KR101460529B1

KR101460529B1 - 톨루엔 인체 노출 특이적 메틸화 마커 유전자 및 이를 이용한 톨루엔 노출 여부 확인 방법

Info

Publication number: KR101460529B1
Application number: KR1020130025111A
Authority: KR
Inventors: 류재천; 송미경; 송미; 최한샘
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2013-03-08
Filing date: 2013-03-08
Publication date: 2014-11-10
Also published as: KR20140110550A

Abstract

본 발명은 휘발성 유기 화합물류 중의 하나인 톨루엔(Toluene)의 인체 노출에 특이적인 메틸화 바이오마커 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 톨루엔에 의해 특정 유전자의 프로모터 부위가 특이적으로 메틸화되는 톨루엔 노출 특이적 마커 유전자 및 이를 이용한 톨루엔에 대한 인체 노출 확인 방법에 관한 것이다. 본 발명의 메틸화 마커는 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자의 메틸화된 프로모터 부위를 바이오마커로 이용하여 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 환경 중 노출된 인체 시료에서 톨루엔의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 톨루엔에 의해 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

Description

톨루엔 인체 노출 특이적 메틸화 마커 유전자 및 이를 이용한 톨루엔 노출 여부 확인 방법{Methylation marker for identification of exposure to toluene and the method of identification using thereof}

본 발명은 톨루엔(toluene) 노출에 특이적인 메틸화 바이오마커 및 이를 이용한 톨루엔에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.

생체에서 유전자의 단백질-코딩 서열에서 변이가 없더라도 상기 유전자의 기능이 손실되어 주된 메커니즘이 방해받게 된다. DNA 메틸화는 이러한 현상 중의 하나이며 특정 유전자의 프로모터 부위가 과메틸화(하이퍼메틸레이션)되면 상기 유전자의 발현이 억제되고 반대로 저메틸화(하이포메틸레이션)되면 유전자의 발현이 증가한다. DNA 메틸화는 원핵생물에서는 외부 유전자의 침입으로부터 보호해 주는 역할을 하며, 진핵생물에서는 발달과정에서 유전자의 발현을 조절해 주는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근의 연구에서는 DNA 메틸화가 그 외에도 유전체 각인 및 안정화나 X염색체의 불활성화 등에도 관여하며, 조직 특이적 유전자 활성, 질병과 연관된 유전자들의 발현 증가 또는 억제에도 영향을 미친다는 것이 밝혀지고 있다. 메틸화의 메커니즘은 암 발병, 세포 노화, 장기의 성장 등에 중요한 영향을 미치고 있으며, 이에 따라 메틸화 관련 연구는 암 발생, 노화 등의 생명현상 인과 관계 규명에 중추적 역할을 할 뿐만 아니라, 향후 발생 및 분화나 줄기세포를 이용한 세포치료제 개발 등의 연구에도 적용시킬 수 있는 우리나라 바이오 연구의 핵심 분야로 자리 잡을 수 있을 것으로 예상된다. 따라서, 메틸화 마커의 발굴은 암을 포함하여 질병의 조기 진단 가능성을 예측하는 데에 많은 도움을 줄 것이라는 점에서 의의가 있다.

최근의 급격한 기술 발달에 따라, 유전체 전반에 걸친 메틸화 분석이 시도되고 있으며, 이를 통해 이제까지 알려지지 않은 새로운 것을 포함하여 전반적인 메틸화의 기능에 대한 연구가 가능해 질 것으로 여겨지고 있다. 특히 고분해능의 마이크로어레이와 초고속 차세대 염기서열분석 등의 기술들은 보다 많은 질병에 있어서 메틸화 전반에 걸친 연구를 가능하게 하여 질병 유발 과정에 대한 새로운 지식을 제공하고 이를 통한 새로운 진단 마커 및 치료 표적의 발굴을 가능하게 할 것이다.

뿐만 아니라 메틸화 마커는 특정 환경유해물질의 노출 예측에도 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 생각되어지고 있다. 지금까지는 환경유해물질의 노출에 따른 유전자(mRNA)의 변화 양상과 그에 따른 질병과의 연관성에 관련된 연구가 주로 진행되었으나 최근 DNA 메틸화와의 연관성에 대한 관심이 증가함에 따라 몇몇 연구에서 benzene(벤젠), arsenic(비소) 또는 RDX와 같은 유해물질의 노출에 따른 메틸화 변화를 관찰하였으며 특이적인 변화를 보이는 메틸화 유전자를 유해물질에 대한 마커로 제시하였다(Baccarelli, A. & Bollati, V. Curr . Opin . Prediatr . 21, 243-251, 2009 참조). 또한 발굴된 메틸화 유전자는 노출 예측을 위한 마커로서 뿐만 아니라 환경유해물질에 의한 독성 기작 예측을 위한 마커로서도 유용하게 쓰일 수 있다. 이렇듯 메틸화 마커의 환경유해물질 노출 및 독성기작 예측에서의 역할이 매우 중요하다고 할 수 있음에도 불구하고 현재 DNA 메틸화 관련 연구는 주로 질병 진단용 마커 발굴에 국한되어 있으며 다양한 환경 중에 노출 가능성이 매우 큰 휘발성 유기 화합물류와 같은 유해물질 노출에 의한 유전자 메틸화 변화에 대한 연구는 부족하다. 또한, 후성유전학적 변화는 유전자의 발현과 같은 유전학적 변화의 다양성에 비해 그 정도가 심하지 않게 때문에 다수의 마커가 필요한 유전자 발현 프로파일링에 비해서 단 하나의 DNA 메틸화나 마이크로 RNA와 같은 후성유전체 마커로도 질병이나 유해물질 노출을 초기에 진단할 수 있다는 장점뿐만 아니라 비침습적 방법으로 진단할 수 있다는 이점이 있다.

휘발성 유기 화합물류 중에서 톨루엔(toluene)은 석유, 석탄 및 스틸렌 생산 공정에서 발생하는 부산물, 화학적 중간매체 및 담배연기 등에 포함되어 있다. 톨루엔은 휘발성이 있으며 토양에서의 휘발성이 다른 화합물에 비해 빠르다. 대기중 반감기가 빨라 넓은 부위로의 이동이 용이하며 표면수에서 공기중으로의 이동도 빠르다. 톨루엔은 무색투명한 가연성으로서 방향성 벤젠과 유사한 냄새가 나고 알코올, 클로로포름, 에테르, 성유에테르, 아세톤, 빙초산, 이황화탄소, 벤젠 및 아세트산 등과 혼합되나 물(0.067%)에는 녹지 않는다. 톨루엔은 주로 화학 합성 시 중간제, 화학용제 등으로 사용되며 인체 발암성 자료로서 역학 자료는 거의 없다. 자연발생적 오염원은 화산, 산불, 원유 등이며 인공적 오염원으로는 자동차 배기장치, 가솔린 저장탱크, 주유소, 소화기 등이 있다. 톨루엔을 처음에는 톨루발삼(tolu balsam)을 건류하여 얻었으며, 19세기 후반에는 석탄 건류(탄화)의 부산물을 이용하여 생산하였으며 2차 대전 후, 석유로부터 톨루엔 제조가 증가되었고 코크(coke)와 석탄타르는 감소하였다. 현재는 87%의 톨루엔은 정제분류의 촉매 reforming에 의해 생산되고 9%은 에틸렌과 프로필렌 제조 시 증기분해 반응탑에서 유도된 가솔린 열분해 과정에서 분리된다. 그 외 4%은 다른 과정의 부산물에서 생산되고 있다. 톨루엔은 일부 초목의 유형에서 자연적으로 발생되기도 하나(Toxicological Profile for Toluene, U.S.;2000), 주된 오염원으로는 석유 정제공정, 코크스 오븐공정, 페인트, 잉크, 신나, 접착제, 화장품의 성분 및 스티렌 등 다른 화학물질의 생산 등에 사용되며 이로 인하여 환경 중으로 배출된다(환경부, 1997).

톨루엔은 유기용매로서 널리 이용되어 도료나 접착제 등에 사용되어 왔으며 체내에 과량 흡입될 경우 복통, 구토와 같은 위장관계의 기능장애를 초래할 뿐만 아니라 두통, 현훈 및 환각증세와 같은 신경장애를 일으킨다고 알려져 있다. 더욱이 근대산업이 발달함에 따라 산업체 근로자가 과량의 유기용매에 장기간 노출되는 경우가 날로 증가하고 있으며 근래 일부 청소년층에서 도취감을 얻기 위한 수단으로 접착제를 통한 톨루엔의 흡입이 유행되고 있어 이의 흡입이 생체기능, 특히 정신신경계에 미치는 효과 규명이 긴요한 과제로 대두되고 있다. 급성 또는 만성적인 톨루엔 흡입은 자율신경계를 포함한 중추신경계의 기능장애를 유발하며 EEG의 변화와 acetylcholine을 포함한 신경전도물질의 분비 및 대사에 변화를 초래한다. 톨루엔은 벤젠 고리 중의 하나인 -H가 알킬기(-CH3)로 바뀐 것으로 가소제나 합성섬유 등의 합성원료로 사용이 되며 톨루엔은 벤젠보다 피부나 점막에 주는 자극이 강하며 증기흡입에 의한 중추신경에 주는 작용도 벤젠보다 강하다고 한다. 100~200 ppm의 증기를 8시간 흡입하면 피로, 구토, 감각저하, 운동불능, 무기력, 졸림 등의 증상을 보이며 600 ppm 정도의 농도가 되면 단시간 노출만으로 심한 흥분, 강한 피로감, 구토, 두통을 일으킨다.

국내 식품 및 소비재 중 톨루엔에 대한 오염도 자료는 휘발성이 높은 톨루엔이라는 물질의 특성상 조사 자료가 미흡하다. 국내 톨루엔이 함유되어 있는 제품은 최근 유사휘발유로 제품화되어 나온 첨가제 등의 자동차원료, 폭약, 염료, 페인트, 잉크, 접착제, 인공가죽제조, 용매, 화장품, 의약품, 락카희석제, 수지류, 세제 및 향료 등으로 다양하며(환경부, 1997: 국립환경연구원, 환경자료집, 1999), 이들 제품 사용시 호흡기 및 피부접촉을 통해 인체 노출가능성은 있으나 접착제(10% 미만)와 물휴지(불검출)에서만 톨루엔 농도를 규제하고 있다(식품의약품안전청 위해예방정책국).

또한, 휘발성 유기 화합물류의 인체 독성 정도와 유전자 발현 변화에 대한 연구는 일부 보고되고 있지만, 대표적인 휘발성 유기 화합물류로 알려진 포름알데하이드, 벤젠(Formaldehyde, Benzene) 등에 대한 연구에 거의 국한되어 있다. 이처럼 톨루엔의 인간에 대한 잠재적 위해성에도 불구하고 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 보다 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 마이크로 어레이 칩 또는 프라이머(primer)를 이용하는 실시간(real-time) PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 등으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용, 특히 암을 비롯한 다양한 질병 유발에 관여하는 메틸화 변화 여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 톨루엔의 인체 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.

DNA chip 기술의 발달로 인해 최근 연구들은 암이나 기타 질병 또는 특정 자극에 따른 DNA 메틸화 양상 변화의 특징을 분석하는 쪽으로 이루어지고 있다. 이러한 분석 방법에는 methylation된 sequence와 그렇지 않은 sequence의 차이를 이용, 제한효소를 사용하는 방법(HELP)과 항 5-methylcytosine 항체를 이용한 면역침강 방법(MIRA, MeDIP) 그리고 sodium bisulfite를 이용한 sequence 분석 방법 등 다양한 방법이 최근 들어 개발 및 사용되고 있다. 이들 중 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자 메틸화 양상을 확인하고 이들의 기능을 연구하기 위한 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구, 즉 마이크로어레이(microarray) 분석이 주로 이루어지고 있다.

마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et. al. J. Am . Acad . Dermatol. 51, 681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al. J. Am . Acad . Dermatol. 51, 681-692, 2004).

유전자의 메틸화 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 메틸화된 DNA만을 얻어 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 DNA는 형광이나 동위원소로 표지화한다.

최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯해 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서의 DNA 메틸화 변화 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 메틸화 양상을 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 확인이 가능하게 될 것이다.

이에 본 발명자들은 인간 유전자 프로모터 부위 41만 여개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 톨루엔의 DNA 메틸화 프로파일을 실제 톨루엔에 노출된 작업장의 근로자로부터 혈액 시료를 얻어 관찰 및 분석한 결과, 톨루엔의 인체 노출에 의해 특이적으로 변화되는 메틸화 DNA를 발굴하고, 상기 메틸화 DNA를 이용하여 톨루엔 노출 여부를 확인하는 방법을 확립하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 톨루엔(toluene) 노출에 의해 특이적으로 메틸화 정도가 변화되는 유전자 및 상기 유전자를 바이오마커로 이용하여 톨루엔에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 톨루엔(toluene) 노출에 의해 메틸화 정도의 변화를 일으키는 바이오마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 유전자 프로모터 부위 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 톨루엔 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다:

유전자 등록번호(Genebank): NM_001145416(TMEM205, transmembrane protein 205),

유전자 등록번호: NM_004302(ACVR1B, activin A receptor, type IB),

유전자 등록번호: NM_025150(TARS2, threonyl-tRNA synthetase 2, mitochondrial (putative)),

유전자 등록번호: NM_001166034(SBSN, suprabasin),

유전자 등록번호: NM_144653(NACC2, NACC family member 2, BEN and BTB (POZ) domain containing),

유전자 등록번호: NM_173515(CNKSR3, CNKSR family member 3),

유전자 등록번호: NM_001136046(ZMYND15, zinc finger, MYND-type containing 15),

유전자 등록번호: NM_001128826(NCS1, neuronal calcium sensor 1),

유전자 등록번호: NM_001128141(DPEP1, dipeptidase 1 (renal)),

유전자 등록번호: NM_175895(C12orf61, chromosome 12 open reading frame 61),

유전자 등록번호: NM_001009997(C10orf62, chromosome 10 open reading frame 62),

유전자 등록번호: NM_002926(RGS12, regulator of G-protein signaling 12),

유전자 등록번호: NM_031219(HDHD3, haloacid dehalogenase-like hydrolase domain containing 3),

유전자 등록번호: NM_001025591(SCGBL, secretoglobin-like),

유전자 등록번호: NM_032323(TMEM79, transmembrane protein 79),

유전자 등록번호: NM_148178(C9orf23, chromosome 9 open reading frame 23), 및

유전자 등록번호 NM_002221(ITPKB, inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase B).

또한, 본 발명은

1) 톨루엔 노출이 의심되는 실험군 및 정상 대조군의 혈액시료에서 DNA를 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 DNA를 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;

3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 DNA를 상기 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 하는 단계;

4) 단계 3)의 반응한 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및

5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 상기 마이크로어레이 칩에 직접된 유전자의 메틸화 변화 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔 노출 여부 확인하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 톨루엔 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

본 발명의 톨루엔(toluene) 노출에 의해 메틸화 정도의 변화를 일으키는 바이오마커 및 이를 이용한 톨루엔 노출 여부 확인 방법은, 톨루엔의 노출을 조기에 모니터링 및 판정이 가능하고, 통상적인 방법에 비해 정확하게 노출을 모니터링 할 수 있어 유용하며, 톨루엔에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

도 1은 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 이용한 톨루엔(toluene; TOL)에 노출된 인간 혈액시료에서의 DNA 메틸화 변화 양상을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 톨루엔 인체 노출에 의해 특이적으로 메틸화 양상이 변화하는 17종의 유전자 프로브의 메틸화 변화 양상을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 PCA 분석을 이용한 톨루엔에 노출된 인간 혈액시료와 노출되지 않은 인간 혈액시료의 DNA 메틸화 변화 양상을 비교 분석한 결과를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 톨루엔(toluene)의 노출에 의해 특이적으로 DNA 메틸화 정도가 변화를 일으키는 바이오마커를 제공한다.

상기 바이오마커는 p-value < 0.05로 유의성 있게 변화를 보인 메틸화 DNA로써, 톨루엔 노출에 의해 메틸화 변화가 3.0배 이상 감소된 프로모터 부위를 가지는 유전자로 구성되어 있다.

상기 유전자는 하기의 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다:

유전자 등록번호: NM_004302(ACVR1B, activin A receptor, type IB),

유전자 등록번호: NM_001166034(SBSN, suprabasin),

유전자 등록번호: NM_173515(CNKSR3, CNKSR family member 3),

유전자 등록번호: NM_001128826(NCS1, neuronal calcium sensor 1),

유전자 등록번호: NM_001128141(DPEP1, dipeptidase 1 (renal)),

유전자 등록번호: NM_002926(RGS12, regulator of G-protein signaling 12),

유전자 등록번호: NM_001025591(SCGBL, secretoglobin-like),

유전자 등록번호: NM_032323(TMEM79, transmembrane protein 79),

상기 프로모터 부위는 하기와 같이 구성된 군에서 선택되어지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

유전자 등록번호: NM_001145416(TMEM205, transmembrane protein 205)의 프로모터 부위는 서열번호 1로 기재되는 염기서열,

유전자 등록번호: NM_004302(ACVR1B, activin A receptor, type IB)의 프로모터 부위는 서열번호 2로 기재되는 염기서열 ,

유전자 등록번호: NM_025150(TARS2, threonyl-tRNA synthetase 2, mitochondrial (putative))의 프로모터 부위는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열,

유전자 등록번호: NM_001166034(SBSN, suprabasin)의 프로모터 부위는 서열번호 4로 기재되는 염기서열,

유전자 등록번호: NM_144653(NACC2, NACC family member 2, BEN and BTB (POZ) domain containing)의 프로모터 부위는 서열번호 5로 기재되는 염기서열,

유전자 등록번호: NM_173515(CNKSR3, CNKSR family member 3)의 프로모터 부위는 서열번호 6으로 기재되는 염기서열,

유전자 등록번호: NM_001136046(ZMYND15, zinc finger, MYND-type containing 15)의 프로모터 부위는 서열번호 7로 기재되는 염기서열,

유전자 등록번호: NM_001128826(NCS1, neuronal calcium sensor 1)의 프로모터 부위는 서열번호 8로 기재되는 염기서열,

유전자 등록번호: NM_001128141(DPEP1, dipeptidase 1 (renal))의 프로모터 부위는 서열번호 9로 기재되는 염기서열,

유전자 등록번호: NM_175895(C12orf61, chromosome 12 open reading frame 61)의 프로모터 부위는 서열번호 10으로 기재되는 염기서열,

유전자 등록번호: NM_001009997(C10orf62, chromosome 10 open reading frame 62)의 프로모터 부위는 서열번호 11로 기재되는 염기서열,

유전자 등록번호: NM_002926(RGS12, regulator of G-protein signaling 12)의 프로모터 부위는 서열번호 12로 기재되는 염기서열,

유전자 등록번호: NM_031219(HDHD3, haloacid dehalogenase-like hydrolase domain containing 3)의 프로모터 부위는 서열번호 13으로 기재되는 염기서열,

유전자 등록번호: NM_001025591(SCGBL, secretoglobin-like)의 프로모터 부위는 서열번호 14로 기재되는 염기서열,

유전자 등록번호: NM_032323(TMEM79, transmembrane protein 79)의 프로모터 부위는 서열번호 15로 기재되는 염기서열,

유전자 등록번호: NM_148178(C9orf23, chromosome 9 open reading frame 23)의 프로모터 부위는 서열번호 16으로 기재되는 염기서열, 및

유전자 등록번호 NM_002221(ITPKB, inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase B)의 프로모터 부위는 서열번호 17로 기재되는 염기서열.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 톨루엔의 인체 노출 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 전라남도 영암 소재의 톨루엔을 취급하는 선박제조 사업장의 근로자를 대상으로 혈액시료를 채취하였으며 생물학적 노출 지표(biological exposure index; BEI)에 따라 대사산물을 분석하여 유해물질 노출의 생체지표로 활용하였다(표 1 참조). 톨루엔의 경우 hippuri acid(HA)를 생체지표로 분석하였으며, 요중 크레아티닌 분석을 하여 각각의 수치를 보정하였다.

이후 상기 농도로 톨루엔 노출을 보이는 노출군과 비노출군 근로자의 혈액시료로부터 메틸화 DNA만을 특이적으로 분리하여 whole genome amplification를 하면서 형광물질(Cy5)로 표지하였으며 input DNA의 경우 Cy3로 표지하였다. 상기 형광표지된 DNA를 Agilent SurePrint G3 Human Promoter 2x400K microarray(Agilent, USA)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 DNA 메틸화 양상의 차이를 분석하였다(도 1 참조). 분석시 비노출군에 비해 유의하게 메틸화 변화를 나타낸 DNA에 대해 unpaired Welchs t-test, Multiple Test Correction - Benjamini and Hochberg False Discovery Rate를 통해서 p-value < 0.05로 유의성 있게 메틸화 변화 양상을 보인 유전자의 프로모터 부위 2,206종을 선별하였다. 이들 중 분석 결과, 메틸화 변화가 3.0배 이상 감소된 프로모터 부위를 가지는 유전자가 17종이었으며(표 3, 도 2), 이들 메틸화 유전자들은 톨루엔의 인체노출 시 독성과 관련되어 있다는 보고는 없다.

따라서, 본 발명의 톨루엔 노출에 특이적 메틸화 바이오마커는 톨루엔 노출을 조기에 모니터링 및 판정이 가능하고 통상적인 방법에 비해 정확하게 노출을 모니터링 할 수 있어 유용하며, 톨루엔에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자 프로모터 부위 또는 그의 상보가닥 분자가 직접된 톨루엔 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩을 제공한다:

유전자 등록번호: NM_004302(ACVR1B, activin A receptor, type IB),

유전자 등록번호: NM_001166034(SBSN, suprabasin),

유전자 등록번호: NM_173515(CNKSR3, CNKSR family member 3),

유전자 등록번호: NM_001128826(NCS1, neuronal calcium sensor 1),

유전자 등록번호: NM_001128141(DPEP1, dipeptidase 1 (renal)),

유전자 등록번호: NM_002926(RGS12, regulator of G-protein signaling 12),

유전자 등록번호: NM_001025591(SCGBL, secretoglobin-like),

유전자 등록번호: NM_032323(TMEM79, transmembrane protein 79),

본 발명의 톨루엔 검색용 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 inkjet 방식 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 SurePrint inkjet micro dropping 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 에폭시(epoxy), 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 에폭시가 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 톨루엔 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 톨루엔 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다:

5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 상기 마이크로어레이 칩에 직접된 유전자의 메틸화 변화 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔 노출 여부 확인 방법.

상기 노출 여부 확인 방법에 있어서, 단계 1)의 혈액시료는 톨루엔에 노출되거나 노출되지 않은 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 노출 여부 확인 방법에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 노출 여부 확인 방법에 있어서, 단계 3)의 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩은 Agilent SurePrint G3 Human Promoter 2x400K microarray (Agilent, USA) 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 DNA 프로모터 부위 중 본 발명에서 상기 메틸화 양상이 변화된 DNA 프로모터 부위(표 3 및 표 4 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 4)의 분석 방법은 Genomic Workbench와 GeneSpring GX 12 소프트웨어(Agilent, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 포함하는 톨루엔 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

상기 확인용 키트에 추가적으로 인간 혈액시료를 포함하는 톨루엔의 인체 노출에 대한 DNA 메틸화 변화 여부 확인용 키트를 제공한다. 상기 인간 혈액시료는 톨루엔에 노출되거나 노출되지 않은 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.

상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 연구모집단 및 혈액시료 수득

<1-1> 연구모집단

톨루엔 노출군과 비노출군 근로자들은 가톨릭대학교 의과대학 산업보건연구소 연구원들에 의해 모집하였다. 본 연구의 모집단은 톨루엔을 취급하는 선박제조 업체의 톨루엔에 노출되거나 노출되지 않은 근로자들(N=16)로 구성되었다(표 1). 이들 시료는 성별, 연령분포, 근무경력, 흡연이나 음주 등의 생활습관, 평균 근무시간 등의 요인들과 무관하게 선정하였으며 약물 복용자는 제외하였다. 실험에 앞서 본 연구방법은 IRB 위원회로부터 평가되고 인증 받았으며(승인번호 CUMC10U066) 실험에 앞서 모든 참가자는 동의서를 읽고 서명하였다.

	샘플 번호 (sample No.)	직종	공정	대사산물 분석 결과
	샘플 번호 (sample No.)	직종	공정	톨루엔 HA(g/gCr)
비노출군 (n=6)	A0-003	C/L	E/R CLEANING	0.10
	A0-006	관리자	현장관리	0.21
	A0-010	관리자	현장관리	0.21
	B0-007	소지	B/L	0.03
	C0-005	도장	자재	0.19
	D1-002	도장	B/L	0.06
톨루엔 노출군 (n=10)	A1-006	도장	E/R 스프레이	0.42
	A1-007	도장	E/R 스프레이	0.90
	A1-021	도장	E/R T/UP	0.27
	A1-025	도장	E/R T/UP	0.34
	A1-027	도장	E/R T/UP	0.28
	A1-028	도장	E/R T/UP	0.32
	A1-035	도장	E/R T/UP	0.70
	B1-019	도장	S/P	0.32
	B1-031	소지	C/L	0.37
	C1-017	도장	SPRAY 사수	0.28

<1-2> 연구모집단의 피검화합물 노출 여부 확인

생물학적 노출지표(Biological Exposure Index; BEI)에 따라 대사산물을 분석하여 톨루엔의 생체지표로 활용하였다. 현재까지는 국내 생물학적 노출지표(BEI) 기준이 명확하지 않아 국제적으로 많이 통용되는 미국 정부산업 위생전문가협의회(ACGIH, American conference of Governmental Industrial Hygienists)의 기준 BEI를 대사산물 측정 기준으로 하였다. 톨루엔의 경우 hippuri acid(HA, 중 마뇨산)를 생체지표로 분석하였으며 요중 마뇨산 분석을 위하여 채취된 소변은 적합한 시료의 선택을 위하여 요중 크레아티닌을 분석하여 하기 [수학식 1]과 같이 보정하였다.

<1-3> 혈액시료

동의서를 받은 후, 혈액시료는 연구 간호사에 의해 EDTA tube를 사용하여 수득하였으며 -20℃에서 24시간 보관 후 -80℃에서 보관하였다.

< 실시예 2> 마이크로어레이 실험

<2-1> Genomic DNA의 분리

톨루엔 노출군과 비노출군 혈액시료로부터의 DNA 분리는 PAXgene blood DNA kit를 사용하여 정제하였다. 각 전체 DNA 시료의 농도는 분광광도계인 NanoDrop ND 1000 spectrophotometer(NanoDrop Technologies Inc., 미국)를 이용하여 측정하였으며 순도는 아가로스젤 전기영동으로 확인하였다.

<2-2> Genomic DNA 의 단편화

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 톨루엔 노출군 전체 DNA로부터 메틸화 DNA만을 특이적으로 추출하여야 한다. 이때, genomic DNA의 크기가 200bp에서 1000bp 정도가 적당하므로 Sonic Dismembrator를 이용하여 20sec 'ON' 20sec 'OFF' 4회를 1cycle로, 3cycle을 수행하여 DNA를 200 bp~1000 bp로 잘라 주었다. DNA의 크기를 확인하기 위해 아가로스젤 전기영동을 수행하였다.

<2-3> 메틸화 DNA 면역 침강법

메틸화 DNA만을 특이적으로 추출하기 위하여 면역 침강법을 이용하였으며 Invitrogen사의 MethylMiner Methylated DNA Enrichment Kit를 사용하며 제조사의 지시방법에 따라 실험을 진행하였다. 면역 침강법은 beads의 원리에 의해 진행되며, 상기 실시예 <2-2>에서 수득한 단편화 DNA를 beads와 mix하여 실온에서 1시간 동안 반응시키거나 4℃에서 overnight시킨다. 반응되지 않은 non-captured DNA는 세척과정을 반복하여 제거시키고 NaCl로 methylated DNA를 elution시킨 후 최종적으로 phenol-chloroform으로 DNA만을 추출한다. 이렇게 추출된 메틸화 DNA를 메틸화 특이 프라이머를 이용하여 PCR 한 후 아가로스젤 전기영동을 통해 최적의 상태임을 확인하였다.

<2-4> 표지된 DNA 제조

Whole genome amplification kit(SIGMA_WGA2)을 이용하여 DNA와 메틸화 DNA 40 ng을 증폭하여 사용하였다. 증폭한 DNA와 메틸화 DNA 1 ug에 random 프라이머 5 ul을 넣고 95℃에서 3분간 반응시키고 얼음에서 5분간 유지시켜 어닐링 (annealing)시켰다. DNA 표지를 하기 위해 하기 [표 2]와 같은 Master mix를 넣고 잘 섞은 후 37℃에서 2시간 동안 반응한 뒤 enzyme을 비활성 시키기 위해 65℃에서 10분 동안 반응해준 뒤 얼음으로 옮겨주었다.

Component	Vol (㎕)
5X buffer	10
10X dNTPs	5
Cy-3 or Cy-5 dUTP (1.0 mM)	3
Exo-Klenow fragment	1

<2-5> 혼성화 반응

표지된 DNA와 메틸화 DNA를 purification 과정을 거쳐 2.5~5ug 정도 사용하여 Agilent 10 × blocking와 Agilent 2 × hyb buffer넣고 잘 섞은 뒤 95℃에서 3분간 denature한 뒤 37℃에서 30분간 반응시킨다. chip에 잘 넣고 67℃에서 40시간(2 × formats) 동안 오븐에서 혼성화 반응을 하였다. 40시간 뒤 세척과정 (Oligo aCGH/ChIP-on-chip 1에서 5분, Oligo aCGH/ChIP-on-chip 2에서 37℃, 1분)을 거친 후 chip을 3분간 800rpm으로 원심분리하여 건조하였다. 메틸화 DNA 마이크로어레이 칩으로는 Agilent SurePrint G3 Human Promoter 2x400K microarray (Agilent, USA)를 이용하였다.

<2-6> 형광 이미지 획득

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Agilent C scanner(Agilent technologies, USA)로 스캔하였으며 추출된 데이터는 Agilent Genomic Workbench와 GeneSpring GX 12 (Agilent technologies)를 이용하여 normalization을 거쳐 각 DNA 프로모터 부위의 메틸화 변화 양상을 분석하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 41만 여개의 유전자 프로모터 부위를 포함하는 프로브 중에서 비노출군에 비해 톨루엔 노출군 그룹에서 유의하게 메틸화 양상 변이를 나타낸 유전자 프로브들에 대해 unpaired Welchs t-test, Multiple Test Correction - Benjamini and Hochberg False Discovery Rate를 통해서 p-value < 0.05로 유의성 있게 메틸화 변화 양상을 보인 유전자 프로모터 부위 2,206종을 선별하였다(도 1).

또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, GeneSpring GX 12 software를 사용하여 노출군과 비노출군의 유전자 프로모터 부위의 메틸화 변화 양상을 비교하여 이를 검증한 결과, 메틸화 변화가 3.0배 이상 감소된 프로모터 부위를 가지는 유전자가 17종이었으며(표 3, 도 2) 이들 메틸화 유전자들은 톨루엔의 인체노출 시 독성과 관련되어 있다는 보고는 없다.

또한, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 상기 17종의 유전자의 프로모터 부위는 하기 서열번호 1 내지 17로 기재되는 염기서열임을 확인하였다(표 4).

톨루엔 노출에 의해 메틸화 정도가 변화하는 유전자

등록번호	유전자 약어	유전자 명	중간값의 비	메틸화 정도
NM_001145416	TMEM205	transmembrane protein 205	4.15	저메틸화
NM_004302	ACVR1B	activin A receptor, type IB	3.83	저메틸화
NM_025150	TARS2	threonyl-tRNA synthetase 2, mitochondrial (putative)	3.68	저메틸화
NM_001166034	SBSN	suprabasin	3.68	저메틸화
NM_144653	NACC2	NACC family member 2, BEN and BTB (POZ) domain containing	3.56	저메틸화
NM_173515	CNKSR3	CNKSR family member 3	3.52	저메틸화
NM_001136046	ZMYND15	zinc finger, MYND-type containing 15	3.39	저메틸화
NM_001128826	NCS1	neuronal calcium sensor 1	3.33	저메틸화
NM_001128141	DPEP1	dipeptidase 1 (renal)	3.29	저메틸화
NM_175895	C12orf61	chromosome 12 open reading frame 61	3.24	저메틸화
NM_001009997	C10orf62	chromosome 10 open reading frame 62	3.22	저메틸화
NM_002926	RGS12	regulator of G-protein signaling 12	3.19	저메틸화
NM_031219	HDHD3	haloacid dehalogenase-like hydrolase domain containing 3	3.18	저메틸화
NM_001025591	SCGBL	secretoglobin-like	3.07	저메틸화
NM_032323	TMEM79	transmembrane protein 79	3.06	저메틸화
NM_148178	C9orf23	chromosome 9 open reading frame 23	3.06	저메틸화
NM_002221	ITPKB	inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase B	3.04	저메틸화

톨루엔 노출에 의해 메틸화 정도가 변화하는 유전자의 프로모터 부위

유전자	프로브 서열
TMEM205	CAGGTCTTCACGATCGGGTGTCTCGAGCCCTTCTTCGGGAACGAG	서열번호 1
ACVR1B	CTCTAGCCGTCGGTCAAAGTTGGAGATCACTGCCAGTCTCAGACC	서열번호 2
TARS2	GCGATTTTTCGGGTTGGTTACCATGCAGACGAATGACGACGGGAG	서열번호 3
SBSN	TCAGAATTCAGCGAAACCTCCCATGGCCAATGAGACCTTGGGATG	서열번호 4
NACC2	AGTCTCAGAATTGGAGCCTAGGCTCCATCTGTCTCCACCCTGTTT	서열번호 5
CNKSR3	GACCAGACGTGCAAGATGCATATTGCTGGGAAGGTCGGGAAGGAT	서열번호 6
ZMYND15	ACTTGAATGTGCTCTGCTGAGTCCTAGAGAGGCCCCGGTTCTAAG	서열번호 7
NCS1	AAAGAAGGCTTACGAAAATGGACACTTACCGGGGCCTTCAGGGAT	서열번호 8
DPEP1	GATCCTGGTGTACGGGCTGAGCCTGTTATGCTTTTCTGCCCTTCG	서열번호 9
C12orf61	GAGTGAAGAGGTCAGCTCCACGGTTCACATAGAGACCTTCACCAC	서열번호 10
C10orf62	GAGCTTGGTCCCAAGGCTAGGTGTGAAGTTAGCCAAAACCCCAAT	서열번호 11
RGS12	CTGGCTAGGACTGCTCACCAAGGGAGCATTTTCTCATCCAGAGCA	서열번호 12
HDHD3	TCATTTATATGTTGACTGAAATCGTAACAATGTAACTCTTTTAATGCTATTGCTATGAAA	서열번호 13
SCGBL	GGAAGAAATTCTGGCGGAGAGCACTGTACTTGGGGTCCTTCTCTC	서열번호 14
TMEM79	TTTTCTCTCTTCAGAGCGGTGGCTGACGTACAGAACGCCGGCTGTAT	서열번호 15
C9orf23	ATCGTTAAGCTAGCTCCGAACAGCCCCAATGAGGGAGCTAGGCAG	서열번호 16
ITPKB	AGTCCTCATTCACCGAGCAGTGCTCGGTTCTGTGGAAAGACTGTT	서열번호 17

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Methylation marker for identification of exposure to toluene and the method of identification using thereof <130> 13P-01-22 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of TMEM205 <400> 1 caggtcttca cgatcgggtg tctcgagccc ttcttcggga acgag 45 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of ACVR1B <400> 2 ctctagccgt cggtcaaagt tggagatcac tgccagtctc agacc 45 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of TARS2 <400> 3 gcgatttttc gggttggtta ccatgcagac gaatgacgac gggag 45 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of SBSN <400> 4 tcagaattca gcgaaacctc ccatggccaa tgagaccttg ggatg 45 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of NACC2 <400> 5 agtctcagaa ttggagccta ggctccatct gtctccaccc tgttt 45 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of CNKSR3 <400> 6 gaccagacgt gcaagatgca tattgctggg aaggtcggga aggat 45 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of ZMYND15 <400> 7 acttgaatgt gctctgctga gtcctagaga ggccccggtt ctaag 45 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of NCS1 <400> 8 aaagaaggct tacgaaaatg gacacttacc ggggccttca gggat 45 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of DPEP1 <400> 9 gatcctggtg tacgggctga gcctgttatg cttttctgcc cttcg 45 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of C12orf61 <400> 10 gagtgaagag gtcagctcca cggttcacat agagaccttc accac 45 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of C10orf62 <400> 11 gagcttggtc ccaaggctag gtgtgaagtt agccaaaacc ccaat 45 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of RGS12 <400> 12 ctggctagga ctgctcacca agggagcatt ttctcatcca gagca 45 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of HDHD3 <400> 13 tcatttatat gttgactgaa atcgtaacaa tgtaactctt ttaatgctat tgctatgaaa 60 60 <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of SCGBL <400> 14 ggaagaaatt ctggcggaga gcactgtact tggggtcctt ctctc 45 <210> 15 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of TMEM79 <400> 15 ttttctctct tcagagcggt ggctgacgta cagaacgccg gctgtat 47 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of C9orf23 <400> 16 atcgttaagc tagctccgaa cagccccaat gagggagcta ggcag 45 <210> 17 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence of ITPKB <400> 17 agtcctcatt caccgagcag tgctcggttc tgtggaaaga ctgtt 45

Claims

하기 모든 유전자의 프로모터 부위 또는 그의 상보가닥 분자가 모두 집적된 톨루엔(toluene) 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩:
유전자 등록번호(Genebank): NM_001145416(TMEM205, transmembrane protein 205);
유전자 등록번호: NM_004302(ACVR1B, activin A receptor, type IB);
유전자 등록번호: NM_025150(TARS2, threonyl-tRNA synthetase 2, mitochondrial (putative));
유전자 등록번호: NM_001166034(SBSN, suprabasin);
유전자 등록번호: NM_144653(NACC2, NACC family member 2, BEN and BTB (POZ) domain containing);
유전자 등록번호: NM_173515(CNKSR3, CNKSR family member 3);
유전자 등록번호: NM_001136046(ZMYND15, zinc finger, MYND-type containing 15);
유전자 등록번호: NM_001128826(NCS1, neuronal calcium sensor 1);
유전자 등록번호: NM_001128141(DPEP1, dipeptidase 1 (renal));
유전자 등록번호: NM_175895(C12orf61, chromosome 12 open reading frame 61);
유전자 등록번호: NM_001009997(C10orf62, chromosome 10 open reading frame 62);
유전자 등록번호: NM_002926(RGS12, regulator of G-protein signaling 12);
유전자 등록번호: NM_031219(HDHD3, haloacid dehalogenase-like hydrolase domain containing 3);
유전자 등록번호: NM_001025591(SCGBL, secretoglobin-like);
유전자 등록번호: NM_032323(TMEM79, transmembrane protein 79);
유전자 등록번호: NM_148178(C9orf23, chromosome 9 open reading frame 23); 및
유전자 등록번호 NM_002221(ITPKB, inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase B).
제 1항에 있어서, 유전자 등록번호: NM_001145416(TMEM205, transmembrane protein 205)의 프로모터 부위는 서열번호 1로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_004302(ACVR1B, activin A receptor, type IB)의 프로모터 부위는 서열번호 2로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_025150(TARS2, threonyl-tRNA synthetase 2, mitochondrial (putative))의 프로모터 부위는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_001166034(SBSN, suprabasin)의 프로모터 부위는 서열번호 4로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_144653(NACC2, NACC family member 2, BEN and BTB (POZ) domain containing)의 프로모터 부위는 서열번호 5로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_173515(CNKSR3, CNKSR family member 3)의 프로모터 부위는 서열번호 6으로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_001136046(ZMYND15, zinc finger, MYND-type containing 15)의 프로모터 부위는 서열번호 7로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_001128826(NCS1, neuronal calcium sensor 1)의 프로모터 부위는 서열번호 8로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_001128141(DPEP1, dipeptidase 1 (renal))의 프로모터 부위는 서열번호 9로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_175895(C12orf61, chromosome 12 open reading frame 61)의 프로모터 부위는 서열번호 10으로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_001009997(C10orf62, chromosome 10 open reading frame 62)의 프로모터 부위는 서열번호 11로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_002926(RGS12, regulator of G-protein signaling 12)의 프로모터 부위는 서열번호 12로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_031219(HDHD3, haloacid dehalogenase-like hydrolase domain containing 3)의 프로모터 부위는 서열번호 13으로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_001025591(SCGBL, secretoglobin-like)의 프로모터 부위는 서열번호 14로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_032323(TMEM79, transmembrane protein 79)의 프로모터 부위는 서열번호 15로 기재되는 염기서열;
유전자 등록번호: NM_148178(C9orf23, chromosome 9 open reading frame 23)의 프로모터 부위는 서열번호 16으로 기재되는 염기서열; 및
유전자 등록번호 NM_002221(ITPKB, inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase B)의 프로모터 부위는 서열번호 17로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 톨루엔 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩.
제 1항에 있어서, 상기 마이크로어레이 칩은 DNA 메틸화 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 톨루엔 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩.
1) 톨루엔 노출이 의심되는 개체로부터 분리된 실험군 혈액시료와 톨루엔에 노출되지 않은 개체로부터 분리된 대조군 혈액시료에서 DNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 DNA를 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 DNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 하는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 모든 유전자의 메틸화 변화 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔노출 여부를 확인하기 위한 정보를 제공하는 방법.
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제 4항에 있어서, 상기 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 톨루엔 노출 여부를 확인하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 톨루엔 노출 여부 확인용 키트.
제 7항에 있어서, 인간 혈액시료를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 톨루엔 노출 여부 확인용 키트.