CN114381508A - 与icp辅助诊断相关的血清/血浆外泌体标志物及其应用 - Google Patents

与icp辅助诊断相关的血清/血浆外泌体标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与ICP辅助诊断相关的血清/血浆外泌体标志物及其应用。与ICP辅助诊断相关的血清/血浆外泌体miRNA标志物，由hsa‑miR‑6891‑5p组成。所述的血清/血浆外泌体miRNA标志物hsa‑miR‑6891‑5p的引物。所述的引物在制备ICP辅助诊断试剂盒中的应用。发明人通过分离和研究初产、单胎妊娠的ICP病例和与其年龄匹配的健康孕妇对照血清/血浆外泌体中的miRNAs，寻找与ICP发病高度相关的高特异性和敏感性的外泌体miRNAs，并研制出可便于临床应用的ICP辅助诊断试剂盒，为ICP的筛查和诊断治疗提供实验室支持。

Description

与ICP辅助诊断相关的血清/血浆外泌体标志物及其应用
发明领域
本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及与ICP辅助诊断相关的血清/血浆外泌体标志物及其应用。
背景技术
妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)是一种发生在妊娠中晚期的妊娠期特发性肝病。ICP发病率为6％-12％，因种族和地域的不同而发生变化。ICP虽然对母体伤害较小，但对胎儿危害较大。有研究表明，ICP可引起胎儿宫内窘迫、自发性早产、死胎等多种不良妊娠结局，其导致的围产儿死亡率约为正常妊娠者的6-10倍。然而迄今为止，ICP的发病机制尚未完全明确。如何有效早期诊断、早期干预及合理治疗ICP一直是围生医学领域面临的严峻挑战之一。目前临床上对ICP疾病的诊断主要依赖于血清总胆汁酸(total bile acids,TBAs)水平的升高和不明原因的皮肤瘙痒，其灵敏性及特异性均较低，无法实现早期预警和有效监控。因此，探究ICP发生的早期敏感分子事件，寻找易感生物标志物(susceptible biomarker)可为ICP的早期诊断和实施干预提供有效手段，对于促进人类母婴健康具有重大的科学意义。
外泌体(exosome)是细胞外囊泡的一个子集，是一种脂质双分子层包裹的小囊泡，直径约30-150nm，密度约为1.13-1.21g/ml，形状为球形、扁球形或杯状结构。外泌体存在于血清、尿液、唾液及胸腔积液等多种体液。作为分子诊断标志物，外泌体具有天然优势，其内的核酸物质可被外泌体包裹，防止降解。另外，外泌体的形成过程与母细胞关系密切，导致外泌体内分子标志物比传统的分子标志物特异性更高。MicroRNAs(即miRNAs)是近年来分子生物学研究领域的另一个热点，它的成熟状态是一类长约18-24个核苷酸的小非编码单链RNA分子，进化上具有高度保守性。miRNA的主要功能是调节生物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达。近年来，miRNA与疾病的关系已经成为研究的热点和重点，且miRNA已被证实可以作为多种妊娠期并发症的诊断和预后标志物。
外泌体的膜性囊泡结构具有保护miRNA的作用，使miRNA可以免受RNA酶和胰蛋白酶等分解作用，保证其稳定存在于外周血中。研究已经证实血清/血浆外泌体中存在几百种的miRNAs，这些小分子RNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性。现有的成熟的技术，包括外泌体的提取和定量检测miRNA分子的技术，表明利用血清外泌体miRNAs作为分子生物标志物的方法比传统的特异蛋白分子标记方法更加稳定且有效，为生物标志物开拓了新境界。
然而，目前还没有用于ICP辅助诊断的较为稳定的分子生物标志物的报道，若能筛选出ICP特异或异常表达的血清/血浆外泌体miRNAs作为生物标志物，并研制相应的辅助诊断试剂盒，将极大改善我国ICP的诊断现状，具有非常广阔的临床应用前景。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出与ICP辅助诊断相关的血清/血浆外泌体miRNA标志物has-miR-6891-5p。
本发明的第二个目的是提供上述血清/血浆外泌体miRNA标志物has-miR-6891-5p的引物。
本发明的第三个目的是提供上述血清/血浆外泌体miRNA标志物has-miR-6891-5p及其检测试剂在制备ICP辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明第四个目的是提供用于ICP辅助诊断的试剂盒。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
hsa-miR-6891-5p(uaaggagggggaugagggg,https://www.mirbase.org/cgi-bin/mature.pl？mature_acc＝MIMAT0027682)作为检测靶标在制备妊娠期肝内胆汁淤积症血清/血浆外泌体辅助诊断试剂盒中的应用。
定量检测hsa-miR-6891-5p的试剂在制备妊娠期肝内胆汁淤积症血清/血浆外泌体辅助诊断试剂盒中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的定量检测hsa-miR-6891-5p的试剂为检测hsa-miR-6891-5p的特异性引物和/或探针。
作为本发明的进一步优选，所述的定量检测hsa-miR-6891-5p的试剂为检测hsa-miR-6891-5p的特异性引物。
作为本发明的更进一步优选，所述的hsa-miR-6891-5p的特异性引物序列如SEQID No.1和SEQ ID No.2所示。
hsa-miR-6891-5p的特异性引物，如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
正向引物为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACcccctc(SEQ IDNo.1)；
反向引物为：ATAAGGAGGGGGATGAGG(SEQ ID No.2)。
一种妊娠期肝内胆汁淤积症血清/血浆外泌体辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有定量检测血清/血浆外泌体中hsa-miR-6891-5p的试剂。
作为本发明的一种优选，该试剂盒含有本发明所述的引物。
作为本发明的一种优选，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂。
本发明的发明点在于发现血清/血浆外泌体中hsa-miR-6891-5p可以作为ICP辅助诊断相关的血清/血浆分子标志物。
具体地说，本发明血清/血浆外泌体miRNA标志物hsa-miR-6891-5p通过以下方法筛选得到：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)血清/血浆外泌体miRNA差异表达谱分析：选择ICP病例、与ICP病例年龄匹配的健康女性对照，提取ICP病例及对照血清/血浆中的外泌体，检测血清外泌体中miRNA表达谱及含量，分析ICP病例和健康女性对照间血清/血浆外泌体miRNA的共性和特性，筛选差异表达miRNAs，进行进一步多阶段验证。(3)筛选疾病特异血清/血浆外泌体miRNAs：对已筛选的血清/血浆外泌体差异表达miRNAs在大样本人群中进行定量分析，确定ICP特异性血清/血浆外泌体miRNAs。
本发明的有益效果：
本发明提供的血清/血浆外泌体微小核糖核酸(microRNAs/miRNAs)标志物hsa-miR-6891-5p作为ICP诊断的标志物的优越性在于：
本发明以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液，系统收集完整的人口学资料、临床资料等(这些资料可用于判断疾病进展，患者年龄等因素对于发病的影响)，并采用Agilent miRNA芯片法，通过研究初产、单胎妊娠的ICP病例和与其年龄匹配的健康孕妇对照血清/血浆外泌体中的miRNAs的变化，寻找与ICP发病高度相关的高特异性和敏感性的外泌体miRNAs，多因素Logistic回归分析结果表明，hsa-miR-6891-5p与ICP的发病存在着显著关联，其ROC如附图1所示：hsa-miR-6891-5p的AUC为0.838，可为ICP的筛查和诊断治疗提供实验室支持。
本发明初期采用Agilent miRNA芯片检测获取疾病特异和异常表达的血清/血浆外泌体miRNAs表达谱，并应用qRT-PCR的方法在大样本中通过荧光染料法进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了血清/血浆外泌体miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过控制年龄等对疾病发展的影响因素，研究血清/血浆外泌体miRNA标志物hsa-miR-6891-5p在ICP诊断的应用前景，阐述异常表达的外泌体hsa-miR-6891-5p对于ICP进展的影响，揭示其对ICP的诊断价值。因此，本发明获得了ICP发病特异性血清/血浆外泌体miRNAs表达数据库和特异性标志物；通过血清/血浆外泌体miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得ICP的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确诊断ICP及采取治疗措施奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1血清外泌体hsa-miR-6891-5p对ICP的诊断价值。
具体实施方式
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2019年12月至2021年3月从南京医科大学附属无锡妇幼保健院收集了大量ICP患者及健康对照孕妇的外周血样品(用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一)，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了107例符合下列标准的样本作为Agilent miRNA芯片检测和后续一系列qRT-PCR验证的实验样品：
(1)纳入病例组：ICP诊断标准参照ICP患者诊疗指南(第一版)，具体标准如下：1)妊娠中晚期出现皮肤瘙痒，或伴有不同程度的黄疸；2)实验室检查：血清总胆汁酸(TBA)增高(>40μmol/L)，或伴转氨酶(ALT及AST)轻到中度升高，可伴胆红素升高；3)妊娠是引起皮肤瘙痒和生化异常的唯一原因；4)患者一般情况良好，无明显呕吐、食欲不佳、虚弱及其他疾病症状；5)分娩后上述症状、体征、血清生化指标迅速恢复正常。收集临床资料完整的ICP患者59例。
(2)纳入正常对照组：无妊娠并发症及合并症，剖宫产指征为臀位、骨盆异常和社会因素等，收集临床资料完整的正常孕妇48例。
(3)两组排除标准：1)患其它肝胆疾病；2)有其它妊娠并发症如妊娠期高血压疾病或有不能用ICP解释的血、尿或生化异常；3)有全身疾病如糖尿病、高血压、精神及神经疾病等；4)患有遗传性或免疫性疾病；5)有输血、移植或免疫治疗史者；6)有口服避孕药史者。
本研究共采用107例符合标准的样本进行研究，并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况。
实施例2血清/血浆外泌体中Agilent miRNA芯片检测
将上述符合条件的3例ICP病例和3例健康对照经Agilent miRNA芯片检测，研究结果初步筛选发现2个血清外泌体miRNAs上调、7个血清外泌体miRNAs下调，其中包括hsa-miR-6891-5p。具体步骤为：
1、提取血清/血浆中的外泌体：
(1)分别取“妊娠期肝内胆汁淤积症病例”组和“健康女性对照”组患者的血清4mL，在4℃，500g条件下离心5min；
(2)将离心后的血清在4℃，2000g条件下继续离心30min；
(3)加入与血清相等体积的分离试剂，颠倒充分混匀后，在4℃冰箱过夜；
(4)将过夜后的血清在4℃，3214g条件下离心1h；
(5)弃上清，加入50-500ul PBS(PH7.4)重悬，所得溶液即为血清外泌体。
2、Trizol法提取外泌体中的总RNA
(1)将步骤1提取到的外泌体加入适量Trizol(2mL)，混匀室温静置5min；
(2)加入Trizol 1/5体积的氯仿，涡旋混匀，室温放置5min；
(3)将混合后的样品在4℃，16000g条件下离心15min，吸上清到新的EP管里，注意不要吸到水相和有机相分界面的杂质，一般1mL Trizol吸400μL上清；
(4)向上清加入等体积异丙醇，涡旋混匀，-20℃静置1h；
(5)将沉淀后的样品在4℃，16000g条件下离心15min，可以看到RNA沉淀到管底；
(6)吸弃上清，向沉淀加入1mL 75％的用DEPC水配置的乙醇，轻轻涡旋，让沉淀漂起，4℃，16000g离心15min；
(7)倾倒并吸弃上清，将EP管倒扣在吸水纸上晾干沉淀15-20min后，加入适量DEPC水溶解沉淀。可在室温或37℃温浴5min。轻轻涡旋混匀后，测RNA浓度和纯度，RNA可在-80℃冰箱中保存。
3、总RNA的去磷酸化及标记和杂交：
取200ng纯化后总RNA进行实验。使用Agilent公司的miRNA Complete Labelingand Hyb Kit，主要步骤包括：
(1)在一个新的无RNase的Ep管中，加入100ng total RNA，体积2μL；
(2)配制CIP Master Mix(0.4μL的10×碱性磷酸酶缓冲液，1.1μL的预先稀释的Labeling spike-in RNA，0.5μL碱性磷酸酶)。在每份100ng total RNA中，加入2μL CIPMaster Mix，轻轻吹吸混匀，37℃温育30min。这一去磷酸化过程，在碱性磷酸酶(CIP)的作用下去除RNA 5’端磷酸基团；
(3)在每个样品管中加入2.8μL 100％DMSO，混匀。100℃作用10min，以去除磷酸酶活性。然后转到冰浴；
(4)配制Ligation Master Mix(1μL的10×T4 RNA ligase buffer，3μL的Cyanine3-pCP，0.5μL T4 RNA ligase)，在上一步磷酸酶处理后的RNA样品中加入4.5μLLigation Master Mix，轻轻吹吸混匀，16℃孵育2h。这一标记反应过程，在T4 RNA ligase作用下将Cyanine3-pCp连接到RNA3’端；
(5)将标记反应产物在真空浓缩仪中浓缩抽干，设定温度45℃，浓缩时间约3h；
(6)配制杂交体系(17μL的Labeled miRNA sample，1μL预先稀释的Hyb spike-in，4.5μL的10×GE Blocking Agent，22.5μL的2×HI-RPM Hybridization buffer)。其中标记并浓缩后的RNA产物，加水调至17μL，加入其他成分，轻轻吹吸混匀，100℃加热5min。然后转到冰浴；
(7)组装好杂交装置，将45μL杂交液加样至杂交盖片上，安放miRNA芯片，旋紧杂交装置；
(8)将杂交装置放在Agilent公司杂交炉中过夜杂交(约16h，20rpm)。
4、芯片清洗及扫描
(1)杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的洗液|中洗5min，而后在0.2×SSC的洗液Ⅱ中洗5min，玻片甩干后即可用于扫描；
(2)使用Agilent芯片扫描仪(G2565CA)对清洗后的芯片进行扫描，得到杂交图片。
5、数据提取及分析
(1)使用Agilent Feature Extraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取数据；
(2)然后使用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化；
(3)采用GeneSpring软件进行组间的差异分析，例如T-test方法进行两组差异表达基因分析；ANOVA方法进行多组差异表达基因分析。
实施例3血清/血浆外泌体中miRNA的qRT-PCR实验
选择Agilent miRNA芯片中两组研究对象的CT值均不大于35且在各组样本个体间表达信号相对均一的miRNAs用qRT-PCR方法进一步验证，以提高检测效率。满足上述条件的miRNAs为hsa-miR-6891-5p。选择hsa-miR-6891-5p设计逆转录和qRT-PCR的引物，在整个研究过程中均实施严格的质控。每个样本连续检测三次。所有检测均采用盲法，即在不清楚样本背景的情况下完成以避免偏倚。miRNA定量检测采用Sybrgreen荧光染料法。
1、提取血清/血浆中的外泌体，采用Trizol法提取外泌体中的总RNA，然后用分光光度计或Qubit方法定量，用琼脂糖凝胶电泳或Agilent2100等方法检测其完整性。
2、总RNA逆转录反应：采用颈环结构的MegaplexTM RNA逆转录引物混合物进行。逆转录反应体系的配制见下表:
Figure BDA0003383141050000071
逆转录反应：在PCR仪上16℃，10min；37℃,30min；65℃,5min。
3、定量PCR反应：
(1)外泌体miRNA RealTime PCR反应体系配制见下表：
Figure BDA0003383141050000072
Figure BDA0003383141050000081
(2)进行定量PCR反应。PCR仪器设置程序如下:
Figure BDA0003383141050000082
4、数据处理与分析
外泌体miRNA定量PCR检测数据采用比较CT(△△CT)方法计算基因相对表达差异倍数。两组样品血清外泌体miRNAs的相对表达量可用方程2–△△Ct表示，其中△Ct＝CT样本–CT内参(hsa-miR-U6作为内参，引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)。
本发明人通过Sybrgreen荧光染料法qRT-PCR检测59例ICP患者和48例健康对照组的血清外泌体hsa-miR-6891-5p的表达情况，并以此绘制ROC曲线。运用student t检验比较人口学特征，TBA(μmol/L)水平，血清/血浆外泌体hsa-miR-6891-5p平均表达水平(2–△△Ct)在研究对象组间分布的差异。统计学分析均应用SPSS22.0统计学分析软件完成。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验，结果见表1。
根据血清中外泌体miRNA的验证实验，本发明人检测到在“ICP病例”组(59例)和“健康女性对照”组(48例)的血清外泌体中hsa-miR-6891-5p表达存在显著差异(P<0.001)。多因素Logistic回归分析结果表明，hsa-miR-6891-5p与ICP的发病存在着显著关联，其ROC如附图1所示，hsa-miR-6891-5p的AUC为0.838，说明hsa-miR-6891-5p是与ICP发病高度相关的血清外泌体miRNA分子标志物，能够用于制备ICP辅助诊断试剂盒。
表1.ICP患者与正常对照血清外泌体miRNA检测结果比较
Figure BDA0003383141050000083
Figure BDA0003383141050000091
***P<0.001
实施例4用于ICP辅助早期诊断的外泌体miRNA试剂盒的制作
外泌体miRNA试剂盒的制作和操作流程是基于Agilent miRNA芯片检测，RT-PCR和real-time PCR等技术。试剂盒包括血清/血浆外泌体miRNA引物(hsa-miR-6891-5p的引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)，还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，去核酸酶水，荧光染料或探针、Taq酶、通用反向引物(URP：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.5))等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的线虫miR-39样本等)及正常参考值。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光或探针法检测外泌体miRNA的变化趋势，再通过该趋势辅助早期诊断ICP，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断。
序列表
<110> 无锡市妇幼保健院
<120> 与ICP辅助诊断相关的血清/血浆外泌体标志物及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccccctc 50
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ataaggaggg ggatgagg 18
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaaaata 50
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgaagcgttc catattttgt c 21
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgcagggtc cgaggt 16

Claims (9)

1.hsa-miR-6891-5p为检测靶标在制备妊娠期肝内胆汁淤积症血清/血浆外泌体辅助诊断试剂盒中的应用。
2.定量检测hsa-miR-6891-5p的试剂在制备妊娠期肝内胆汁淤积症血清/血浆外泌体辅助诊断试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的定量检测hsa-miR-6891-5p的试剂为检测hsa-miR-6891-5p的特异性引物和/或探针。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的定量检测hsa-miR-6891-5p的试剂为检测hsa-miR-6891-5p的特异性引物。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的hsa-miR-6891-5p的特异性引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
6.hsa-miR-6891-5p的特异性引物，其特征在于如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
7.一种妊娠期肝内胆汁淤积症血清/血浆外泌体辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有定量检测血清/血浆外泌体中hsa-miR-6891-5p的试剂。
8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求6所述的引物。
9.根据权利要求7所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂。
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