KR101301254B1

KR101301254B1 - 퍼플루오로옥탄산염 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법

Info

Publication number: KR101301254B1
Application number: KR1020110100648A
Authority: KR
Inventors: 류재천; 최한샘; 송미; 송미경
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2011-10-04
Filing date: 2011-10-04
Publication date: 2013-08-28
Also published as: KR20130036521A

Abstract

본 발명은 잔류성 유기오염물질 중의 하나인 퍼플루오로옥탄산염 (Perfluorooctanoic acid; PFOA) 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 구체적으로 PFOA에 의해 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 PFOA 에 특이적 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이며, 본 발명의 바이오마커는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 환경 시료에서 PFOA 의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, PFOA 에 의해 특이적으로 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

Description

퍼플루오로옥탄산염 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법{Specific biomarker for identification of exposure to Perfluorooctanoic acid and the method of identification using thesame}

본 발명은 퍼플루오로옥탄산염(Perfluorooctanoic acid; PFOA) 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 PFOA에 의해 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 PFOA 특이적 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.

환경에서 검출되는 물질군중 잔류성 유기 오염 물질류는 잔류성과 생체농축성, 독성을 가지고 있어 환경으로 노출될 경우 사람의 건강이나 생태계에 돌이킬 수 없는 피해를 가져올 우려가 있는 실정이다. 과불화화합물(PFCs: PerFluorinated Compounds)과 같은 잔류성 유기오염물류 중 PFOA (Perfluorooctanoic acid)는 선형의 8개의 탄소가 연결된 직선형태의 물질로서 원래는 산업에서 APFO 형태로 이용되면서 전 지구적으로 확산되어 왔으며, APFO는 암모늄이온의 분리로 쉽게 PFOA의 형태로 될 수 있다(Kennedy et al ., Ceit . Rev . Toxicol., 34:351-384, 2004). 주로 취사도구의 비점착성 표면 코팅에 이용되고, 의류의 방수성과 통기성을 위한 피막, 항공우주산업, 자동차산업, 건설업, 화학 공정, 전기 전자산업, 반도체산업, 섬유산업 등 모든 산업의 각종 분야에 이용되고 있다. PFOA는 주로 산업단지나 주거 밀집지역의 하수를 통해 배출되게 되는데 물질자체의 안정성으로 인해 산이나 염기 등과 반응하지 않으며 환경 중에서 분해와 같은 반응이 잘 일어나지 않아 잔류성이 매우 커서 발생원에서 멀리 떨어진 지역 환경에서도 그 농도가 검출되고 있으며, 심지어 극지방에서도 검출되고 있는 실정이다. John Geisy 와 Kurunthachalam Kannan은 전 세계 다양한 지역에 살고 있는 악어, 포유류, 새, 물고기 등의 피와 조직 샘플들을 수집하여, PFOA에 대하여 조사하였으며 몇몇 종들에서 다양한 PFOA를 상당 수준 함유하고 있다는 것을 발견하였다(Kennan et al., Environ. Sci . Technol ., 35:1593-1598, 2001, Giesy and Kannan, Environ . Sci . Technol ., 35:1339-1342, 2001). 먹이 사슬을 통해 상위 단계의 생물일수록 체내에서 고농도로 검출되는 것으로 보고되고 있다.

인체 또는 생태계에 대한 유해성 여부는 인체에서는 아직까지 명확히 확인되고 있지 않다. 분자자체의 안정성은 분자의 변형이 가능하지 않고 분자가 가지고 있는 형태 그대로 지속적으로 자연환경에 잔류할 수 있는 가능성을 시사하며 생물체로의 유입이 그러한 물질들의 최종 대상의 형태가 될 가능성이 높다는 것을 의미한다. 환경이나 생체 내에서 오랜 기간 잔류함으로써 유해성과 위해성이 우려되는 물질들이며, 실제로 혈액 내의 단백질과 강하게 결합하여 생물체 내에 농축되는 특성이 있으며, 환경 중의 농도보다 생물 체내에서 훨씬 높은 농도로 검출되는 것으로 알려져 있다.

이러한 물질들에 대한 독성 연구는 최근에 여러 방면에서 다양한 방법을 통해 이루어지고 있다. 지금까지 알려진 사실로는 PFOA는 일반적으로 급성독성은 높지 않다고 알려져 있으나, PFOA의 경우 동물실험을 통해 암을 유발할 우려는 있으나, 인체에서의 발암성 증거는 아직까지 밝혀져 있지 않은 상태이다(Sasaki et al., Bull Environ Contam Toxicol ., 71:408-413, 2003). US EPA에서 발표한 자료에 따르면 PFOA는 세포내의 페록시좀을 증식시키고, 지방산의 β-산화를 증가시키는 효과를 가지고 있으며, cytochrome P-450(CYP450)을 증가시킨다고 보고하고 있다(U.S. EPA, 2003). PFOA의 전구물질인 APFO의 경우 신체발달 및 생식 기능상 매우 높은 위험성을 유발시키며, 특히 아동들과 가임 연령 여성의 건강에 큰 영향을 미칠 수 있다고 보고되었으며, 야생동물의 조직뿐만 아니라 인간의 혈청에서도 1.0 ~ 75 μg/L 이상 검출되고 있는 것으로 보고되었다. 또한, 동물 내의 간세포 독성과 치사율이 매우 민감한 것으로 보고되고 있다(Kennedy et al ., Ceit . Rev . Toxicol ., 34:351-384, 2004)

또한 잔류성 유기오염물질류의 발암성 정도와 유전자 발현 변화에 대한 연구는 일부 보고되고 있지만, 대표적인 잔류성 유기오염물질류로 알려진 디디티(dichlorodiphenyl-trichloro-ethane)에 대한 연구에 거의 국한되어 있다. 이처럼 PFOA의 인간에 대한 위해성에도 불구하고 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 보다 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 프라이머(primer)를 이용하는 실시간(real-time) PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)또는 DNA 마이크로어레이 칩 등으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용, 유전자 발현 여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 PFOA의 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.

포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al., Proc . Natl . Acad . Sci . 미국 93:10614-10619, 1996).

마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et. al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).

유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직, 세포 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며 cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cye3 및 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K. et al ., Genomics Proteomics I:1-10, 2002). 최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯해 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 확인이 가능하게 될 것이다.

이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 2천여 개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 퍼플루오로옥탄산염(Perfluorooctanoic acid; PFOA)의 유전자 발현 프로파일을 인간 간암 세포인 HepG2 세포주에서 관찰 및 분석하고 이를 본 발명자들이 수행한 다른 과불화화합물(Perfluoro compounds : PFCs) 1종에 의한 유전자 발현 프로파일과 비교 분석하여 PFOA에 의해서만 특이적으로 과발현 혹은 저발현 되는 유전자를 발굴하여 PFOA만을 특이적으로 검출할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 노출 여부를 확인하는 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 퍼플루오로옥탄산염(Perfluorooctanoic acid; PFOA)의 노출에 의해 특이적으로 과발현 또는 저발현되는 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용한 PFOA 특이적 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 퍼플루오로옥탄산염(Perfluorooctanoic acid; PFOA)의 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 PFOA에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 바이오마커 유전자의 핵산 서열 또는 이의 상보 가닥 분자가 집적된 PFOA 특이적 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 바이오마커를 이용한 PFOA 특이적 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 PFOA 특이적 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

본 발명의 퍼플루오로옥탄산염(Perfluorooctanoic acid; PFOA) 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자를 바이오마커로 이용하여 PFOA의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하며, PFOA에 의해 야기되는 특이적인 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 퍼플루오로옥탄산염(Perfluorooctanoic acid; PFOA)의 인간 간암 세포주에서의 세포 독성 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 마이크로어레이 칩을 이용한 PFOA를 처리한 인간 간암 세포주의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 마이크로어레이 칩을 이용한 PFOA 및 PFOS(Perfluorooctane Sulfonates) 처리 후 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 PFOS 노출에서는 발현이 증가 또는 감소되지 않고 PFOA 노출에 의해서만 발현이 1.5배 이상 증가 혹은 감소하는 유전자 23종의 마이크로어레이 결과를 비교한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 PFOA의 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 퍼플루오로옥탄산염(Perfluorooctanoic acid; PFOA) 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.

상기 바이오마커는 P-value 0.001 이하, 1.5배 이상 발현이 증가 또는 감소한 유전자로써, 4만 2천여 개의 유전자 중 하기 [표 3]의 다른 과불화화합물(Perfluoro compounds : PFCs) 1종에 의한 유전자발현 프로파일과 비교 분석시 PFOA에 의해서만 특이적으로 발현이 변화하는 23종의 유전자로 구성되어 있다.

상기 PFOA 노출 정도에 따라 특이적으로 발현 변화를 나타내는 바이오마커는 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:

유전자 등록번호(Genebank) BC039082(TMPRSS6, transmembrane protease, serine 6), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001100(ACTA1, actin, alpha 1, skeletal muscle), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003385(VSNL1, visinin-like 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_018154(ASF1B, ASF1 anti-silencing function 1 homolog B (S. cerevisiae)), 유전자 등록번호(Genebank) NM_182826(SCARA3, scavenger receptor class A, member 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003530(HIST1H3D, histone cluster 1, H3d), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001237(CCNA2, cyclin A2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_024053(CENPM, centromere protein M), 유전자 등록번호(Genebank) NM_000930(PLAT, plasminogen activator, tissue), 유전자 등록번호(Genebank) NM_004111(FEN1, flap structure-specific endonuclease 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_014321(ORC6L, origin recognition complex, subunit 6 like (yeast)), 유전자 등록번호(Genebank) NM_012484(HMMR, hyaluronan-mediated motility receptor (RHAMM)), 유전자 등록번호(Genebank) NM_002417(MKI67, antigen identified by monoclonal antibody Ki-67), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003246(THBS1, thrombospondin 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003273(TM7SF2, transmembrane 7 superfamily member 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_015974(CRYL1, crystallin, lambda 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_031475(ESPN, espin), 유전자 등록번호(Genebank) NM_201612(IKIP, IKK interacting protein), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003904(ZNF259, zinc finger protein 259), 유전자 등록번호(Genebank) NM_002705(PPL, periplakin), 유전자 등록번호(Genebank) NM_014256(B3GNT3, UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_172069(PLEKHH2, pleckstrin homology domain containing, family H (with MyTH4 domain) member 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_130901(OTUD7A, OTU domain containing 7A).

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 PFOA 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, PFOA를 인간 간암 세포인 HepG2 세포주에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 PFOA는 인간 간암 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 PFOA의 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 PFOA를 인간 간암 세포주에 처리하고, 상기 물질을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 형광물질(Cy5)로 표지하였으며, 약물을 처리하지 않은 대조군의 경우 Cy3로 표지하였다. 상기 형광표지된 cDNA를 8 X 60k 올리고마이크로어레이 칩 Human whole genome oligo microarray(Agilent, 미국)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2 참조). 분석시 Cy5/Cy3 비율이 1.5배 이상인 경우 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.66배 이하인 경우 발현 감소된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 발현 증가된 유전자는 3.79%(42,405개의 유전자 중 1606개) 발현이 감소된 유전자는 1.83%(42,405개의 유전자 중 774개)임을 확인하였다. 이때, 다른 1종의 과불화화합물에 의한 유전자발현 프로파일과 비교 분석시 PFOA에서만 특이적으로 발현이 증가한 유전자 23종을 선별하였다(도 3 내지 도 4 및 표 4 참조). 상기 유전자는 기존의 다른 연구들에서 다른 화학물질들에 의한 간 독성과 관련 질병을 유발시키는데 관여한다는 보고는 있으나 본 발명에서 사용한 PFOA를 처리했을 때, 인간 간암 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자의 핵산 서열 또는 그 상보 가닥 분자가 집적된 PFOA 특이적 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

본 발명의 PFOA 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 PFOA 특이적 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다:

1) PFOA 노출이 의심되는 실험군 및 대조군의 체세포에서 RNA를 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;

3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 본 발명의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;

4) 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및

5) 분석한 데이터에서 본 발명의 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.

상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간 간암 세포인 HepG2 세포주를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 간세포 또는 인간 간암세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 4)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, 미국)등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 과발현 혹은 저발현 유전자(표 4)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 4)의 분석 방법은 Agilent Feature Extraction 10.7.3.1(Agilent technologies, CA, 미국), Agilent GeneSpring GX 7.3(Agilent technologies, CA, 미국)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.

따라서, 본 발명의 바이오마커는 PFOA에 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소되므로, 환경시료에서 PFOA의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에서 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 PFOA 특이적 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

상기 키트는 추가적으로 인간 체세포를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 인간 체세포는 HepG2인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 간세포 또는 인간 간암세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.

상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

본 발명의 바이오마커는 PFOA에 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소되므로, 환경시료에서 PFOA의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, PFOA에 의해 특이적으로 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리

<1-1> 세포배양

인간 간암 세포주인 HepG2 세포(한국 세포주 은행)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Gibro-BRL, 미국)를 이용하여 100 ㎜ 디쉬(dish)에서 80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 잔류성 유기오염물의 하나로서 생태계 잔류성을 가지고 있는 물질인 퍼플루오로옥탄산염(Perfluorooctanoic acid; PFOA)를 선정하였으며, DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.

<1-2> 세포 독성 실험(MTT assay) 및 화학 물질 처리

Mossman 등(J. Immunol . Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 HepG2 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트에 4 × 10⁵/웰 세포수로 DMEM 배지(Gibro-BRL, 미국)에서 DMSO에 용해된 PFOA를 처리하고 48시간 후에 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해한 후, 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 HepG2 세포주에서 PFOA의 세포독성을 살펴본 결과, 20% 생존율을 보이는 농도(IC₂₀)는 305.86 μM 이었으며, 상기 결과를 바탕으로 하기 마이크로어레이 실험을 수행하였다(도 1).

<실시예 2> 마이크로어레이 실험

<2-1> 표적 RNA 의 분리 및 형광 물질 표지

6 × 10⁶ cell/㎖ 농도로 100 mm 디쉬에 HepG2 세포를 분주한 후, 상기 실시예 <1-2>에서 결정된 PFOA의 농도를 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, 미국)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, 미국)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 농도는 ND-1000 Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific Inc., 미국)와 아가로스 젤 전기영동으로 확인하였다.

<2-2> 표지된 cDNA 제조

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 PFOA 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 하기 [표 1]과 같이 시약을 혼합하였다.

대조군인 HepG2 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)로 표지화하였고, PFOA를 처리한 HepG2 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)로 표지화하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, 미국)을 사용하여 혼합, 정제되었다.

구성	부피(㎕)
5X first strand buffer	6
dNTPs	0.6
0.1 M DDT	3
SuperScript II enzyme	3
Cy-3 or Cy-5 dUTP	2

<2-3> 혼성화 반응

혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다.

구체적으로, 하기 [표 2]와 같은 Transcription Master Mix를 만들어 넣고 잘 섞은 뒤 40℃에서 2시간 동안 반응을 시킨 후, 라벨링(Labeling)된 cRNA를 정제(purification)해주는 과정을 진행한 다음, 정제과정을 거친 cRNA 600 ng을 60℃에서 30분간 반응하여, Fragmentation 과정을 수행하였다. 위와 같이 준비된 cRNA에 2 x GEx Hybridization Buffer HI-RPM을 넣고 잘 섞은 뒤 칩(chip)에 잘 넣고 65℃에서 17시간 동안 오븐에서 혼성화(hybridization)를 하였다. 17시간 뒤 세척과정(GE Wash Buffer 1에서 1분, GE Wash Buffer 2에서 1분)을 거친 후 칩을 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조한다.

Component	Volume(㎕) per reaction
nuclease-free water	0.75
5X Transcription Buffer	3.2
0.1 M DTT	0.6
TP mix	1
T7 RNA Polymerase Blend	0.21
Cyanine 3-CTP	0.24

<2-4> 형광 이미지 획득

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Agilent C scanner(Agilent technologies, CA, 미국)로 스캔하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 Agilent Feature Extraction 10.7.3.1(Agilent technologies, CA, 미국)로 분석하였다. 추출된 데이터는 Agilent GeneSpring GX 7.3(Agilent technologies, CA, 미국)를 이용하여 normalization을 거쳐 각 유전자의 발현양상을 분석하였다. 이렇게 하여 얻어진 데이터로부터 PFOA에 대한 마커 유전자를 선별하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 2천여 개의 유전자 중에서 PFOA에 의해 Cy5/Cy3의 비율이 1.5배 이상으로 유전자 발현 증가된 유전자는 3.79%(42,405개의 유전자 중 1,606개) 발현이 감소된 유전자는 1.83%(42,405개의 유전자 중 774개)임을 확인하였다(도 2).

또한, PFOA에서만 특이적으로 발현이 증가 혹은 감소한 유전자를 선별하기 위하여, 하기 [표 3]에 기재된 다른 1종의 과불화화합물인 탄화플루오르옥탄술폰산(Perfluorooctane Sulfonates)과 유전자발현 프로파일을 비교 분석한 결과, 하기 [표 4]에 나타낸 바와 같이 PFOA에서만 특이적으로 발현이 증가 혹은 감소한 유전자 23종을 선별하였다(도 3 내지 도 4 및 표 4). 아울러, 상기 유전자는 본 발명에서 사용한 PFOA를 처리했을 때, 인간 간암 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.

	물질명
과불화화합물 (Perfluoro compounds : PFCs)	PFOS(Perfluorooctane Sulfonates)

등록번호	유전자 약어	유전자 명	중간값의 비
BC039082	TMPRSS6	transmembrane protease, serine 6	4.31
NM_001100	ACTA1	actin, alpha 1, skeletal muscle	3.91
NM_003385	VSNL1	visinin-like 1	3.82
NM_018154	ASF1B	ASF1 anti-silencing function 1 homolog B (S. cerevisiae)	3.62
NM_182826	SCARA3	scavenger receptor class A, member 3	3.28
NM_003530	HIST1H3D	histone cluster 1, H3d	3.04
NM_001237	CCNA2	cyclin A2	2.91
NM_024053	CENPM	centromere protein M	2.75
NM_000930	PLAT	plasminogen activator, tissue	2.42
NM_004111	FEN1	flap structure-specific endonuclease 1	2.32
NM_014321	ORC6L	origin recognition complex, subunit 6 like (yeast)	2.32
NM_012484	HMMR	hyaluronan-mediated motility receptor (RHAMM)	2.27
NM_002417	MKI67	antigen identified by monoclonal antibody Ki-67	2.17
NM_003246	THBS1	thrombospondin 1	2.00
NM_003273	TM7SF2	transmembrane 7 superfamily member 2	1.88
NM_015974	CRYL1	crystallin, lambda 1	1.79
NM_031475	ESPN	espin	1.70
NM_201612	IKIP	IKK interacting protein	1.53
NM_003904	ZNF259	zinc finger protein 259	0.62
NM_002705	PPL	periplakin	0.55
NM_014256	B3GNT3	UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 3	0.50
NM_172069	PLEKHH2	pleckstrin homology domain containing, family H (with MyTH4 domain) member 2	0.49
NM_130901	OTUD7A	OTU domain containing 7A	0.49

Claims

하기 모든 유전자의 핵산 서열 전부 또는 그 상보 가닥 분자가 집적된 퍼플루오로옥탄산염(Perfluorooctanoic acid; PFOA) 특이적 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이칩:
유전자 등록번호(Genebank) BC039082(TMPRSS6, transmembrane protease, serine 6), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001100(ACTA1, actin, alpha 1, skeletal muscle), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003385(VSNL1, visinin-like 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_018154(ASF1B, ASF1 anti-silencing function 1 homolog B (S. cerevisiae)), 유전자 등록번호(Genebank) NM_182826(SCARA3, scavenger receptor class A, member 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003530(HIST1H3D, histone cluster 1, H3d), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001237(CCNA2, cyclin A2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_024053(CENPM, centromere protein M), 유전자 등록번호(Genebank) NM_000930(PLAT, plasminogen activator, tissue), 유전자 등록번호(Genebank) NM_004111(FEN1, flap structure-specific endonuclease 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_014321(ORC6L, origin recognition complex, subunit 6 like (yeast)), 유전자 등록번호(Genebank) NM_012484(HMMR, hyaluronan-mediated motility receptor (RHAMM)), 유전자 등록번호(Genebank) NM_002417(MKI67, antigen identified by monoclonal antibody Ki-67), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003246(THBS1, thrombospondin 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003273(TM7SF2, transmembrane 7 superfamily member 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_015974(CRYL1, crystallin, lambda 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_031475(ESPN, espin), 유전자 등록번호(Genebank) NM_201612(IKIP, IKK interacting protein), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003904(ZNF259, zinc finger protein 259), 유전자 등록번호(Genebank) NM_002705(PPL, periplakin), 유전자 등록번호(Genebank) NM_014256(B3GNT3, UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_172069(PLEKHH2, pleckstrin homology domain containing, family H (with MyTH4 domain) member 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_130901(OTUD7A, OTU domain containing 7A).
1) 퍼플루오로옥탄산염 노출이 의심되는 실험군 및 대조군의 체세포에서 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
4) 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
5) 분석한 데이터에서 제 1항의 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 퍼플루오로옥탄산염에 대한 노출 여부를 확인하는 방법.
제 2항에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간 간세포 또는 인간 간암세포인 것을 특징으로 하는 퍼플루오로옥탄산염에 대한 노출 여부를 확인하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 인간 간암 세포는 HepG2인 것을 특징으로 하는 퍼플루오로옥탄산염에 대한 노출 여부를 확인하는 방법.
제 2항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 퍼플루오로옥탄산염에 대한 노출 여부를 확인하는 방법.
제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 퍼플루오로옥탄산염에 대한 노출 여부 확인용 키트.
제 6항에 있어서, 인간 체세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 7항에 있어서, 상기 체세포는 인간 간세포 또는 인간 간암세포인 것을 특징으로 하는 키트.