KR100957055B1 - 트리클로로에틸렌 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를이용한 확인 방법 - Google Patents

트리클로로에틸렌 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를이용한 확인 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 휘발성 유기 화합물 중의 하나인 트리클로로에틸렌(Trichloroethylene)에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 구체적으로 트리클로로에틸렌에 의해 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이며, 본 발명의 바이오마커는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 환경 시료에서 트리클로로에틸렌의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 트리클로로에틸렌에 의해 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
트리클로로에틸렌, 휘발성 유기 화합물, 바이오마커, 마이크로어레이

Description

트리클로로에틸렌 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법{Biomarker for identification of exposure to Trichloroethylene and the method of identification using thereof}
본 발명은 트리클로로에틸렌(Trichloroethylene)에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것이다.
휘발성 유기 화합물 중에서 트리클로로에틸렌(Trichloroethylene)은 공업용 세정제 및 드라이클리닝 용제 등의 폐수에 의해 환경 중에 배출된다. 트리클로로에틸렌은 용제로 사용되거나 유기화합물의 합성원료로 또는 소화제 등의 약제로도 사용된다.
트리클로로에틸렌은 휘발성이 있으며 토양에서의 휘발성이 다른 화합물에 비해 높다. 대기중 반감기가 빨라 넓은 지역으로의 이동이 용이하며 표면 수에서 공기중으로의 이동도 높다. 수중에서의 가수분해 전환과정은 매우 느리다. 또한, 대기 중에서의 전환은 광화학적인 수산화반응에 의해 일어난다. 국내 수질 중 휘 발성 유기 화합물의 오염도 조사연구에서 16개의 시료 중 6개의 시료에서 트리클로로에틸렌이 검출되었으며 대기중 휘발성 유기 화합물의 오염도 조사연구에서는 서울 주거지역에서 2.28 ppb, 공단배후지역에서 0.86 ppb, 도로변에서 2.51 ppb가 검출되었다(환경부 자료실).
동물모델이 트리클로로에틸렌을 노출해 본 결과, 노출 초기에 빠르게 흡수되어졌고, 위 장관 벽을 침투하는 경우가 있기 때문에 경구를 통한 흡수는 급성 독성의 빈번한 원인이 되었다. 트리클로로에틸렌에 의한 급성 독성은 지방조직의 양에 의해서는 크게 영향을 받지 않았고, 상기 물질의 체내에서의 잔류 정도는 육체적 활동에 의해 다르게 나타났다. 또한, 트리클로로에틸렌은 혈액을 통해 조직에 도달하였으며 지용성으로 인해 특히 지방조직에 잘 축적되었다. 태반을 지나 태아의 혈액에서도 발견된다는 보고도 있다. 또한, 트리클로로에틸렌은 일차적으로 간에서 대사되며 다른 장기에서는 아주 적은 양이 대사된다. 상기 물질의 주요 포유류 대사물은 유리형태 및 접합체 형태의 트리클로로에탄올(trichloethanol)과 트리클로로아세트산(Trihloacetic acid)이다. 아울러, 트리클로로에틸렌은 쥐의 간과 신장에서 선종 및 보기 드문 손상을 나타낸 것으로 보고되었다(IPCS; Internation Programe on chemical safety).
휘발성 유기 화합물의 발암성 정도와 유전자 발현 변화에 대한 연구가 일부 보고되고 있지만, 대표적인 휘발성 유기 화합물로 알려진 포름알데하이드, 벤젠(Formaldehyde, Benzene)등에 대한 연구에 거의 국한되어 있다. 상기에서 언급한 것과 같이 트리클로로에틸렌의 인간에 대한 발암 가능성에도 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. 상기 GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용할 경우 정량적 분석이 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 더욱 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 프라이머(primer)를 이용하는 실시간(real-time) RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등을 이용하여 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 트리클로로에틸렌의 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.
포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 즉, 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:10614-10619, 1996).
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et. al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어 지고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).
유전자 발현의 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 수득하여 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 혼성화반응을 수행한다. 상기 수득한 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며 cDNA로 전환시킨다. 올리고마이크로어레이는 주로 두 개의 다른 형광(예: Cye3 및 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K. et al., Genomics Proteomics I:1-10, 2002). 최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯한 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석 및 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이 를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색이 가능하게 될 것이다.
이에 본 발명자들은 인간 유전자 3만 5천 개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 트리클로로에틸렌의 유전자 발현 프로파일을 인간 백혈병 세포인 HL-60 세포주에서 관찰 및 분석함으로써 트리클로로에틸렌에 의해 과발현 또는 저발현 되는 유전자를 발굴하여 트리클로로에틸렌을 검출할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 노출 여부를 확인하는 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 트리클로로에틸렌의 노출에 의해 과발현 또는 저발현되는 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용한 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트리클로로에틸렌(Trichloroethylene)의 노출에 의해 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부 확인용 검색 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 트리클로로에틸렌의 노출에 의해 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.
상기 바이오마커는 2배 이상 발현이 증가 또는 감소한 유전자로써, 면역반응(Immune response), 아팝토시스의 조절(regulation of apoptosis), 손상에 대한 반응(Response to stimulus), 세포내 신호전달 캐스케이드(intracellular signaling cascades), 세포골격 조직과 발생(cytoskeleton organization and biogenesis) 등의 관련 유전자로 구성되어 있다.
본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 제공한다:
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(Genebank) BC038433(OPRL1, opiate receptor-like 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_005737(ARL4C, ADP-ribosylation factor-like 4C), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_007313(ABL1, v-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_178148(SLC35B2, solute carrier family 35, member B2), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014238(KSR1, kinase suppressor of ras 1), 유전자 등록번호 (Genebank) BE896653(RLB1C, Small GTP-binding protein), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_005228(EGFR, epidermal growth factor receptor(erythroblastic leukemia viral(v-erb-b) oncogene homolog, avian)), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_152879(DGKD, diacylglycerol kinase, delta 130kDa) 및 유전자 등록번호 (Genebank) NM_003029(SHC1, SHC(Src homology 2 domain containing) transforming protein 1).
1) 상기 바이오마커 중에서 트리클로로에틸렌의 노출에 의해 발현이 증가하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다:
유전자 등록번호 (Genebank) NM_012420(IFIT5, interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 5), 유전자 등록번호 (Genebank) BX649185(BCL6, B-cell CLL/lymphoma 6 (zinc finger protein 51)), 유전자 등록번호 (Genebank) AK095515(IFIT1, Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1), 유전자 등록번호 (Genebank) AF026939(IFIT3, interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001993(F3, coagulation factor III (thromboplastin, tissue factor)), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_000566(FCGR1A, Fc fragment of IgG, high affinity Ia, receptor (CD64)), 유전자 등록번호 (Genebank) BC032319(MNDA, myeloid cell nuclear differentiation antigen), 유전자 등록번호 (Genebank) U62027(C3AR1, complement component 3a receptor 1), 유전자 등록번호 (Genebank) AB209647(NCF2, neutrophil cytosolic factor 2 (65kDa, chronic granulomatous disease, autosomal 2)), 유전자 등록번호 (Genebank) AK093842(XBP1, X-box binding protein 1), 유전자 등록번호 (Genebank) BC010940(AIM2, absent in melanoma 2), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_003855(IL18R1, interleukin 18 receptor 1), 유전자 등록번호 (Genebank) BQ056329(MIF, Macrophage migration inhibitory factor (glycosylation-inhibiting factor)), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014314(DDX58, DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 58), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_006573(TNFSF13B, tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 13b), 유전자 등록번호 (Genebank) AF077346(IL18RAP, interleukin 18 receptor accessory protein), 유전자 등록번호 (Genebank) BC028148(TNF, tumor necrosis factor(TNF superfamily, member 2)), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_002852(PTX3, pentraxin-related gene, rapidly induced by IL-1 beta), 유전자 등록번호 (Genebank) BC036368(AOC3, amine oxidase, copper containing 3 (vascular adhesion protein 1)), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_139314(ANGPTL4, angiopoietin-like 4), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_005101(G1P2, interferon, alpha-inducible protein(clone IFI-15K)), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_000958(PTGER4, prostaglandin E receptor 4 (subtype EP4)), 유전자 등록번호 (Genebank) BC032839(IFIT2, interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2), 유전자 등록번호 (Genebank) BC010954(CXCL10, chemokine(C-X-C motif) ligand 10), 유전자 등록번호 (Genebank) AK125926(PABPC4, Poly(A) binding protein, cytoplasmic 4 (inducible form)), 유전자 등록번호 (Genebank) AK023956(OASL, 2'-5'-oligoadenylate synthetase-like), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_176817(TAS2R38, taste receptor, type 2, member 38), 유전자 등록번호 (Genebank) BC018740(HSPA1A, heat shock 70kDa protein 1A), 유전자 등록번호 (Genebank) AK096149(ERRFI1, ERBB receptor feedback inhibitor 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001778(CD48, CD48 antigen(B-cell membrane protein)), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_024800(NEK11, NIMA(never in mitosis gene a)- related kinase 11), 유전자 등록번호 (Genebank) CR601067(PLAUR, Plasminogen activator, urokinase receptor), 유전자 등록번호 (Genebank) AK125343(SRXN1, sulfiredoxin 1 homolog(S. cerevisiae)), 유전자 등록번호 (Genebank) L20470(VLDLR, very low density lipoprotein receptor), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_020529(NFKBIA, nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha), 유전자 등록번호 (Genebank) AF217990(HERPUD1, homocysteine-inducible, endoplasmic reticulum stress-inducible, ubiquitin-like domain member 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_003714(STC2, stanniocalcin 2), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001561(TNFRSF9, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 9), 유전자 등록번호 (Genebank) BC093988(IFNA13, interferon, alpha 13), 유전자 등록번호 (Genebank) AB209639(ISG20, interferon stimulated exonuclease gene 20kDa), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_022168(IFIH1, interferon induced with helicase C domain 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_004049(BCL2A1, BCL2-related protein A1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001165(BIRC3, baculoviral IAP repeat-containing 3), 유전자 등록번호 (Genebank) BC012609(SERPINB2, serpin peptidase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 2), 유전자 등록번호 (Genebank) BC018740(HSPA1A, heat shock 70kDa protein 1A), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001561(TNFRSF9, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 9), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_006290(TNFAIP3, tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3) 및 유전자 등록번호 (Genebank) BF690887(BCL2A1, BCL2-related protein A1).
3) 상기 바이오마커 중에서, 트리클로로에틸렌의 노출에 의해 발현이 감소하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다:
유전자 등록번호 (Genebank) AF043045(FLNB, filamin B, beta(actin binding protein 278)), 유전자 등록번호 (Genebank) AF061943(TAOK2, TAO kinase 2), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_005781(TNK2, tyrosine kinase, non-receptor, 2), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_006148(LASP1, LIM and SH3 protein 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_006306(SMC1L1, SMC1 structural maintenance of chromosomes 1-like 1(yeast)), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_020820(PREX1, phosphatidylinositol 3, 4, 5-trisphosphate-dependent RAC exchanger 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_002375(MAP4, microtubule-associated protein 4), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_004010(DMD, dystrophin(muscular dystrophy, Duchenne and Becker types)), 유전자 등록번호 (Genebank) X86019(WASPIP, Wiskott-Aldrich syndrome protein interacting protein), 유전자 등록번호 (Genebank) AF345347(SPAG5, sperm associated antigen 5), 유전자 등록번호 (Genebank) AB018260(RHOBTB2, Rho-related BTB domain containing 2), 유전자 등록번호 (Genebank) AK124547(ABR, active BCR-related gene), 유전자 등록번호 (Genebank) AK125360(ASB15, ankyrin repeat and SOCS box-containing 15), 유전자 등록번호 (Genebank) BC038433(OPRL1, opiate receptor-like 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_005737(ARL4C, ADP-ribosylation factor-like 4C), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_007313(ABL1, v-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_178148(SLC35B2, solute carrier family 35, member B2), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014238(KSR1, kinase suppressor of ras 1), 유전자 등록번호 (Genebank) BE896653(RLB1C, Small GTP-binding protein), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_005228(EGFR, epidermal growth factor receptor(erythroblastic leukemia viral(v-erb-b) oncogene homolog, avian)), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_152879(DGKD, diacylglycerol kinase, delta 130kDa) 및 유전자 등록번호 (Genebank) NM_003029(SHC1, SHC(Src homology 2 domain containing) transforming protein 1).
본 발명자들은 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 트리클로로에틸렌을 인간 백혈병 세포주(HL-60)에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 트리클로로에틸렌은 인간 백혈병 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 트리클로로에틸렌의 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 트리클로로에틸렌을 인간 백혈병 세포주에 처리하고, 상기 물질을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 형광물질(Cy5)로 표지하였으며, 약물을 처리하지 않은 대조군의 경우 Cy3로 표지하였다. 상기 형광표지 된 cDNA를 35 k 올리고마이크로어레이 칩 Human whole genome microarray(operon, USA)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2 참조). 분석시 Cy5/Cy3 비율이 2.0배 이상인 경우 발현이 증가한 유전자로 분류하였고,0.5배 이하인 경우 발현 감소한 유전자로 분류하였다. 분석 결과, IC20값에서 발현이 증가한 유전자는 0.125%(35,000개의 유전자 중 44개), 발현이 감소한 유전자는 0.46%(35,000개의 유전자 중 161개)임을 확인하였고, IC50값에서 발현이 증가한 유전자는 0.37%(35,000개의 유전자 중 131개), 발현이 감소한 유전자는 0.46%(35,000개의 유전자 중 161개)임을 확인하였으며, IC20과 IC50값에서 공통으로 발현이 증가한 유전자는 0.08%(35,000개의 유전자 중 27개), 발현이 감소한 유전자는 0.25%(35,000개의 유전자 중 90개)임을 확인하였다. 이때, 트리클로로에틸렌에 의해 2배 이상 과발현 또는 저발현 되는 유전자들을 분류한 기능별로 분류하면, 면역반응(Immune response), 아팝토시스의 조절(regulation of apoptosis), 손상에 대한 반응(Response to stimulus), 세포내 신호전달 캐스케이드(intracellular signaling cascades), 세포골격 조직과 발생(cytoskeleton organization and biogenesis) 등의 관련 유전자들이었다(표 2 및 표 3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 트리클로로에틸렌을 처리했을 때, 인간 백혈병 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보 가닥 분자가 집적된 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 바이오마커 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함 한다.
본 발명의 트리클로로에틸렌 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로파이펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다:
1) 실험군으로서 피검체로부터 분리된 인간 체세포와 대조군 체세포에서 RNA 를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 4항의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 본 발명의 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간 백혈병 세포주(HL-60)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 골수 또는 백혈병의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 4)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole Human Genome Oligo Microarray(operon, USA)등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 공통으로 과발현 또는 저발현 유전자(표 2 및 표 3 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사 용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 4)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
또한, 본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다:
1) 실험군으로서 피검체로부터 분리된 인간 체세포와 대조군 체세포에서 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를, 본 발명의 바이오마커 유전자에 상보적이고 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간 백혈병 세포주(HL-60)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 골수 또는 백혈병의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 2)의 프라이머는 본 발명에서 탐색 된 바이오마커 유전자와 상보적이고, 바이오마커를 증폭할 수 있는 프라이머라면 모두 사용가능하다.
아울러, 본 발명은 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 확인용 키트에 추가적으로 인간 골수세포를 포함하는 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다. 상기 인간 골수세포는 HL-60를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 골수 또는 백혈병의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙타비딘-알칼린 포스파타제 접합물질(streptavidin-alkaline phosphatase conjugate), 화학형광물질(chemifluorenscent material) 및 화학발광물질(chemiluminescent material)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
본 발명의 트리클로로에틸렌에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 트리클로로에틸렌의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하며, 트리클로로에틸렌에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리
<1-1> 세포배양
인간 백혈병 세포주인 HL-60 세포(한국 세포주 은행)를 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지(Gibro-BRL, USA)를 이용하여 T75 플라스크(flask)에서 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 휘발성 유기 화합물의 하나로서 발암성을 가지고 있는 물질인 트리클로로에틸렌을 선정하였으며, 이를 DMSO에 용해하였다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.
<1-2> 세포 독성 실험( MTT assay ) 및 화학 물질 처리
Mossman 등(J. Immunol . Methods, 65:55-63, 1983)의 방법으로 HL-60 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 15 ㎖ 튜브에 1 × 106 cell/㎖ 세포수로 3 ㎖을 넣고 RPMI 배지(Gibro-BRL, USA)에서 DMSO에 용해된 트리클로로에틸렌을 처리하고 3시간 후에 MTT(3-4, 5-dimethylthiazol-2, 5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하였고 흡광도 540 ㎜에서 O.D.값을 측정하였다.
HL-60 세포주에서 트리클로로에틸렌의 세포독성을 살펴본 결과, 20% 생존율을 보이는 농도(IC20)는 1.733 mM 이었고 50% 생존율을 보이는 농도(IC50)는 4.112 mM이었으며(도 1), 상기 농도로 결정하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
< 실시예 2> 마이크로어레이 실험
<2-1> RNA 의 분리 및 형광 물질 표지
1 × 106 cell/㎖ 농도로 15 ㎖ 튜브에 3 ㎖씩 HL-60 세포를 분주한 후, 실시예 1-2에서 결정한 농도의 트리클로로에틸렌을 3시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포로부터 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하였고, RNeasy mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 농도는 Experion(Automated Electrophoresis station, Bio-Rad, USA)으로 확인하였다.
<2-2> 표지된 cDNA 제조
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시예 2-1에서 수득한 트리클로로에틸렌 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 표 1과 같이 시약을 혼합하였다.
구성 부피(㎕)
5X first strand buffer 6
dNTPs 0.6
0.1 M DDT 3
SuperScript II enzyme 3
Cy-3 or Cy-5 dUTP 2
대조군인 HL-60 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)로 표지화하였고, 트리클로로에틸렌을 처리한 HL-60 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)로 표지화하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제되었다.
<2-3> 혼성화 반응
혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)(한국)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로는 35 k Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, USA)를 이용하였다. 세척 과정(2분간 2× SSC/0.1% SDS, 3분간 1× SSC 및 2분간 0.2× SSC에 세척)을 거친 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.
<2-4> 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon Instruments, USA)로 스캔하였다. 결합하지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미하였다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)로 분석하였다. 상기 방법에 의해 수득한 데이터로부터 트리클로로에틸렌에 대한 마커 유전자를 선별하였다(도 2).
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 3만 5천 개의 유전자 중에서 트리클로로에틸렌에 의해 분석시 Cy5/Cy3 비율이 2.0배 이상인 경우 발현이 증가한 유전자로 분류하였고,0.5배 이하인 경우 발현 감소한 유전자로 분류하였다. 분석 결과, IC20값에서 발현이 증가한 유전자는 0.125%(35,000개의 유전자 중 44개), 발현이 감소한 유전자는 0.46%(35,000개의 유전자 중 161개)임을 확인하였고, IC50값에서 발현이 증가한 유전자는 0.37%(35,000개의 유전자 중 131개), 발현이 감소한 유전자는 0.46%(35,000개의 유전자 중 161개)임을 확인하였으며, IC20과 IC50값에서 공통으로 발현이 증가한 유전자는 0.08%(35,000개의 유전자 중 27개), 발현이 감소한 유전자는 0.25%(35,000개의 유전자 중 90개)임을 확인하였다.
이때, 트리클로로에틸렌에 의해 2배 이상 과발현 혹은 저발현 되는 유전자들을 기능별로 분류한 결과, 면역반응(Immune response), 아팝토시스의 조절(regulation of apoptosis), 손상에 대한 반응(Response to stimulus), 세포내 신호전달 캐스케이드(intracellular signaling cascades), 세포골격 조직과 발생(cytoskeleton organization and biogenesis) 이었다(표 2 및 표 3).
트리클로로에틸렌에 의해 발현이 증가하는 유전자
등록번호 유전자 약어 유전자 명 중간값의 비
(a) 면역반응 IC20 IC50
NM_012420 IFIT5 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 5 6.115 23.735
BX649185 BCL6 B-cell CLL/lymphoma 6 (zinc finger protein 51) 2.3118 4.6338
AK095515 IFIT1 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 43.673 61.971
AF026939 IFIT3 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3 5.4597 6.2631
NM_001993 F3 coagulation factor III (thromboplastin, tissue factor) 2.0177 　
NM_000566 FCGR1A Fc fragment of IgG, high affinity Ia, receptor (CD64) 　 2.819
BC032319 MNDA myeloid cell nuclear differentiation antigen 　 2.1544
U62027 C3AR1 complement component 3a receptor 1 　 2.1866
AB209647 NCF2 neutrophil cytosolic factor 2 (65kDa, chronic granulomatous disease, autosomal 2) 　 2.838
AK093842 XBP1 X-box binding protein 1 　 2.1758
BC010940 AIM2 absent in melanoma 2 　 3.9661
NM_003855 IL18R1 interleukin 18 receptor 1 　 2.1439
BQ056329 MIF Macrophage migration inhibitory factor (glycosylation-inhibiting factor) 　 2.0074
NM_014314 DDX58 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 58 　 5.6773
NM_006573 TNFSF13B tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 13b 　 2.2796
AF077346 IL18RAP interleukin 18 receptor accessory protein 　 8.9273
BC028148 TNF tumor necrosis factor (TNF superfamily, member 2) 　 3.8429
NM_002852 PTX3 pentraxin-related gene, rapidly induced by IL-1 beta 　 2.3191
BC036368 AOC3 amine oxidase, copper containing 3 (vascular adhesion protein 1) 　 2.5659
(b) 손상에 대한 반응
NM_139314 ANGPTL4 angiopoietin-like 4 2.1664 7.9193
NM_005101 G1P2 interferon, alpha-inducible protein (clone IFI-15K) 2.0501 9.9824
NM_000958 PTGER4 prostaglandin E receptor 4 (subtype EP4) 2.0083 9.2053
BC032839 IFIT2 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2 68.812 89.17
BC010954 CXCL10 chemokine (C-X-C motif) ligand 10 4.1497 7.9454
AK125926 PABPC4 Poly(A) binding protein, cytoplasmic 4 (inducible form) 2.0076 2.066
AK023956 OASL 2'-5'-oligoadenylate synthetase-like 2.6131 5.0309
NM_176817 TAS2R38 taste receptor, type 2, member 38 2.4886 　
BC018740 HSPA1A heat shock 70kDa protein 1A 2.0459 　
AK096149 ERRFI1 ERBB receptor feedback inhibitor 1 　 2.6128
NM_001778 CD48 CD48 antigen (B-cell membrane protein) 　 2.2556
NM_024800 NEK11 NIMA (never in mitosis gene a)- related kinase 11 　 2.587
CR601067 PLAUR Plasminogen activator, urokinase receptor 　 2.1348
AK125343 SRXN1 sulfiredoxin 1 homolog (S. cerevisiae) 　 2.1181
L20470 VLDLR very low density lipoprotein receptor 　 3.0013
NM_020529 NFKBIA nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha 　 2.4725
AF217990 HERPUD1 homocysteine-inducible, endoplasmic reticulum stress-inducible, ubiquitin-like domain member 1 　 2.3759
NM_003714 STC2 stanniocalcin 2 　 2.7504
NM_001561 TNFRSF9 tumor necrosis factor receptor superfamily, member 9 　 2.0321
BC093988 IFNA13 interferon, alpha 13 　 2.2149
AB209639 ISG20 interferon stimulated exonuclease gene 20kDa 　 3.4956
(c) 아팝토시스의 조절
NM_022168 IFIH1 interferon induced with helicase C domain 1 4.8843 17.725
NM_004049 BCL2A1 BCL2-related protein A1 2.2752 2.4541
NM_001165 BIRC3 baculoviral IAP repeat-containing 3 3.0032 7.4623
BC012609 SERPINB2 serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 2 2.0333 2.8491
NM_022168 IFIH1 interferon induced with helicase C domain 1 4.8843 　
NM_139314 ANGPTL4 angiopoietin-like 4 2.1664 　
BC012609 SERPINB2 serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 2 2.0333 　
BC018740 HSPA1A heat shock 70kDa protein 1A 2.0459 　
NM_001165 BIRC3 baculoviral IAP repeat-containing 3 3.0032 　
NM_004049 BCL2A1 BCL2-related protein A1 2.2752 　
NM_022168 IFIH1 interferon induced with helicase C domain 1 　 17.725
NM_001561 TNFRSF9 tumor necrosis factor receptor superfamily, member 9 　 2.0321
NM_139314 ANGPTL4 angiopoietin-like 4 　 7.9193
BC012609 SERPINB2 serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 2 　 2.8491
BQ056329 MIF Macrophage migration inhibitory factor (glycosylation-inhibiting factor) 　 2.0074
NM_006290 TNFAIP3 tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3 　 3.2836
NM_001165 BIRC3 baculoviral IAP repeat-containing 3 　 7.4623
BF690887 BCL2A1 BCL2-related protein A1 　 2.1481
트리클로로에틸렌에 의해 발현이 감소하는 유전자
등록번호 유전자 약어 유전자 명 중간값의 비
(a) 세포골격 조직과 발생 IC20 IC50
AF043045 FLNB filamin B, beta (actin binding protein 278) 0.4669 0.4513
AF061943 TAOK2 TAO kinase 2 0.4081 0.4071
NM_005781 TNK2 tyrosine kinase, non-receptor, 2 0.4685 0.2603
NM_006148 LASP1 LIM and SH3 protein 1 0.3381 0.4244
NM_006306 SMC1L1 SMC1 structural maintenance of chromosomes 1-like 1 (yeast) 0.4751 0.3485
NM_020820 PREX1 phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-dependent RAC exchanger 1 0.3181 　
NM_002375 MAP4 microtubule-associated protein 4 0.3852 　
NM_004010 DMD dystrophin (muscular dystrophy, Duchenne and Becker types) 0.4013 　
X86019 WASPIP Wiskott-Aldrich syndrome protein interacting protein 　 0.4152
AF345347 SPAG5 sperm associated antigen 5 　 0.3619
(b) 세포내 신호전달 캐스케이드
AB018260 RHOBTB2 Rho-related BTB domain containing 2 0.4549 0.4677
AK124547 ABR active BCR-related gene 0.4221 0.4161
AK125360 ASB15 ankyrin repeat and SOCS box-containing 15 0.3342 0.3298
BC038433 OPRL1 opiate receptor-like 1 0.4761 0.4919
NM_005737 ARL4C ADP-ribosylation factor-like 4C 0.4721 0.492
NM_007313 ABL1 v-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 0.2645 0.2292
NM_178148 SLC35B2 solute carrier family 35, member B2 0.4837 　
NM_014238 KSR1 kinase suppressor of ras 1 0.4568 　
BE896653 RLB1C Small GTP-binding protein 0.4812 　
NM_005228 EGFR epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian) 0.4965 　
NM_152879 DGKD diacylglycerol kinase, delta 130kDa 0.4852 　
NM_003029 SHC1 SHC (Src homology 2 domain containing) transforming protein 1 0.4643 　
도 1은 트리클로로에틸렌(Trichloroethylene)의 인간 백혈병 세포주에서의 세포 독성을 조사한 그래프이다.
도 2는 마이크로어레이 칩을 이용한 트리클로로에틸렌을 처리한 인간 백혈병 세포주에서의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

Claims (14)

  1. 세포사멸 관련 기능을 갖는, 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산서열의 전부 또는 18 내지 30개의 핵산 서열로 구성되는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 트리클로로에틸렌 노출에 의한 상기 유전자의 발현량 증가 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩:
    유전자 등록번호 (Genebank) NM_022168(IFIH1, interferon induced with helicase C domain 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_004049(BCL2A1, BCL2-related protein A1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001165(BIRC3, baculoviral IAP repeat-containing 3), 유전자 등록번호 (Genebank) BC012609(SERPINB2, serpin peptidase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 2).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 실험군으로서 트리클로로에틸렌에 대한 노출이 의심되는 환자 유래 인간 골수 세포 또는 인간 백혈병 세포, 및 대조군으로서 정상인 유래 인간 골수 세포로부터 각각 분리된 RNA 시료로부터
    1) cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
    2) 단계 1)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
    3) 단계 2)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및,
    4) 단계 3)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 상기 유전자 발현량의 증가 여부를 측정하는 단계를 포함하는 트리클로로에틸렌 노출에 의한 상기 유전자 발현량 증가 여부 확인을 위한 유전자 검출 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 5항에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 유전자 검출 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩 또는 상기 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는, 18 내지 30머 길이의 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 트리클로로에틸렌 노출에 의한 상기 유전자 발현량 증가 여부 확인용 키트.
  13. 삭제
  14. 삭제
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013168842A1 (ko) * 2012-05-10 2013-11-14 한국수력원자력 주식회사 고준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법 및 상기 방법으로 검출된 유전자
WO2013168844A1 (ko) * 2012-05-10 2013-11-14 한국수력원자력 주식회사 저준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법 및 상기 방법으로 검출된 유전자
WO2013168843A1 (ko) * 2012-05-10 2013-11-14 한국수력원자력 주식회사 저준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법 및 상기 방법으로 검출된 유전자

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101488671B1 (ko) * 2009-10-20 2015-02-04 순천향대학교 산학협력단 트리클로로에틸렌 독성 중독 진단용 바이오마커

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Toxicol Appl Pharmacol.2005 Aug 7;206(2):157-68

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013168842A1 (ko) * 2012-05-10 2013-11-14 한국수력원자력 주식회사 고준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법 및 상기 방법으로 검출된 유전자
WO2013168844A1 (ko) * 2012-05-10 2013-11-14 한국수력원자력 주식회사 저준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법 및 상기 방법으로 검출된 유전자
WO2013168843A1 (ko) * 2012-05-10 2013-11-14 한국수력원자력 주식회사 저준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법 및 상기 방법으로 검출된 유전자
CN104284987A (zh) * 2012-05-10 2015-01-14 韩国水力原子力株式会社 对低强度电离放射线敏感的基因的检测方法及用所述方法检测的基因
US9512489B2 (en) 2012-05-10 2016-12-06 Korea Hydro & Nuclear Power Co., Ltd. Method for detecting genes sensitive to low-level ionizing radiation
US9708668B2 (en) 2012-05-10 2017-07-18 Korea Hydro & Nuclear Power Co., Ltd. Method for detecting genes sensitive to low-level ionizing radiation
US9708669B2 (en) 2012-05-10 2017-07-18 Korea Hydro & Nuclear Power Co., Ltd. Method for detecting genes sensitive to low-level ionizing radiation
US9708670B2 (en) 2012-05-10 2017-07-18 Korea Hydro & Nuclear Power Co., Ltd. Method for detecting genes sensitive to low-level ionizing radiation
US9714453B2 (en) 2012-05-10 2017-07-25 Korea Hydro & Nuclear Power Co., Ltd. Method for detecting genes sensitive to low-level ionizing radiation
US9976186B2 (en) 2012-05-10 2018-05-22 Korea Hydro & Nuclear Power Co., Ltd. Method for detecting genes sensitive to high-level ionizing radiation, and gene detected by the method
US10174379B2 (en) 2012-05-10 2019-01-08 Korea Hydro & Nuclear Power Co., Ltd. Method for detecting genes sensitive to low-level ionizing radiation, and gene detected by the method
US10760134B2 (en) 2012-05-10 2020-09-01 Korea Hydro & Nuclear Power Co., Ltd Method for detecting Ppargc1a gene sensitive to high-level ionizing radiation
US10844439B2 (en) 2012-05-10 2020-11-24 Korea Hydro & Nuclear Power Co., Ltd Method for detecting lipe gene sensitive to high-level ionizing radiation
US10844438B2 (en) 2012-05-10 2020-11-24 Korea Hydro & Nuclear Power Co., Ltd Method for detecting Acsl1 gene sensitive to high-level ionizing radiation
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