KR101758701B1

KR101758701B1 - 엑소좀과 세포주 유래 톨루엔 노출 여부 확인용 마이크로 ｒｎａ 및 이를 이용한 확인 방법

Info

Publication number: KR101758701B1
Application number: KR1020160029879A
Authority: KR
Inventors: 류재천; 임정희; 송미경; 조윤; 김웅
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2016-03-11
Filing date: 2016-03-11
Publication date: 2017-07-17

Abstract

본 발명은 마이크로 RNA를 이용한 톨루엔 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 톨루엔 노출에 의해 엑소좀 유래 마이크로 RNA와 세포주 유래 마이크로 RNA에서 공통적으로 발현수준이 1.5배 이상 과발현되는 마이크로 RNA 81종과 0.66배 이하 저발현되는 마이크로 RNA 6종을 선별함으로써, 총 87종의 마이크로 RNA를 바이오마커로 이용하여 톨루엔의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하게 사용할 수 있으며, 톨루엔에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있음을 알 수 있다.

Description

엑소좀과 세포주 유래 톨루엔 노출 여부 확인용 마이크로 ＲＮＡ 및 이를 이용한 확인 방법{microRNAs from exosomes and cell line for identification of exposure to toluene and the method of identification using thereof}

본 발명은 톨루엔(Toluene) 노출 여부 확인용 엑소좀과 세포주 유래 마이크로 RNA 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 80%와 50%의 세포생존율을 보이는 농도로 처리한 톨루엔(Toluene)에 의해 특이적으로 발현이 변화하는 엑소좀과 세포주 유래 마이크로 RNA 및 이를 이용한 톨루엔(Toluene)에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.

최근 전 세계의 많은 연구기관들이 주목하고 있는 엑소좀(exosome)은 다양한 세포가 분비하거나 방출하는 30-150nm 크기의 작은 소포체(membrane vesicle)이다. 엑소좀 안에는 세포에서 유래된 다양한 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA) 등이 포함되어 있고 세포 간의 정보 전달 등에 관여하기 때문에 생물학 및 병리학 연구의 새로운 도구로서 각광받고 있다. 많은 연구진들이 암의 악화에 관련된 물질로 엑소좀을 주목하고 있으며, 동시에 이를 이용한 진단 및 치료 방법의 개발을 도모하고 있다.

엑소좀은 그 안에 마이크로 RNA(miR, miRNA)라는 조절성 RNA를 가지고 있는데 이것이 세포간의 상호작용을 조절하는 중요한 역할을 한다. 마이크로 RNA는 전형적으로 18-24개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 비(非)암호화 RNA이다. 마이크로 RNA는 작지만 그 영향력이 커서 한 분자만으로도 RNA 분해 촉진, mRNA 번역 저해 및 유전자 전사에의 영향 등을 통해 많은 생물학적 기능을 제어할 수 있다. 마이크로 RNA는 발달 및 분화, 세포 증식 제어, 스트레스 반응 및 대사작용 등의 다양한 과정에서 중심적 역할을 한다.

세포 내에서 마이크로 RNA에 관여하는 효소는 RNA 중합효소 Ⅱ로 알려져 있으며, 일부 마이크로 RNA의 경우에는 RNA 중합효소 Ⅲ에 의해 전사된다고 알려져 있다. 마이크로 RNA의 초기 형태인 초기 전사체(pri-miRNA)는 mRNA와 매우 유사한 구조로 전사 되는데, 전두부에 cap 구조를 포함하며 후미부에는 아데닌을 다량으로 포함한 poly-A 구조를 가지고 있다. pri-miRNA는 핵 속에 존재하는 드로샤(Drosha)에 의해 절단된 후, 약 70개의 염기로 구성된 전구체(pre-miRNA)로 변형된다. 세포질로 운반 된 후, 헤어핀 pre-miRNA는 이중가닥 miRNA를 생산하기 위해 다이서에 의해 추가로 가공된다. 이렇게 최종적으로 약 22개의 염기로 구성된 miRNA가 생성되고 이 성숙한 miRNA는 RNA-유도 침묵 복합체(RISC) 속에 혼합되어 복합체를 형성한다. 이 복합체가 표적 유전자와 결합함으로서 표적 mRNA를 분해시키거나 단백질로 번역되는 과정을 억제하게 된다.

생물학적으로 마이크로 RNA가 유전자의 발현을 조절하는 중요한 조절인자임이 밝혀지고, 또한 지금까지 동식물을 포함한 223가지의 종에서 28,645개(인간에서 약 2,000여 개)의 마이크로 RNA가 발견되었다. 또한 마이크로 RNA 메커니즘은 암 발병, 세포 노화, 장기의 성장 등에 중요한 영향을 미치고 있으며, 이에 따라 마이크로 RNA 관련 연구는 암 발생, 노화 등의 생명현상 인과 관계 규명에 중추적 역할을 할 것이다. 뿐만 아니라, 향후 발생 및 분화나 줄기세포를 이용한 세포치료제 개발 등의 연구에도 적용시킬 수 있어 우리나라 바이오 연구의 핵심 분야로 자리 잡을 수 있을 것으로 예상된다. 따라서, 마이크로 RNA 마커의 발굴은 암을 포함하여 질병의 조기 진단 가능성을 예측하는 데에 많은 도움을 줄 것이라는 점에서 의의가 있다.

더욱이 마이크로 RNA 마커는 특정 환경유해물질의 노출 및 위해성 예측에도 유용하게 쓰일 수 있을 것이다. 최근 마이크로 RNA와의 연관성에 대한 관심이 증가함에 따라 지금까지 주로 진행된 환경유해물질의 노출에 따른 유전자(mRNA)의 변화 양상과 그에 따른 질병과의 연관성에 관련된 연구와 달리, 벤젠(benzene), 비소(arsenic), RDX와 많은 수의 유해물질의 노출에 따른 마이크로 RNA의 발현 변화를 관찰하였으며 특이적으로 발현이 변화하는 마이크로 RNA와 그 표적 유전자를 유해물질에 대한 마커로 제시하였다(Baccarelli, A. & Bollati, V. Curr . Opin . Prediatr. 21, 243-251, 2009 참조). 또한 발굴된 마이크로 RNA는 노출 예측을 위한 마커로서 뿐만 아니라 표적 유전자의 발현을 조절하는 조절자로서 환경유해물질에 의한 독성 기작 예측을 위한 마커로서도 유용하게 쓰일 수 있다. 이렇듯 마이크로 RNA 마커의 환경유해물질 노출 및 독성기작 예측에서의 역할이 매우 중요하다고 할 수 있음에도 불구하고 현재 마이크로 RNA 관련 연구는 주로 질병 진단용 마커 발굴에 국한되어 있으며 다양한 환경 중에 노출 가능성이 있는 휘발성 유기화합물과 같은 유해물질 노출에 의한 마이크로 RNA의 발현 변화에 대한 연구는 부족하다. 또한, 후성유전학적 변화는 유전자의 발현과 같은 유전학적 변화의 다양성에 비해 그 정도가 심하지 않게 때문에 다수의 마커가 필요한 유전자 발현 프로파일링에 비해서 단 하나의 마이크로 RNA나 DNA 메틸레이션과 같은 유전자 외적(epigenetic) 마커로도 질병이나 유해물질 노출을 초기에 진단할 수 있다는 장점뿐만 아니라 비침습적 방법으로 진단할 수 있다는 이점이 있다. 각 마이크로 RNA가 다양한 표적 유전자들을 조절하고 고등진핵생물에서는 천여 개의 마이크로 RNA가 존재하기 때문에 마이크로 RNA에 의해 조절될 수 있는 잠재적인 회로가 막대할 것이라고 예상하고 있다.

휘발성 유기 화합물의 하나인 톨루엔(Toluene)은 석유 정제공정, 코크스 오븐 공정, 페인트, 잉크, 시너, 접착제, 화장품의 성분, 스티렌 등 다른 화학물질의 생산 등에 사용된다(환경부, 1997). 톨루엔은 휘발성이 있어 대기가 주된 노출 경로이며, 실외노출보다 실내노출의 비중이 높고 작업장의 일부 집단에게서 고동도로 노출될 가능성이 있으며 흡연 등을 통해서도 노출될 수 있다. 톨루엔은 방향족탄화수솔로서 벤젠의 수소 하나를 메틸기(-CH3)로 치환하여 형성된 무색의 벤젠과 같은 냄새를 가진 휘발성, 가연성 액체이며 메틸벤젠(methylbenzene)이라고도 한다. 톨루엔은 주로 화학 합성 시 중간제, 화학용제 등으로 사용되며 인체 발암성 자료로서 역학 자료는 거의 없다. 자연발생적 오염원은 화산, 산불, 원유 등이며 인공적 오염원으로는 자동차 배기장치, 가솔린 저장탱크, 주유소, 소화기 등이 있다.

톨루엔은 유기용매로서 널리 이용되며 이들 제품 사용 시 호흡기 및 피부 접촉을 통해 인체 노출 가능성이 있다. 톨루엔이 체내에 과량 흡입될 경우 복통, 구토와 같은 위장기관 기능장애를 초래할 뿐만 아니라 두통, 현훈 및 환각 증세와 같은 신경장애를 일으킨다고 알려져 있다. 더욱이 근대산업이 발달함에 따라 산업체 근로자가 과량의 유기용매에 장기간 노출되는 산업재해의 경우가 증가하고 있어 톨루엔의 흡입이 생체기능, 특히 정신신경계에 미치는 효과 규명이 긴요한 과제로 대두되고 있다. 급성 또는 만성적인 톨루엔 흡입은 자율신경계를 포함한 중추신경계의 기능장애를 유발하며 EEG의 변화와 아세틸콜린(acetylcholine)을 포함한 신경전도물질의 분비 및 대사에 변화를 초래한다. 톨루엔은 벤젠보다 피부나 점막에 주는 자극이 강하며 증기흡입에 의한 중추신경 독성 작용도 벤젠보다 강하다. 100~200 ppm의 증기를 8시간 흡입하면 피로, 구토, 감각저하, 운동 불능, 무기력, 졸림 등의 증상을 보이며 600 ppm 정도의 농도가 되면 단시간 노출만으로 심한 흥분, 강한 피로감, 구토, 두통을 일으킨다.

국내 식품 및 소비재 중 톨루엔에 대한 오염도 자료는 휘발성이 높은 톨루엔의 특성상 미흡하다. 국내 톨루엔이 함유되어 있는 제품은 최근 유사휘발유로 제품화되어 나온 첨가제 등의 자동차원료, 폭약, 염료, 페인트, 잉크, 접착제, 인공가죽제조, 용매, 화장품, 의약품, 락카희석제, 수지류, 세제 및 향료 등으로 다양하며(환경부, 1997 : 국립환경연구원, 환경자료집, 1999) 이들 제품 사용시 호흡기 및 피부접촉을 통해 인체 노출가능성은 있으나 접착제(10% 미만)와 물휴지(불검출)에서만 톨루엔 농도를 규제하고 있다(식품의약품안전청 위해예방정책국).

또한, 휘발성 유기 화합물류의 인체 독성 정도와 유전자 발현 변화에 대한 연구는 대표적인 휘발성 유기 화합물류로 알려진 포름알데하이드, 벤젠(Formaldehyde, Benzene) 등에 국한되어 있다. 이처럼 톨루엔의 잠재적 위해성에도 불구하고 인체에서의 위해도 평가 자료가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 보다 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 마이크로 어레이 칩 또는 프라이머(primer)를 이용하는 실시간(real-time) PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 등으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용, 특히 암을 비롯한 다양한 질병 유발에 관여하는 마이크로 RNA 발현 변화 여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 톨루엔의 인체 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.

1993년 처음으로 마이크로 RNA가 밝혀진 이래 포유류, 미생물 등 여러 종의 마이크로 RNA가 급속도로 밝혀지면서 마이크로 RNA들의 서열 및 정보, 특징들을 저장, 관리하는 데이터베이스(database)가 구축되었다. 그 중 대표적인 것이 Sanger miRBASE 데이터베이스(http://www.mirbase.org/index.shtml)인데, 이렇게 밝혀진 마이크로 RNA 데이터를 바탕으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드(genome-wide) 발현 연구가 이루어지고 있다.

마이크로어레이(microarray) 분석은 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 확인할 수 있게 해준다(Schena, M, et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93, 10614-10619, 1996). 마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리 표면에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et. al. J. Am. Acad. Dermatol . 51, 681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al. J. Am. Acad. Dermatol. 51, 681-692, 2004).

유전자의 발현 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 얻어진 마이크로 RNA를 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 마이크로 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화한다.

마이크로어레이를 통해 유전자 발현을 측정하는 방법으로는 크게 두 개의 염료(two-dye) 방식과 한 개의 염료(one-dye) 방식이 있다. 상보결합 반응을 측정할 때, 대조군 샘플과 실험군 샘플에 각각 두 개의 다른 형광(예: Cye3 및 Cye5)을 표지한 후 마이크로어레이에서 반응시켜 측정하는 방식을 두 개의 염료 마이크로어레이(two-dye microarray)라고 하고, 두 샘플에 동일한 형광을 입힌 후 두 개의 서로 다른 마이크로어레이에서 반응시켜 측정하는 방식을 한 개의 염료 마이크로어레이(one-dye microarray)라고 한다(Vivian, G. et al. Nature 21, 15-19, 1999).

최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯해 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 마이크로 RNA들의 발현 패턴 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 마이크로 RNA의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 확인이 가능하게 될 것이다.

이에 본 발명자들은 인간 마이크로 RNA 2549개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 80%와 50% 생존율을 보이는 농도(IC20, IC50)로 처리한 톨루엔의 엑소좀과 세포주 유래 마이크로 RNA 발현 프로파일을 인간 혈액 세포인 HL-60 세포주에서 관찰 및 분석한 결과, 톨루엔에 의해 발현이 공통으로 변화되는 엑소좀과 세포주 유래 마이크로 RNA를 발굴함으로써, 상기 마이크로 RNA를 이용하여 톨루엔 노출 여부를 확인할 수 있는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 두 가지 농도의 톨루엔(Toluene)의 노출에 의해 공통적으로 발현이 변화하는 엑소좀과 세포주 유래 마이크로 RNA 및 상기 바이오마커를 이용하여 인체에 다양한 독성작용을 갖는 톨루엔의 노출 여부 확인 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로 RNA 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 톨루엔(Toluene) 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩을 제공한다;

마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0015041 hsa-miR-1260b Homo sapiens hsa-miR-1260b, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005911 hsa-miR-1260a Homo sapiens hsa-miR-1260a, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000269 hsa-miR-212-3p Homo sapiens hsa-miR-212-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000252 hsa-miR-7-5p Homo sapiens hsa-miR-7-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0016916 hsa-miR-4286 Homo sapiens hsa-miR-4286, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0022967 hsa-miR-3620-5p Homo sapiens hsa-miR-3620-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027539 hsa-miR-6819-3p Homo sapiens hsa-miR-6819-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0016865 hsa-miR-4313 Homo sapiens hsa-miR-4313, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019006 hsa-miR-4478 Homo sapiens hsa-miR-4478, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003257 hsa-miR-550a-3p Homo sapiens hsa-miR-550a-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027616 hsa-miR-6858-5p Homo sapiens hsa-miR-6858-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000267 hsa-miR-210-3p Homo sapiens hsa-miR-210-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0022929 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Homo sapiens hsa-miR-874-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000457 hsa-miR-188-5p Homo sapiens hsa-miR-188-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027450 hsa-miR-6775-5p Homo sapiens hsa-miR-6775-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018929 hsa-miR-4417 Homo sapiens hsa-miR-4417, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003326 hsa-miR-663a Homo sapiens hsa-miR-663a, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027472 hsa-miR-6786-5p Homo sapiens hsa-miR-6786-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018444 hsa-miR-642b-3p Homo sapiens hsa-miR-642b-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0022838 hsa-miR-1185-1-3p Homo sapiens hsa-miR-1185-1-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0023252 hsa-miR-5787 Homo sapiens hsa-miR-5787, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000258 hsa-miR-181c-5p Homo sapiens hsa-miR-181c-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0016889 hsa-miR-4327 Homo sapiens hsa-miR-4327, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005929 hsa-miR-1275 Homo sapiens hsa-miR-1275, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0028115 hsa-miR-7109-5p Homo sapiens hsa-miR-7109-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0016901 hsa-miR-4271 Homo sapiens hsa-miR-4271, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0024599 hsa-miR-6126 Homo sapiens hsa-miR-6126, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0022942 hsa-miR-1229-5p Homo sapiens hsa-miR-1229-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019073 hsa-miR-4534 Homo sapiens hsa-miR-4534, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004749 hsa-miR-424-3p Homo sapiens hsa-miR-424-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019069 hsa-miR-4530 Homo sapiens hsa-miR-4530, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0016900 hsa-miR-4270 Homo sapiens hsa-miR-4270, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0016852 hsa-miR-4298 Homo sapiens hsa-miR-4298, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019043 hsa-miR-2392 Homo sapiens hsa-miR-2392, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0023711 hsa-miR-6086 Homo sapiens hsa-miR-6086, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027682 hsa-miR-6891-5p Homo sapiens hsa-miR-6891-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019978 hsa-miR-4800-5p Homo sapiens hsa-miR-4800-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003299 hsa-miR-630 Homo sapiens hsa-miR-630, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018104 hsa-miR-3679-5p Homo sapiens hsa-miR-3679-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027620 hsa-miR-6769b-5p Homo sapiens hsa-miR-6769b-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003945 hsa-miR-765 Homo sapiens hsa-miR-765, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004761 hsa-miR-483-5p Homo sapiens hsa-miR-483-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0028111 hsa-miR-7107-5p Homo sapiens hsa-miR-7107-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005793 hsa-miR-320c Homo sapiens hsa-miR-320c, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0022496 hsa-miR-5703 Homo sapiens hsa-miR-5703, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0028211 hsa-miR-7150 Homo sapiens hsa-miR-7150, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019936 hsa-miR-4778-5p Homo sapiens hsa-miR-4778-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027634 hsa-miR-6867-5p Homo sapiens hsa-miR-6867-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0025476 hsa-miR-6510-5p Homo sapiens hsa-miR-6510-5p 및 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0028117 hsa-miR-7110-5p Homo sapiens hsa-miR-7110-5p.

또한, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나의 마이크로 RNA에 상보적이고, 상기 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 톨루엔 노출 여부 확인용 키트를 제공한다;

마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005880 hsa-miR-1290 Homo sapiens hsa-miR-1290, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0012735 hsa-miR-718 Homo sapiens hsa-miR-718, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003240 hsa-miR-575 Homo sapiens hsa-miR-575, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004761 hsa-miR-483-5p Homo sapiens hsa-miR-483-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003237 hsa-miR-572 Homo sapiens hsa-miR-572, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018085 hsa-miR-3663-3p Homo sapiens hsa-miR-3663-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0020924 hsa-miR-642a-3p Homo sapiens hsa-miR-642a-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005793 hsa-miR-320c Homo sapiens hsa-miR-320c, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019069 hsa-miR-4530 Homo sapiens hsa-miR-4530, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018981 hsa-miR-4459 Homo sapiens hsa-miR-4459 및 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005929 hsa-miR-1275 Homo sapiens hsa-miR-1275.

또한, 본 발명은,

1) 톨루엔을 노출시킨 실험군 및 정상 대조군의 체세포에서 total RNA를 분리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 각각의 다른 형광물질로 표지하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 형광물질로 표지된 RNA를 본 발명의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;

4) 상기 단계 3)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및

5) 상기 단계 4)의 분석한 데이터에서 본 발명의 마이크로어레이칩에 집적된 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은,

1) 톨루엔을 노출시킨 실험군 및 정상 대조군의 체세포에서 각각의 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 분리된 엑소좀에서 total RNA를 분리하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 실험군과 대조군의 RNA를 각각의 다른 형광물질로 표지하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 형광물질로 표지된 RNA를 본 발명의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;

5) 상기 단계 4)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및

6) 상기 단계 5)의 분석한 데이터에서 본 발명의 마이크로어레이칩에 집적된 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은,

2) 상기 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 본 발명의 마이크로어레이칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은,

3) 상기 단계 2)의 실험군과 대조군의 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 본 발명의 마이크로어레이칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

5) 상기 단계 4)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 DNA 마이크로 어레이 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 키트를 제공한다.

본 발명의 톨루엔 인체 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법은 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 마이크로 RNA들을 바이오마커로 이용하여 톨루엔의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하며, 톨루엔에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다. 또한, 톨루엔 노출 여부 확인 방법에 엑소좀을 이용함으로써 정확하고 신속하게 진단 및 예측이 가능하다.

도 1은 HL-60 세포주에서 분리된 엑소좀을 나타낸 도이다.
도 2는 톨루엔을 처리한 엑소좀 유래 마이크로 RNA와 인간 혈액 세포주의 마이크로 RNA 발현 양상을 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 이용하여 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 두 가지 농도의 톨루엔을 처리한 엑소좀과 세포주 유래 마이크로 RNA에서 공통적으로 과발현 또는 저발현을 보이는 87종의 발현 양상을 나타내는 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 톨루엔(Toluene) 노출에 의해 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.

상기 바이오마커는 톨루엔 노출에 의해 과발현된 마이크로 RNA 81종, 저발현된 마이크로 RNA 6종으로 구성되어 있다.

상기 바이오마커는 두 가지 농도의 톨루엔 노출에 의해 엑소좀과 세포주 유래 마이크로 RNA에서 공통적으로 1.5배 이상 발현이 증가 또는 감소한 마이크로 RNA로 구성되어 있다.

본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되어지는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 제공한다;

본 발명자들은 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 톨루엔를 인간 혈액 세포주(HL-60)에 처리하여 세포독성을 확인하였다. 그 결과 상기 톨루엔은 인간 혈액 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고, 상기 실험을 바탕으로 톨루엔의 농도(세포 생존율 80%인 농도:IC_20,세포 생존율 50%인 농도:IC₅₀)를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 톨루엔을 인간 혈액 세포주에 처리하고, 상기 물질을 처리한 세포주에서 엑소좀을 분리하였다.(도 1 참조) 물질이 처리된 세포주와 엑소좀에서 각각 마이크로 RNA를 포함하는 총 RNA를 분리하여 형광물질(Cy3)로 표지하였다. 상기 형광표지된 마이크로 RNA를 Agilent Human miRNA array 8 X 60K Release 21.0 (Agilent, 미국)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다. 분석시 실험군/대조군의 신호 강도(signal intensity) 비율이 1.5배 이상인 경우 발현 증가한 유전자로 분류하였고, 0.66배 이하인 경우 발현 감소한 유전자로 분류하였다. 그 결과, IC₂₀ 농도로 톨루엔을 처리한 엑소좀 유래 샘플에서 발현이 증가한 마이크로 RNA는 39.23%(2549개의 마이크로 RNA 중 1000개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 2.12%(2549개의 마이크로 RNA 중 54개)이며, IC₅₀ 농도로 톨루엔을 처리한 엑소좀 유래 마이크로 RMA 샘플에서 발현이 증가한 마이크로 RNA는 39.31%(2549개의 마이크로 RNA 중 1002개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 1.88%(2549개의 마이크로 RNA 중 48개)이었다.

세포주 유래 마이크로 RNA의 경우는 IC₂₀ 농도에서 과발현 마이크로 RNA 5.92%(2549개의 마이크로 RNA 중 151개)이고, 저발현 마이크로 RNA는 0.47%(2549개의 마이크로 RNA 중 12개)이었다. 또한 IC₅₀ 농도에서 과발현 마이크로 RNA는 7.06%(2549개의 마이크로 RNA 중 180개), 저발현 마이크로 RNA는 3.18%(2549개의 마이크로 RNA 중 81개)임이 확인되었다. 이 때,IC₂₀ 농도와 IC₅₀ 농도의 엑소좀 유래 마이크로 RNA와 세포주 유래 마이크로 RNA가 공통적으로 발현이 1.5배 이상 과발현, 저발현 되는 마이크로 RNA는 87종 (과발현 81종, 저발현 6종) 이었으며 이들 마이크로 RNA들은 톨루엔의 인체 노출시 독성과 관련되어 있다는 보고는 없다. (표 1, 도 2, 도 3 참조).

본 발명자들은 상기 마이크로 RNA 중 과발현된 마이크로 RNA 중 11종을 분리하여, 실시간 RT-PCR(real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 방법으로 발현 양상을 조사하였다. 그 결과, 과발현된 마이크로 RNA 11종 발현 양상이 올리고마이크로어레이 칩 결과와 유사하게 나타남을 확인하였다(표 5 참조).

이들 마이크로 RNA 등록번호는 하기와 같다;

또한, 본 발명은 상기 바이오마커 마이크로 RNA 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보 가닥 분자가 합성/집적된 톨루엔에 대한 노출 여부 확인용 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 바이오마커 마이크로 RNA의 15 내지 20개의 핵산을 포함한다.

본 발명의 톨루엔 검색용 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 구체적으로 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 마이크로 RNA 분자로 이용하여 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 잉크젯 방식 등을 사용하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 SurePrint 잉크젯 마이크로 드롭핑 마이크로어레이(inkjet micro dropping microarray)를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 구체적으로 에폭시(epoxy), 아미노-실란(amino-silane), 폴리-엘-리신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 에폭시가 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법을 제공한다;

3) 상기 단계 2)의 형광물질로 표지된 RNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;

5) 상기 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이칩에 집적된 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법.

4) 상기 단계 3)의 형광물질로 표지된 RNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;

6) 상기 단계 5)의 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이칩에 집적된 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법.

상기 방법에 있어서, 상기 체세포는 구체적으로 인간의 혈액 세포인 것이나 이에 한정되지 않고, 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 방법에 있어서, 인간 혈액 세포는 구체적으로 HL-60인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 상기 형광물질은 구체적으로 Cy3, Cy5, 폴리 엘-리신-플루오레세인 이소티오시안산염(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-비-이소티오시안산염(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 방법에 있어서, 상기 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩은 구체적으로 Agilent Human miRNA array 8 X 60K Release 21.0 (Agilent, 미국)등을 사용하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 마이크로 RNA 중 본 발명에서 상기 공통적으로 발현이 변화된 마이크로 RNA(표 1 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 가장 바람직한 것은 상기 본 발명자가 제작한 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이다.

상기 방법에 있어서, 상기 분석 방법은 구체적으로 GeneSpring GX 11 소프트웨어(Agilent, 미국)를 사용하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.

또한, 본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 톨루엔에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 상기 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다;

3) 상기 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 제 1항의 마이크로어레이칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.

4) 상기 단계 3)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 제 1항의 마이크로어레이칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

5) 상기 단계 4)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.

상기 방법에 있어서, 상기 프라이머는 본 발명에서 탐색된 바이오마커 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머라면 모두 사용가능하다.

상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 구체적으로 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3를 사용하였다.

상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

아울러, 본 발명은 상기 바이오마커 마이크로 RNA에 상보적이고, 바이오마커 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 톨루엔에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

상기 확인용 키트의 프라이머는 하기 프라이머 1 내지 11으로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 바이오마커 마이크로 RNA를 증폭할 수 있으며 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 프라이머는 모두 사용 가능하다:

프라이머 1 - 서열번호 1로 기재된 프라이머;

프라이머 2 - 서열번호 2로 기재된 프라이머;

프라이머 3 - 서열번호 3로 기재된 프라이머;

프라이머 4 - 서열번호 4로 기재된 프라이머;

프라이머 5 - 서열번호 5로 기재된 프라이머;

프라이머 6 - 서열번호 6로 기재된 프라이머;

프라이머 7 - 서열번호 7로 기재된 프라이머;

프라이머 8 - 서열번호 8로 기재된 프라이머;

프라이머 9 서열번호 9로 기재된 프라이머;

프라이머 10 - 서열번호 10로 기재된 프라이머; 및

프라이머 11 - 서열번호 11으로 기재된 프라이머.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 톨루엔의 세포독성 확인

<1-1> 세포배양

인간 혈액 세포주인 HL-60 세포(한국 세포주 은행)를 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지(Gibco, 미국)를 이용하여 T75 플라스크(flask)에서 80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 휘발성 유기 화합물의 하나로서 위해성을 가지고 있는 물질인 톨루엔을 선정하였으며, 이를 DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.

<1-2> 세포독성 실험(MTT assay) 및 화학 물질 처리

Mossman 등(J. Immunol. Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 HL-60 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다.

구체적으로, 세포는 50 ㎖ 튜브에 1 ×10⁶/웰 세포수로 RPMI 배지(Gibco, 미국)에서 DMSO에 용해된 톨루엔을 처리하고 3시간 배양한 후에 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 3 ㎖에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.

그 결과, HL-60 세포주에서 톨루엔의 세포독성에 80% 생존율을 보이는 농도(IC₂₀)는 1.14 mM, 50% 생존율을 보이는 농도(IC₅₀)는 2.74 mM이었으며, 상기 결과를 바탕으로 하기 마이크로어레이 실험을 수행하였다.

<실시예 2> 엑소좀 분리

상기 실시예 1-1에서 배양한 세포의 배지에서 엑소좀을 분리하기 위하여 ExoQuick-TC™ Exosome Isolation Reagent(SBI System Biosciences cat. no. EXOTC-SAM)을 이용하여 제조사에서 제시한 방법대로 엑소좀을 수득하였다. 노란색을 띄는 엑소좀 펠릿(pellet)을 관찰하였으며, 도 1에 나타낸 바와 같이, TEM 이미지와 사이즈 분석을 통해서 엑소좀이 잘 분리되었음을 확인하였다.

<실시예 3> 마이크로어레이 실험을 통해 톨루엔에 의한 마이크로 RNA의 발현 양상 확인

<3-1> 표적 마이크로 RNA의 분리

1 ×10⁶ 세포/㎖ 농도로 50 ㎖ 튜브에 HL-60 세포를 분주한 후, 상기 실시예 <1-2>에서 결정한 톨루엔의 농도들을 3시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, 미국)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하였다. 엑소좀 전체 RNA는 세포주에서와 동일하게 트리졸(trizol) 시약을 사용하여 분리하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase 세트(set)(Qiagen, 미국)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 농도는 분광광도계인 NanoDrop ND 1000 분광광도계(spectrophotometer)(NanoDrop Technologies Inc., 미국)를 이용하여 측정하였다.

<3-2> 표지된 마이크로 RNA 제조 및 형광 물질 표지

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <3-1>에서 수득한 톨루엔 처리군의 전체 RNA에 형광 물질을 표지하였다.

구체적으로, 형광 표지는 Agilent사의 miRNA 완전한 라벨링 및 혼성화 키트(complete labeling and Hybridization kit)를 사용하여 제조사의 방법대로 수행하였다. 상기 수득한 전체 RNA 2 ㎕(100 ng)에 0.4 ㎕의 10 X CIP 완충용액, 1.1 ㎕의 핵산분해효소 자유수(nuclease-free water), 0.5 ㎕의 캐프 인테스터널 포스파타아제(Calf Intestinal Phosphatase)를 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 2.8 ㎕의 100% DMSO를 첨가하여 100%에서 5 내지 10분간 반응시키고 즉시 얼음으로 옮겼다. 염료(dye)를 붙여주기 위해 1 ㎕의 10 X T4 RNA 리가아제(Ligase) 완충용액, 3 ㎕의 Cyanine3-pCp, 0.5 ㎕의 T4 RNA 리가아제(ligase)를 넣고 16℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 라벨링(labeling) 된 시료를 Micro Bio-Spin 6 컬럼(column)을 사용하여 정제하였다. 정제된 RNA를 55℃의 진공 농축기(vacuum concentrator)에서 완전히 말려 18 ㎕의 핵산분해효소 자유수로 녹인 후 4.5 ㎕의 10 X GE 차단 에이전트(Blocking Agent)를 넣고 22.5 ul의 2 X Hi-RPM 혼성화 완충용액(Hybridization buffer)을 넣어주었다. 준비된 시료를 100℃에서 5분간 반응시키고 즉시 얼음으로 옮겨 5분간 반응시킨 다음 혼성화 반응에 사용하였다.

<3-3> 혼성화 반응

혼성화 및 세척 과정을 이바이오젠(서울, 한국)의 지시방법에 따라 수행하였다. 혼성화를 20시간 동안 55℃ 오븐에서 수행하였다. DNA 마이크로어레이 칩은 인간 miRNA 어레이(array) Release 21.0(Agilent, 미국)을 이용하였다.

<3-4> 형광 이미지 획득을 통한 마이크로 RNA 발현 양상 확인

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Agilent C 스캐너(scanner)(Agilent technologies, 미국)로 스캔하였으며 추출된 데이터를 Agilent GeneSpring GX 11(Agilent technologies)를 이용하여 정상화(normalization)를 거쳐 각 유전자의 발현양상을 분석하였다.

그 결과, 표 1, 도 2, 도 3에 나타낸 바와 같이 올리고 칩 상에 존재하는 대략 2549개의 마이크로 RNA 중에서 IC₂₀ 농도로 톨루엔을 처리한 엑소좀 유래 샘플에서 발현이 증가한 마이크로 RNA는 39.23%(2549개의 마이크로 RNA 중 1000개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 2.12%(2549개의 마이크로 RNA 중 54개)이며, IC₅₀ 농도로 톨루엔을 처리한 엑소좀 유래 마이크로 RMA 샘플에서 발현이 증가한 마이크로 RNA는 39.31%(2549개의 마이크로 RNA 중 1002개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 1.88%(2549개의 마이크로 RNA 중 48개)이었다.

세포주 유래 마이크로 RNA의 경우는 IC₂₀ 농도에서 과발현 마이크로 RNA 5.92%(2549개의 마이크로 RNA 중 151개)이고, 저발현 마이크로 RNA는 0.47%(2549개의 마이크로 RNA 중 12개)이었다. 또한 IC₅₀ 농도에서 과발현 마이크로 RNA는 7.06%(2549개의 마이크로 RNA 중 180개), 저발현 마이크로 RNA는 3.18%(2549개의 마이크로 RNA 중 81개)임이 확인되었다. 이 때,IC₂₀ 농도와 IC₅₀ 농도의 엑소좀 유래 마이크로 RNA와 세포주 유래 마이크로 RNA가 공통적으로 발현이 1.5배 이상 과발현, 저발현 되는 마이크로 RNA는 87종(과발현 81종, 저발현 6종)이 있다는 것을 확인하였다(표 1, 도 2, 도 3 참조).

등록번호	유전자명	Fold Change
등록번호	유전자명	엑소좀 IC₂₀	엑소좀 IC₅₀	세포주 IC₂₀	세포주 IC₅₀
MIMAT0015041	hsa-miR-1260b	0.07	0.06	0.66	0.27
MIMAT0005911	hsa-miR-1260a	0.11	0.08	0.65	0.26
MIMAT0000269	hsa-miR-212-3p	0.32	0.35	0.03	0.03
MIMAT0000252	hsa-miR-7-5p	0.52	0.52	0.66	0.03
MIMAT0016916	hsa-miR-4286	0.56	0.29	0.59	0.24
MIMAT0022967	hsa-miR-3620-5p	0.65	0.60	0.47	0.22
MIMAT0027539	hsa-miR-6819-3p	1.73	2.47	15.70	19.75
MIMAT0016865	hsa-miR-4313	1.98	1.59	39.37	38.72
MIMAT0019006	hsa-miR-4478	2.01	2.13	3.01	3.20
MIMAT0003257	hsa-miR-550a-3p	2.20	2.24	1.62	1.63
MIMAT0027616	hsa-miR-6858-5p	2.22	2.98	2.13	4.28
MIMAT0000267	hsa-miR-210-3p	2.25	3.77	27.05	13.49
MIMAT0022929	hsa-miR-758-5p	2.77	2.32	36.61	89.90
MIMAT0000440	hsa-miR-191-5p	2.82	8.74	2.04	2.36
MIMAT0004682	hsa-miR-361-3p	3.03	3.82	13.32	14.38
MIMAT0019015	hsa-miR-4481	3.21	2.75	35.51	14.46
MIMAT0027644	hsa-miR-6872-5p	3.47	3.88	1.88	1.92
MIMAT0018992	hsa-miR-4465	3.48	4.93	1.61	4.71
MIMAT0003888	hsa-miR-766-3p	3.71	5.24	2.09	1.83
MIMAT0019019	hsa-miR-4485-3p	3.73	1.54	1.63	3.72
MIMAT0019779	hsa-miR-4690-5p	4.04	2.80	20.33	24.06
MIMAT0015078	hsa-miR-3194-5p	4.37	5.37	27.90	14.76
MIMAT0027514	hsa-miR-6807-5p	4.37	3.16	5.03	2.37
MIMAT0023698	hsa-miR-6073	5.02	5.97	21.39	59.88
MIMAT0019052	hsa-miR-4515	5.13	5.93	1.66	2.66
MIMAT0025855	hsa-miR-6723-5p	5.47	14.20	31.51	33.95
MIMAT0027355	hsa-miR-6727-5p	6.63	7.91	1.51	2.19
MIMAT0003237	hsa-miR-572	7.08	8.13	1.57	3.06
MIMAT0022941	hsa-miR-1227-5p	7.31	8.22	1.60	2.97
MIMAT0004687	hsa-miR-371a-5p	8.31	16.24	7.21	15.40
MIMAT0028113	hsa-miR-7108-5p	9.22	14.93	2.07	3.43
MIMAT0004595	hsa-miR-135a-3p	9.37	17.67	8.98	42.03
MIMAT0030987	hsa-miR-8060	9.45	14.96	14.96	37.68
MIMAT0027470	hsa-miR-6785-5p	10.22	11.44	2.24	3.98
MIMAT0000772	hsa-miR-345-5p	10.57	8.03	10.03	18.94
MIMAT0019071	hsa-miR-4532	11.43	11.57	1.92	4.27
MIMAT0027686	hsa-miR-6893-5p	11.58	24.97	1.54	1.85
MIMAT0019793	hsa-miR-4698	11.63	16.02	46.32	94.96
MIMAT0018085	hsa-miR-3663-3p	11.66	10.41	2.76	6.67
MIMAT0003240	hsa-miR-575	11.84	30.44	2.52	5.38
MIMAT0019913	hsa-miR-4763-3p	12.17	14.02	1.57	2.77
MIMAT0019868	hsa-miR-4739	12.82	25.10	1.74	3.40
MIMAT0027404	hsa-miR-6752-5p	12.82	18.45	24.89	61.62
MIMAT0027600	hsa-miR-6850-5p	12.97	13.49	1.51	2.95
MIMAT0018981	hsa-miR-4459	14.65	17.49	1.82	3.22
MIMAT0022709	hsa-miR-652-5p	15.77	24.61	17.36	21.62
MIMAT0012735	hsa-miR-718	16.57	16.80	19.02	42.13
MIMAT0005880	hsa-miR-1290	17.57	12.67	2.09	3.57
MIMAT0020924	hsa-miR-642a-3p	19.15	26.55	2.24	3.92
MIMAT0004911	hsa-miR-874-3p	19.33	24.59	15.73	40.41
MIMAT0000457	hsa-miR-188-5p	19.56	26.55	1.53	2.34
MIMAT0027450	hsa-miR-6775-5p	20.05	19.68	35.45	52.57
MIMAT0018929	hsa-miR-4417	20.49	27.25	32.37	38.61
MIMAT0003326	hsa-miR-663a	20.66	31.78	2.14	4.82
MIMAT0027472	hsa-miR-6786-5p	21.14	29.32	18.40	46.67
MIMAT0018444	hsa-miR-642b-3p	21.51	39.06	1.82	3.01
MIMAT0022838	hsa-miR-1185-1-3p	22.81	23.75	19.81	24.51
MIMAT0023252	hsa-miR-5787	23.45	36.98	2.68	5.13
MIMAT0000258	hsa-miR-181c-5p	25.11	30.78	21.15	21.15
MIMAT0016889	hsa-miR-4327	29.07	46.27	14.03	42.78
MIMAT0005929	hsa-miR-1275	29.95	33.30	1.77	2.76
MIMAT0028115	hsa-miR-7109-5p	32.86	42.02	14.32	33.79
MIMAT0016901	hsa-miR-4271	32.98	35.46	37.64	51.86
MIMAT0024599	hsa-miR-6126	33.29	48.21	1.74	2.37
MIMAT0022942	hsa-miR-1229-5p	34.19	32.10	1.57	2.94
MIMAT0019073	hsa-miR-4534	35.62	40.63	16.69	47.68
MIMAT0004749	hsa-miR-424-3p	36.47	51.14	24.51	46.04
MIMAT0019069	hsa-miR-4530	36.98	25.38	1.72	3.17
MIMAT0016900	hsa-miR-4270	40.29	48.21	1.56	2.84
MIMAT0016852	hsa-miR-4298	41.23	45.19	2.09	2.51
MIMAT0019043	hsa-miR-2392	41.75	37.01	2.97	2.37
MIMAT0023711	hsa-miR-6086	46.66	46.13	13.83	15.87
MIMAT0027682	hsa-miR-6891-5p	57.41	56.60	1.74	2.52
MIMAT0019978	hsa-miR-4800-5p	59.24	74.92	50.37	87.27
MIMAT0003299	hsa-miR-630	60.69	52.43	3.27	7.27
MIMAT0018104	hsa-miR-3679-5p	60.74	67.14	1.95	3.67
MIMAT0027620	hsa-miR-6769b-5p	61.35	63.62	3.64	6.10
MIMAT0003945	hsa-miR-765	75.02	69.64	17.22	35.79
MIMAT0004761	hsa-miR-483-5p	76.63	85.20	2.24	5.68
MIMAT0028111	hsa-miR-7107-5p	78.43	76.45	1.92	3.70
MIMAT0005793	hsa-miR-320c	78.60	87.82	2.06	3.62
MIMAT0022496	hsa-miR-5703	80.75	65.47	3.19	7.11
MIMAT0028211	hsa-miR-7150	83.06	87.95	2.37	4.73
MIMAT0019936	hsa-miR-4778-5p	91.44	104.52	38.70	108.57
MIMAT0027634	hsa-miR-6867-5p	97.85	115.01	42.92	111.27
MIMAT0025476	hsa-miR-6510-5p	139.22	134.12	2.19	4.57
MIMAT0028117	hsa-miR-7110-5p	177.10	128.75	1.74	2.75

<실시예 4> 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction)을 통한 마이크로 RNA의 발현 변화 확인

두 가지 농도의 톨루엔 노출에 의해 공통으로 발현이 변화된 마이크로 RNA 87종 중 11종의 마이크로 RNA를 선별하였다. 이들 마이크로 RNA들은 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005880 hsa-miR-1290 Homo sapiens hsa-miR-1290. 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0012735 hsa-miR-718 Homo sapiens hsa-miR-718, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003240 hsa-miR-575 Homo sapiens hsa-miR-575, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004761 hsa-miR-483-5p Homo sapiens hsa-miR-483-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003237 hsa-miR-572 Homo sapiens hsa-miR-572, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018085 hsa-miR-3663-3p Homo sapiens hsa-miR-3663-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0020924 hsa-miR-642a-3p Homo sapiens hsa-miR-642a-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005793 hsa-miR-320c Homo sapiens hsa-miR-320c, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019069 hsa-miR-4530 Homo sapiens hsa-miR-4530, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018981 hsa-miR-4459 Homo sapiens hsa-miR-4459 및 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005929 hsa-miR-1275 Homo sapiens hsa-miR-1275 이다.

상기 마이크로 RNA들의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 상기 마이크로 RNA를 특이적으로 발현할 수 있는 프라이머를 제작하여(표 2), My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR)(Bio-rad, 미국)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다.

등록번호	유전자명	Mature마이크로RNA프라이머서열(5'→3')
MIMAT0005880	hsa-miR-1290	5'UGGAUUUUUGGAUCAGGGA (서열번호 1)
MIMAT0012735	hsa-miR-718	5'CUUCCGCCCCGCCGGGCGUCG (서열번호 2)
MIMAT0003240	hsa-miR-575	5'GAGCCAGUUGGACAGGAGC (서열번호 3)
MIMAT0004761	hsa-miR-483-5p	5'AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG (서열번호 4)
MIMAT0003237	hsa-miR-572	5'GUCCGCUCGGCGGUGGCCCA (서열번호 5)
MIMAT0018085	hsa-miR-3663-3p	5'UGAGCACCACACAGGCCGGGCGC (서열번호 6)
MIMAT0020924	hsa-miR-642a-3p	5'AGACACAUUUGGAGAGGGAACC (서열번호 7)
MIMAT0005793	hsa-miR-320c	5'AAAAGCUGGGUUGAGAGGGU (서열번호 8)
MIMAT0019069	hsa-miR-4530	5'CCCAGCAGGACGGGAGCG (서열번호 9)
MIMAT0018981	hsa-miR-4459	5'CCAGGAGGCGGAGGAGGUGGAG (서열번호 10)
MIMAT0005929	hsa-miR-1275	5'GUGGGGGAGAGGCUGUC (서열번호 11)

<4-1> cDNA 제조

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <3-1>에서 수득한 톨루엔 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다.

구체적으로, cDNA 제조는 Qiagen사의 miScript RT 키트를 사용하여 제조사의 방법대로 수행하였다. 상기 수득한 세포주 유래 전체 RNA 1 ㎍과 엑소좀 유래 전체 RNA 0.5㎍을 하기 표 3과 같이 시약을 혼합한 후 37℃에서 60분간 반응시킨 후 95℃에서 5분간 반응시켜 역전사 효소(Reverse Transcriptase)를 불활성화시켰다.

구성	부피(㎕)
RT 완충용액(buffer)	4
RNase-자유수(free water)	잔량(variable)
역전사 효소 믹스(Reverse Trascriptase Mix)	1
주형(Template)	1㎕까지
총 부피	20

<4-2> PCR 산물 정량을 통한 마이크로 RNA 발현 변화 확인

PCR 산물을 정량하기 위하여 Qiagen사의 miScript 사이버그린(SYBR Green) PCR 키트를 사용하여 PCR을 수행하였다. 사이버그린 I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저, 하기 표 4와 같이 PCR에 이용한 표적 마이크로 RNA와 Universal 프라이머, 그리고 내재성(endogenous) 대조군(RNU6B2)에 대한 프라이머를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 각각의 프라이머(표 2)를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다.

구성	부피(㎕)
사이버 그린 마스터 믹스(SYBR Green Master Mix)	5
Universal 프라이머(Primer)	1
프라이머(primer)	1
RNase-자유수(free water)	3.8
주형(Template) cDNA	0.2

그 결과, 표 5에서 나타난 바와 같이 과발현된 마이크로 RNA 11종의 발현 양상이 톨루엔 의한 마이크로 RNA 발현을 조사한 올리고 마이크로어레이 결과와 유사하게 나타남을 확인하였다(표 5).

	in vitro 상대적 비율
유전자명	마이크로어레이				실시간 PCR
유전자명	엑소좀		세포주		엑소좀		세포주
Systematic Name	TolIC₂₀	TolIC₅₀	TolIC₂₀	TolIC₅₀	TolIC₂₀	TolIC₅₀	TolIC₂₀	TolIC₅₀
hsa-miR-1290	17.57	12.67	2.09	3.57	142.02	167.34	2.3	2.14
hsa-miR-718	16.57	16.80	19.02	42.13	49.07	41.36	4.32	2.43
hsa-miR-575	11.84	30.44	2.52	5.38	41.84	25.52	8.32	1.52
hsa-miR-483-5p	76.63	85.20	2.24	5.68	236.66	174.85	29.31	5.79
hsa-miR-572	7.08	8.13	1.57	3.06	87.43	94.14	2.08	2.12
hsa-miR-3663-3p	11.66	10.41	2.76	6.67	85.43	82.33	3.37	2.51
hsa-miR-642a-3p	19.15	26.55	2.24	3.92	290.02	221.83	7.01	1.73
hsa-miR-320c	78.60	87.82	2.06	3.62	195.81	222.35	10.98	2.37
hsa-miR-4530	36.98	25.38	1.72	3.17	117.78	148.4	6.47	3.39
hsa-miR-4459	14.65	17.49	1.82	3.22	320.31	367.94	15.56	3.59
hsa-miR-1275	29.95	33.30	1.77	2.76	54.82	65.19	13.39	1.67

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명은 인체에 다양한 질병을 유발하는 등 독성작용을 갖는 톨루엔의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하게 사용할 수 있으며, 톨루엔에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> microRNAs from exosomes and cell line for identification of exposure to toluene and the method of identification using thereof <130> 2016P-01-052 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-1290 <400> 1 uggauuuuug gaucaggga 19 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-718 primer <400> 2 cuuccgcccc gccgggcguc g 21 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-575 primer <400> 3 gagccaguug gacaggagc 19 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-483-5p primer <400> 4 aagacgggag gaaagaaggg ag 22 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-572 primer <400> 5 guccgcucgg cgguggccca 20 <210> 6 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-3663-3p primer <400> 6 ugagcaccac acaggccggg cgc 23 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-642a-3p primer <400> 7 agacacauuu ggagagggaa cc 22 <210> 8 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-320c primer <400> 8 aaaagcuggg uugagagggu 20 <210> 9 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-4530 primer <400> 9 cccagcagga cgggagcg 18 <210> 10 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-4459 primer <400> 10 ccaggaggcg gaggaggugg ag 22 <210> 11 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-1275 primer <400> 11 gugggggaga ggcuguc 17

Claims

하기의 모든 마이크로 RNA의 상보가닥 분자가 집적된, 톨루엔(Toluene) 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩;
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0015041 hsa-miR-1260b Homo sapiens hsa-miR-1260b, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005911 hsa-miR-1260a Homo sapiens hsa-miR-1260a, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000269 hsa-miR-212-3p Homo sapiens hsa-miR-212-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000252 hsa-miR-7-5p Homo sapiens hsa-miR-7-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0016916 hsa-miR-4286 Homo sapiens hsa-miR-4286, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0022967 hsa-miR-3620-5p Homo sapiens hsa-miR-3620-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027539 hsa-miR-6819-3p Homo sapiens hsa-miR-6819-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0016865 hsa-miR-4313 Homo sapiens hsa-miR-4313, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019006 hsa-miR-4478 Homo sapiens hsa-miR-4478, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003257 hsa-miR-550a-3p Homo sapiens hsa-miR-550a-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027616 hsa-miR-6858-5p Homo sapiens hsa-miR-6858-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000267 hsa-miR-210-3p Homo sapiens hsa-miR-210-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0022929 hsa-miR-758-5p Homo sapiens hsa-miR-758-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000440 hsa-miR-191-5p Homo sapiens hsa-miR-191-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004682 hsa-miR-361-3p Homo sapiens hsa-miR-361-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019015 hsa-miR-4481 Homo sapiens hsa-miR-4481, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027644 hsa-miR-6872-5p Homo sapiens hsa-miR-6872-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018992 hsa-miR-4465 Homo sapiens hsa-miR-4465, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003888 hsa-miR-766-3p Homo sapiens hsa-miR-766-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019019 hsa-miR-4485-3p Homo sapiens hsa-miR-4485-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019779 hsa-miR-4690-5p Homo sapiens hsa-miR-4690-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0015078 hsa-miR-3194-5p Homo sapiens hsa-miR-3194-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027514 hsa-miR-6807-5p Homo sapiens hsa-miR-6807-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0023698 hsa-miR-6073 Homo sapiens hsa-miR-6073, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019052 hsa-miR-4515 Homo sapiens hsa-miR-4515, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0025855 hsa-miR-6723-5p Homo sapiens hsa-miR-6723-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027355 hsa-miR-6727-5p Homo sapiens hsa-miR-6727-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003237 hsa-miR-572 Homo sapiens hsa-miR-572, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0022941 hsa-miR-1227-5p Homo sapiens hsa-miR-1227-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004687 hsa-miR-371a-5p Homo sapiens hsa-miR-371a-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0028113 hsa-miR-7108-5p Homo sapiens hsa-miR-7108-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004595 hsa-miR-135a-3p Homo sapiens hsa-miR-135a-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0030987 hsa-miR-8060 Homo sapiens hsa-miR-8060, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027470 hsa-miR-6785-5p Homo sapiens hsa-miR-6785-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000772 hsa-miR-345-5p Homo sapiens hsa-miR-345-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019071 hsa-miR-4532 Homo sapiens hsa-miR-4532, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027686 hsa-miR-6893-5p Homo sapiens hsa-miR-6893-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019793 hsa-miR-4698 Homo sapiens hsa-miR-4698, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018085 hsa-miR-3663-3p Homo sapiens hsa-miR-3663-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003240 hsa-miR-575 Homo sapiens hsa-miR-575, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019913 hsa-miR-4763-3p Homo sapiens hsa-miR-4763-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019868 hsa-miR-4739 Homo sapiens hsa-miR-4739, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027404 hsa-miR-6752-5p Homo sapiens hsa-miR-6752-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027600 hsa-miR-6850-5p Homo sapiens hsa-miR-6850-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018981 hsa-miR-4459 Homo sapiens hsa-miR-4459, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0022709 hsa-miR-652-5p Homo sapiens hsa-miR-652-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0012735 hsa-miR-718 Homo sapiens hsa-miR-718, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005880 hsa-miR-1290 Homo sapiens hsa-miR-1290, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0020924 hsa-miR-642a-3p Homo sapiens hsa-miR-642a-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004911 hsa-miR-874-3p Homo sapiens hsa-miR-874-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000457 hsa-miR-188-5p Homo sapiens hsa-miR-188-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027450 hsa-miR-6775-5p Homo sapiens hsa-miR-6775-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018929 hsa-miR-4417 Homo sapiens hsa-miR-4417, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003326 hsa-miR-663a Homo sapiens hsa-miR-663a, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027472 hsa-miR-6786-5p Homo sapiens hsa-miR-6786-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018444 hsa-miR-642b-3p Homo sapiens hsa-miR-642b-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0022838 hsa-miR-1185-1-3p Homo sapiens hsa-miR-1185-1-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0023252 hsa-miR-5787 Homo sapiens hsa-miR-5787, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000258 hsa-miR-181c-5p Homo sapiens hsa-miR-181c-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0016889 hsa-miR-4327 Homo sapiens hsa-miR-4327, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005929 hsa-miR-1275 Homo sapiens hsa-miR-1275, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0028115 hsa-miR-7109-5p Homo sapiens hsa-miR-7109-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0016901 hsa-miR-4271 Homo sapiens hsa-miR-4271, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0024599 hsa-miR-6126 Homo sapiens hsa-miR-6126, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0022942 hsa-miR-1229-5p Homo sapiens hsa-miR-1229-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019073 hsa-miR-4534 Homo sapiens hsa-miR-4534, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004749 hsa-miR-424-3p Homo sapiens hsa-miR-424-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019069 hsa-miR-4530 Homo sapiens hsa-miR-4530, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0016900 hsa-miR-4270 Homo sapiens hsa-miR-4270, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0016852 hsa-miR-4298 Homo sapiens hsa-miR-4298, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019043 hsa-miR-2392 Homo sapiens hsa-miR-2392, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0023711 hsa-miR-6086 Homo sapiens hsa-miR-6086, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027682 hsa-miR-6891-5p Homo sapiens hsa-miR-6891-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019978 hsa-miR-4800-5p Homo sapiens hsa-miR-4800-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003299 hsa-miR-630 Homo sapiens hsa-miR-630, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018104 hsa-miR-3679-5p Homo sapiens hsa-miR-3679-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027620 hsa-miR-6769b-5p Homo sapiens hsa-miR-6769b-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003945 hsa-miR-765 Homo sapiens hsa-miR-765, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004761 hsa-miR-483-5p Homo sapiens hsa-miR-483-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0028111 hsa-miR-7107-5p Homo sapiens hsa-miR-7107-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005793 hsa-miR-320c Homo sapiens hsa-miR-320c, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0022496 hsa-miR-5703 Homo sapiens hsa-miR-5703, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0028211 hsa-miR-7150 Homo sapiens hsa-miR-7150, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019936 hsa-miR-4778-5p Homo sapiens hsa-miR-4778-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0027634 hsa-miR-6867-5p Homo sapiens hsa-miR-6867-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0025476 hsa-miR-6510-5p Homo sapiens hsa-miR-6510-5p 및 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0028117 hsa-miR-7110-5p Homo sapiens hsa-miR-7110-5p.
하기의 마이크로 RNA에 상보적이고, 상기 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 모든 프라이머를 포함하는 톨루엔 노출 여부 확인용 키트;
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005880 hsa-miR-1290 Homo sapiens hsa-miR-1290, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0012735 hsa-miR-718 Homo sapiens hsa-miR-718, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003240 hsa-miR-575 Homo sapiens hsa-miR-575, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004761 hsa-miR-483-5p Homo sapiens hsa-miR-483-5p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003237 hsa-miR-572 Homo sapiens hsa-miR-572, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018085 hsa-miR-3663-3p Homo sapiens hsa-miR-3663-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0020924 hsa-miR-642a-3p Homo sapiens hsa-miR-642a-3p, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005793 hsa-miR-320c Homo sapiens hsa-miR-320c, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019069 hsa-miR-4530 Homo sapiens hsa-miR-4530, 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018981 hsa-miR-4459 Homo sapiens hsa-miR-4459 및 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005929 hsa-miR-1275 Homo sapiens hsa-miR-1275.
1) 톨루엔에 노출된 실험군 및 정상 대조군으로부터 분리된 체세포에서 total RNA를 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 각각의 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 형광물질로 표지된 RNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 상기 단계 3)의 반응한 실험군 및 대조군의 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 분석한 데이터에서 실험군의 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법.
1) 톨루엔에 노출된 실험군 및 정상 대조군으로부터 분리된 체세포에서 각각의 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 분리된 엑소좀에서 total RNA를 추출하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 실험군과 대조군의 RNA를 각각의 다른 형광물질로 표지하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 형광물질로 표지된 RNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
5) 상기 단계 4)의 반응한 실험군 및 대조군의 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
6) 상기 단계 5)의 분석한 데이터에서 실험군의 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 체세포는 인간의 혈액 세포인 것을 특징으로 하는 톨루엔 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 인간 혈액 세포는 HL-60인 것을 특징으로 하는 톨루엔 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 엘-리신-플루오레세인 이소티오시안산염(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-비-이소티오시안산염(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 톨루엔 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법.
1) 톨루엔에 노출된 실험군 및 정상 대조군으로부터 분리된 체세포에서 total RNA를 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 제 1항의 마이크로어레이칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
1) 톨루엔에 노출된 실험군 및 정상 대조군으로부터 분리된 체세포에서 각각의 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 분리된 엑소좀에서 total RNA를 추출하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 실험군과 대조군의 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 제 1항의 마이크로어레이칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 체세포는 인간의 혈액 세포인 것을 특징으로 하는 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
제 10항에 있어서, 상기 인간 혈액 세포는 HL-60인 것을 특징으로 하는 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 프라이머는 하기 프라이머 1 내지 11으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법:
프라이머 1 - 서열번호 1로 기재된 프라이머;
프라이머 2 - 서열번호 2로 기재된 프라이머;
프라이머 3 - 서열번호 3로 기재된 프라이머;
프라이머 4 - 서열번호 4로 기재된 프라이머;
프라이머 5 - 서열번호 5로 기재된 프라이머;
프라이머 6 - 서열번호 6로 기재된 프라이머;
프라이머 7 - 서열번호 7로 기재된 프라이머;
프라이머 8 - 서열번호 8로 기재된 프라이머;
프라이머 9 - 서열번호 9로 기재된 프라이머;
프라이머 10 - 서열번호 10로 기재된 프라이머; 및
프라이머 11 - 서열번호 11으로 기재된 프라이머.
제 1항의 DNA 마이크로 어레이 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 키트.
제 13항에 있어서, 인간 혈액 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 톨루엔에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 키트.