KR101011155B1 - 아미오다론 및 카르바마제핀 처리에 따른, 폐독성 유발약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법 - Google Patents

아미오다론 및 카르바마제핀 처리에 따른, 폐독성 유발약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폐독성 유발 약물인 아미오다론(Amiodarone) 및 카르바마제핀(Carbamazepine)에 의해 공통적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 마커유전자, 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법에 관한 것이다. 본 발명의 마커유전자는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 마커유전자로 이용하여 폐독성의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 아미오다론 및 카르바마제핀이 폐독성 및 부작용을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
아미오다론, 카르바마제핀, 마커유전자, 마이크로어레이, 폐독성

Description

아미오다론 및 카르바마제핀 처리에 따른, 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법{Marker genes based on amiodarone and carbamazepine treatment for screening of drug inducing pulmonary toxicity and screening method using the same}
본 발명은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폐독성 유발 약물인 아미오다론 및 카르바마제핀에 의해 공통적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 마커유전자, 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법에 관한 것이다.
폐독성은 항생제나 여러 치료 약물들을 투여받았을 때 폐, 폐포 및 기관지 등에 발생하는 부작용을 말한다. 폐독성을 나타내는 약물들은 천식, 폐쇄성 세기관지염, 과민성 폐렴, 간질성 폐렴, 폐섬유증, 심장 외적인 폐부종, 흉막유출 및 폐정맥 질환 등의 다양한 폐독성 유발 양상을 보이는 것으로 알려져 있다. 폐독성을 유발하는 약물 중 부정맥 치료제로 사용되는 아미오다론(amiodarone)과 간질치 료제로서 사용되는 카르바마제핀(carbamazepine)은 대표적으로 폐독성을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 상기 두 약물의 부작용 양상은 폐렴, 기관지염 또는 폐섬유증 등을 유발하는 것으로 알려져 있다(Metin et al, Clev . Clin . J. Med ., 68(9): 782-795, 2001).
약물 복용에 의해서 유발되는 1) 폐독성으로는 Fas, FasL, p53, p21 및 TGF-β 등의 유전자들이 관여하여 작용하는 세포사멸(apoptosis), ROS(reactive oxidative stress) 형성으로 인한 직접적인 폐 손상을 일으키는 경우, 2) 여러 사이토카인(cytokine) 분비로 인해 염증(inflammation)을 유발하는 경우, 3) 폐 세포의 이동, 증식, 분화 및 생존 등을 조절하는 EGF(epidemal growth factor) 속(family)에 속하는 EGF 또는 EGFR이 손상된 경우가 보고된바 있다(Higenbottam, T. et al., Br . J. Cancer, 91: 31-37, 2004). 또한, 폐 세포에 주로 존재하는 Na+ 채널(channel)의 이온 수송(ion transport) 손상에 의해서 염증을 유발한다는 보고가 있다(Matalon, S. et al., Am . J. Respir . Crit . Care Med ., 171(5): 424-425, 2005).
아미오다론 및 카르바마제핀에 의해 유발되는 간독성과 관련하여, 간독성을 유발하는 15가지 약물(아미오다론 및 카르바마제핀 포함)을 랫트(rat)에 투여하여 간에서의 유전자 발현양상을 클러스터링(clustering)하여 2차원 그래프(two-dimensional graph)로 살펴본 결과, 15가지 약물 중 아미오다론과 카르바마제핀이 유사한 발현 양상을 보이는 것을 확인할 수 있으나 이에 대하여 바이오마커로서 제 시된 바는 없다(Waring, J. F., et al, Toxicol . Appl . Pharm ., 175(1): 28-42, 2001). 또한, 폐독성에 대하여 아미오다론 및 카르바마제핀에 의해 유발되는 공통적인 유전자와 관련하여 보고된 바 없다.
포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고 되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:10614-10619, 1996).
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20-25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 에질런트(Agilent), 제노믹 솔루션(Genomic Solutions) 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer, K. et.al., J. Am . Acad . Dermatol. 51: 681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 애피메트릭스(Affymetrix)사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성 방법에 의해 만들고 있으며, 에질런트(Agillent)사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K., et.al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).
유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며, cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cye3과 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K., et al ., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).
최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 진단이 가능하게 될 것이다.
이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 4천 개가 집적된 올리고 마이크로어레이를 이용하여 아미오다론 및 카르바마제핀의 유전자 발현 프로파일을 인간 기관지 상피 세포인 BEAS-2B 세포주에서 관찰 및 분석함으로써 아미오다론 및 카르바마제 핀에 의해 공통적으로 과발현 또는 저발현되는 유전자를 발굴하고, 실시간(real-time) 정량 RT-PCR 방법에 의해 상기 유전자들의 발현 양상을 확인하여 폐독성 유발 약물을 검출할 수 있는 마커유전자 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 폐독성 유발 약물인 아미오다론 및 카르바마제핀에 의해 공통적으로 과발현 또는 저발현되는 마커유전자, 및 상기 마커유전자를 이용한 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폐독성 유발 약물인 아미오다론 및 카르바마제핀에 의해 기관지 상피 세포에서 발현변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된 폐독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자를 이용한 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 폐독성 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.
본 발명의 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 마커유전자로 이용하여 새로운 폐독성의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질을 모니터링하거나 위해성을 판정하는데 유용하며, 아미오다론 및 카르바마제핀에 의해 야기되는 폐독성 및 부작용을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 제공한다.
상기 마커 유전자는 아미오다론 및 카르바마제핀에 의해 자극받은 인간 기관지 상피 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 한다.
상기 마커유전자는 세포자살(apoptosis), 이온수송(ion transport), 세포 이온 항상성(cell ion homeostasis), 세포골격 조직 및 생물발생(cytoskeleton organization and biogenesis), 세포주기(cell cycle) 또는 세포분열중기(M pahse)에 관련된 유전자로 구성되어 있다.
본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 마커유전자를 제공한다:
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1) 상기 마커유전자 중에서 폐독성 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 증가하는 마커유전자는 하기와 같다:
유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AB195679(Hypothetical protein FLJ20366), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AK096256(Chromosome 17 open reading frame 51), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AY247738[Tribbles homolog 3(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) BC053653[Chemokine(C-X-C motif) ligand 2], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) BC069830(Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_000189(Hexokinase 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_004864(Growth differentiation factor 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_005203(Collagen, type XIII, alpha 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_013231(Fibronectin leucine rich transmembrane protein 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_013372[Gremlin 1, cysteine knot superfamily, homolog(Xenopus laevis)], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_014079(Kruppel-like factor 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_014707(Histone deacetylase 9), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_022726[Elongation of very long chain fatty acids(FEN1/Elo2, SUR4/Elo3, yeast)-like 4], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_023003(Transmembrane 6 superfamily member 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_170735(Brain-derived neurotrophic factor opposite strand), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_203403(Chromosome 9 open reading frame 150), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) X96753[Chondroitin sulfate proteoglycan 4(melanoma-associated)].
2) 상기 마커유전자 중에서, 폐독성 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 감소하는 마커유전자 유전자는 하기와 같다:
유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AB208813(RNA binding motif protein 5), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AB209164(Glutamate receptor, metabotropic 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AB210026(Myosin, heavy polypeptide 10, non-muscle), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AF001540[metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1(non-coding RNA)], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AF059611[Ectodermal-neural cortex(with BTB-like domain)], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AF345347(Sperm associated antigen 5), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AI690706[Transcribed locus, weakly similar to NP_536845.1 cytochrome c oxidase subunit I(Homo sapiens)], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AJ002535(Obscurin, cytoskeletal calmodulin and titin-interacting RhoGEF), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AK000052[Mediator of RNA polymerase II transcription, subunit 18 homolog(yeast)], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AK025790(Kinesin family member 20A), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AK127394(Hydrolethalus syndrome 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AL834231(Myotrophin), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AY033611(Homo sapiens placenta immunoregulatory factor PLIF mRNA, complete cds.), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AY358369[PRO333; Homo sapiens clone DNA41374 SIGLEC5(UNQ294) mRNA, partial cds.], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AY367065[Asp(abnormal spindle)-like, microcephaly associated(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) BC000206(Homo sapiens, clone IMAGE:3350658, mRNA.), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) BC010281(ADP-ribosylation factor-like 6 interacting protein), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) BC043212(Hypothetical LOC401057), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) BC052951(Lamin B1), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) BC065544(Chromosome 14 open reading frame 106), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) BM752802(Histone 1, H2bm), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) BX647421(Follistatin-like 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) CD388106[S100 calcium binding protein A10(annexin II ligand, calpactin I, light polypeptide(p11))], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) CR621398(Cell division cycle associated 3), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) D63880(Chromosome condensation-related SMC-associated protein 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_001620[AHNAK nucleoprotein(desmoyokin)], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_001964(Early growth response 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_002305[Lectin, galactoside-binding, soluble, 1(galectin 1)], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_002982[Chemokine(C-C motif) ligand 2], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_005345(Heat shock 70kDa protein 1A), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_006087(Tubulin, beta 4), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_006464(Trans-golgi network protein 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_014905(Glutaminase), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_030583(Matrilin 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_052876[BTB(POZ) domain containing 14B], 유전자 등록번 호(Genebank Accession No.) NM_152562(Cell division cycle associated 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_183380(Dystonin), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_207035(Chromosome 1 open reading frame 63), 유전자 등록번호(TIGR) THC2283359, 유전자 등록번호(TIGR) THC2301481, 유전자 등록번호(TIGR) THC2343936, 유전자 등록번호(TIGR) THC2345721.
본 발명자들은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 발굴하기 위하여, 폐독성을 나타내는 아미오다론 및 카르바마제핀을 각각 인간 기관지 상피 세포주(BEAS-2B)에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 아미오다론 및 카르바마제핀은 인간 기관지 상피 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 및 도 2 참조), 상기 실험을 바탕으로 아미오다론 및 카르바마제핀의 처리를 위한 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 아미오다론 및 카르바마제핀을 각각 인간 기관지 상피 세포주에 처리하고, 상기 약물을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 Cy5 형광물질로 표지하였으며, 약물을 처리하지 않은 대조군의 경우 Cy3 형광물질로 표지하였다. 상기 형광표지된 cDNA를 44 k 인간 유전체 전체(Human whole genome) 올리고마이크로어레이 칩(Agilent, USA)과 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 3 참조). 분석시 Cy5/Cy3 비율이 1.5 배 이상인 경우 발현이 증가된 유전자로 분류하였고, 0.5 배 이하인 경우 발현이 감소화된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 아미오다론 및 카르바마제핀의 처리에 의해 공통적으로 발현이 증가된 유전자는 0.038%(44,290개 의 유전자 중 17개), 및 공통적으로 발현이 감소된 유전자는 0.095%(44,290개의 유전자 중 42개)임을 확인하였다. 이때, 아미오다론 및 카르바마제핀에 의해 1.5 배 이상 발현이 변화된 유전자들을 기능별로 분류하였을 때, 폐독성에 작용하는 기능으로 판단되는 세포자살(apoptosis), 이온수송(ion transport), 세포 이온 항상성 유지(cell ion homeostasis), 세포골격 조직과 생물발생설(cytoskeleton organization and biogenesis), 세포주기(cell cycle) 또는 세포분열 중기(M pahse)에 관련된 유전자를 선별하였다(표 2 및 표 3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 아미오다론 및 카르바마제핀을 처리했을 때, 인간 기관지 상피 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
본 발명에서는 상기 유전자 중 세포사멸(apoptosis) 관련 유전자 4종, 이온 수송 관련 유전자 1종, 세포 이온 항상성 관련 유전자 1종, 세포골격과 생물발생설 관련 유전자 4종, 및 세포분열중기 관련 유전자 3종을 분리하여 실시간 역전사유전자증폭기술(real-time reverse transcript polymerase chain reaction, RT-PCR) 방법으로 발현 양상을 조사하였다. 그 결과, 2종의 과발현 유전자들과 9종의 저발현 유전자의 발현 양상이 올리고 마이크로어레이 칩 결과와 유사하게 나타남을 확인하였다(표 5 참조).
또한, 본 발명은 상기 마커유전자 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된 폐독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드는 상기 마커유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함한다.
본 발명의 폐독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이칩을 제작하는 방법은 하기와 같다:
상기 탐색된 마커유전자를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자를 이용한 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
본 발명은
1) 인간 기관지 상피 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 피검 화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군과 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질을 표지하는 단계;
4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 본 발명의 마커유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 기관지 상피 세포는 BEAS-2B를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 인간 기관지 또는 폐로부터 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 전체 인간 게놈 올리고 마이크로어레이(Whole Human Genome Oligo Microarray)(Agilent, USA)를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 공통적으로 과발현 또는 저발현 유전자(표 2 및 표 3 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 모두 사용 가능하며, 본 발명의 실시예에서는 직접 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하였다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어라면 모두 사용 가능하다.
또한, 본 발명은
1) 인간 기관지 상피 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
3) 단계 2)의 RNA를, 본 발명의 마커유전자에 상보적이고 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 기관지 상피 세포는 BEAS-2B를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 기관지 또는 폐로부터 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 프라이머는 본 발명에서 탐색된 마커유전자 유전자와 상보적이고, 마커유전자를 증폭할 수 있으며, 증폭산물이 100 내지 300 bp(base pair)가 되도록 설계된 프라이머라면 모두 사용가능하다. 본 발명에서는 서열번호 1 내지 22로 기재되는 정방향 및 역방향 프라이머 11쌍을 제시하였으나 이에 한정하는 것은 아니다.
아울러, 본 발명은 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 폐독성 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.
상기 DNA 마이크로어레이 칩은 본 발명의 방법으로 제작한 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 검색용 키트는 추가적으로 인간 기관지 상피 세포를 포함할 수 있으며, 인간 기관지 상피 세포는 BEAS-2B를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 기관지 또는 폐로부터 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색용 키트는 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.
상기 검색용 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.
상기 검색용 키트에 추가적으로 상기 마커유전자 유전자에 상보적이고, 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함할 수 있으며, 프라이머는 서열번호 1 내지 22로 기재되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프라이머를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 마커유전자에 상보적이고, 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있으며 증폭산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 정방향 또는 역방향 프라이머쌍은 모두 사용 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리
<1-1> 세포배양
인간 기관지 상피 세포주인 BEAS-2B 세포(CRL-9609, ATCC, USA)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)를 이용하여 T 75 플라스크에서 5 × 105 세포/ml가 되도록 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 폐독성을 부작용으로 나타나는 대표적인 약물인 아미오다론 및 카르바마제핀을 선정하였으며, DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.
<1-2> 세포 독성 실험( MTT assay ) 및 화학 물질 처리
Mossman 등(J. Immunol . Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 BEAS-2B 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트에 3× 104/웰 세포수로 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)에서 DMSO에 용해된 아미오다론 및 카르바마제핀을 처리하고 48시간 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다. BEAS-2B 세포주에서 아미오다론 및 카르바마제핀의 세포독성을 살펴본 결과, 아미오다론의 20% 생존 저해율을 보이는 농도(IC20)는 29.388 uM 이었고(도 1), 카르바마제핀의 20% 생존 저해율을 보이는 농도(IC20)는 324.313 uM 이었으며(도 2), 상기 농도로 결정하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
<실시예 2> 마이크로어레이 실험
<2-1> 표적 RNA 의 분리 및 형광 물질 표지
1.24 × 106 cell/㎖ 농도로 100 mm 디쉬에 BEAS-2B 세포를 분주한 후, 실시예<1-2>에서 결정된 아미오다론 및 카르바마제핀의 농도로 각각 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 순도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)으로 확인하였다.
<2-2> 표지된 cDNA 제조
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 아미오다론 및 카르바마제핀 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 하기 <표 1>과 같이 시약을 혼합하였다.
구성 부피(㎕)
5X first strand buffer 6
dNTPs 0.6
0.1 M DDT 3
SuperScript II enzyme 3
Cy-3 또는 Cy-5 dUTP 2
대조군인 BEAS-2B 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)으로 표지화하였고, 아미오다론 및 카르바마제핀을 처리한 BEAS-2B 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)를 표지화하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 혼합 및 정제되었다.
<2-3> 혼성화 반응
혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로 44 k Whole Human Genome 올리고 마이크로어레이(Agilent, USA)를 이용하였다. 세척(2분간 2×SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1×SSC, 2분간 0.2× SSC에 세척) 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.
<2-4> 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon Instruments, USA)로 스캔하였다. 결합하지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)로 분석하였다. 이렇게 얻어진 데이터로부터 아미오다론 및 카르바마제핀에 대한 마커 유전자를 선별하였다(도 3).
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 4천 개의 유전자 중에서 아미오다론 및 카르바마제핀에 의해 공통적으로 Cy5/Cy3의 비율이 1.5배 이상으로 유전자 발현 증가를 보이는 유전자는 0.038%(44,290개의 유전자 중 17개)이고, 발현이 감소된 유전자는 0.095%(44,290개의 유전자 중 42개)임을 확인하였다.
이때, 아미오다론 및 카르바마제핀에 의해 공통적으로 1.5 배 이상 발현이 변화된 유전자들을 기능별로 분류하였을 때, 폐독성에 작용하는 기능으로 판단되는 세포자살(apoptosis), 이온수송(ion transport), 세포 이온 항상성(cell ion homeostasis), 세포골격 조직 및 생물발생(cytoskeleton organization and biogenesis), 세포주기(cell cycle) 또는 세포분열중기(M pahse)에 관련된 유전자를 선별하였다(표 2 및 표 3). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 아미오다론 및 카르바마제핀을 처리했을 때, 인간 기관지 상피 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
아미오다론 및 카르바마제핀에 의해 공통적으로 발현이 증가하는 유전자
유전자 등록번호 유전자 명 유전자 약어 중간값의 비
아미오다론 카르바마제핀
(a) 세포자살( apoptosis)
AY247738 Tribbles homolog 3(Drosophila) TRIB3 1.504 1.729
(b) 이온수송( ion transport )
NM_005203 Collagen, type XIII, alpha 1 COL13A1 1.820 1.574
(c) 세포주기( cell cycle )
NM_000189 Hexokinase 2 HK2 1.625 1.783
NM_014707 Histone deacetylase 9 HDAC9 2.242 1.762
(d) 기타
AB195679 Hypothetical protein FLJ20366 FLJ20366 1.566 1.752
AK096256 Chromosome 17 open reading frame 51 LOC339263 1.568 1.577
BC053653 Chemokine(C-X-C motif) ligand 2 CXCL2 1.519 1.629
BC069830 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2 LETM2 1.529 1.577
NM_004864 Growth differentiation factor 15 GDF15 2.866 1.565
NM_013231 Fibronectin leucine rich transmembrane protein 2 FLRT2 1.628 1.534
NM_013372 Gremlin 1, cysteine knot superfamily, homolog(Xenopus laevis) GREM1 1.538 1.733
NM_014079 Kruppel-like factor 15 KLF15 3.259 1.613
NM_022726 Elongation of very long chain fatty acids(FEN1/Elo2, SUR4/Elo3, yeast)-like 4 ELOVL4 1.601 1.637
NM_023003 Transmembrane 6 superfamily member 1 TM6SF1 1.615 1.513
NM_170735 Brain-derived neurotrophic factor opposite strand BDNF 1.521 2.119
NM_203403 Chromosome 9 open reading frame 150 C9orf150 1.504 1.530
X96753 Chondroitin sulfate proteoglycan 4(melanoma-associated) CSPG4 1.538 1.749
아미오다론 및 카르바마제핀에 의해 공통적으로 발현이 감소하는 유전자
유전자 등록번호 유전자 명 유전자 약어 중간값의 비
아미오다론 카르바마제핀
(a) 세포자살( apoptosis)
NM_002305 Lectin, galactoside-binding, soluble, 1(galectin 1) LGALS1 0.629 0.617
NM_002982 Chemokine(C-C motif) ligand 2 CCL2 0.543 0.579
NM_005345 Heat shock 70kDa protein 1A HSPA1A 0.611 0.466
(b) 이온수송( ion transport)
AY033611 Homo sapiens placenta immunoregulatory factor PLIF mRNA, complete cds. 0.567 0.555
(c) 세포 이온 항상성( cell ion homeostasis )
AY033611 Homo sapiens placenta immunoregulatory factor PLIF mRNA, complete cds. 0.567 0.555
NM_002982 Chemokine(C-C motif) ligand 2 CCL2 0.543 0.579
(d) 세포 골격 조직 및 생물발생( cytoskeleton organization and biogenesis )
AK025790 Kinesin family member 20A KIF20A 0.400 0.560
AF345347 Sperm associated antigen 5 SPAG5 0.620 0.648
NM_006087 Tubulin, beta 4 TUBB4 0.629 0.611
NM_183380 Dystonin DST 0.665 0.641
(e) 세포주기( cell cycle)
AB208813 RNA binding motif protein 5 RBM5 0.588 0.596
CR621398 Cell division cycle associated 3 CDCA3 0.567 0.663
NM_152562 Cell division cycle associated 2 CDCA2 0.602 0.662
(f) 세포분열 중기(M phase)
AF345347 Sperm associated antigen 5 SPAG5 0.620 0.648
AY367065 Asp(abnormal spindle)-like, microcephaly associated(Drosophila) ASPM 0.414 0.636
D63880 Chromosome condensation-related SMC-associated protein 1 CNAP1 0.630 0.655
(g) 기타
AB209164 Glutamate receptor, metabotropic 2 GRM2 0.608 0.586
AB210026 Myosin, heavy polypeptide 10, non-muscle MYH10 0.629 0.605
AF001540 metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1(non-coding RNA) MALAT-1 0.345 0.299
AF059611 Ectodermal-neural cortex(with BTB-like domain) ENC1 0.580 0.558
AI690706 Transcribed locus, weakly similar to NP_536845.1 cytochrome c oxidase subunit I [Homo sapiens] 0.636 0.515
AJ002535 Obscurin, cytoskeletal calmodulin and titin-interacting RhoGEF OBSCN 0.387 0.661
AK000052 Mediator of RNA polymerase II transcription, subunit 18 homolog(yeast) MED18 0.531 0.622
AK127394 Hydrolethalus syndrome 1 FLJ32915 0.621 0.626
AL834231 Myotrophin MTPN 0.644 0.659
AY358369 PRO333; Homo sapiens clone DNA41374 SIGLEC5(UNQ294) mRNA, partial cds. 0.461 0.600
BC000206 Homo sapiens, clone IMAGE:3350658, mRNA. 0.523 0.665
BC010281 ADP-ribosylation factor-like 6 interacting protein ARL6IP 0.571 0.651
BC043212 Hypothetical LOC401057 0.608 0.501
BC052951 Lamin B1 LMNB1 0.659 0.455
BC065544 Chromosome 14 open reading frame 106 C14orf106 0.614 0.653
BM752802 Histone 1, H2bm HIST1H2BM 0.395 0.639
BX647421 Follistatin-like 1 FSTL1 0.648 0.528
CD388106 S100 calcium binding protein A10(annexin II ligand, calpactin I, light polypeptide(p11)) S100A10 0.644 0.386
NM_001620 AHNAK nucleoprotein(desmoyokin) MGC5395 0.638 0.463
NM_001964 Early growth response 1 EGR1 0.439 0.596
NM_006464 Trans-golgi network protein 2 TGOLN2 0.645 0.656
NM_014905 Glutaminase GLS 0.606 0.589
NM_030583 Matrilin 2 MATN2 0.664 0.589
NM_052876 BTB(POZ) domain containing 14B BTBD14B 0.420 0.638
NM_207035 Chromosome 1 open reading frame 63 NPD014 0.598 0.612
THC2283359 HSU64315 DNA repair endonuclease subunit {Homo sapiens;} , partial(7%) [THC2283359] 0.654 0.658
THC2301481 Unknown 0.565 0.554
THC2343936 Unknown 0.660 0.596
THC2345721 Unknown 0.582 0.184
<실시예 3> 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction) 정량
아미오다론 및 카르바마제핀에 의해 발현 유도된 상기 <실시예 2>의 과발현 및 저발현된 유전자 중 아미오다론 및 카르바마제핀에 의해 주로 야기되는 폐독성 관련 기전으로 세포사멸, 이온 수송, 세포 이온 항상성, 세포분열중기 및 세포골격 조직 관련 유전자 11종을 선별하였다. 이들 유전자들은 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AF345347(Sperm associated antigen 5), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AK025790(Kinesin family member 20A), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AY247738[Tribbles homolog 3(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AY367065[Asp(abnormal spindle)-like, microcephaly associated(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) D63880(Chromosome condensation-related SMC-associated protein 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_002305[Lectin, galactoside-binding, soluble, 1(galectin 1)], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_002982[Chemokine(C-C motif) ligand 2], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_005203(Collagen, type XIII, alpha 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_005345(Heat shock 70kDa protein 1A), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_006087(Tubulin, beta 4), 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_183380(Dystonin) 이다.
상기 유전자들의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR)(Bio-rad, USA)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다. 구체적으로, 올리고 dT 프라이머와 Superscript kit(Omniscipt™ kit, Qiagen, Co., USA)를 이용하여 역전사반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA 0.2 ㎕와 물 3.8 ㎕, 센스 프라이머 0.5 ㎕, 안티센스 프라이머 0.5 ㎕, 사이버그린 I 염색 수퍼믹스(Bio-rad, USA) 5 ㎕ 를 혼합하여, PCR 튜브에 담아 단계 1: 95℃, 3분; 단계 2(45회 반복): 단계 2-1: 95℃, 10초; 단계 2-2: 55 내지 65℃ 45초; 단계 3: 95℃, 1분; 단계 4: 55℃, 1분; 단계 5(반복 80회): 55℃, 10초로 프로그램을 설계한 My IQ 실시간 PCR 기계에서 반응을 수행하였다. PCR 산물을 정량하기 위하여 사이버그린(SYBR Green) I 염색(Bio-rad, USA)으로 염색하였다. 사이버그린 I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저 PCR에 이용한 표적 유전자와 내재성(endogenous) 대조군(GAPDH)에 대한 프라이머를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 각각의 프라이머(표 4)를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다(표 5 참조).
프라이머 서열
등록번호 유전자명 PCR 프라이머 서열
(5'->3')
AF345347 Sperm associated antigen 5 센스
(서열번호 1)		 AGCTGGGTCAGGTTGAGTGTCAAT
안티센스
(서열번호 2)		 TGGCCAGTTTAGCCGTTAGGTTCT
AK025790 Kinesin family member 20A 센스
(서열번호 3)		 GAACACCAACCTGCCAAAGCTCAA
안티센스
(서열번호 4)		 AGGGCCATGACTGCTCTTCTCTTT
AY247738 Tribbles homolog 3(Drosophila) 센스
(서열번호 5)		 TTCAGTGCCTTCCAGAAGGGAGAA
안티센스
(서열번호 6)		 ACCTGATAAGCACCCAAGCAGGAA
AY367065 Asp(abnormal spindle)-like, microcephaly associated(Drosophila) 센스
(서열번호 7)		 AAGCTTCTGGCCTTGCTTGTTCAC
안티센스
(서열번호 8)		 AAGAACTGAATCCGTAGGGCAGCA
D63880 Chromosome condensation-related SMC-associated protein 1 센스
(서열번호 9)		 AGGAGCACAAGACCAAAGATCCCA
안티센스
(서열번호 10)		 ATGCCACGGATTAGTTCTGCCTCT
NM_002305 Lectin, galactoside-binding, soluble, 1(galectin 1) 센스
(서열번호 11)		 TCCTCCTGGACTCAATCATGGCTT
안티센스
(서열번호 12)		 CAGGCACAGGTTGTTGCTGTCTTT
NM_002982 Chemokine(C-C motif) ligand 2 센스
(서열번호 13)		 CATTGTGGCCAAGGAGATCTG
안티센스
(서열번호 14)		 CTTCGGAGTTTGGGTTTGCTT
NM_005203 Collagen, type XIII, alpha 1 센스
(서열번호 15)		 ATTGGGCGAAGATGGCTTACCAGT
안티센스
(서열번호 16)		 AACACACACACAGGCCAATCCAAG
NM_005345 Heat shock 70kDa protein 1A 센스
(서열번호 17)		 TGGAGTCCTACGCCTTCAACATGA
안티센스
(서열번호 18)		 TCCTCTTGTGCTCAAACTCGTCCT
NM_006087 Tubulin, beta 4 센스
(서열번호 19)		 AACGTGTACTACAACGAGGCCACA
안티센스
(서열번호 20)		 ATTGGCCAAACACGAAGTTGTCCG
NM_183380 Dystonin 센스
(서열번호 21)		 AAAGACAAACACACCCACACGCAG
안티센스
(서열번호 22)		 GGCCTCATTGAAAGCAATGGCAGA
등록번호 유전자명 아미오다론 카르바마제핀
실시간 PCR
(상대적 배율) 		cDNA 마이크로어레이
(Cy3/Cy5 비율) 		실시간 PCR
(상대적 배율) 		cDNA 마이크로어레이
( Cy3 / Cy5 비율)
AF345347 Sperm associated antigen 5 0.620 0.572 0.648 0.453
AK025790 Kinesin family member 20A 0.400 0.518 0.560 0.634
AY247738 Tribbles homolog 3(Drosophila) 1.504 1.578 1.729 1.526
AY367065 Asp(abnormal spindle)-like, microcephaly associated(Drosophila) 0.414 0.501 0.636 0.569
D63880 Chromosome condensation-related SMC-associated protein 1 0.630 0.586 0.655 0.515
NM_002305 Lectin, galactoside-binding, soluble, 1(galectin 1) 0.629 0.476 0.617 0.464
NM_002982 Chemokine(C-C motif) ligand 2 0.543 0.582 0.579 0.540
NM_005203 Collagen, type XIII, alpha 1 1.820 3.811 1.574 2.007
NM_005345 Heat shock 70kDa protein 1A 0.611 0.505 0.466 0.474
NM_006087 Tubulin, beta 4 0.629 0.184 0.611 0.023
NM_183380 Dystonin 0.665 0.823 0.641 0.516
그 결과, 2종의 과발현 유전자들과 9종의 저발현 유전자들의 유전자 발현 양상은 폐독성 유발 약물들에 의한 유전자 발현을 조사한 올리고 마이크로어레이 결과와 매우 유사하게 나타남을 확인하였다.
도 1은 아미오다론의 인간 기관지 상피 세포주에서의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 카르바마제핀의 인간 기관지 상피 세포주에서의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 3는 마이크로어레이 칩을 이용한 아미오다론 및 카르바마제핀을 처리한 인간 기관지 상피 세포주의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Marker genes based on amiodarone and carbamazepine treatment for screening of drug inducing pulmonary toxicity and screening method using the same <130> 8p-06-55 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sperm associated antigen 5 sense primer <400> 1 agctgggtca ggttgagtgt caat 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sperm associated antigen 5 antisense primer <400> 2 tggccagttt agccgttagg ttct 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kinesin family member 20A sense primer <400> 3 gaacaccaac ctgccaaagc tcaa 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kinesin family member 20A antisense primer <400> 4 agggccatga ctgctcttct cttt 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tribbles homolog 3(Drosophila) sense primer <400> 5 ttcagtgcct tccagaaggg agaa 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tribbles homolog 3(Drosophila) antisense primer <400> 6 acctgataag cacccaagca ggaa 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp(abnormal spindle)-like, microcephaly associated(Drosophila) sense primer <400> 7 aagcttctgg ccttgcttgt tcac 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp(abnormal spindle)-like, microcephaly associated(Drosophila) antisense primer <400> 8 aagaactgaa tccgtagggc agca 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chromosome condensation-related SMC-associated protein 1 sense primer <400> 9 aggagcacaa gaccaaagat ccca 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chromosome condensation-related SMC-associated protein 1 antisense primer <400> 10 atgccacgga ttagttctgc ctct 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lectin, galactoside-binding, soluble, 1(galectin 1) sense primer <400> 11 tcctcctgga ctcaatcatg gctt 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lectin, galactoside-binding, soluble, 1(galectin 1) antisense primer <400> 12 caggcacagg ttgttgctgt cttt 24 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemokine(C-C motif) ligand 2 sense primer <400> 13 cattgtggcc aaggagatct g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemokine(C-C motif) ligand 2 antisense primer <400> 14 cttcggagtt tgggtttgct t 21 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen, type XIII, alpha 1 sense primer <400> 15 attgggcgaa gatggcttac cagt 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen, type XIII, alpha 1 antisense primer <400> 16 aacacacaca caggccaatc caag 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heat shock 70kDa protein 1A sense primer <400> 17 tggagtccta cgccttcaac atga 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heat shock 70kDa protein 1A antisense primer <400> 18 tcctcttgtg ctcaaactcg tcct 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tubulin, beta 4 sense primer <400> 19 aacgtgtact acaacgaggc caca 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tubulin, beta 4 antisense primer <400> 20 attggccaaa cacgaagttg tccg 24 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dystonin sense primer <400> 21 aaagacaaac acacccacac gcag 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dystonin antisense primer <400> 22 ggcctcattg aaagcaatgg caga 24

Claims (20)

  1. 하기의 모든 유전자의 핵산 서열의 전부 또는 그 서열 내에서 선택되는 18 내지 30개의 핵산 서열로 구성되는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오디드가 집적된 폐독성 유발 약물인 아미오다론 또는 카르바마제핀 검색용 DNA 마이크로어레이 칩:
    유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AY247738[Tribbles homolog 3(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_002305[Lectin, galactoside-binding, soluble, 1(galectin 1)], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_002982[Chemokine(C-C motif) ligand 2], 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) NM_005345(Heat shock 70kDa protein 1A).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 1) 인간 기관지 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
    3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
    4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제1항의 DNA 마이크로어레이와 혼성화시키는 단계;
    5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이를 분석하는 단계; 및
    6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 폐독성 유발 약물인 아미오다론 또는 카르바마제핀 검색 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 단계 1)의 인간 기관지 세포는 인간 기관지 상피 세포인 것을 특징으로 하는 검색 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 검색 방법.
  9. 1) 인간 기관지 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
    3) 단계 2)의 RNA를, 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 폐독성 유발 약물인 아미오다론 또는 카르바마제핀 검색 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 단계 1)의 인간 기관지 세포는 인간 기관지 상피 세포인 것을 특징으로 하는 검색 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 단계 3)의 프라이머는 서열번호 5, 6, 11 내지 14, 17 및 18로 기재되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 검색 방법.
  12. 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 폐독성 유발 약물인 아미오다론 또는 카르바마제핀 검색용 키트.
  13. 제 12항에 있어서, 인간 기관지 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  14. 제 12항에 있어서, 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 형광물질군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  15. 제 12항에 있어서, 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제인 표식시약, 및 세척 완충용액으로 이루어진 반응시약군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  16. 제 12항에 있어서, 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 5, 6, 11 내지 14, 17 및 18로 기재되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  18. 제 7항 또는 제 10항에 있어서, 상기 인간 기관지 상피 세포는 BEAS-2B 세포(CRL-9609, ATCC, USA)인 것을 특징으로 하는 검색 방법.
  19. 제 13항에 있어서, 상기 인간 기관지 세포는 인간 기관지 상피 세포인 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 인간 기관지 상피 세포는 BEAS-2B 세포(CRL-9609, ATCC, USA)인 것을 특징으로 하는 키트.
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