaaa aacaagaaat aactctaggc 4200

agcctgtaac atactaaatt atttcccatt agcacattag cacataaaca ccattagcac 4260

atctttttga atatgtaagg tctgtggaga taagactaca cacaggatct caaagaatct 4320

cccttactaa gggggaaatc aagttggctt ttatcctagc aacttactta agccttaaca 4380

tacttacaat tgttttacat agtatataat atttcccata cttgattgtg tttcttaagt 4440

ttcattttta attttcaaat caaaacagga aatatgggct gggcacagtg tcccacactc 4500

tcagcacttt gggaggatag cttgaggcca agagatcaag accagtctgg gcaacatagc 4560

aagactctgc ctctacaaaa tttttttaat tagccaagca tggtggcatg catctgtagt 4620

cccagctact cgggaggctg aggcaggatt gcctgagccc tggagttcga tactgcagtg 4680

agctaggatc ataccaacat gctccagcct gagtgagaga ggaggacccc gtctcaaaaa 4740

actgtcaaaa aaaaaaaaaa aaacagaaaa tatagagaag aggtagctat ttagaatgct 4800

tgtagaactt ttgtaacatt actgtttttt agactgagga acattctcca aaaatatgat 4860

tttgcacaca cttttgattg cctaaccaaa agtcatttct ctctctcttt cccttctggc 4920

agggcctgct tcccataaga agggctaaaa atgccagaca ctctctttca gcctcttttg 4980

caggtagggc tggccacatg acccatctgg tcaaattaac ctttcagcca caccctccca 5040

aaaggctttt agaaagattt ttcatggtaa tgaaaacaac agatattcaa ggagagcttt 5100

ttttccccac ctcttccttc ctgacatttc ataggcattt catttcatgg gagctatgga 5160

agctatattg cagccattaa gcagtagaca aagcgaacgt gctgaggatg gcaacaaaca 5220

gggatggaaa gaacctggat cactgatgat gacactgttt agcttgggac catcaccttc 5280

tgtattagtc agggttctct agagggagag aactaataag atttatatat atatacataa 5340

aggggagtta attaagtatt aactcacaca atcaagaggt cccacaacag gcggtctgca 5400

atctgaggag aaaggagagc cagtccgagt cccaaaactg aagaactggg agtccgatgt 5460

ttgagggcag gaagcatcca acacgggaga aggatgtagg ctgggaggct aggcaagtct 5520

agtcttttca catttttctg cctgctttat attctaccca tgctggcagc tgattagatg 5580

gtgcccaccc agattaaggg tgggtctgcc tttcccagtc cactgactca aatgttaatc 5640

tcctttggca acaccctcac agacacactc aggatcaatg ctttgcatcc ttcaatccaa 5700

tcaagttgac actcagtatt aaccatcaca cgttctaaac accttattat gtaaaatgat 5760

acaatcctgt tggatatgcc accttttttt gaaacagggt ctcaccctgt tgcccaggct 5820

acagtgcaat ggcatgatca cggctcactg cagcttcaaa ctcctgggct caaagtgatc 5880

ctcccatgtc agcctcctga gtagctggaa ccacaggcat gtgccaccat gcctagctaa 5940

tttttttttt agagagagac aggctcttgc tatgttgccc aggctggtct cgaactcctg 6000

ggctcaagtg atcctcctgc ctcagcatcc caaactcctg ggattttagg catgtggagc 6060

cattgtgcgt ggctggatat tgtttttacc acttttagct ggatattgtt attcacagct 6120

gaaagcacct taacatattc aatgcgattt taaatacagt ccaagtggaa cctattttac 6180

accaaatatt gactaacttt ctgtcagaca ttggaaggcc atgttcctaa acataagcat 6240

atgagaaaat ccttgtaatg atgagataaa gggagtttgc cagtttaaac acccgcgggt 6300

tgccctggca aatgtcaggt gtcacagggt cggaaagatt agttcataat gtactaggaa 6360

aaacatcctg caatgtatat gaaaatatat attgtaaaaa atctttttgg ctaaatgtat 6420

tggcacgatt attagaatac aatctagaaa catttacttt aaattttaag agcaaagaca 6480

agacttctaa tcttaattag tcaaagtttt tcttaaggat ttcaattcaa atgtgtcctt 6540

tattctgatt gtgatgggac ttttgatttc tcctatttga aatgccatgt gaatgtctta 6600

gaaaacccag acatctgacc ttatatttta cttgataaat tgaaaaagcc acttgctgat 6660

aaaattttgt tattcacagg tattacatga gtgaattcat ttttctactt gctagttttc 6720

tagacaacta tcttcattaa aattttagat tactgtaatt tacatggagt tcacacattc 6780

aatttacaga tttagaatac ttaatcaatt gatgtccatt ttattttttc atttagttgc 6840

tgagataaga catccatttt tctcaaaatg tatcagatca agctaaaaaa aaagaaatga 6900

aattaatatg aaaatatcta ttaaaggaca tcagtgtcca agctcaccat cctttctaac 6960

tatctttcat ctgaacatag tcagggctta tacaatagaa ttaaatatac catcccagag 7020

gacacctggc agtgtccaga gacatttttg gttgtcacaa catggaggcg cagtgccact 7080

ggcatccttg gtagaggaca aggatgctgc tacacatccc acagtgcaca ggacaacccc 7140

cacagcaaag aatgctccag cccaaaatgt caatagtgcc agggttaaga aaccctgttc 7200

tacaccaagc accttgatgt ctaaaataca acacaaactg gttctttgtt cattagaatt 7260

cctacagagg aaagaataga ttactatcat tttacagtca tctcaacaat tgaagtcagg 7320

agaagccttg attcttataa actgcaaaac attagtttga agtctagttt gtaggtatca 7380

tttgttttct atgaggaatt ccttcttttg atgttatatt ttctttcatt caaagacagg 7440

acttacatga gccttccttt ctgctgttcc ttttcttaaa aaaaaatgtc ttatggctgg 7500

gtgcagtggc tcatgcccgt aatctcagca ctttgggagg ccaaggcagg cggatcacct 7560

gaggtcagga gtttgagacc agcctgccca acatggtgaa accctgtctc tacgaaaaa 7619

<210> 8

<211> 5168

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 8

cccgcaggca tcgggccaat ctcagagggc gcgcacgccg catcaggacc ccggaacccg 60

ccccgttggg gatagggaca gatggagaat ccagctcaga cccagcaact ctgagctgac 120

ttggatctaa ttcttcccaa ttcatgccac aagcccaact catcagctga tacctgagga 180

tgatccactg ctcactgagc gtggtcaggg agcgccgctg tcggacgagc atcttcatca 240

aatgtgctga gaaccctctg cacctctcca cgttgcccat gcccatttcc tggcagaaga 300

aggaaaaaca tgctgaaggg gctgctgaca aacatcaccc acagatgtgc ctctagaaag 360

ctgtttctac tataagcgtc agacatgcca cactctagag atttctgttc agcaaagacc 420

agagctcact ctatcccaaa cacaggactg tgtgtcagtg aacaagtaaa acaagtctaa 480

aaaagaaacc atgggctagg cgcggtggct cacacctgta atcccagcac tttgggaggc 540

caaggtgggc ggaatcacaa ggggggaacg aagttccaca attttggcct ggacccggtc 600

aaagaattgc ttgtaataat ggtacaaatt ccatagaaca ctgcaaagtg aatctggaag 660

aaatgaaaag gaaacaaaaa taccacactt gctgcatgtg ctactggtgc cagctgtggc 720

cttcatattt cagtgatgac ccttcctcat tactctctat gccatgagat tacagtgagt 780

ttcacaggtg cattatttag ggatcctgtc tgagtttagc atttcccaga gatgcaggct 840

gtcaacactc ccctattttt cacttctgct tgtaacagat gtttttttgc acttttgttc 900

ttgaagatga tgtactccta ggttcttcta aaatcacaat gtcaaattcc ttctgtgaaa 960

cttattgtaa aatcagcaga aactgagctt tttttaaaag atggcatatt aagcagttca 1020

cctcaaatgc tcattcatgt acaatctata ctcatcttgt agtgagactt ttatcccagt 1080

tgctgtgatc agggatagta cttgacagcg ggcagtttta gatgcagttc cttgatggct 1140

ggcagtgctc tcactggatg aaagaaacta ataatggcct ggatcaagga gcagcttagc 1200

aggacattta caatgtctag acagagagat gtgctgcctc aacatggtag gtcctgagat 1260

cttcatctgg caatttacct ctgccagagc tcactagtca gtactaaact tataaccatc 1320

tgcacctcac tttgaatgtt cttctctata tctaatgtga atcgcattaa acataactaa 1380

atgtgtcttg tttaaaacct agcgtgcaac aaggcacctg tctcatgcag agaattcaaa 1440

gcctaactca ttttagtcgt gcaatgtcaa aggaaaggaa aaaaaaatcc tcaccccttc 1500

cttcaacctg tggcatcagc aagacatgac aatggaaaac cagtaacatc tgaagtcgca 1560

catggaactc tcccagcgag gatccttcaa taaatgcttg taatgtgctg accagcaaca 1620

tcaaggtcat ctgtttgtca tctttaaaaa ttcaaagaga aaaatatata tgttccttcg 1680

accatgactc cctattccta acatgcacgc aatctatttg ggatactacg gatggccaag 1740

aggtagacat cacaatgtga agctctcaag caaggaccat ggctaaattc taagctgatt 1800

taaaagtaac aggccggtgt ggtggctcac gcctgtaatc ccagcactct gggaggccaa 1860

ggcgggcaga tcatttgagg tcaggagttc aaaaccagcc ttgccaacat ggtgaaacct 1920

cgtgtctact aaaaatacaa aaattagaca ggcatggtgt tgggcaccgg taatcccagc 1980

tactgagaag gctgaagtag gagagtcact tgagcctggg aggcggagat tgcagggagc 2040

tgagatcgta ccactgtact ccagcctggg caacagagca ggactctgtc tcaaaaaaaa 2100

ataaaaaaca aatataaata aataaataaa agtagcagct gcacatagag catgtgttaa 2160

atgcactcac agcaaattat gaaaatgaat tataaggtgc ttgtcacaag tataaaataa 2220

aagactgttc attcaagcat gttggctact acctaccaaa aagtcagctt tcagtttgac 2280

ttctatcatg gacatagaga agacggaaac cttatcctac gactggttct ctagactttt 2340

ggagaagaca tttaaacctc tcacactttt gttattattc tctcagttag ataagcacga 2400

tttgcagttt tcttggctga cctctcagaa atatcatgaa gtcaaatggg aggcattccc 2460

atgaaagcca tgtagcggga gaagcgggag caggaaaatc ctacactttg cagcactcca 2520

tttagccggg aagctctaag tgggcaggaa atgtactgct aggcattacc ttcctgttct 2580

tctgtttgtt cctgcatgtg cttctcaagc atctgataga tggagaacca gtgcttggtg 2640

gatttctcgg tgtggcgctt catagtatta tccaaactca tggaccagca gctgaaacga 2700

gaagaagcca aggaggcatt taggaaaacc tatttgaaat atctgaaacc aaagatgcag 2760

aagctacatg ctcacatttc tctcctccca aatggagatg gaggagccac ccagtttcct 2820

ccctcaagaa tatatgctgt tgtctggact gtattcaggt cattttaatg ccctactttt 2880

aactctgtga ttaataactg aaaagcacat tctgtagctg taatactata taaatcctaa 2940

agaaatttaa actaccaaaa gacaaaagcc cttacaacct aagtttagga gagggaagga 3000

gagtcactta cttcagctcc agtttacgcc accgaatgat catctgactg atcaaatcaa 3060

gatgtttccg caaagacaaa gctcgacttg cattttcctc ccaatcctaa agaaacaaag 3120

ataaaattta ctacagatat tattcaatgc cataatcacc tccttcctca agaacatctt 3180

gaactttgct tgagtgaaga ctactgggcc cttaaacaac ttgcaccaat tgtaggaatg 3240

aatttacagt gtatcagctt caagttcttt ctgttcacat gacagaactc caccagagcc 3300

aagtttagag gctggcaaaa aagcacagtg tttatagact ggagcctgaa ttcgtgctct 3360

ttgctatctg acctagaaca aagacatgcg gcccttttct gtccaatggg gaggcaacag 3420

ctaacttaga ggccatgagg gcactgaggg gaaccgtgta tgtgggcact cagttggaat 3480

gaaggcccac ctggaaggct gggaggagtg caccctcatt accggtagat actgcatccc 3540

actggataaa aggcaaggca gctagccctc accacagggg caacagcctc acttgcaatg 3600

atctcacccc atgccagaaa aaccaaggat gtttaccttt ttctagccca aactataatt 3660

ttctgtctaa caacaaaggt gccacaagac gtatcttttg ccaactgacc accaactaaa 3720

atgaggaaga gaggtattag ctcacctgtg cctttgccag aaggatctct aagccattca 3780

ggaactttga gatgggactg gaaagtggga aactacgaat tctgtccatt acaaccagga 3840

gctgcagaaa taaagatttg ggtatctcag taggaatacc agtgatccta agtcacaggg 3900

tactgaagag agtcctgacc agaagattcc ccccagttct ctacttttaa aacacctctg 3960

aaaaaaaaaa cagagcaaca tggcagcatt ttattatgtg gtcagcaact cctgaccaac 4020

aaataaaatt aacagaatcc ccaatcattt acacaagaga aatacaaaac tggtgtgttc 4080

atcctgcagt tagtaagtaa catctcattg aactgcagtt ctttaagcct ttgtttatat 4140

gtatatatgt gcaagtgggt gcccccaggg ataatggtga ggctgcatcc tcattgcaga 4200

ctcagtactg tgagcactcc ttcctcaaca gctgccctac ctgttcaagc gctgggtgtt 4260

ctggccagtc ctgtagcaag tgactgacag cctctgagaa accttgaagc acaggttgac 4320

actgccgtgc ttctggaaca ttgtgatgct ggtagaagtc atagggccca tcaggtttca 4380

ccatcaggtc tgagggtgcc tccccaaaaa gagtgttatg ggagagggta caggccaaaa 4440

gttggctgcc caagagtcgg tcattcagtt caactcctgt gaggttaaca tcacggtaaa 4500

gtcagtgaat tcagtaagtt gatctatcaa catgtcaaaa agatgtcagc aacagggcca 4560

ggtgcagtgg ctcatgtctg taatcccagc actttgggga gccgaggcag gcagattgct 4620

tgaggccagg agtttgagac catcctggcc aacatggtga aacctctttt ctactaaaaa 4680

tacaaacatt agccagacat gcatgtgcct gtaatcccag cttcttgcgg gcctgaggca 4740

caagaattgc ttgaacctgg gaggcagaga ttgcagtgag ctgagattgt gccactgcac 4800

tccagcctga gaaacagagc atcagcaaca tcagcaacaa tgaactaatt gggactaatg 4860

aatgctattc tcccctaaag caacattggc ctagagaact gtaatcctaa tactatagta 4920

gctacctaaa gctctcaagt ttctggaatg tgcagaggaa gtcagaaact gcctaggtat 4980

aaacaaatgg tgtaggggtt aactcagtgc atccaaattc ccagttttta tacctattct 5040

aggtaaacag aaaggaaact taaagcctcc ttcctacttc tatgaaataa tgccaagaaa 5100

tcatgtagga aactgcaatg aaccaactat taaaccatat tctacaagaa aaaaaaaaaa 5160

aaaaaaaa 5168

<210> 9

<211> 432

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 9

acatgtcaac aacatcaaca aatagaaagc attcctccat tcatcactcc ttctgggaag 60

aagtagacta agaggtaaga agcaactaat ttttcatggg atttgaaact aagtaggtga 120

atctgaagtc tgcgctgctt ccattccatc ccattgtctc ttctgaggga gaaagcttct 180

aagggagaaa gcctttgggg cttgctggtg atctttttct acacaaaaag ttttcaaaca 240

aaaggaacaa aagaagccag agtctttaga gtacacactc cgtacttcca ttaaataaat 300

ttcaacaaca ggtcaaagca tgtatcttgc aaccttcttt gaataaggct cagtgcaaag 360

ctggggccag tgaccttgac cttccttcat ccctatctat caaggatttt ttgtgagcat 420

aagaggcagc aa 432

Claims (4)

1.血清/血浆LncRNA标志物 ENST00000449605.1作为检测靶标在制备妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断试剂盒中的应用; ENST00000449605.1的cDNA序列如SEQ ID No.7所示。

2.检测血清/血浆LncRNA标志物ENST00000449605.1的试剂在制备妊娠期肝内胆汁淤积症辅助诊断试剂盒中的应用,ENST00000449605.1的cDNA序列如SEQ ID No.7所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的检测血清/血浆LncRNA标志物ENST00000449605.1的试剂为检测ENST00000449605.1的引物。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于检测ENST00000449605.1的引物如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示。

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