KR101292840B1 - 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐, 및 인데노(１,２,３―ｃ,ｄ)파이렌 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 - Google Patents
벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐, 및 인데노(１,２,３―ｃ,ｄ)파이렌 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101292840B1 KR101292840B1 KR1020110002197A KR20110002197A KR101292840B1 KR 101292840 B1 KR101292840 B1 KR 101292840B1 KR 1020110002197 A KR1020110002197 A KR 1020110002197A KR 20110002197 A KR20110002197 A KR 20110002197A KR 101292840 B1 KR101292840 B1 KR 101292840B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- genebank
- pyrene
- indeno
- expression
- exposure
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 대표적인 다환방향족탄화수소류인 벤조에이안트라센(benz[a]anthracene), 벤조케이플루오란텐(benzo[k]fluoranthene), 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌(indeno(1,2,3-c,d)pyrene) 노출에 대한 암세포의 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 구체적으로 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 의해 공통적이며 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 암세포 이동 관련 바이오마커, 및 이를 이용한 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐, 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이며, 본 발명의 암세포 이동 관련 바이오마커는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용함으로써, 환경 시료에서 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 오염에 의한 암세포의 이동성을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 의해 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로서 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 벤조에이안트라센(benz[a]anthracene), 벤조케이플루오란텐(benzo[k]fluoranthene), 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌(indeno(1,2,3-c,d)pyrene) 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐, 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌에 의해 유전자 발현이 변화하는 암세포 이동 관련 바이오마커 및 이를 이용한 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐, 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
대부분의 다환방향족탄화수소류(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAH)는 화재로부터 불완전 연소에 의해 자연적으로 발생하거나, 트럭, 선반 등에서 연소된 기체로부터 발생하거나, 토탄 침전물에서 발견된다. 이중 벤조에이안트라센(benz[a]anthracene) 및 벤조케이플루오란텐(benzo[k]fluoranthene)은 상업적으로 생산되는 물질은 아니지만 주로 연구 목적으로 생산되며, 인데노(1,2,3-c,d)파이렌(indeno(1,2,3-c,d)pyrene)은 환경 중에서 주로 대기에서 배출된다. 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 또한 상업적으로 생산되는 물질은 아니지만 주로 연구 목적으로 생산되며 국외에서 염료생산시 사용되는 것으로 알려져 있다.
벤조에이안트라센 및 벤조케이플루오란텐은 휘발성이 없어서 토양 중 이동성이 아주 미미하며, 토양 중 반감기는 각각 750일, 65일 내지 1400일 정도이다. 물 표면에서의 휘발성도 거의 없어서, 주로 저질과 부유물질에 흡착되고, 수중에서의 가수분해반응은 일어나지 않으며 수생생물 중 생물농축이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 대기 중에서는 입자 상태로만 존재하여 주로 물리적인 방법으로 제거될 수 있다. 또한, 태양광에 강하게 흡착하여 환경 중에서 직접적인 광분해반응이 일어난다. 국내 식품 중 다환 방향족 탄화수소류의 오염도 조사연구를 통하여, 전국 9개 도시에서 유통되는 육류, 육류 가공품 및 유지류의 벤조에이안트라센 및 벤조케이플루오란텐의 함량을 조사한 결과, 훈연제품, 가금류 식품, 육류에서 각각 0.022~0.046 ㎍/㎏ 및 0.041~0.221 ㎍/㎏으로 검출되었고, 식용유지에서는 각각 평균 0.16 ㎍/㎏ 및 0.16 ㎍/㎏으로 조사되었다.
동물실험에서 벤조에이안트라센은 경구를 통해 흡수되며 피부흡수는 느리고 공기 중 흡입에 의한 흡수는 그리 연구되지 않았다고 알려져 있다. 흡수된 벤조에이안트라센은 대부분 변으로 분비되며 배출되도록 포접화합물로 대사된다. 벤조에이안트라센은 bay region의 반응성이 있는 다이올-에폭사이드 유도체로 대사되어 유전 독성 및 발암성을 일으킨다고 알려져 있다. 또한, 벤조케이플루오란텐의 경우 동물실험에서 위 장관 및 폐에서 빠르게 흡수되고, 지질에 잘 녹으며 표피 막을 통과할 수 있다고 보고되었으며, 장기에서의 부산물은 오랫동안 잔류하며 장기간 노출로 인하여 축적된다는 보고가 있다(Ericson G et al, 1999). 벤조케이플루오란텐은 강한 아크릴 탄화수소 수산화효소(acryl hydrocarbon hydroxylase, AHH) 유도인자이다. 벤조케이플루오란텐은 쥐에서 8,9-다이하이드로-8,9-다이하이드록시 벤조케이플루오란텐으로 대사되어 궁극적으로 유전 독성 및 발암성을 일으키는 것으로 보고되고 있다.
인데노(1,2,3-c,d)파이렌은 낮은 수용성으로 인해 낮은 수생상과의 친화력을 가지며 저질, 토양, 생물 상에서의 유기체의 높은 친화력을 가지므로 수, 저질의 유기물 및 식품에 축적된다. 광분해 및 미생물 분해되며 미생물 분해는 호기성 조건에서 발생한다. 대기 중 부유하는 OH 라디칼과의 반응에 의한 반감기는 약 1일이다. 또한 태양광에 강하게 흡착하여 환경 중에서 직접적인 광분해반응이 일어난다.
구조적으로 유사한 PAH, 주로 벤조에이파이렌의 자료를 근거로 유추해 보면, 인데노(1,2,3-c,d)파이렌은 위장관, 폐, 피부로 흡수됨을 생각해 볼 수 있다. 마우스의 피부에서 가장 많이 발견된 대사체는 8-하이드록시인데노(1,2,3-c,d)파이렌이고, 그 외에 9-하이드록시인데노(1,2,3-c,d)파이렌, 트랜스-1,2-다이하이드로-1,2-다이하이드록시인데노(1,2,3-c,d)파이렌 등이 발견된다고 알려져 있다. 일반적인 PAH와는 달리 인데노(1,2,3-c,d)파이렌은 bay region을 갖지 않으므로 단순히 bay region 에폭사이드에 의해 활성화되지 않고 1,2-다이올과 그것의 에폭사이드 전구체인 1,2-에폭사이드에서 비슷한 발암성을 갖는 것으로 알려져 있다.
또한, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌은 세계보건기구(WHO) 산하의 국제암연구기관(IARC)에서 '인체 발암 가능성 물질'인 2B등급으로 분류되어 있으며(IARC, IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum 82: 367-435, 2002), 미국 환경부의 발암성 분류 등급에서는 잠재적인 인체 발암물질로 발암성 C등급으로 구분되고 있다(IRIS, U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC: Integrated Risk Information System. http://www.epa.gov/iris/. June 6, 2003).
다환방향족 탄화수소류의 발암성에 대한 연구는 많이 보고되어 있지만 암전이, 신생혈관합성 등의 암촉진 및 진행에 관한 연구는 거의 전무하다. 암은 복잡하며 다단계적 과정을 통하여 발생하고 진행되기 때문에 다양한 특징에 나타내지만 기본적으로 정상세포가 암세포의 성질을 갖게 되면 보이는 특징적인 성질들이 몇 가지 알려져 있다. 그 중 가장 대표적인 성질이 바로 운동성(motility) 및 이동(migration)이다. 암세포는 일반적으로 원발 부위로부터 다른 조직이나 장기로 이동하는 전이(metastasis) 과정을 거치게 되는데, 이때 세포가 가져야할 가장 중요한 특징이 바로 이동성과 침윤성(invasion)이다. 세포가 발생부위로부터 먼 곳으로 이동하고 그 조직이나 장기를 뚫고 들어가는 침윤성이 있어야만 전이가 가능하기 때문이다. 세포가 이동성을 갖기 위해서는 서로에게 신호를 주고받으며 영향을 주고받는데 이때 관여하는 다양한 단백질과 유전자들에 대한 연구가 최근 들어 활발히 이루어지고 있다. p53 및 p38 등은 암의 발생, 촉진 및 진행 단계에 있어서 세포 간의 신호전달에 가장 핵심이 되는 단백질로 밝혀져 있으며, 암전이와의 관련성도 많이 알려져 있다. 또한 MMP(matrix metalloproteinase)나 인테그린(integrin)과 같은 단백질들은 세포의 리모델링(remodeling)에 관여하는 단백질로써 세포가 운동성과 이동성을 갖는데에 필수적인 역할을 하는 단백질이라고 할 수 있다. 이처럼 암세포의 이동이 암 촉진 및 진행에 크게 기여하며 이에 관련된 단백질 및 유전자에 대한 연구가 많음에도 불구하고, 다환방향족탄화수소류의 노출에 의해 이러한 유전자의 발현 및 실제 암세포의 이동에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 연구는 부족한 실정이다.
이처럼 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 인간에 대한 발암 및 암 촉진 등의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 상기 물질의 노출에 대한 검색 방법 역시 가스 크로마토그래피-질량 분석법(Gas Chromatography-Mass Spectrometer, GC-MS) 또는 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 따라서, 보다 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 프라이머(primer)를 이용하는 실시간 역전사중합효소연쇄반응(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction, RT-PCR) 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등을 이용한 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용, 특히 암 촉진에 크게 관여한다고 알려진 암세포의 이동 관련 유전자 발현 여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.
포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 발현(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여, DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행할 수 있다(Schena, M., et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 93:10614-10619, 1996).
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA) 또는 20 ~ 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화 하거나, 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et. al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있으며, Agillent사 등에서는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).
유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 상기 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며 cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예를 들면, Cye3 및 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K. et al., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).
최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯하여 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라, 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 확인이 가능하게 될 것이다.
이에, 본 발명자들은 인간 유전자 4만 4천 개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 유전자 발현 프로파일을 인간 간암 세포인 HepG2 세포주에서 관찰 및 분석하여, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌에 의해 공통적으로 과발현 또는 저발현 되는 암세포의 이동에 관련된 유전자를 발굴하고 실시간 RT-PCR 방법에 의해 상기 유전자들의 발현 양상을 확인하였으므로, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 노출시 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부를 검출할 수 있는 바이오마커, 및 이를 이용한 노출 여부를 확인하는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 의해 공통적으로 과발현 또는 저발현되는 암세포 이동에 관련된 바이오마커, 및 상기 바이오마커를 이용한 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 노출 여부 확인용 암세포 이동 관련 바이오 마커 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오 마커 유전자의 핵산 서열의 전부 또는 일부의 핵산 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오 마커 유전자를 이용한 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트를 제공한다.
본 발명의 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커, 및 이를 이용한 확인방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 모니터링 및 암세포의 이동과 관련된 암전이와 같은 위해성을 판정하는데 유용하며, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 인간 간암 세포주에서의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 마이크로어레이 칩을 이용하여, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌을 각각 처리한 인간 간암 세포주의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대해 공통적으로 발현이 증가 또는 감소하는 유전자의 개수를 도식화한 그림이다.
도 2는 마이크로어레이 칩을 이용하여, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌을 각각 처리한 인간 간암 세포주의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대해 공통적으로 발현이 증가 또는 감소하는 유전자의 개수를 도식화한 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 벤조에이안트라센(benz[a]anthracene), 벤조케이플루오란텐(benzo[k]fluoranthene), 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌(indeno(1,2,3-c,d)pyrene)의 노출에 의해 공통적으로 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.
상기 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 의해 공통적으로 발현 변화를 일으키는 유전자는, 유전자 등록번호(Genebank) NM_002228[AP-1, jun oncogene], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005238[ETS-1, v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005985[SNAI1, snail homolog 1 (Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_002203[ITGA2, integrin, alpha 2 (CD49B, alpha 2 subunit of VLA-2 receptor)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_000296[PKD1, polycystic kidney disease 1 (autosomal dominant)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001408[CELSR2, cadherin, EGF LAG seven-pass G-type receptor 2 (flamingo homolog, Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_002996[CX3CL1, chemokine (C-X3-C motif) ligand 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_012131[CLDN17, claudin 17], 유전자 등록번호(Genebank) NM_015102[NPHP4, nephronophthisis 4], 유전자 등록번호(Genebank) NM_032088[PCDHGA8, protocadherin gamma subfamily A, 8], 유전자 등록번호(Genebank) NM_144966[FREM1, FRAS1 related extracellular matrix 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001777[CD47, CD47 molecule], 유전자 등록번호(Genebank) NM_002508[NID1, nidogen 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005560[LAMA5, laminin, alpha 5], 유전자 등록번호(Genebank) NM_006329[FBLN5, fibulin 5], 유전자 등록번호(Genebank) NM_016446[C9orf127, chromosome 9 open reading frame 127], 유전자 등록번호(Genebank) BF312639[RELN, reelin], 유전자 등록번호(Genebank) NM_000638[VTN, vitronectin], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001005862[ERBB2, v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, neuro/glioblastoma derived oncogene homolog (avian)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001457[FLNB, filamin B, beta (actin binding protein 278)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001626[AKT2, v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 2], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001844[COL2A1, collagen, type Ⅱ, alpha 1 (primary osteoarthritis, spondyloepiphyseal dysplasia, congenital)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_006113[VAV3, vav 3 oncogene], 유전자 등록번호(Genebank) NM_015059[TLN2, talin 2], 유전자 등록번호(Genebank) NM_016848[SHC3, SHC (Src homology 2 domain containing) transforming protein 3], 유전자 등록번호(Genebank) NM_033641[COL4A6, collagen, type Ⅳ, alpha 6] 및 유전자 등록번호(Genebank) NM_053025[MYLK, myosin, light chain kinase]로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 유전자 등록번호(Genebank) NM_002228[AP-1, jun oncogene], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005238[ETS-1, v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005985[SNAI1, snail homolog 1 (Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_002203[ITGA2, integrin, alpha 2 (CD49B, alpha 2 subunit of VLA-2 receptor)]로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 바이오마커는 1.5배 이상 발현이 유의성 있게 증가 또는 감소하는 유전자로써, 암세포의 이동(cancer cell migration)과 관련된 유전자로 구성되어 있다.
본 발명자들은 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포의 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌을 인간 간암 세포주(HepG2)에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌은 모두 인간 간암 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 독성 실험을 바탕으로 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 농도를 결정하였다(벤조에이안트라센; 36.09 μM, 벤조케이플루오란텐; 22.56 μM, 인데노(1,2,3-c,d)파이렌; 227.66 μM). 이후 상기 결정된 농도로 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌을 인간 간암 세포주에 처리하고, 상기 물질을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 형광물질(Cy5)로 표지하였으며, 약물을 처리하지 않은 대조군의 경우 Cy3로 표지하였다. 상기 형광표지된 cDNA를 44 k 올리고마이크로어레이 칩 Human whole genome microarray(Agilent, USA)와 혼성화 하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2 참조). 분석시 Cy5/Cy3 비율이 1.5배 이상인 경우 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.667배 이하인 경우 발현 감소된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 다환 방향족 탄화수소류의 노출에 의해 공통으로 발현이 증가된 유전자는 1.2%(44,000개의 유전자 중 532개)이고, 공통으로 발현이 감소된 유전자는 1.7%(44,000개의 유전자 중 742개)임을 확인하였다(도 3 참조). 이때, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌에 의해 공통으로 1.5배 이상 과발현 또는 저발현 되는 유전자들을 기능별로 분류한 결과, 암세포 이동(cancer cell migration) 관련 유전자들이 27종이 포함되어 있었다(표 2 참조).
본 발명자들은 상기 유전자 중 과발현된 유전자 4종, 즉 등록번호(Genebank) NM_002228[AP-1, jun oncogene], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005238[ETS-1, v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005985[SNAI1, snail homolog 1 (Drosophila)] 및 유전자 등록번호(Genebank) NM_002203[ITGA2, integrin, alpha 2 (CD49B, alpha 2 subunit of VLA-2 receptor)]에 대하여 실시간 RT-PCR(real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 방법으로 발현 양상을 조사하였다. 그 결과, 상기 4종의 과발현 유전자들의 발현 양상이 올리고마이크로어레이 칩 결과와 유사하게 나타남을 확인하였다(표 4 참조).
따라서, 본 발명의 상기 암세포 이동 관련 유전자는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 의해 공통적으로 발현 변화를 일으킴으로써, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커로서 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자의 핵산 서열의 전부 또는 18 내지 30개의 핵산 서열로 구성되는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 바이오마커 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다.
상기 선별된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다.
상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
본 발명에서 선별된 상기 바이오마커는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 의해 발현량이 공통적이고 유의적으로 증가 또는 감소하므로, 상기 바이오마커는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인 방법을 제공한다.
본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인 방법을 제공한다:
1) 실험군인 피검체 유래 인간 체세포와 대조군인 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌에 노출되지 않은 인간 체세포로부터 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질을 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 상기 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 본 발명의 상기 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간 간암 세포주(HepG2)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 간 세포 또는 인간 간암의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, USA) 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 공통적으로 과발현 또는 저발현 유전자(표 2 참조)가 집적된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 4)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
본 발명의 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩은, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 의해 공통적으로 발현량의 유의적인 증가 또는 감소를 나타내는 바이오마커가 집적되어 있으므로, 상기 바이오마커들의 발현 양상을 확인함으로써 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부를 검출하는데 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌에 대한 노출 여부 확인 방법을 제공한다:
1) 실험군인 피검체 유래 인간 체세포와 대조군인 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌에 노출되지 않은 인간 체세포로부터 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를, 본 발명의 상기 바이오마커에 상보적이고 상기 바이오마커를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간 간암 세포주(HepG2)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 간 또는 간암의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 프라이머쌍은 본 발명에서 탐색된 바이오마커 유전자와 상보적이고, 바이오마커를 증폭할 수 있는 프라이머쌍이라면 모두 사용가능하다.
상기 프라이머쌍은 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍; 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍; 서열번호 5로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍; 서열번호 7로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍; 및 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 의해 공통적으로 발현량의 유의적인 증가 또는 감소를 나타내는, 암세포 이동 관련 상기 바이오마커는, 상기 바이오마커의 발현 양상을 확인함으로써 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부를 검출하는데 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 키트는 추가적으로 인간 간 세포 또는 간암 세포를 포함할 수 있고, 상기 인간 간암 세포는 HepG2를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 간 세포 또는 인간 간암의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 않고, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정되지 않고, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자에 상보적으로 결합하고, 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 10 내지 100bp 길이의 프라이머쌍을 포함하는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 키트는 추가적으로 인간 간 세포 또는 간암 세포를 포함할 수 있고, 상기 인간 간암 세포는 HepG2를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 간 세포 또는 인간 간암의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 프라이머쌍은 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍; 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍; 서열번호 5로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍; 서열번호 7로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍; 및 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 바이오마커 유전자에 상보적이며, 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있으며 증폭산물이 100 내지 300bp가 되도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머쌍은 모두 사용 가능하다.
본 발명의 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 의해 공통적으로 발현량의 유의적인 증가 또는 감소를 나타내는 암세포 이동 관련 상기 바이오마커는, 상기 바이오마커들의 발현 양상을 확인함으로써 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부를 검출하기 위한 키트에 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
세포 배양 및 화학물질 처리
<1-1> 세포배양
인간 간암 세포주인 HepG2 세포(한국세포주은행)를 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)가 첨가된 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)를 이용하여 100 ㎜ 디쉬(dish)에서 80% 정도 성장할 때까지 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 다환방향족탄화수소류의 하나로서 발암성을 가지는 물질인, 벤조에이안트라센(benz[a]anthracene), 벤조케이플루오란텐(benzo[k]fluoranthene) 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌(indeno(1,2,3-c,d)pyrene)을 선정하였으며, 이를 DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.
<1-2> 화학물질의 처리 및 세포 독성 실험(
MTT
assay
)
Mossman 등(J. Immunol . Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법에 따라, HepG2 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. HepG2 세포는 24-웰 플레이트에 4×105/웰 세포수로 하여 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)에서 DMSO에 용해된 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌을 각각 처리하였고, 처리한 뒤 48시간 후에 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이 후, 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 그런 다음, 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하였고 흡광도 540 ㎚에서 O.D.값을 측정하였다.
HepG2 세포주에서 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 세포독성을 확인한 결과, 20% 생존율을 보이는 농도(IC20)는 각각 36.09 μM, 22.56 μM 및 227.66 μM이었으며, 상기 농도들로 결정하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
<
실시예
2>
마이크로어레이
실험을 통한 유전자 발현량 분석
<2-1> 표적
RNA
의 분리
6×106 세포수/㎖ 농도로 100 ㎜ 디쉬에 HepG2 세포를 분주한 후, 상기 실시예 <1-2>에서 결정된 각각의 농도로 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌을 48시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 3종류의 다환방향족탄화수소가 각각 처리된 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하였고, RNeasy mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각각의 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 농도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)와 아가로스 젤 전기영동으로 확인하였다.
<2-2> 형광 물질이
표지된
cDNA
제조
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여, 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)을 혼합하여 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing) 하였다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 실시하기 위하여 하기 표 1과 같이 시약을 혼합하였다. 대조군인 HepG2 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)로 표지화하였고, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌을 처리한 HepG2 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)로 표지화하였다. 이때, 두 군의 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제하였다.
| 구성 | 부피(㎕) |
| 5X first strand buffer | 6 |
| dNTPs | 0.6 |
| 0.1 M DDT | 3 |
| SuperScript II enzyme | 3 |
| Cy-3 or Cy-5 dUTP | 2 |
<2-3>
혼성화
반응
혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로는 44 k Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, USA)를 이용하였다. 세척(2분간 2×SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1×SSC, 및 2분간 0.2×SSC에 세척) 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.
<2-4> 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon Instruments, USA)로 스캔하였다. 결합하지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때, 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성 정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)로 분석하였다. 이렇게 하여 얻어진 데이터로부터 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌에 대한 마커 유전자를 선별하였다(도 2).
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 4천 개의 유전자 중에서 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 의해 공통적으로 Cy5/Cy3의 비율이 1.5배 이상으로 유전자 발현 증가를 보이는 유전자는 1.2%(44,000개의 유전자 중 532개)이고, 공통으로 발현이 감소된 유전자는 1.7%(44,000개의 유전자 중 742개)임을 확인하였다(도 3). 이때, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌에 의해 공통적으로 1.5배 이상 과발현 또는 저발현 되는 유전자들을 기능별로 분류한 결과, 암세포 이동(cancer cell migration) 관련 유전자들이 27종이 포함되어 있었다(표 2). 이들 암세포 이동 관련 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌을 처리했을 때, 인간 간암 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 아직까지 없는 실정이다.
| 등록번호 | 유전자 약어 |
유전자명 | 중간값의 비 | ||
| 벤조에이안트라센 | 벤조케이플루오란텐 | 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 | |||
| NM_002228 | AP-1 | jun oncogene | 1.72 | 1.78 | 3.80 |
| NM_005238 | ETS-1 | v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian) | 2.08 | 2.89 | 2.00 |
| NM_005985 | SNAI1 | snail homolog 1 (Drosophila) | 1.57 | 1.80 | 2.06 |
| NM_002203 | ITGA2 | integrin,alpha2(CD49B,alpha2subunitofVLA-2receptor) | 3.07 | 5.87 | 6.20 |
| NM_000296 | PKD1 | polycystic kidney disease 1 (autosomal dominant) | 0.57 | 0.06 | 0.51 |
| NM_001408 | CELSR2 | cadherin, EGF LAG seven-pass G-type receptor 2 (flamingo homolog, Drosophila) | 0.43 | 0.22 | 0.47 |
| NM_002996 | CX3CL1 | chemokine (C-X3-C motif) ligand 1 | 0.60 | 0.21 | 0.60 |
| NM_012131 | CLDN17 | claudin 17 | 0.38 | 0.08 | 0.37 |
| NM_015102 | NPHP4 | nephronophthisis 4 | 0.67 | 0.47 | 0.54 |
| NM_032088 | PCDHGA8 | protocadherin gamma subfamily A, 8 | 0.65 | 0.47 | 0.53 |
| NM_144966 | FREM1 | FRAS1 related extracellular matrix 1 | 0.32 | 0.09 | 0.21 |
| NM_001777 | CD47 | CD47 molecule | 0.57 | 0.40 | 0.35 |
| NM_002508 | NID1 | nidogen 1 | 0.47 | 0.19 | 0.31 |
| NM_005560 | LAMA5 | laminin, alpha 5 | 0.49 | 0.46 | 0.60 |
| NM_006329 | FBLN5 | fibulin 5 | 0.21 | 0.22 | 0.31 |
| NM_016446 | C9orf127 | chromosome 9 open reading frame 127 | 0.64 | 0.64 | 0.45 |
| BF312639 | RELN | reelin | 0.60 | 0.29 | 0.25 |
| NM_000638 | VTN | vitronectin | 0.53 | 0.25 | 0.27 |
| NM_001005862 | ERBB2 | v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, neuro/glioblastoma derived oncogene homolog (avian) | 0.42 | 0.20 | 0.48 |
| NM_001457 | FLNB | filamin B, beta (actin binding protein 278) | 0.58 | 0.42 | 0.59 |
| NM_001626 | AKT2 | v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 2 | 0.50 | 0.29 | 0.60 |
| NM_001844 | COL2A1 | collagen, type II, alpha 1 (primary osteoarthritis, spondyloepiphyseal dysplasia, congenital) | 0.12 | 0.05 | 0.15 |
| NM_006113 | VAV3 | vav 3 oncogene | 0.45 | 0.28 | 0.29 |
| NM_015059 | TLN2 | talin 2 | 0.42 | 0.30 | 0.25 |
| NM_016848 | SHC3 | SHC (Src homology 2 domain containing) transforming protein 3 | 0.39 | 0.28 | 0.19 |
| NM_033641 | COL4A6 | collagen, type IV, alpha 6 | 0.45 | 0.37 | 0.24 |
| NM_053025 | MYLK | myosin, light chain kinase | 0.61 | 0.45 | 0.30 |
<
실시예
3> 실시간
RT
-PCR(
Real
-
time
reverse
transcriptase
polymerase
chain
reaction
)을 이용한 유전자 정량
벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 의해 공통적으로 발현이 유도된 상기 실시예 2의 1.5배 이상 과발현 및 저발현된 유전자 중, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌에 의해 과발현되는 유전자 4종을 선별하였다. 이들 유전자들은 유전자 등록번호(Genebank) NM_002228[AP-1, jun oncogene], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005238[ETS-1, v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005985[SNAI1, snail homolog 1 (Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_002203[ITGA2, integrin, alpha 2 (CD49B, alpha 2 subunit of VLA-2 receptor)]이었다.
상기 유전자들의 발현 변화 정도를 조사 및 정량하기 위하여, My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR)(Bio-rad, USA)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다. 구체적으로, 올리고 dT 프라이머 및 Superscript kit(Omniscipt™ kit, Qiagen, Co., USA)를 이용하여 역전사 반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. PCR 산물을 정량하기 위하여, 사이버그린(SYBR Green) Ⅰ 염색(Bio-rad, USA)으로 염색하였다. 사이버그린 Ⅰ 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저 PCR에 이용한 표적 유전자와 내재성(endogenous) 대조군(GAPDH)에 대한 프라이머를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 하기 표 3에 기재된 각각의 프라이머를 혼합하였고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행하였으며, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다.
| 유전자 약어 | 등록번호 | PCR 프라이머 서열 (5'→3') | |
| ETS-1 | NM_005238 | 센스 | AAACTTGCTACCATCCCGTACGT (서열번호 1) |
| 안티센스 | TGGTGAGAGTCGGCTTGAGAT (서열번호 2) | ||
| AP-1 | NM_002228 | 센스 | CCCCAGCGTATCTATATGGAA (서열번호 3) |
| 안티센스 | CTGTCCCTCTCCACTGCAA (서열번호 4) | ||
| SNAI1 | NM_005985 | 센스 | AGGCAGCTATTTCAGCCTCCTGTT (서열번호 5) |
| 안티센스 | GACAGCCATTACTCACAGTCCCT (서열번호 6) | ||
| ITGA2 | NM_002203 | 센스 | ACTCTTTGGATTTGCGTGTG (서열번호 7) |
| 안티센스 | GGCAGTCTCAGAATAGGCTTC (서열번호 8) | ||
| GAPDH | NM_002046 | 센스 | GCACCACCAACTGCTTAGC (서열번호 9) |
| 안티센스 | GCATGGACTGTGGTCATGAG (서열번호 10) | ||
그 결과, 상기 4종의 과발현 유전자들의 유전자 발현 양상은 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 노출에 의한 유전자 발현을 조사한 올리고 마이크로어레이 결과와 매우 유사하게 나타남을 확인하였다(표 4).
| 등록번호 | 유전자명 | 유전자 약어 | 마이크로어레이 | 실시간 PCR | |
| (Cy3/Cy5 비율) | (상대적 배율) | ||||
| NM_002228 | jun oncogene | AP-1 | 벤조에이안트라센 | 1.72 | 1.44 |
| 벤조케이플루오란텐 | 1.78 | 6.56 | |||
| 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 | 3.80 | 3.01 | |||
| NM_005238 | v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian) | ETS-1 | 벤조에이안트라센 | 2.08 | 6.09 |
| 벤조케이플루오란텐 | 2.89 | 9.38 | |||
| 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 | 2.00 | 6.60 | |||
| NM_005985 | snail homolog 1 (Drosophila) | SNAI1 | 벤조에이안트라센 | 1.57 | 1.75 |
| 벤조케이플루오란텐 | 1.80 | 4.06 | |||
| 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 | 2.06 | 2.89 | |||
| NM_002203 | integrin,alpha2(CD49B,alpha2subunitofVLA-2receptor) | ITGA2 | 벤조에이안트라센 | 3.07 | 5.79 |
| 벤조케이플루오란텐 | 5.87 | 10.68 | |||
| 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 | 6.20 | 3.94 |
<110> Korea Institute of Science and Technology
<120> Biomarker for identification of genes related cancer cell
migration after exposure to benz[a]anthracene,
benzo[k]fluoranthene and indeno(1,2,3-c,d)pyrene, and the method
of identification using thereof
<130> 10p-11-91
<160> 10
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ETS-1 sense primer
<400> 1
aaacttgcta ccatcccgta cgt 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ETS-1 antisense primer
<400> 2
tggtgagagt cggcttgaga t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AP-1 sense primer
<400> 3
ccccagcgta tctatatgga a 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AP-1 antisense primer
<400> 4
ctgtccctct ccactgcaa 19
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNAI1 sense primer
<400> 5
aggcagctat ttcagcctcc tgtt 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNAI1 antisense primer
<400> 6
gacagccatt actcacagtc cct 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGA2 sense primer
<400> 7
actctttgga tttgcgtgtg 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGA2 antisense primer
<400> 8
ggcagtctca gaataggctt c 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH sense primer
<400> 9
gcaccaccaa ctgcttagc 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH antisense primer
<400> 10
gcatggactg tggtcatgag 20
Claims (13)
- 하기 모든 유전자 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩:
유전자 등록번호(Genebank) NM_002228[AP-1, jun oncogene], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005238[ETS-1, v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005985[SNAI1, snail homolog 1 (Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_002203[ITGA2, integrin, alpha 2 (CD49B, alpha 2 subunit of VLA-2 receptor)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_000296[PKD1, polycystic kidney disease 1 (autosomal dominant)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001408[CELSR2, cadherin, EGF LAG seven-pass G-type receptor 2 (flamingo homolog, Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_002996[CX3CL1, chemokine (C-X3-C motif) ligand 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_012131[CLDN17, claudin 17], 유전자 등록번호(Genebank) NM_015102[NPHP4, nephronophthisis 4], 유전자 등록번호(Genebank) NM_032088[PCDHGA8, protocadherin gamma subfamily A, 8], 유전자 등록번호(Genebank) NM_144966[FREM1, FRAS1 related extracellular matrix 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001777[CD47, CD47 molecule], 유전자 등록번호(Genebank) NM_002508[NID1, nidogen 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005560[LAMA5, laminin, alpha 5], 유전자 등록번호(Genebank) NM_006329[FBLN5, fibulin 5], 유전자 등록번호(Genebank) NM_016446[C9orf127, chromosome 9 open reading frame 127], 유전자 등록번호(Genebank) BF312639[RELN, reelin], 유전자 등록번호(Genebank) NM_000638[VTN, vitronectin], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001005862[ERBB2, v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, neuro/glioblastoma derived oncogene homolog (avian)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001457[FLNB, filamin B, beta (actin binding protein 278)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001626[AKT2, v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 2], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001844[COL2A1, collagen, type Ⅱ, alpha 1 (primary osteoarthritis, spondyloepiphyseal dysplasia, congenital)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_006113[VAV3, vav 3 oncogene], 유전자 등록번호(Genebank) NM_015059[TLN2, talin 2], 유전자 등록번호(Genebank) NM_016848[SHC3, SHC (Src homology 2 domain containing) transforming protein 3], 유전자 등록번호(Genebank) NM_033641[COL4A6, collagen, type Ⅳ, alpha 6] 및 유전자 등록번호(Genebank) NM_053025[MYLK, myosin, light chain kinase].
- 1) 실험군인 피검체 유래 인간 체세포와 대조군인 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌에 노출되지 않은 인간 체세포로부터 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인 방법.
- 제 2항에 있어서, 단계 1)의 인간 체세포는 인간의 간 세포 또는 인간 간암 세포인 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 인간 간암 세포는 HepG2인 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인 방법.
- 제 2항에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인 방법.
- 1) 실험군인 피검체 유래 인간 체세포와 대조군인 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌에 노출되지 않은 인간 체세포로부터 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를, 제 1항의 암세포 이동 관련 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인 방법.
- 제 6항에 있어서, 단계 1)의 인간 체세포는 인간의 간 세포 또는 인간 간암 세포인 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 인간 간암 세포는 HepG2인 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인 방법.
- 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트.
- 제 9항에 있어서, 인간 간 세포 또는 간암 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트.
- 제 1항의 암세포 이동 관련 유전자에 상보적으로 결합하고 상기 각각의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 모두 포함하는, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트.
- 제 11항에 있어서, 인간 간 세포 또는 간암 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트.
- 제 11항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍; 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍; 서열번호 5로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍; 및 서열번호 7로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 또는 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110002197A KR101292840B1 (ko) | 2011-01-10 | 2011-01-10 | 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐, 및 인데노(１,２,３―ｃ,ｄ)파이렌 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110002197A KR101292840B1 (ko) | 2011-01-10 | 2011-01-10 | 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐, 및 인데노(１,２,３―ｃ,ｄ)파이렌 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20120080786A KR20120080786A (ko) | 2012-07-18 |
| KR101292840B1 true KR101292840B1 (ko) | 2013-08-05 |
Family
ID=46713236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020110002197A KR101292840B1 (ko) | 2011-01-10 | 2011-01-10 | 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐, 및 인데노(１,２,３―ｃ,ｄ)파이렌 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101292840B1 (ko) |
-
2011
- 2011-01-10 KR KR1020110002197A patent/KR101292840B1/ko not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Cancer Lett, Vol. 265, No. 1, pp. 135-147 (2008.06.28.) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20120080786A (ko) | 2012-07-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101008385B1 (ko) | 다환 방향족 탄화수소류 노출 여부 확인용 바이오마커 및이를 이용한 확인 방법 | |
| KR101463900B1 (ko) | 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 | |
| KR101342035B1 (ko) | 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커 및 이를이용한 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색 방법 | |
| KR101398548B1 (ko) | 저급 지방족 포화 알데하이드류 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 | |
| KR101301255B1 (ko) | 탄화플루오르옥탄술폰산 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 | |
| KR100957055B1 (ko) | 트리클로로에틸렌 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를이용한 확인 방법 | |
| KR101292840B1 (ko) | 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐, 및 인데노(１,２,３―ｃ,ｄ)파이렌 노출에 대한 암세포 이동 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 | |
| KR101749566B1 (ko) | 디젤 배기 미립자(diesel exhaust particle) 노출에 따른 염증반응 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 | |
| KR101294787B1 (ko) | 벤조에이안트라센 노출 여부 확인용 마이크로 ｒｎａ 및 이를 이용한 확인 방법 | |
| KR101271598B1 (ko) | 벤조케이플루오란텐 노출 여부 확인용 마이크로 ｒｎａ 및 이를 이용한 확인 방법 | |
| KR101144199B1 (ko) | 잔류성 유기오염물질류 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 | |
| KR100991755B1 (ko) | 카르바마제핀 처리에 따른, 폐독성 유발 약물 검색용마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법 | |
| KR101011155B1 (ko) | 아미오다론 및 카르바마제핀 처리에 따른, 폐독성 유발약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법 | |
| KR101138954B1 (ko) | 갑상선 과산화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법 | |
| KR100962211B1 (ko) | 에틸벤젠 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한확인 방법 | |
| KR101062784B1 (ko) | 미렉스 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 | |
| KR100936286B1 (ko) | 아미오다론 처리에 따른, 폐독성 유발 약물 검색용마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법 | |
| KR101383653B1 (ko) | 프로피온알데히드 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 | |
| KR101457481B1 (ko) | 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법 | |
| KR101383641B1 (ko) | 부틸알데히드 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 | |
| KR101079250B1 (ko) | 카바릴 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 | |
| KR101609373B1 (ko) | 저급 지방족 포화 알데하이드 류 특이적 메틸화 마커 유전자 및 이를 이용한 저급 지방족 포화 알데하이드 류 노출 여부 확인 방법 | |
| KR101386075B1 (ko) | 헥사클로로벤젠 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법 | |
| KR101151786B1 (ko) | 트리클로로에틸렌의 인체 노출에 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 바이오 마커 및 이를 이용한 확인 방법 | |
| KR20090061160A (ko) | 인데노(1,2,3-ｃ,ｄ)파이렌 노출 여부 확인용 바이오마커및 이를 이용한 확인 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160701 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170703 Year of fee payment: 5 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |