KR101138954B1 - 갑상선 과산화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법 - Google Patents

갑상선 과산화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101138954B1
KR101138954B1 KR1020100021743A KR20100021743A KR101138954B1 KR 101138954 B1 KR101138954 B1 KR 101138954B1 KR 1020100021743 A KR1020100021743 A KR 1020100021743A KR 20100021743 A KR20100021743 A KR 20100021743A KR 101138954 B1 KR101138954 B1 KR 101138954B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
thyroid
thyroid peroxidase
activity
exposure
gene
Prior art date
Application number
KR1020100021743A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110102639A (ko
Inventor
류재천
김연정
송미
이지나
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to KR1020100021743A priority Critical patent/KR101138954B1/ko
Publication of KR20110102639A publication Critical patent/KR20110102639A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101138954B1 publication Critical patent/KR101138954B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩 및 상기 마이크로어레이 칩을 이용하여 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 갑상선 호르몬 합성에 중요한 역할을 하는 갑상선 과산화효소를 활성화하는 화학물질인 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논(2,2',4,4'-Tetrahydroxybenzophenone) 또는 빈클로졸린(vinclozolin)에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커, 상기 바이오마커가 집적된 DNA 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로 본 발명의 바이오마커는 DNA 마이크로어레이를 통하여 선별된 단백질 티로신 인산화효소(protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11)[유전자 등록번호(Genebank) NM_002834]를 바이오마커로 이용하여 환경 시료에서 갑상선 과산화효소를 활성화하는 화학물질의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 갑상선 과산화효소를 활성화하는 화학물질에 의해 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

Description

갑상선 과산화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법 {The biomarkers for identification of exposure to disruptors inhibiting thyroid peroxidase and the identification method of disruptors inhibiting thyroid peroxidase exposure using the same biomarkers}
본 발명은 갑상선 과산화효소를 저해하는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것이다.
나트륨/요오드화물 심포터(sodium iodide symporter), 5 탈요오드화 효소(typer Ⅰ 5'-deiodinase), 갑상선 호르몬 수송 단백질 트랜스티레틴(TH transport protein transthyretin), 갑상선 호르몬 수용체(TH receptor) 등은 갑상선 호르몬에의 장애를 일으키는 작용 연구에 중요 표적이라 보고되고 있다(Schmutzler C. et al ., Endocrinology, 148(6):2835-2844, 2007). 이 외에 갑상선 과산화효소(thyroid peroxidase, TPO)를 표적으로 이용하여 갑상선 과산화효소의 촉매 억제 및 활성 여부에 의한 갑상선 호르몬 생성 방해와 관련된 연구도 진행되고 있다.
갑상선 과산화효소는 갑상선 상피세포의 세포막에 위치한 단백질로 갑상선 호르몬 생합성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었으며, 갑상선 과산화효소의 억제는 체내 대사율을 조절하는 갑상선 호르몬인 티록신(T4)의 구성성분인 요오드의 결핍 및 갑상선종 발달을 촉진시키는 것으로 보고되고 있기 때문에 갑상선 과산화효소의 활성에 장애를 유발하는 물질의 갑상선에의 독성 여부를 관찰하는데 있어 중요한 표적이 된다(Schmutzler C. et al ., Endocrinology, 148(6):2835-2844). 갑상선 여포암(Follicular carcinomas) 또는 갑상선암(Thyroid cancer) 발병시에 갑상선 과산화효소의 유전자 발현이 감소하는 것으로 보고된 바 있다(G, A.C., et al ., J. Clin . Endocrinol . Metab . 88(10):4977-4983, 2003). 갑상선 과산화효소의 억제는 SMAD 신호전달에 의한 TGF-β1의 발현이 저해로 유발되거나, 갑상선 자극 호르몬인 TSH(Thyroid stimulating hormone)의 생성이 증가 하면서 Wnt-1의 발현 증가 또는 β-catenin의 발현 저해로 유발된다는 보고가 있으며, 이 외에 tyrosine kinase receptor의 발현 저해로 인해 갑상선 과산화효소의 발현이 저해되는 것으로 알려져 있다(Nicolussi A., et al ., Mol. Cell Endocrinol . 207(1-2):1-11.2003; Kim W. B. et al ., J. Endocrinol . 193(1):93-106, 2007; Wong E. et al ., Thyroid . 17(4):351-355, 2007). 이러한 갑상선 과산화효소의 발현 저해는 갑상선 세포의 증식을 억제하여 갑상선에 장애를 유발하는 것으로 보고되고 있다.
내분비계 장애 화학물질 중 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논(2,2‘,4,4’-tetrahydroxybenzophenone)과 빈클로졸린(Vinclozolin)은 갑상선 호르몬 장애를 유발하는 물질로 보고된 바 있다(Schmutzler C et al ., Endocrinology, 148(6):2835-2844, 2007; Monosson E. et al ., Toxicol. Ind . Health . 15(1-2):65-79, 1999). 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논은 인체의 호르몬계 중 갑상선호르몬 축(thyroid hormone axis)의 이상에 크게 관여하는 것으로 보고되고 있으며, 갑상선 호르몬의 항상성 이상, 갑상선 기능 저하증(hypothyroidism), 갑상샘증식(thyroid hyperplasia), 종양형성(neoplasia), 중추신경계 발달 이상 등의 부작용을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 살충제류의 하나인 빈클로졸린은 갑상선 호르몬인 티록신의 합성을 저해하여 갑상선 장애를 유발하는 것으로 보고된 바 있다(Toft G. et al ., Environ . Health . 5:32, 2006).
갑상선 호르몬 장애물질의 갑상선 호르몬 활성 및 호르몬 수용체 결합과 유전자 발현 변화에 대한 연구가 일부 보고되고 있지만, 주로 마우스를 이용한 연구에 거의 국한되어 있다. 그리고 상기에서 언급한 것과 같이 갑상선 과산화효소의 활성 저해에 의한 인간의 갑상선에의 장애 가능성에도 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. 상기 GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용할 경우 정량적 분석이 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 더욱 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 프라이머(primer)를 이용하는 실시간(real-time) RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 또는 DNA 마이크로어레이 등을 이용하여 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 갑상선 과산화효소 활성을 증가시키는 화학물질 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.
포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 즉, 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:10614-10619, 1996).
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et al ., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어 지고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et al ., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).
유전자 발현의 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 수득하여 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 혼성화 반응을 수행한다. 상기 수득한 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며 cDNA로 전환시킨다. 올리고마이크로어레이는 주로 두 개의 다른 형광(예: Cy3 및 Cy5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K. et al ., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).
최근 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯한 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석 및 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색이 가능하게 될 것이다.
이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 4천개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 갑상선 과산화효소 저해 화학물질 중 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 및 빈클로졸린의 유전자 발현 프로파일을 인간 갑상선 소포암 세포에 갑상선 과산화효소 유전자를 재조합한 세포주인 FTC-238/hrTPO/RSK008 세포주에서 관찰 및 분석함으로써 갑상선 과산화효소의 활성을 저해하는 화학물질에 의해 저발현 되는 유전자를 발굴하여 갑상선 과산화효소의 활성을 저해하는 화학물질을 검출할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 노출 여부를 확인하는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질 특이적 바이오마커가 집적된 DNA 마이크로어레이 칩 및 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩을 이용한 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유전자 등록번호(Genebank) NM_002834(protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11)의 핵산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된, 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은
갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출이 의심되는 개체(실험군) 및 대조군으로부터 분리된 RNA 시료로부터
1) cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
2) 단계 1)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 상기 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화 시키는 단계;
3) 단계 2)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
4) 단계 3)의 분석한 데이터에서 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인을 위한 유전자 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출이 의심되는 개체(실험군) 및 대조군으로부터 분리된 RNA 시료로부터
1) 상기 RNA를, 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
2) 단계 1)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현정도를 확인하는 단계를 포함하는 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인을 위한 유전자 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 본 발명의 유전자 등록번호(Genebank) NM_002834(protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11)의 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
본 발명의 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법은 DNA 마이크로어레이를 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하며, 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.
도 1은 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질(2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논)의 인간 갑상선 소포암 갑상선 과산화효소 유전자 재조합 세포주에서의 갑상선 과산화효소 활성 저해 농도를 조사한 그래프이다.
도 2는 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질(빈클로졸린)의 인간 갑상선 소포암 갑상선 과산화효소 유전자 재조합 세포주에서의 갑상선 과산화효소 활성 저해 농도를 조사한 그래프이다.
도 3은 마이크로어레이를 이용한 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질을 처리한 인간 갑상선 소포암 갑상선 과산화효소 유전자 재조합 세포주에서의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질의 노출에 의해 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커[유전자 등록번호(Genebank) NM_002834(protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11)]를 제공한다.
상기 바이오마커는 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논의 인간 갑상선 소포암 세포에서 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질을 갑상선 과산화효소 억제 농도로 처리하였을 때 0.6배 이하로 유전자 발현이 감소된 유전자이다.
본 발명자들은 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질인 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린를 인간 갑상선 소포암 세포주에 갑상선 과산화효소를 재조합 한 세포주인 FTC-238/hrTPO/RSK008에 처리하여 세포 독성 및 갑상선 호르몬 생산에 중요하다고 알려진 갑상선 과산화효소의 활성 여부를 확인하였다. 그 결과, 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 및 빈클로졸린는 FTC-238/hrTPO/RSK008에서 갑상선 과산화효소의 작용을 활성화 시키는 것을 확인하였으며(도 1 및 도 2 참조), 상기 실험을 바탕으로 세포독성을 나타내지 않으면서 갑상선 과산화효소를 활성화시키는 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 및 빈클로졸린의 농도를 결정하였다. 이후 상기에서 결정된 농도로 FTC-238/hrTPO/RSK008에 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린를 처리한 후, mRNA를 분리하여 4×44 k 인간 유전체 전체 올리고마이크로어레이 칩(Human whole genome microarray, Agilent, 미국)을 이용하여 유전자 발현양상을 분석하였다. 분석시 Cy5/Cy3 비율이 1.5배 이상인 경우 발현이 증가된 유전자로 분류하였고, 0.67배 이하인 경우 발현이 감소된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논(2,2',4,4'-Tetrahydroxybenzophenone) 및 빈클로졸린(vinclozolin)에 의해 공통적으로 Cy5/Cy3의 비율이 1.5배 이상 과발현 혹은 저발현 되는 유전자들로써 p-value가 0.01 이하인 유전자는 0.020%(44,000개의 유전자 중 7개), 발현이 감소한 유전자는 0.175%(44,000개의 유전자 중 77개)임을 확인하였다(도 3 참조). 상기에서, 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 및 빈클로졸린를 처리한 경우 모두에서 단백질 티로신 인산화효소(protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11)[유전자 등록번호(Genebank) NM_002834]가 발현이 0.6배 이하로 감소하였다(표 2 참조). 티로신 키나아제 수용체의 발현 저해는 갑상선 과산화효소의 발현 억제를 유도하여 갑상선 기능 저하증을 유발하는 것으로 보고된바 있다(Wong E. et al ., Thyroid . 17(4):351-355, 2007). 그러나 상기 유전자가 본 발명에서 사용한 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질을 처리했을 때, 인간 갑상선 소포암 세포에서의 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
또한, 본 발명은 티로신 키나아제 연관 유전자의 핵산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된, 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
상기 티로신 키나아제 연관 유전자는 단백질 티로신 인산화효소(protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11)[유전자 등록번호(Genebank) NM_002834]이다.
상기 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드는 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함한다.
상기 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질은 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 유전자를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
또한, 본 발명은
갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출이 의심되는 개체(실험군) 및 대조군으로부터 분리된 RNA 시료로부터
1) cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
2) 단계 1)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
3) 단계 2)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및,
4) 단계 3)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인을 위한 유전자 검출 방법을 제공한다.
상기 RNA 시료는 RNA 시료는 인간의 갑상선, 갑상선 소포 또는 갑상선 소포암 세포 또는 조직으로부터 유래하고, 바람직하게는 인간 갑상선 소포암 세포주에 갑상선 과산화효소를 재조합 한 세포주인 FTC-238/hrTPO/RSK008로부터 유래한 것이다. 이때, 대조군은 건강한 개체로부터 유래한 것이다.
또한, 단계 1)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질은 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 혼성화는 40℃ 내지 50℃에서 10 내지 20시간 동안 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 DNA 마이크로어레이 칩은 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 유전자 등록번호(Genebank) NM_002834(protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, 미국) 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 분석은 혼성화된 마이크로어레이 칩을 세척 및 염색한 후 스캔하여 이미지 프로세싱을 수행한 다음 통계적 분석을 수행하는 것이 바람직하다. 상기 염색 및 세척은 Fluidics Station 450을 이용하고, 스캔은 GeneChip scanner　3000을 이용하며, 이미지 프로세싱은 Affymetrix GeneChip Operating System(GCOS)을 이용하며, 모든 절차는 Affymetrix사의 프로토콜에 따라 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 통계학적 분석은 GenPlex software version 2.3을 이용하여 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
또한, 본 발명은
갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출이 의심되는 개체(실험군) 및 대조군으로부터 분리된 RNA 시료로부터
1) 상기 RNA를, 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및,
2) 단계 1)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부를 측정하는 단계를 포함하는 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인을 위한 유전자 검출 방법을 제공한다.
상기 RNA 시료는 RNA 시료는 인간의 갑상선, 갑상선 소포 또는 갑상선 소포암 세포 또는 조직으로부터 유래하고, 바람직하게는 인간 갑상선 소포암 세포주에 갑상선 과산화효소를 재조합 한 세포주인 FTC-238/hrTPO/RSK008로부터 유래한 것이다. 이때, 대조군은 건강한 개체로부터 유래한 것이다.
상기 단계 1)의 프라이머 쌍은 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 15 내지 50머 길이, 바람직하게는 15 내지 30머 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 25머의 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 모두 사용 가능하다.
상기 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질은 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 확인용 키트에 추가로 갑상선 소포암 세포를 포함하는 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다. 상기 갑상선 소포암 세포는 인간 갑상선 소포암 세포주에 갑상선 과산화효소를 재조합 한 세포주인 FTC-238/hrTPO/RSK008 세포주를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 갑상선 또는 갑상선암 유래의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질은 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 키트에 추가로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인산화효소 접합물질(streptavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemifluorescent agent) 및 화학발광물질(chemiluminescent agent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 키트에 추가로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표시 시약 및 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 확인용 키트의 프라이머 쌍은 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 15 내지 50머의 길이, 바람직하게는 15 내지 30머의 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 25머의 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 모두 사용 가능하다.
상기 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질은 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 확인용 키트에 추가로 갑상선 소포암 세포를 포함하는 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다. 상기 갑상선 소포암 세포는 인간 갑상선 소포암 세포주에 갑상선 과산화효소를 재조합 한 세포주인 FTC-238/hrTPO/RSK008 세포주를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 갑상선 또는 갑상선암 유래의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
또한, 상기 키트에 추가로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 상기 반응 시약은 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), DNA 중합 효소 및, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 RT-PCR 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
세포 배양 및 화학물질 처리
<1-1> 세포배양
인간 갑상선 소포암 갑상선 과산화효소 유전자 재조합 세포주인 FTC-238/hrTPO/RSK008 세포를 5% FBS, 2% penicillin/streptomycin, 0.06% G418 첨가된 DMEM/F12 배지(Gibro-BRL, 미국)를 이용하여 100 ㎜ 디쉬(dish)에서 80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구를 통해 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질인 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논(2,2',4,4'-Tetrahydroxybenzophenone) 및 빈클로졸린(vinclozolin)를 선정하였으며, 이를 DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.
<1-2> 갑상선 과산화효소 활성 감소 농도 결정 및 화학 물질 처리
FTC-238/hrTPO/RSK008 세포주를 이용하여 갑상선 과산화효소 활성 감소 농도 결정을 위해 과이어콜 어세이(guaiacol assay) 실험을 수행하였다. 2×106 cell/㎖ 농도로 100 ㎜ 디쉬에 FTC-238/hrTPO/RSK008 세포를 분주한 후, 24시간이 지난 후 헤마틴(hematin)을 1 ㎍/㎖로 처리하고 48시간 후 세포를 1.5 ㎖ 튜브에 모아 초음파기로 0.6초 10번 펄스(pulse)로 세포막을 분쇄하였다. 이 후 상기 튜브를 1시간 30분 동안 4℃에서 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 원심분리 후에 상층액을 버리고 침전물을 잘 풀어준 다음 1% 디기토닌(digitonin) 500 ㎕를 첨가한 후 4℃에서 24시간 배양하였다. 이 후 다시 1시간 30분 동안 4℃에서 14,000 rpm으로 원심분리하고 원심분리 후의 튜브에서 상층액을 새 튜브로 옮긴다. 상층액은 하기 과이어콜 어세이(guaiacol assay)에 이용하였다.
추출한 상층액 갑상선 과산화효소를 포함하는 단백질로 BCA assay kit(pierce)을 이용하여 정량한 후 농도가 325 ㎍이 되도록 각 튜브에 옮겼다. 총 부피가 600 ㎕에 갑상선 과산화효소를 포함하는 단백질 325 ㎍과 100 mM 인산칼륨완충액(potassium phosphate buffer), 10 μM의 과산화수소(H2O2)가 포함된 용액에 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질인 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린를 각 농도별로 처리하고 5분 배양한 후 이 중 100㎕를 취해 새로운 튜브에 옮겼다. 그리고 50 mM 인산칼륨완충액, 40 mM 과이어콜(guaiacol), 220 μM 과산화수소(H2O2)를 첨가하여 이 중 100 ㎕를 취해 470 nm에서의 흡광도를 측정하여 갑상선 과산화효소 활성이 증가되는 농도를 측정하였다. 갑상선 과산화효소 활성이 감소하는 농도는 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논은 1 μM, 빈클로졸린는 10 μM이었으며(도 1 및 도 2), 상기 농도로 결정하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
마이크로어레이 실험
<2-1> RNA 의 분리 및 형광 물질 표지
2×106 cell/㎖ 농도로 100 ㎜ 디쉬에 FTC-238/hrTPO/RSK008 세포를 분주한 후, 상기 실시예 1-2에서 결정한 농도의 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린를 48시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포로부터 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, 미국)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하였고, RNeasy mini kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, 미국)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 농도는 엑스페리온(Experion, Automated Electrophoresis station, Bio-Rad, 미국)으로 확인하였다.
<2-2> 표지된 cDNA 제조
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시 예 2-1에서 수득한 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 표 1과 같이 시약을 혼합하였다.
구성 부피(㎕)
5X first strand buffer 6
dNTPs 0.6
0.1 M DDT 3
SuperScript II enzyme 3
Cy-3 or Cy-5 dUTP 2
대조군인 FTC-238/hrTPO/RSK008 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)로 표지화하였고, 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질을 처리한 FTC-238/hrTPO/RSK008 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)로 각각 표지화하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, 미국)을 사용하여 혼합, 정제되었다.
<2-3> 혼성화 반응
혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)(한국)의 지시방법에 따라 수행하였다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이로는 44 k 인간 유전체 전체(Human whole genome) 올리고마이크로어레이(Agilent, 미국)를 이용하였다. 세척 과정(2분간 2×SSC/0.1% SDS, 3분간 1×SSC 및 2분간 0.2×SSC에 세척)을 거친 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.
<2-4> 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon Instruments, 미국)로 스캔하였다. 결합하지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, 미국)로 분석하였다. 상기 방법에 의해 수득한 데이터로부터 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 마커 유전자를 선별하였다(표 2).
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 4천 개의 유전자 중에서 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질인 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 및 빈클로졸린에 의해 공통적으로 Cy5/Cy3의 비율이 1.5배 이상 과발현 혹은 저발현 되는 유전자들로써 p-value가 0.01 이하인 유전자는 0.020%(44,000개의 유전자 중 7개), 발현이 감소한 유전자는 0.175%(44,000개의 유전자 중 77개)임을 확인하였다(도 3). 이들 유전자 중 갑상선 과산화효소 활성 저해에 특이적으로 발현하는 단백질 티로신 인산화효소(protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11)[유전자 등록번호(Genebank) NM_002834] 1종을 확인하였다(표 2).
갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 의해 발현이 변화하는 유전자
유전자 번호
(Genebank)		 유전자
약어		 유전자 명 올리고마이크로어레이 값
2,2',4,4'-테트라 히드록시 빈클로졸린
NM_002834 PTPN11 protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11 0.59 0.48

Claims (14)

  1. 단백질 티로신 인산화효소(protein tyrosine phosphatase)[유전자 등록번호(Genebank) NM_002834]의 핵산 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된, 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논(2,2',4,4'-Tetrahydroxybenzophenone) 또는 빈클로졸린(vinclozolin)에 대한 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린에 대한 노출이 의심되는 개체(실험군) 및 대조군으로부터 분리된 RNA 시료로부터
    1) cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
    2) 단계 1)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
    3) 단계 2)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및,
    4) 단계 3)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린에 대한 노출 여부 확인을 위한 유전자 검출 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 단계 1)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 확인 방법.
  6. 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린에 대한 노출이 의심되는 개체(실험군) 및 대조군으로부터 분리된 RNA 시료로부터
    1) 상기 RNA를, 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및,
    2) 단계 1)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린에 대한 노출 여부 확인을 위한 유전자 검출 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 단계 2)의 프라이머 쌍은 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자를 증폭할 수 있는, 18 내지 30머 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 4항 또는 제 6항에 있어서, RNA 시료는 인간의 갑상선, 갑상선 소포 또는 갑상선 소포암 세포 또는, 조직으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 확인 방법.
  9. 삭제
  10. 제 1항의 마이크로어레이 칩을 포함하는 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린에 대한 노출 여부 확인용 키트.
  11. 유전자 등록번호(Genebank) NM_002834(protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11)의 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 갑상선 과산화효소의 활성을 저해시키는 2,2',4,4'-테트라히드록시벤조페논 또는 빈클로졸린에 대한 노출 여부 확인용 키트.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 18 내지 30머 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 키트.

  13. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 추가로 갑상선 소포암 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.

  14. 삭제
KR1020100021743A 2010-03-11 2010-03-11 갑상선 과산화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법 KR101138954B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100021743A KR101138954B1 (ko) 2010-03-11 2010-03-11 갑상선 과산화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100021743A KR101138954B1 (ko) 2010-03-11 2010-03-11 갑상선 과산화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110102639A KR20110102639A (ko) 2011-09-19
KR101138954B1 true KR101138954B1 (ko) 2012-04-25

Family

ID=44954183

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100021743A KR101138954B1 (ko) 2010-03-11 2010-03-11 갑상선 과산화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101138954B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102207608B1 (ko) 2019-04-24 2021-01-26 윤종오 카르복실산으로 유기화된 규소 이온 복합체 및 복합체의 제조방법과 이를 이용한 제품

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Schmutzler, C. et al, Endocrinology, 148(6):2835-2844, 2007 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110102639A (ko) 2011-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101008385B1 (ko) 다환 방향족 탄화수소류 노출 여부 확인용 바이오마커 및이를 이용한 확인 방법
KR101398548B1 (ko) 저급 지방족 포화 알데하이드류 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법
KR101301255B1 (ko) 탄화플루오르옥탄술폰산 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법
KR100957055B1 (ko) 트리클로로에틸렌 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를이용한 확인 방법
KR101138954B1 (ko) 갑상선 과산화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법
KR20070120709A (ko) 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커 및 이를이용한 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색 방법
KR101749566B1 (ko) 디젤 배기 미립자(diesel exhaust particle) 노출에 따른 염증반응 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법
KR100974228B1 (ko) 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커 및 이를이용한 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 방법
KR101138953B1 (ko) 갑상선 과산화효소 활성 증가 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법
KR101079250B1 (ko) 카바릴 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법
KR100936286B1 (ko) 아미오다론 처리에 따른, 폐독성 유발 약물 검색용마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법
KR101383653B1 (ko) 프로피온알데히드 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법
KR101453887B1 (ko) 퍼플루오르옥탄산 노출 특이적 메틸화 마커 유전자 및 이를 이용한 퍼플루오르옥탄산 노출 여부 확인 방법
KR101011155B1 (ko) 아미오다론 및 카르바마제핀 처리에 따른, 폐독성 유발약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법
KR101301254B1 (ko) 퍼플루오로옥탄산염 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법
KR101144199B1 (ko) 잔류성 유기오염물질류 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법
KR101062784B1 (ko) 미렉스 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법
KR101457481B1 (ko) 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법
KR101383641B1 (ko) 부틸알데히드 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법
KR101292840B1 (ko) 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐, 및 인데노(１,２,３―ｃ,ｄ)파이렌 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법
JP6166247B2 (ja) ヘキサナール特異的暴露有無確認用バイオマーカーおよびそれを用いた確認方法
KR100978791B1 (ko) 디클로로메탄 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한확인 방법
KR101386075B1 (ko) 헥사클로로벤젠 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법
KR101276733B1 (ko) １７β－에스트라디올(１７β－ｅｓｔｒａｄｉｏｌ, Ｅ２) 노출에 대응하는 바다송사리 유전자 및 이를 이용한 환경 오염 진단 방법
KR101016700B1 (ko) 2,2&#39;,4,4&#39;-테트라히드록시벤조페논 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160401

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee