KR101784293B1 - 휘발성 유기 화합물의 인체 노출 여부 확인용 특이적 바이오마커 및 이를 이용한 휘발성 유기 화합물의 노출 여부 확인 방법 - Google Patents
휘발성 유기 화합물의 인체 노출 여부 확인용 특이적 바이오마커 및 이를 이용한 휘발성 유기 화합물의 노출 여부 확인 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 휘발성 유기 화합물(Volatile organic compounds, VOCs)의 인체 노출 여부 확인용 특이적 바이오마커 및 이를 이용한 휘발성 유기 화합물의 노출 여부 확인 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 휘발성 유기 화합물의 대표적인 화학물질인 톨루엔(Toluene) 또는 자일렌(Xylene)에 대해 단독 또는 복합적으로 노출된 여부에 따라 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 톨루엔 또는 자일렌에 대한 단독 노출 또는 복합 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 휘발성 유기 화합물의 인체 노출 여부 확인용 특이적 바이오마커 및 이를 이용한 휘발성 유기 화합물의 노출 여부 확인 방법은, DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 휘발성 유기 화합물 중에 특이적으로 톨루엔 또는 자일렌의 단독 노출 또는 복합 노출 여부를 조기에 모니터링할 수 있고, 인체 위해성을 판정하는데 유용하게 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 톨루엔 및/또는 자일렌에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로도 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명의 휘발성 유기 화합물의 인체 노출 여부 확인용 특이적 바이오마커 및 이를 이용한 휘발성 유기 화합물의 노출 여부 확인 방법은, DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 휘발성 유기 화합물 중에 특이적으로 톨루엔 또는 자일렌의 단독 노출 또는 복합 노출 여부를 조기에 모니터링할 수 있고, 인체 위해성을 판정하는데 유용하게 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 톨루엔 및/또는 자일렌에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로도 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 휘발성 유기 화합물(Volatile organic compounds, VOCs)의 인체 노출 여부 확인용 특이적 바이오마커 및 이를 이용한 휘발성 유기 화합물의 노출 여부 확인 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 휘발성 유기 화합물의 대표적인 화학물질인 톨루엔(Toluene) 또는 자일렌(Xylene)에 대해 단독 또는 복합적으로 노출된 여부에 따라 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 톨루엔 또는 자일렌에 대한 단독 노출 또는 복합 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
휘발성 유기 화합물(Volatile Organic Compounds: VOCs)은 대기 중에서 태양 빛을 받아 광화학 반응을 일으켜 지표오존(ground level ozone)을 만들고 스모그를 형성하는 물질로 정의되며 대기 오염의 주요인 중의 하나이다.
휘발성 유기 화합물은 화학, 제약, 전자 공업뿐만 아니라 용매 및 세정제를 사용하는 일반 산업체에서도 광범위하게 배출되고 있다. 특히, 휘발성 유기 화합물의 대부분이 휘발성이 강해 증기 형태로 배출되어 대기 오염의 원인이 됨은 물론, 호흡기를 통해 쉽게 인체로 유입되어 유해를 야기한다. 이들 중 상당수(톨루엔, 자일렌, 벤젠, 염화 비닐 등)는 발암물질로 증명되어 매우 중요시되는 물질 군으로 알려져 있다. 이들 오염도 및 위해도는 실내에서 높은 것으로 보고되고 있으며, 노출 정도는 개인의 특성에 따라 변이가 크기 때문에 개인 노출 평가가 필수적이라고 할 수 있다(Fawell and Hun, John Wiley & Sons, 1998; Wallace, Environmental Research, 35, 293-319, 1984). 이와 같은 오염원에 의해 발생된 대기중의 휘발성 유기 화합물은 만성 노출시에는 인체내 기관에 축적되어 폐부종, 신장독성, 혈액암 등의 유해한 영향을 끼치게 된다(Otto et al., Arch. Environ. Health, 47, 23-30, 1992; Hudnell et al., Arch. Environ. Health, 47, 31-38, 1992; Koren et al., Arch. Environ. Health, 47, 39-44, 1992).
최근, 환경문제로 대두되고 있는 새집 증후군은 휘발성 유기 화합물의 배출로 인해 사람이 두통이나 알레르기 증세를 일으킬 수 있는 일종의 생활 공해이다. 우리나라에서는 아직까지 새집 증후군의 사례가 많지 않지만, 휘발성 유기 화합물 배출은 집에서 흔하게 볼 수 있는 벽지, 장판 등 친숙한 자재들로부터 나온다. 휘발성 유기용제(에스테르, 알데히드, 케톤 등)는 페인트, 접착제, 스프레이, 연소과정, 세탁소, 의복, 방향제, 건축자재, 왁스 등에서 발생하고 피로감, 정신착란, 두통, 구토증, 현기증, 중추신경 억제작용 등으로, 우리가 생각했던 것보다 많은 화학물질이 배출되며 사람이 나타낼 수 있는 증상도 다양하다.
이러한 휘발성 유기 화합물 중 톨루엔(toluene)은 무색의 액체로서 석탄을 건류하여 얻은 경유를 황산으로 씻은 다음 정류하여 만들거나 메틸사이클로헥세인을 수소이탈하여 제조하며 유기합성화학에서 중요한 화합물이다. 톨루엔은 유기용매로서 널리 이용되어 도료나 접착제 등에 사용되어 왔으며 체내에 과량 흡입될 경우 복통, 구토와 같은 위장관계의 기능장애를 초래할 뿐만 아니라 두통, 현훈 및 환각증세와 같은 신경장애를 일으킨다고 알려져 있다.
또한, 자일렌(Xylene)은 주로 인쇄, 고무, 가죽 산업에서 용매로 사용되는 화합물로, 높은 농도의 자일렌에 노출될 경우 눈과 목 등에 자극을 유발할 수 있으며, 중추신경계에 영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다. 그 밖에 구역, 구토, 두통, 졸린 증상, 현기증, 가슴 통증, 호흡 곤란 등의 다양한 증상이 나타날 수 있다.
이처럼 휘발성 유기 화합물의 중요성에도 불구하고, 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출 여부에 대한 확인 방법 역시 고전적인 방법에 국한되어 있어 보다 빠르고 정확한 위해성 평가 방법을 통해 인체에서의 오염 정도를 파악하고 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.
따라서, 이들 휘발성 유기 화합물 중에서 배출 농도와 오염도 특히 위해도 측면에서 주로 문제시되는 톨루엔 및 자일렌에 대한 위해도 평가를 위해 바이오마커를 발굴하는 것이 필요하다.
포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:10614-10619, 1996).
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20-25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer, K and Belbin, T.J., J. Am. Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진식각(photolithography) 공정을 이용하여 칩 위에서 직접 합성 방법에 의해 만들고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. and Belbin, T.J., J. Am. Acad . Dermatol . 51:681-692, 2004).
유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며, cDNA로 전환시킨다. cDNA 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cye3과 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K., et al., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).
최근 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 진단이 가능하게 될 것이다.
이에 본 발명자들은 DNA 마이크로어레이를 이용하여 휘발성 유기 화합물을 대표하는 톨루엔 또는 자일렌의 단독 노출 또는 복합 노출에 따른 유전자 발현 프로파일을 실제 톨루엔 및/또는 자일렌에 노출된 작업장의 근로자로부터 혈액 시료를 얻어 관찰 및 분석한 결과, 톨루엔 또는 자일렌에 대해 단독 또는 복합적으로 인체 노출에 의해 특이적으로 변화되는 유전자를 발굴하고, 상기 톨루엔 및/또는 자일렌에 특이적인 바이오마커 유전자를 이용하여 톨루엔 또는 자일렌의 단독 또는 복합 노출 여부를 확인하는 방법을 확립함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
Fawell and Hun, John Wiley & Sons, 1998
Wallace, Environmental Research, 35, 293-319, 1984
Otto et al., Arch. Environ. Health, 47, 23-30, 1992
Hudnell et al., Arch. Environ. Health, 47, 31-38, 1992
Koren et al., Arch. Environ. Health, 47, 39-44, 1992
Schena, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996
Sellheyer, K and Belbin, T.J., J. Am. Acad. Dermatol. 51:681-692, 2004
Somasundaram, K., et al., Genomics Proteomics I:1-10, 2002
본 발명의 목적은 휘발성 유기 화합물(Volatile organic compounds, VOCs)의 대표적인 화학물질인 톨루엔(Toluene) 또는 자일렌(Xylene)에 대해 단독 또는 복합적으로 노출된 여부에 따라 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 톨루엔 또는 자일렌에 대한 단독 노출 또는 복합 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 톨루엔(toluene) 또는 자일렌(xylene)의 단독 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 톨루엔(toluene) 및 자일렌(xylene)의 복합 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 바이오마커를 제공한다.
상기 바이오마커는 p-value < 0.05인 유전자들 중 1.5 fold change 이상으로 유의성 있게 발현 변화를 보인 것을 특징으로 하는 바이오마커이다.
본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 제공한다: 유전자 등록번호(Genbank) NM_000665(ACHE, acetylcholinesterase(Yt blood group), 유전자 등록번호(Genbank) NM_001033886(CXCL12, chemokine (C-X-C motif) ligand 12), 유전자 등록번호(Genbank) NM_177977(HAP1, huntingtin-associated protein 1), 유전자 등록번호(Genbank) NM_006889(CD86, CD86 molecule), 유전자 등록번호(Genbank) NM_005310(GRB7, growth factor receptor bound protein 7), 유전자 등록번호(Genbank) NM_000419(ITGA2B, integrin subunit alpha 2b), 유전자 등록번호(Genbank) NM_033023(PDGFA, platelet-derived growth factor alpha polypeptide), 유전자 등록번호(Genbank) NM_033244(PML, promyelocytic leukemia), 유전자 등록번호(Genbank) NM_003152(STAT5A, signal transducer and activator of transcription 5A), 유전자 등록번호(Genbank) BC020881(TLN1, talin 1), 유전자 등록번호(Genbank) NM_001206541(CAPZB, capping protein (actin filament) muscle Z-line, beta), 유전자 등록번호(Genbank) NM_000603(NOS3, nitric oxide synthase 3), 유전자 등록번호(Genbank) NM_006775(QKI, K Homology(KH) domain containing, RNA binding), 및/또는 유전자 등록번호(Genbank) NM_003286(TOP1, topoisomerase (DNA) I).
1) 상기 바이오마커 중에서, 톨루엔의 단독 노출에 따라 특이적으로 발현이 증가하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다: 유전자 등록번호(Genbank) NM_000665(ACHE, acetylcholinesterase(Yt blood group), 유전자 등록번호(Genbank) NM_001033886(CXCL12, chemokine (C-X-C motif) ligand 12), 및/또는 유전자 등록번호(Genbank) NM_177977(HAP1, huntingtin-associated protein 1).
2) 상기 바이오마커 중에서, 자일렌의 단독 노출에 따라 특이적으로 발현이 감소하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다: 유전자 등록번호(Genbank) NM_006889(CD86, CD86 molecule), 유전자 등록번호(Genbank) NM_005310(GRB7, growth factor receptor bound protein 7), 유전자 등록번호(Genbank) NM_000419(ITGA2B, integrin subunit alpha 2b), 유전자 등록번호(Genbank) NM_033023(PDGFA, platelet-derived growth factor alpha polypeptide), 유전자 등록번호(Genbank) NM_033244(PML, promyelocytic leukemia), 및/또는 유전자 등록번호(Genbank) NM_003152(STAT5A, signal transducer and activator of transcription 5A).
3) 상기 바이오마커 중에서, 톨루엔 및 자일렌의 복합 노출에 따라 특이적으로 발현이 증가하는 유전자는 하기와 같다: 유전자 등록번호(Genbank) NM_000603(NOS3, nitric oxide synthase 3).
4) 상기 바이오마커 중에서, 톨루엔 및 자일렌의 복합 노출에 따라 특이적으로 발현이 감소하는 유전자는 하기와 같다: 유전자 등록번호(Genbank) BC020881(TLN1, talin 1), 유전자 등록번호(Genbank) NM_001206541(CAPZB, capping protein (actin filament) muscle Z-line, beta), 유전자 등록번호(Genbank) NM_006775(QKI, K Homology(KH) domain containing, RNA binding), 및/또는 유전자 등록번호(Genbank) NM_003286(TOP1, topoisomerase (DNA) I).
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 톨루엔 또는 자일렌의 인체 단독 노출 또는 복합 노출 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 톨루엔 및/또는 자일렌을 취급하는 사업장의 근로자를 대상으로 혈액시료를 채취하였으며, 톨루엔 또는 자일렌에 대해 단일 또는 복합적으로 노출되었을 것으로 예상되는 근로자들의 평균 연령, 평균 노출기간(years) 및 1일 평균 노출시간(hours/day) 등을 확인하였다(표 2).
이후, 톨루엔 및/또는 자일렌 노출을 보이는 노출군 근로자, 즉 실험군의 혈액시료와, 비노출군 근로자, 즉 대조군의 혈액시료로부터 각각 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 형광물질 Cy3로 표지하였다. 상기 각각 형광표지된 aRNA(amplified RNA)를 올리고마이크로어레이 칩(Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression v2 8×60K Microarry)과 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 6).
분석시 대조군/노출군 Cy3 형광값 비율이 1.5 배 이상(p-value < 0.05)으로 유의성 있게 발현 변화, 즉 증가 또는 감소하는 유전자들로 선별하였다. 분석 결과, 톨루엔 단독 노출에 대해 발현 증가를 보인 유전자가 925종, 발현 감소를 보인 유전자가 189종이었으며, 자일렌 단독 노출에 대해 발현 증가를 보인 유전자가 752종, 발현 감소를 보인 유전자가 691종이었다. 또한 톨루엔 및 자일렌의 복합 노출에 대해 발현 증가를 보인 유전자가 481종, 발현 감소를 보인 유전자가 535종이었다. 이때, 톨루엔 또는 자일렌에 대해 단독 노출 또는 복합 노출 시 공통으로 발현된 715종을 제외하고, 톨루엔 단독 노출에 대해서만 특이적으로 발현이 변화한 유전자 897종 중 3종을, 자일렌 단독 노출에 대해서만 특이적으로 발현이 변화한 유전자 851종 중 6종을, 톨루엔 및 자일렌 복합 노출에 대해서만 특이적으로 발현이 변화한 유전자 330종 중 5종을 선정하였다(표 4, 도 5 및 도 6). 상기 선정한 톨루엔 단독 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 보인 유전자는 자궁내막암, 여성생식기 관련 암 및 인지능력(기억장애, 치매) 관련 질환과 연관성을 나타내었으며(표 8), 자일렌 단독 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 보인 유전자는 복부 관련 암 및 소화기관(위장염, 소화기계) 관련 암과 관련된 질환과 연관성을 나타내었다(표 9). 또한, 톨루엔 및 자일렌 복합 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 보인 유전자는 유방암, 난소암, 대장암, 피부질환(피부염, 아토피 피부염)과 관련된 질환과 연관성을 나타내었다(표 10).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전체 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 휘발성 유기 화합물 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
본 발명의 상기 휘발성 유기 화합물 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩은 이에 제한되지는 않으나, 톨루엔 단독 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩, 자일렌 단독 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩, 그리고 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩일 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 이에 제한되지는 않으나, 상기 바이오마커 유전자의 15 내지 75개의 핵산을 포함하는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 25 내지 65개의 핵산을 포함하는 것일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 55 내지 60개의 핵산을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 이에 제한되지는 않으나, 가장 바람직하게는 하기 표 1의 핵산 서열을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 휘발성 유기 화합물 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 휘발성 유기 화합물 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 휘발성 유기 화합물 노출은 이에 제한되지는 않으나, 톨루엔 단독 노출, 자일렌 단독 노출, 그리고 톨루엔 및 자일렌 복합 노출일 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 톨루엔 단독 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다:
1) 톨루엔 노출 가능성이 있는 개체로부터 수득된 실험군 혈액 시료 및 톨루엔이 노출되지 않은 개체로부터 수득된 대조군 혈액으로부터 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 증폭하여 실험군과 대조군을 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 aRNA(amplified RNA)를 제1항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 톨루엔 단독 노출 여부를 확인하기 위한 정보를 제공하는 방법.
상기 노출 여부 확인 방법에 있어서, 단계 1)의 실험군의 혈액시료는 톨루엔 노출 가능성이 있는 산업 현장의 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하며, 단계 1)의 대조군의 혈액시료는 톨루엔에 노출되지 않은 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 노출 여부 확인 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression v2 8×60K Microarry(Agilent, USA) 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 유전자 등록번호(Genbank) NM_000665(ACHE, acetylcholinesterase(Yt blood group), 유전자 등록번호(Genbank) NM_001033886(CXCL12, chemokine (C-X-C motif) ligand 12) 및 유전자 등록번호(Genbank) NM_177977(HAP1, huntingtin-associated protein 1)로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 유전자가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GeneSpring GX 7.3.1(Agilent Technology, USA) software를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 톨루엔 단독 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 유전자 등록번호(Genbank): NM_000665(ACHE, acetylcholinesterase(Yt blood group), 유전자 등록번호(Genbank): NM_001033886(CXCL12, chemokine (C-X-C motif) ligand 12) 및 유전자 등록번호(Genbank): NM_177977(HAP1, huntingtin-associated protein 1)로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트를 포함하는 톨루엔 단독 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 확인용 키트에 추가적으로 음성 대조군 및 양성 대조군의 인간 혈액시료를 포함하는 것을 특징으로 하는 톨루엔 단독 노출 여부 확인용 키트를 제공한다. 상기 인간 혈액시료는 톨루엔에 노출되거나 노출되지 않은 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 Cy3를 사용하였다.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 자일렌 단독 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다:
1) 자일렌 노출 가능성이 있는 개체로부터 수득된 실험군 혈액 시료 및 자일렌이 노출되지 않은 개체로부터 수득된 대조군 혈액으로부터 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 증폭하여 실험군과 대조군을 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 aRNA(amplified RNA)를 제7항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제7항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 자일렌 단독 노출 여부를 확인하기 위한 정보를 제공하는 방법.
상기 노출 여부 확인 방법에 있어서, 단계 1)의 실험군의 혈액시료는 자일렌 노출 가능성이 있는 산업 현장의 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하며, 단계 1)의 대조군의 혈액시료는 자일렌에 노출되지 않은 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 노출 여부 확인 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression v2 8×60K Microarry(Agilent, USA) 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 유전자 등록번호(Genbank): NM_006889(CD86, CD86 molecule), 유전자 등록번호(Genbank): NM_005310(GRB7, growth factor receptor bound protein 7), 유전자 등록번호(Genbank): NM_000419(ITGA2B, integrin subunit alpha 2b), 유전자 등록번호(Genbank): NM_033023(PDGFA, platelet-derived growth factor alpha polypeptide), 유전자 등록번호(Genbank): NM_033244(PML, promyelocytic leukemia) 및 유전자 등록번호(Genbank): NM_003152(STAT5A, signal transducer and activator of transcription 5A)로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 유전자가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GeneSpring GX 7.3.1(Agilent Technology, USA) software를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 자일렌 단독 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 유전자 등록번호(Genbank): NM_006889(CD86, CD86 molecule), 유전자 등록번호(Genbank): NM_005310(GRB7, growth factor receptor bound protein 7), 유전자 등록번호(Genbank): NM_000419(ITGA2B, integrin subunit alpha 2b), 유전자 등록번호(Genbank): NM_033023(PDGFA, platelet-derived growth factor alpha polypeptide), 유전자 등록번호(Genbank): NM_033244(PML, promyelocytic leukemia) 및 유전자 등록번호(Genbank): NM_003152(STAT5A, signal transducer and activator of transcription 5A)로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트를 포함하는 자일렌 단독 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 확인용 키트에 추가적으로 음성 대조군 및 양성 대조군의 인간 혈액시료를 포함하는 것을 특징으로 하는 자일렌 단독 노출 여부 확인용 키트를 제공한다. 상기 인간 혈액시료는 자일렌에 노출되거나 노출되지 않은 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 Cy3를 사용하였다.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다:
1) 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 가능성이 있는 개체로부터 수득된 실험군 혈액 시료 및, 톨루엔 및 자일렌이 노출되지 않은 개체로부터 수득된 대조군 혈액으로부터 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 증폭하여 실험군과 대조군을 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 aRNA(amplified RNA)를 제7항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제13항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 여부를 확인하기 위한 정보를 제공하는 방법.
상기 노출 여부 확인 방법에 있어서, 단계 1)의 실험군의 혈액시료는 톨루엔 및 자일렌에 복합적으로 노출될 가능성이 있는 산업 현장의 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하며, 단계 1)의 대조군의 혈액시료는 톨루엔 및 자엘렌에 노출되지 않은 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 노출 여부 확인 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression v2 8×60K Microarry(Agilent, USA) 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 유전자 등록번호(Genbank): BC020881(TLN1, talin 1), 유전자 등록번호(Genbank): NM_001206541(CAPZB, capping protein (actin filament) muscle Z-line, beta), 유전자 등록번호(Genbank): NM_000603(NOS3, nitric oxide synthase 3), 유전자 등록번호(Genbank): NM_006775(QKI, K Homology(KH) domain containing, RNA binding) 및 유전자 등록번호(Genbank): NM_003286(TOP1, topoisomerase (DNA) I)로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 유전자가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GeneSpring GX 7.3.1(Agilent Technology, USA) software를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 유전자 등록번호(Genbank): BC020881(TLN1, talin 1), 유전자 등록번호(Genbank): NM_001206541(CAPZB, capping protein (actin filament) muscle Z-line, beta), 유전자 등록번호(Genbank): NM_000603(NOS3, nitric oxide synthase 3), 유전자 등록번호(Genbank): NM_006775(QKI, K Homology(KH) domain containing, RNA binding) 및 유전자 등록번호(Genbank): NM_003286(TOP1, topoisomerase (DNA) I)로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트를 포함하는 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 확인용 키트에 추가적으로 음성 대조군 및 양성 대조군의 인간 혈액시료를 포함하는 것을 특징으로 하는 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 여부 확인용 키트를 제공한다. 상기 인간 혈액시료는 톨루엔 및 자일렌에 복합적으로 노출되거나 노출되지 않은 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 Cy3를 사용하였다.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
본 발명의 휘발성 유기 화합물의 인체 노출 여부 확인용 특이적 바이오마커 및 이를 이용한 휘발성 유기 화합물의 노출 여부 확인 방법은, DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 휘발성 유기 화합물 중에 특이적으로 톨루엔 또는 자일렌의 단독 노출 또는 복합 노출 여부를 조기에 모니터링할 수 있고, 인체 위해성을 판정하는데 유용하게 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 톨루엔 및/또는 자일렌에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로도 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 연구모집단의 혈액 시료에서 전체 RNA(total RNA)를 추출하는 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 연구모집단의 혈액 시료에서 추출한 total RNA의 품질 검사(quality check; degradation 여부) 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 품질 검사(quality check)가 완료된 total RNA를 이용하여 마이크로어레이(microarray) 분석을 위한 샘플 준비 및 어레이 단계를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 single-color microarray 분석을 위한 cRNA 샘플 준비 단계를 개략적으로 나타낸 도로, total RNA에서 cDNA를 합성하고, 최종적으로 라벨된 cRNA를 증폭하여 올리고 마이크로어레이(oligo microarray)를 수행하는 단계를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 5는 톨루엔 또는 자일렌에 대한 단일 또는 복합적 노출에 의해 공통적으로 발현 변화하는 유전자의 개수를 도식화한 벤다이어그램(Venn-diagram)을 나타낸 도이다.
도 6은 톨루엔 또는 자일렌에 단일 또는 복합 노출된, 본 발명의 연구모집단의 혈액 시료에서의 유전자 발현 양상을 마이크로어레이 실험을 통해 도출한 결과를 분석하여 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 연구모집단의 혈액 시료에서 추출한 total RNA의 품질 검사(quality check; degradation 여부) 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 품질 검사(quality check)가 완료된 total RNA를 이용하여 마이크로어레이(microarray) 분석을 위한 샘플 준비 및 어레이 단계를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 single-color microarray 분석을 위한 cRNA 샘플 준비 단계를 개략적으로 나타낸 도로, total RNA에서 cDNA를 합성하고, 최종적으로 라벨된 cRNA를 증폭하여 올리고 마이크로어레이(oligo microarray)를 수행하는 단계를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 5는 톨루엔 또는 자일렌에 대한 단일 또는 복합적 노출에 의해 공통적으로 발현 변화하는 유전자의 개수를 도식화한 벤다이어그램(Venn-diagram)을 나타낸 도이다.
도 6은 톨루엔 또는 자일렌에 단일 또는 복합 노출된, 본 발명의 연구모집단의 혈액 시료에서의 유전자 발현 양상을 마이크로어레이 실험을 통해 도출한 결과를 분석하여 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 연구모집단 및 혈액시료 수득
휘발성 유기화합물(Volatile organic compounds, VOCs) 중 톨루엔(toluene) 또는 자일렌(xylene)을 단일 또는 복합적으로 취급하고 있으며, 이에 톨루엔 또는 자일렌에 대해 단일 또는 복합적으로 노출되었을 것으로 예상되는 직업의 작업장 상태 및 작업 환경 노출 여부를 고려하여 공장 등 산업현장의 근로자들로부터 수검용 시료로서 혈액을 채취하였다. 그리고 단일 또는 복합적으로 노출되었을 것으로 예상되는 물질별로 수검용 시료(샘플)를 수집, 구분하여 평균 연령, 평균 노출기간(years) 및 1일 평균 노출시간(hours/day) 등을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명에 사용된 구체적 연구모집단은 하기 표 2와 같으며, 비교 실험을 위한 대조군으로서 정상 그룹(Normal group) 11명(남자 10명/여자 1명), 실험군으로서 톨루엔 노출 예상 그룹(Toluene) 11명(남자 11명), 자일렌 노출 예상 그룹(Xylene) 11명(남자 9명/여자 2명), 그리고 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 예상 그룹(Toluene + Xylene) 11명(남자 11명)의 검체를 수집 확보하였다.
환경유해물질 노출 작업장의 근로자를 대상으로 확보한 시료로서, 톨루엔 또는 자일렌에 단일 또는 복합적으로 노출되었을 것으로 예상되는 실험군 시료(검체)는 총 33개였으며, 실험군 총 33 개체의 평균 연령은 37.1세, 평균 노출기간(years)은 6.7년, 1일 평균 노출시간(hours/day)은 8.7시간으로 확인되었다.
실시예
2: 연구모집단 수검용 시료의 전체 RNA(total RNA) 추출 및 전체 RNA(total RNA) 품질 검사(quality check)
상기 실시예 1에서 확보한 연구모집단 수검용 시료의 전체 RNA(total RNA) 추출은 제조사의 메뉴얼에 따라 RNA 추출 키트(PAXgene miRNA Kit, PreAnalytiX)를 사용하여 수행하였다(도 1).
또한, 상기 연구모집단의 수검용 시료로부터 추출한 전체 RNA(total RNA)는 마이크로에러이(microarray) 분석에 대한 적합성 여부를 판정하기 위해 나노드롭(NanoDrop)을 이용해 total RNA의 순도와 농도를 확인하였다. 총 44명의 연구모집단 수검용 시료로부터 추출한 Total RNA 순도는 260/280 nm 비율(ratio)이 2.14 ± 0.05임을 확인하였다(표 3).
Total RNA의 품질 검사(quality check; degradation 여부)는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technology, USA)를 이용하여 측정하였다. 그 결과, rRNA(ribosomal RNA) ratio(28s/18s)가 1.9 이상, RIN(RNA integrity number)가 8.0 이상임을 확인하였다(도 2).
| 시료명 | 260nm/280nm | 농도(ng/ul) | 농도(ug/ul) | total vol.(ul) | total 양(ug) | |
| C1 | 2.08 | 310.51 | 0.31 | 18 | 5.59 | |
| C2 | 2.10 | 99.82 | 0.10 | 18 | 1.80 | |
| C3 | 2.13 | 209.09 | 0.21 | 18 | 3.76 | |
| C4 | 2.14 | 208.52 | 0.21 | 18 | 3.75 | |
| C5 | 2.29 | 54.92 | 0.05 | 18 | 0.99 | |
| C6 | 2.19 | 93.59 | 0.09 | 18 | 1.68 | |
| C7 | 2.13 | 201.53 | 0.20 | 18 | 3.63 | |
| C8 | 2.14 | 192.14 | 0.19 | 18 | 3.46 | |
| C9 | 2.10 | 178.24 | 0.18 | 18 | 3.21 | |
| C10 | 2.20 | 144.48 | 0.14 | 18 | 2.60 | |
| C11 | 2.12 | 215.56 | 0.22 | 18 | 3.88 | |
| T1 | 2.07 | 144.89 | 0.14 | 18 | 2.61 | |
| T2 | 2.08 | 293.78 | 0.29 | 18 | 5.29 | |
| T3 | 2.02 | 100.32 | 0.10 | 18 | 1.81 | |
| T4 | 2.14 | 153.63 | 0.15 | 18 | 2.77 | |
| T5 | 2.09 | 207.85 | 0.21 | 18 | 3.74 | |
| T6 | 2.17 | 112.41 | 0.11 | 18 | 2.02 | |
| T7 | 2.17 | 106.69 | 0.11 | 18 | 1.92 | |
| T8 | 2.13 | 158.12 | 0.16 | 18 | 2.85 | |
| T9 | 2.12 | 183.46 | 0.18 | 18 | 3.30 | |
| T10 | 2.09 | 225.99 | 0.23 | 18 | 4.07 | |
| T11 | 2.12 | 226.95 | 0.23 | 18 | 4.09 | |
| X1 | 2.13 | 202.59 | 0.20 | 18 | 3.65 | |
| X2 | 2.19 | 115.23 | 0.12 | 18 | 2.07 | |
| X3 | 2.15 | 184.78 | 0.18 | 18 | 3.33 | |
| X4 | 2.11 | 209.96 | 0.21 | 18 | 3.78 | |
| X5 | 2.19 | 93.21 | 0.09 | 18 | 1.68 | |
| X6 | 2.25 | 74.30 | 0.07 | 18 | 1.34 | |
| X7 | 2.20 | 78.45 | 0.08 | 18 | 1.41 | |
| X8 | 2.14 | 171.98 | 0.17 | 18 | 3.10 | |
| X9 | 2.14 | 170.00 | 0.17 | 18 | 3.06 | |
| X10 | 2.15 | 143.91 | 0.14 | 18 | 2.59 | |
| X11 | 2.11 | 210.68 | 0.21 | 18 | 3.79 | |
| T+X1 | 2.11 | 231.21 | 0.23 | 18 | 4.16 | |
| T+X2 | 2.17 | 169.53 | 0.17 | 18 | 3.05 | |
| T+X3 | 2.10 | 228.71 | 0.23 | 18 | 4.12 | |
| T+X4 | 2.04 | 162.61 | 0.163 | 18 | 4.88 | |
| T+X5 | 2.13 | 247.02 | 0.25 | 18 | 4.45 | |
| T+X6 | 2.18 | 90.72 | 0.09 | 18 | 1.63 | |
| T+X7 | 2.20 | 53.61 | 0.05 | 18 | 0.96 | |
| T+X8 | 2.09 | 305.13 | 0.31 | 18 | 5.49 | |
| T+X9 | 2.12 | 180.71 | 0.18 | 18 | 3.25 | |
| T+X10 | 2.16 | 102.32 | 0.10 | 18 | 1.84 | |
| T+X11 | 2.06 | 226.19 | 0.23 | 18 | 6.79 | |
실시예
3:
마이크로어레이
(
microarray
) 실험
환경유해물질인 휘발성 유기화합물(Volatile organic compounds, VOCs) 중, 톨루엔 또는 자일렌에 대해 단일 또는 복합적으로 노출된 여부를 파악하기 위한 마이크로어레이(microarray) 실험을 수행하였다.
마이크로어레이 실험은 상기 실시예 2의 품질 검사(quality check)가 완료된 total RNA에 대하여 Agilent's Low Input Quick Amp Labeling Kit, Single-Color(Agilent Technology, USA)를 사용하여 타겟 cRNA(target complementary RNA) 프로브(probe)를 합성하고 혼성화 반응(hybridization)을 수행하였다. 이때, 마이크로어레이 실험이 제대로 진행되었는지 아닌지를 확인하기 위해 control RNA로서 One-color spike mix를 준비하여 사용하였다.
구체적으로, 200 ng의 total RNA에 T7 프로모터 프라이머(T7 promoter primer)를 혼합하여 65℃에서 10분간 반응시키고, 4℃(ice 상)에서 5분간 정치하였다. 이후, 준비한 cDNA master mix(5×first strand buffer, 0.1M DTT, 10mM dNTP mix, 및 Affinity Script RNase Block Mix)를 반응액에 첨가하여 40℃에서 2시간 반응시키고 70℃에서 15분간 정치하여 dsDNA 합성 반응을 정지시켰다. 여기에 Transcription master mix(5×transcription buffer, 0.1M DTT, NTP mix, T7 RNA polymerase blend, 및 Cyanine 3-CTP)를 첨가하여 40℃에서 2시간 반응하여 dsDNA의 전사반응을 유도하고, cyanine 3(Cy3)는 톨루엔 및/또는 자일렌에 노출되지 않은 정상 그룹군(Normal group)과 톨루엔 노출 예상 그룹군(Toluene), 자일렌 노출 예상 그룹군(Xylene), 그리고 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 예상 그룹군(Toluene + Xylene)에 각각 표지하면서 cRNA를 증폭하였다. 증폭시킨 표지 cRNA를 cRNA Cleanup Module(Agilent Technology)를 사용하여 정제한 후 분광형광광도계(ND-1000 spectrophotometer, NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE)에서 표지 cRNA target 함량을 정량하였다. 600 ng의 표지 cRNA target에 10×Gene expression blocking agent와 25×Fragmentation buffer를 첨가하여 60℃에서 30분간 반응하여 cRNA target의 단편화(fragmentation)를 유도하였다. 단편화된 cRNA(fragmented cRNA)에 2×Hi-RPM hybridization buffer를 첨가한 후 Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression v2 8×60K Microarray에 점적하고, 이후 65℃에서 17시간동안 10 rpm의 속도로 쉐이킹(shaking)하면서 Agilent Hybridization oven(Agilent Technology, USA)에서 혼성화 반응(hybridization)을 유도하였다. 반응이 완료된 후 워시 버퍼(wash buffer, Agilent Technology, USA)를 사용하여 혼성화된 마이크로어레이(hybridized microarry)를 세정하였다. 이후, Agilent's DNA microarray scanner 및 Feature Extraction Software(Agilent Technology, Palo Alto, CA)를 이용하여 마이크로어레이 혼성화반응(microarray hibridization) 이미지를 받은 후 이미지를 분석하였다(도 3 및 도 4).
이때, 모든 spot의 형광도는 GeneSpringGX 7.3(Agilent Technology, USA)에서 표준화(normalization)를 실시하여 이 값을 사용하여 유의한 수준의 변화를 보이는 유전자를 선발하였다. 표준화 비율(normalized ratio)의 평균값은 톨루엔 및/또는 자일렌 노출 예상 그룹군의 표준화 신호 강도(normalized signal intensity) 평균값을 톨루엔 및/또는 자일렌에 노출되지 않은 정상 그룹군의 표준화 신호 강도(normalized signal intensity)의 평균값으로 나누어 산출하였다.
상기와 같이 얻어진 데이터로부터 톨루엔 및/또는 자일렌의 단일 또는 복합 노출에 대한 발현 프로파일 변화가 일치하는, 즉 동일하게 유의한 증가를 보이거나 동일하게 유의한 감소를 보이는 유전자를 선별해 본 결과, 톨루엔 단독 노출에 대해 발현 증가를 보인 유전자가 925종, 발현 감소를 보인 유전자가 189종이었으며, 자일렌 단독 노출에 대해 발현 증가를 보인 유전자가 752종, 발현 감소를 보인 유전자가 691종인 것으로 나타났다. 또한 톨루엔 및 자일렌의 복합 노출에 대해 발현 증가를 보인 유전자가 481종, 발현 감소를 보인 유전자가 535종인 것으로 나타났다(표 4).
구체적으로 전체 50,599종의 유전자 탐식자(probe) 중에서, 총 44개의 연구모집단 샘플 중 총 22개 이상의 샘플을 탐지(detection)한 유전자 탐식자(probe) 23,070종을 이용하여, 톨루엔 및/또는 자일렌의 단일 또는 복합 노출에 대해 1.5 배 이상(p-value < 0.05 기준)의 발현 변화를 보이는 유전자 탐식자(probe)를 선별해 본 결과, 23,070종의 유전자 탐식자(probe) 중에서 2,793 종의 발현 변이가 나타나는 것으로 분석되었다(도 5).
또한, 톨루엔 단독 노출에 대해서만 특이적으로 발현이 변화한 유전자가 897종, 자일렌 단독 노출에 대해서만 특이적으로 발현이 변화한 유전자가 851종, 톨루엔 및 자일렌 복합 노출에 대해서만 특이적으로 발현이 변화한 유전자가 330종인 것으로 분석되었다(도 5). 한편, 상기 결과는 대조군(control)으로서 톨루엔 및/또는 자일렌에 노출되지 않은 정상 그룹군(Normal group)을 기준으로 유전자 발현 변이 패턴(pattern)을 분석한 결과로서 톨루엔 노출 예상 그룹군(Toluene), 자일렌 노출 예상 그룹군(Xylene), 그리고 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 예상 그룹군(Toluene + Xylene)의 실험군 샘플의 클러스터링(clustering)이 유의하게 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
4:
벤다이어그램
(Venn-diagram) 분석
상기 실시예 3에서와 같이 마이크로어레이(microarray) 실험을 완료한 후 실시한 초기 결과 분석으로서 벤다이어그램 분석을 수행하였으며, 이를 통하여 마이크로어레이 실험의 유용성을 검증할 수 있었다.
벤다이어그램 분석 결과, 톨루엔 노출 예상 그룹군(Toluene), 자일렌 노출 예상 그룹군(Xylene), 그리고 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 예상 그룹군(Toluene + Xylene)의 각각의 실험군에서 특이적으로 발현 변화를 보이는 유전자를 확인할 수 있었다. 구체적으로, 톨루엔 단독 노출에 대해서만 특이적으로 발현이 변화한 유전자가 897종, 자일렌 단독 노출에 대해서만 특이적으로 발현이 변화한 유전자가 851종, 톨루엔 및 자일렌 복합 노출에 대해서만 특이적으로 발현이 변화한 유전자가 330종임을 확인할 수 있었다(도 5).
실시예
5: 유전자 온톨로지(Gene Ontology, GO) 분석
상기 실시예 4의 초기 분석 결과를 토대로 마이크로어레이(microarray) 결과를 응용하기 위하여, DAVID Bioinformatics tool을 이용하여 GO 분석을 수행하였다.
구체적으로, GeneSpringGX 7.3에서 제공하는 Gene OntologyTM Consortium(http://www.geneontology.org/index.shtml)을 사용하여 유의한 변화를 보이는 유전자의 기능 해석(functional annotation)을 실시하였으며, 유전체 연구를 위한 통합분석 솔루션(integrated solutions for the annotation and analysis of genome-scale datasets)인 DAVID(http://david.abcc.ncifcrf/gov/)는 Nastional Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID)에서 제공하는 genome browser 연계 web-accessible program으로서 이를 이용하여 톨루엔 단독 노출, 자일렌 단독 노출, 톨루엔 및 자일렌 복합 노출에 의해 유의한 변화를 보이는 유전자를 근거로 GO 분석을 실시하였다. Gene ontology에 대한 유전자 분류는 biological process, molecular function, cellular component로 크게 분류되며, 선별된 유전자들이 각각 어떠한 기능을 가지며, 그에 따라 어떻게 분류되는지 분석할 수 있다.
톨루엔 단독 노출(표 5), 자일렌 단독 노출(표 6), 톨루엔 및 자일렌 복합 노출(표 7)에 의해 유의한 변화를 보이는 특이적 유전자를 근거로 GO 분석을 실시한 결과는 하기 표 5 내지 표 7에 나타낸 바와 같으며, 이와 같이 기능 분석을 통해 각각 특이적으로 관여하는 유전자의 기능에 대해 확인할 수 있었다. 이를 토대로, 톨루엔 또는 자일렌의 단독 또는 복합 노출에 의해 발현 변화를 보이는 특이적 유전자 선별 또한 가능하다.
실시예
6: IPA(Ingenuity Pathway Analysis) 프로그램을 이용한
마이크로어레이
(microarray) 데이터 분석
마이크로어레이 실험 후, 선발한 유전자 바이오마커의 기능을 분석하기 위하여, Ingenuity System사의 IPA(Ingenuity Pathway Analysis) 프로그램(www.ingenuity.com)을 이용하였다.
IPA 프로그램을 이용하여 톨루엔 또는 자일렌의 단독 또는 복합 노출에 대해 선별된 특이적 유전자의 발현 변화에 따른 질병과의 연관성을 분석해 본 결과, 톨루엔 단독 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 보인 유전자는 자궁내막암, 여성생식기 관련 암 및 인지능력(기억장애, 치매) 관련 질환과 연관성을 나타내었으며, 자일렌 단독 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 보인 유전자는 복부 관련 암 및 소화기관(위장염, 소화기계) 관련 암과 관련된 질환과 연관성을 나타내었다. 또한, 톨루엔 및 자일렌 복합 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 보인 유전자는 유방암, 난소암, 대장암, 피부질환(피부염, 아토피 피부염)과 관련된 질환과 연관성을 나타내었다.
구체적으로, 톨루엔의 단독 노출에 대해 선별된 특이적 유전자인 유전자 등록번호(Genbank) NM_000665(ACHE, acetylcholinesterase(Yt blood group), 유전자 등록번호(Genbank) NM_001033886(CXCL12, chemokine (C-X-C motif) ligand 12) 및 유전자 등록번호(Genbank) NM_177977(HAP1, huntingtin-associated protein 1)의 발현 변화에 따른 질병과의 연관성을 IPA 프로그램을 이용하여 분석해 본 결과는 하기 표 8에 나타낸 바와 같으며, 자일렌의 단독 노출에 대해 선별된 특이적 유전자인 유전자 등록번호(Genbank) NM_006889(CD86, CD86 molecule), 유전자 등록번호(Genbank) NM_005310(GRB7, growth factor receptor bound protein 7), 유전자 등록번호(Genbank) NM_000419(ITGA2B, integrin subunit alpha 2b), 유전자 등록번호(Genbank) NM_033023(PDGFA, platelet-derived growth factor alpha polypeptide), 유전자 등록번호(Genbank) NM_033244(PML, promyelocytic leukemia) 및 유전자 등록번호(Genbank) NM_003152(STAT5A, signal transducer and activator of transcription 5A)의 발현 변화에 따른 질병과의 연관성을 분석해 본 결과는 하기 표 9에 나타낸 바와 같이 도출되었다.
또한, 톨루엔 및 자일렌의 복합 노출에 대해 선별된 특이적 유전자인 유전자 등록번호(Genbank) NM_001206541(CAPZB, capping protein (actin filament) muscle Z-line, beta), 유전자 등록번호(Genbank) NM_000603(NOS3, nitric oxide synthase 3), 유전자 등록번호(Genbank) NM_006775(QKI, K Homology(KH) domain containing, RNA binding), 유전자 등록번호(Genbank) BC020881(TLN1, talin 1) 및 유전자 등록번호(Genbank) NM_003286(TOP1, topoisomerase (DNA) I)의 발현 변화에 따른 질병과의 연관성을 IPA 프로그램을 이용하여 분석해 본 결과는 하기 표 10에 나타낸 바와 같이 도출되었다.
<110> INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANYANG UNIVERSITY ERICA CAMPUS
<120> Specific biomarker for identification of exposure to volatile
organic compounds and the method of identification using thereof
<130> P15U22D1667
<150> KR 10-2015-0010565
<151> 2015-01-22
<160> 14
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACHE(NM_000665)
<400> 1
agatcgagtt catctttggg atccccctgg acccctctcg aaactacacg gcagaggaga 60
60
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CXCL12(NM_001033886)
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60
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60
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<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD86(NM_006889)
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gagagagaga gaaaaaagag agatcttgat ccacagaaat acatgaaatg tctggtctgt 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GRB7(NM_005310)
<400> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGA2B(NM_000419)
<400> 6
acaacaatgg ccctgggact gtgaatggtc ttcacctcag catccacctt ccgggacagt 60
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<213> Artificial Sequence
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<223> PDGFA(NM_033023)
<400> 7
gcccgcagtc agatccacag catccgggac ctccagcgac tcctggagat agactccgta 60
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<223> PML(NM_033244)
<400> 8
ggactggcta tcccaagacc tggcagatgt ggctgctcaa taaacacttg ttgaaccatc 60
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tctctgtttg taaccttgtc gacaaagagg tagaaaagat tgggtctagg atatggtggg 60
60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TLN1(BC020881)
<400> 10
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60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAPZB(NM_001206541)
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60
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<212> DNA
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<223> NOS3(NM_000603)
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<213> Artificial Sequence
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<223> QKI(NM_006775)
<400> 13
aacgacaaga agctcatgag cagcctgccc aacttctgcg ggatcttcaa ccacctcgag 60
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<223> TOP1(NM_003286)
<400> 14
agtttgactt cctcgggaag gactccatca gatactataa caaggtccct gttgagaaac 60
60
Claims (18)
- 삭제
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- 하기의 군으로부터 하나 이상 선택되는 유전자 서열의 전체 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된 톨루엔(tolune) 및 자일렌(xylene) 복합 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩:
유전자 등록번호(Genbank): BC020881(TLN1, talin 1);
유전자 등록번호(Genbank): NM_001206541(CAPZB, capping protein (actin filament) muscle Z-line, beta);
유전자 등록번호(Genbank): NM_000603(NOS3, nitric oxide synthase 3);
유전자 등록번호(Genbank): NM_006775(QKI, K Homology(KH) domain containing, RNA binding); 및
유전자 등록번호(Genbank): NM_003286(TOP1, topoisomerase (DNA) I).
- 1) 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 가능성이 있는 개체로부터 수득된 실험군 혈액 시료 및, 톨루엔 및 자일렌이 노출되지 않은 개체로부터 수득된 대조군 혈액으로부터 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 증폭하여 실험군과 대조군을 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 aRNA(amplified RNA)를 제13항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제13항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 여부를 확인하기 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제14항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는, 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 여부를 확인하기 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제13항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 여부 확인용 키트.
- 제16항에 있어서, 음성 대조군 및 양성 대조군의 인간 혈액시료를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 여부 확인용 키트.
- 제13항에 기재된 유전자 군으로부터 하나 이상 선택되는 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트를 포함하는 톨루엔 및 자일렌 복합 노출 여부 확인용 키트.
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