KR101383653B1

KR101383653B1 - 프로피온알데히드 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법

Info

Publication number: KR101383653B1
Application number: KR1020120040407A
Authority: KR
Inventors: 류재천; 송미; 윤지성; 이효선; 류우인; 신찬영
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2012-04-18
Filing date: 2012-04-18
Publication date: 2014-04-10
Also published as: KR20130117298A; US20130281311A1

Abstract

본 발명은 환경 중 노출되는 휘발성 유기화합물 중의 하나인 프로피온알데히드(Propionaldehyde) 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 구체적으로 프로피온알데히드에 의해 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 프로피온알데히드에 특이적 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이며, 본 발명의 바이오마커는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 환경 시료에서 프로피온알데히드의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 프로피온알데히드에 의해 특이적으로 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

Description

프로피온알데히드 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법{Specific biomarker for identification of exposure to Propionaldehyde and the method of identification using thesame}

발명은 프로피온알데히드(Propionaldehyde) 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 프로피온알데히드에 의해 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 프로피온알데히드 특이적 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.

무색에 심한 악취를 발생시키는 물질로 알려진 프로피온알데히드(Propionaldehyde)는 프로피온산(Propion acid), 폴리비닐(Polyvinyl) 및 기타 플라스틱류 제조, 고무합성, 소독 및 방부 효과를 위해 많이 사용되고 있다. 프로피온알데히드는 나무, 가솔린, 디젤연료 및 폴리에틸렌(Polyethylene) 연소 시에 일차적으로 환경 중에 배출된다. 또한 담배연기를 통해 인체 노출되며, 이외에 식품첨가제 및 향신료 등에도 사용된다. 프로피온알데히드는 알데히드류(Aldehydes) 물질 중 포름알데히드(Formaldehyde), 아세트알데히드(Acetaldehyde) 다음으로 환경 중 노출 분포가 높은 것으로 보고되었다 (EPA. 2008).

프로피온알데히드의 인체 노출은 호흡기계질환 및 심혈관계질환을 가장 많이 유발하는 것으로 보고되고 있다. 프로피온알데히드는 알데하드 디하이데로나이즈(aldehyde dehyderonase)에 의해 대사가 이루어지며, 실제 인체 노출에 의해 ALDH 및 ALDH2의 유전자 변이가 나타난다는 보고가 있으며(Drug Chem Toxicol 20(3):173-187, 1997; Drug Metab Dispos 30(1):69-73, 2002), 또한, 랫트(Rat)를 이용한 생체내(in vivo) 노출평가 결과, 저농도 노출에서도 후각상피세포의 액포화현상(vacuolization) 및 위축현상(atrophy)이 나타나는 것으로 보고되는바, 프로피온알데히드가 호흡기계 질환과 많은 연관성이 있음을 시사한다.

혈류를 타고 흐르는 휘발성 유기화합물은 폐포막의 확산현상에 의해 폐에 영향을 미치게 되며, 헥산(hexane), 메틸펜탄(methylpentan), 이소프로펜(isopropene), 벤젠(benzene) 등은 질환의 마커로 사용되고 있으며(J Vet Sci 5(1):11-18, 2004), 최근 날숨 테스트(exhaled breath analysis)를 통해 포집된 물질의 휘발성 유기화합물류 분석 결과로부터 간단한 폐암 진단법이 개발되어 이용되고 있다. 휘발성 유기화합물류 중 알데히드류(Aldehydes)는 폐암질환자들에게 나타나는 대표적 물질로 보고되고 있다(J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 878(27):2643-2651, 2010). 따라서, 프로피온알데히드 등의 알데히드류 특이적 바이오마커 발굴은 폐질환 및 프로피온알데히드의 환경 중 노출을 스크리닝하는데 활용될 수 있다.

이처럼 프로피온알데히드의 인간에 대한 위해성에도 불구하고 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 보다 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 프라이머(primer)를 이용하는 실시간(real-time) PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용, 유전자 발현 여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 프로피온알데히드의 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.

포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:10614-10619, 1996).

마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).

유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직, 세포 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며 cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두 개의 다른 형광(예: Cye3 및 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Genomics Proteomics I:1-10, 2002). 최근 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯한 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 확인할 수 있게 될 것이다.

이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 2천여 개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 프로피온알데히드의 유전자 발현 프로파일을 인간 폐암조직 유래 세포인 A549 세포주에서 관찰 및 분석하여 환경 중 프로피온알데히드에 의해서만 특이적으로 과발현 혹은 저발현되는 유전자를 발굴하여 프로피온알데히드만을 특이적으로 검출할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 노출 여부를 확인하는 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 프로피온알데히드(Propionaldehyde)의 노출에 의해 특이적으로 과발현 또는 저발현되는 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용한 프로피온알데히드 특이적 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로피온알데히드(Propionaldehyde)의 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 프로피온알데히드 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열 또는 그 상보 가닥 분자가 집적된 프로피온알데히드 특이적 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이칩을 제공한다:

유전자 등록번호(Genebank) NM_000029(AGT, angiotensinogen), 유전자 등록번호(Genebank) NM_057159(LPAR1, lysophosphatidic acid receptor 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003004(SECTM1, secreted and transmembrane 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003810(TNFSF10, tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10) 및 유전자 등록번호(Genebank) NM_002133(HMOX1, heme oxygenase 1).

또한, 본 발명은,

1) 프로피온알데히드 노출이 의심되는 실험군 및 정상 대조군의 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;

3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 본 발명의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;

4) 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및

5) 분석한 데이터에서 본 발명의 DNA 마이크로어레이칩에 직접된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은,

1) 프로피온알데히드 노출이 의심되는 실험군 및 정상 대조군의 체세포에서 각각의 RNA을 분리하는 단계;

2) 상기 RNA를 하기 유전자에 상보적이고 하기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계:

유전자 등록번호(Genebank) NM_000029(AGT, angiotensinogen), 유전자 등록번호(Genebank) NM_057159(LPAR1, lysophosphatidic acid receptor 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003004(SECTM1, secreted and transmembrane 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003810(TNFSF10, tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10) 및 유전자 등록번호(Genebank) NM_002133(HMOX1, heme oxygenase 1); 및

3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 하기 각각의 유전자에 상보적이고 하기 각각의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다:

본 발명의 프로피온알데히드(Propionaldehyde) 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자를 바이오마커로 이용하여 프로피온알데히드의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하며, 프로피온알데히드에 의해 야기되는 특이적인 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 프로피온알데히드(Propionaldehyde)의 인간 폐암조직 유래 세포주에서의 세포 독성 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 마이크로어레이 칩을 이용한 프로피온알데히드를 처리한 인간 폐암조직 유래 세포주의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타내는 도이다:
가운데 선(M=0)은 R(시험군 형광 세기 값) = G(대조군 형광 세기 값) 선을 표시한다;
M=1인 경우 G(대조군 형광 세기 값)값 보다 R(시험군 형광 세기 값)값이 1.5배 높은 값을 가진 프로브(probes) 들이 분포하고 있는 것을 나타내며, 그 이상의 점(spots)은 1.5배 이상 높은 신호 강도(signal intensity) 값을 가진 프로브들의 분포를 나타낸다.
도 3은 프로피온알데히드에서만 특이적으로 발현이 증가 혹은 감소한 유전자를 선별하기 위하여, 부틸알데히드(Butylaldehyde), 발러알데히드(Valeradehyde), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal)과 유전자발현 프로파일을 비교 분석한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 프로피온알데히드(Propionaldehyde)의 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 프로피온알데히드 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.

상기 바이오마커는 1.5배 이상 발현이 증가 또는 감소한 유전자로써, 프로피온알데히드에 의해서만 특이적으로 발현이 변화하는 5종의 유전자로 구성되어 있다.

상기 프로피온알데히드 노출 정도에 따라 특이적으로 발현 변화를 나타내는 바이오마커는 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 프로피온알데히드 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 프로피온알데히드를 인간 폐암조직 유래 세포인 A549 세포주에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 프로피온알데히드는 인간 폐암조직 유래 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 프로피온알데히드의 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 프로피온알데히드를 인간 폐암조직 유래 세포주에 처리하고, 상기 물질을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 형광물질(Cy5)로 표지하였으며, 상기 물질을 처리하지 않은 대조군의 경우 Cy3로 표지하였다. 상기 형광표지된 cDNA를 8 × 60k 올리고마이크로어레이 칩 Human whole genome oligo microarray(Agilent, 미국)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2 참조). 분석시 Cy5/Cy3 비율이 1.5배 이상인 경우 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.66배 이하인 경우 발현 감소된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 발현 증가된 유전자는 2.12%(42,405개의 유전자 중 900개) 발현이 감소된 유전자는 3.59%(42,405개의 유전자 중 1,522개)임을 확인하였다. 발현 변화를 나타내는 유전자들의 생물학적 기능 분류 중 단백질 키나제 케스케이드(Protein Kinase Cascade)에 속하는 유전자 5종을 선별하였으며, 실시간 정량 PCR을 이용하여 프로피온알데히드 외의 5종의 알데히드류(부틸알데히드, 발러알데히드, 헥사날, 헵타날, 옥타날) 노출에 의해 프로피온알데히드에서만 특이적으로 발현이 변한(증가 또는 감소) 유전자 5종을 선별하였다(도 3, 표3 및 표 4 참조). 상기 유전자는 기존의 다른 연구들에서 다른 화학물질들에 의한 폐 독성과 관련 질병을 유발시키는데 관여한다는 보고는 있으나 본 발명에서 사용한 프로피온알데히드를 처리했을 때, 인간 폐암조직 유래 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.

또한, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열 또는 그 상보 가닥 분자가 집적된 프로피온알데히드(Propionaldehyde) 특이적 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이칩을 제공한다:

본 발명의 프로피온알데히드 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

또한, 본 발명은 본 발명의 바이오마커를 이용한 프로피온알데히드 특이적 노출 여부 확인방법을 제공한다.

본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 프로피온알데히드 특이적 노출 여부 확인방법을 제공한다:

4) 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및

5) 분석한 데이터에서 본 발명의 DNA 마이크로어레이칩에 집적된 유전자들의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.

상기 노출 여부 확인방법에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간 폐암조직 유래 세포인 A549 세포주를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 폐세포 또는 인간 폐암세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 노출 여부 확인방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리-L-라이신-플로오르세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate; FITC), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 노출 여부 확인방법에 있어서, 단계 4)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, 미국)등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 과발현 혹은 저발현 유전자(표 4 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 4)의 분석 방법은 Agilent Feature Extraction 10.7.3.1(Agilent technologies, CA, 미국), Agilent GeneSpring GX 11.5.1(Agilent technologies, CA, 미국)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.

또한, 본 발명은,

1) 프로피온알데히드 노출이 의심되는 실험군 및 정상 대조군의 체세포에서 각각 RNA를 분리하는 단계;

3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인방법을 제공한다.

상기 단계 2)의 프라이머 쌍은 단계 2)의 유전자를 증폭할 수 있는, 18 내지 30머 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍인 것이 바람직하고, 하기 프라이머 쌍 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

프라이머 쌍 1: 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머;

프라이머 쌍 2: 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머;

프라이머 쌍 3: 서열번호 5로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 역방향 프라이머;

프라이머 쌍 4: 서열번호 7로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 역방향 프라이머; 및

프라이머 쌍 5: 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머.

따라서, 본 발명의 바이오마커는 프로피온알데히드에 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소되므로, 환경시료에서 프로피온알데히드의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에서 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 프로피온알데히드 특이적 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

상기 키트는 추가적으로 인간 체세포를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 인간 체세포는 A549인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 폐세포 또는 인간 폐암세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.

상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

본 발명의 바이오마커는 프로피온알데히드에 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소되므로, 환경시료에서 프로피온알데히드의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 프로피온알데히드에 의해 특이적으로 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은,

하기 각각의 유전자에 상보적이고, 하기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다:

상기 확인용 키트의 프라이머 쌍은 하기 프라이머 쌍 1 내지 5로 구성된 군으로부터 선택되어 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 바이오마커 유전자의 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 15 내지 50머 길이, 바람직하게는 15 내지 30머의 길의, 더욱 바람직하게는 18 내지 25머의 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 모두 사용 가능하다.

상기 확인용 키트에 추가적으로 인간 체세포를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 인간 체세포는 인간 폐암조직 유래 세포인 A549 세포주를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 폐세포 또는 인간 폐암세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

아울러, 상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 상기 반응 시약은 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 RT-PCR 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리

<1-1> 세포배양

인간 폐암조직 유래 세포주인 A549 세포(한국 세포주 은행)를 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지(Gibro-BRL, 미국)를 이용하여 100 ㎜ 디쉬(dish)에서 80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 환경 중 노출되는 휘발성 유기화합물 중 알데하이드류의 하나인 프로피온알데히드(Prorionaldehyde)를 선정하였으며, DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.

<1-2> 세포 독성 실험( MTT assay ) 및 화학 물질 처리

Mossman 등(J. Immunol. Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 A549 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다.

구체적으로 세포는 24-웰 플레이트에 3.5 × 10⁴/웰 세포수로 RPMI 배지(Gibro-BRL, 미국)에서 DMSO에 용해된 프로피온알데히드를 처리하고 48시간 후에 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해한 후, 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 A549 세포주에서 프로피온알데히드의 세포독성을 살펴본 결과, 20% 생존율을 보이는 농도(IC₂₀)는 2.5 mM 이었으며, 상기 결과를 바탕으로 하기 마이크로어레이 실험을 수행하였다(도 1).

<실시예 2> 마이크로어레이 실험

<2-1> 표적 RNA 의 분리 및 형광 물질 표지

25 × 10⁴ cell/㎖ 농도로 6-웰 플레이트에 A549 세포를 분주한 후, 상기 실시예 <1-2>에서 결정한 프로피온알데히드의 농도를 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, 미국)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, 미국)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 농도는 ND-1000 Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific Inc., 미국)와 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent)로 확인하였다.

<2-2> 표지된 cDNA 제조

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 프로피온알데히드 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 하기 [표 1]과 같이 시약을 혼합하였다. 대조군인 A549 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)로 표지화하였고, 프로피온알데히드를 처리한 A549 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)로 표지화하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, 미국)을 사용하여 혼합, 정제하였다.

구성	부피(㎕)
5X first strand buffer	6
dNTPs	0.6
0.1 M DDT	3
SuperScript II enzyme	3
Cy-3 또는 Cy-5 dUTP	2

<2-3> 혼성화 반응

혼성화 및 세척 과정은 (주)이바이오젠의 지시방법에 따라 수행되었다.

구체적으로, 하기 [표 2]와 같은 Transcription Master Mix를 만들어 넣고 잘 섞은 뒤 40℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 라벨링(Labeling)된 cRNA를 정제(purification)하는 과정을 진행한 다음, 정제과정을 거친 cRNA 600 ng을 60℃에서 30분간 반응하여, 단편화(Fragmentation) 과정을 수행하였다. 위와 같이 준비된 cRNA에 2 x GEx Hybridization Buffer HI-RPM을 넣고 잘 섞은 뒤 칩(chip)에 잘 넣고 65℃에서 17시간 동안 오븐에서 혼성화(hybridization)를 하였다. 17시간 뒤 세척과정(GE Wash Buffer 1에서 1분, GE Wash Buffer 2에서 1분)을 거친 후 상기 칩을 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.

Component	Volume(㎕) per reaction
nuclease-free water	0.75
5X Transcription Buffer	3.2
0.1 M DTT	0.6
TP mix	1
T7 RNA Polymerase Blend	0.21
Cyanine 3-CTP	0.24

<2-4> 형광 이미지 획득

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Agilent C scanner(Agilent technologies, CA, 미국)로 스캔하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성 정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 Agilent Feature Extraction 10.7.3.1(Agilent technologies, CA, 미국)로 분석하였다. 추출된 데이터는 Agilent GeneSpring GX 11.5.1(Agilent technologies, CA, 미국)을 이용하여 정규화(normalization)를 거쳐 각 유전자의 발현양상을 분석하였다. 이렇게 하여 얻어진 데이터로부터 프로피온알데히드에 대한 마커 유전자를 선별하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 2천여 개의 유전자 중에서 프로피온알데히드에 의해 Cy5/Cy3의 비율이 1.5배 이상으로 유전자 발현 증가를 보이는 유전자는 2.12%(42,405개의 유전자 중 900개) 발현이 감소된 유전자는 3.59%(42,405개의 유전자 중 1,522개)임을 확인하였다(도 2).

또한, 프로피온알데히드에서만 특이적으로 발현이 증가 혹은 감소한 유전자를 선별하기 위하여, 하기 [표 3]에 기재된 다른 5종의 알데히드류인 부틸알데히드(Butylaldehyde), 발러알데히드(Valeradehyde), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal)과 유전자발현 프로파일을 비교 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 프로피온알데히드에서만 특이적으로 발현이 증가 혹은 감소한 유전자 5종을 선별하였다(도 3 및 표 4). 아울러, 상기 유전자는 본 발명에서 사용한 프로피온알데히드를 처리했을 때, 인간 폐암조직 유래 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없었다.

	물질명	노출 농도
알데히드류 (Aldehydes)	Butylaldehyde(부틸알데히드)	4.6 mM
	Valeraldehyde(발러알데히드)	3.4 mM
	Hexanal(헥사날)	1.6 mM
	Heptanal(헵타날)	0.6 mM
	Octanal(옥타날)	0.58 mM

등록번호	유전자 약어	유전자 명	프로피온알데히드노출에 의한 마이크로어레이 중간값의 비
NM_000029	AGT	Angiotensinogen	0.55
NM_057159	LPAR1	Lysophosphatidic acid receptor 1	0.62
NM_003004	SECTM1	Secreted and transmembrane 1	0.63
NM_003810	TNFSF10	Tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10	0.65
NM_002133	HMOX1	Heme oxygenase 1	1.52

< 실시예 3> 실시간 RT - PCR 정량

상기 마이크로어레이 결과로부터 프로피온알데히드에 의해 특이적으로 발현이 변화된 상기 <실시예 2>의 과발현 및 저발현된 유전자 중 프로피온알데히드에 의해 특이적으로 발현되는 5종의 유전자[유전자 등록번호(Genebank) NM_000029(AGT, angiotensinogen), 유전자 등록번호(Genebank) NM_057159(LPAR1, lysophosphatidic acid receptor 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003004(SECTM1, secreted and transmembrane 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003810(TNFSF10, tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10), 유전자 등록번호(Genebank) NM_002133(HMOX1, heme oxygenase 1)]의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR)(Bio-rad, 미국)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다. 이때, 프로피온알데히드 특이적으로 발현이 변화되는 것을 확인하기 위해 상기 [표 3]에 기재된 추가 5종의 물질로부터 위 5종 유전자에 대한 발현변화를 확인하였다.

구체적으로, 올리고 dT 프라이머와 Superscript kit(Omniscipt™ kit, Qiagen, Co., 미국)를 이용하여 역전사반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA 0.2 ㎕와 물 3.8 ㎕, 센스 프라이머 0.5 ㎕, 안티센스 프라이머 0.5 ㎕, 사이버그린 I 염색 수퍼믹스(Bio-rad, 미국) 5 ㎕를 혼합하여, PCR 튜브에 담아 단계 1: 95℃, 3분; 단계 2(45회 반복): 단계 2-1: 95℃, 10초; 단계 2-2: 57℃ 45초; 단계 3: 95℃, 1분; 단계 4: 55℃, 1분; 단계 5(반복 80회): 55℃, 10초로 프로그램을 설계한 My IQ 실시간 PCR 기계에서 반응을 수행하였다. PCR 산물을 정량하기 위하여 사이버그린(SYBR Green) I 염색(Bio-rad, 미국)으로 염색하였다. 사이버그린 I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저 PCR에 이용한 표적 유전자와 내재성(endogenous) 대조군(MDH1)에 대한 프라이머를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 하기 [표 5]에 기재된 각각의 프라이머를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다.

그 결과, 유전자 등록번호(Genebank) NM_000029(AGT, angiotensinogen), 유전자 등록번호(Genebank) NM_057159(LPAR1, lysophosphatidic acid receptor 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003004(SECTM1, secreted and transmembrane 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003810(TNFSF10, tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10), 유전자 등록번호(Genebank) NM_002133(HMOX1, heme oxygenase 1) 유전자의 발현 양상은 상기 실시예 <2-4>의 마이크로어레이 칩 결과와 매우 유사하게 나타남을 확인하였으며, 또한, 추가 알데히드류 5종에 대한 각 5종 유전자의 발현양상을 확인한 결과, 프로피온알데히드의 유전자 발현양상과는 다른 양상(물질노출에 의한 변화가 없음 또는 프로피온알데히드와 다른 발현양상을 보임)을 보이는 것을 확인하였다.

Genbank 등록번호	유전자명	PCR 프라이머 서열 (5'->3')
NM_000029	AGT(angiotensinogen)	센스 (서열번호 1)	TGCTGCATGGAGTGAGCAGTAGAA
		안티센스 (서열번호 2)	CACAAACAAGCTGGTCGGTTGGAA
NM_057159	LPAR1(lysophosphatidic acid receptor 1)	센스 (서열번호 3)	TCTGCTGGACTCCTGGATTGGTTT
		안티센스 (서열번호 4)	AAGGTGGCGCTCATTTCTTTGTCG
NM_003004	SECTM1(secreted and transmembrane 1)	센스 (서열번호 5)	ACTGGTGTTCAAACCCTCACCACT
		안티센스 (서열번호 6)	ATGGGTCTGCGGCATATGGAAACA
NM_003810	TNFSF10(tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10)	센스 (서열번호 7)	GAGCTGAAGCAGATGCAGGAC
		안티센스 (서열번호 8)	TGACGGAGTTGCCACTTGACT
NM_002133	HMOX1, heme oxygenase 1	센스 (서열번호 9)	ATTGCCAGTGCCACCAAGTTCAAG
		안티센스 (서열번호 10)	ACGCAGTCTTGGCCTCTTCTATCA

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열 또는 그 상보 가닥 분자가 집적된 프로피온알데히드(Propionaldehyde) 특이적 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이칩:
유전자 등록번호(Genebank) NM_000029(AGT, angiotensinogen), 유전자 등록번호(Genebank) NM_057159(LPAR1, lysophosphatidic acid receptor 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003004(SECTM1, secreted and transmembrane 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003810(TNFSF10, tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10) 및 유전자 등록번호(Genebank) NM_002133(HMOX1, heme oxygenase 1).
1) 프로피온알데히드 노출이 의심되는 실험군 및 정상 대조군으로부터 각각 분리된, 인간 폐세포 또는 인간 폐암조직 유래 세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
4) 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
5) 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이칩에 집적된 유전자들의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인방법.
삭제
제 2항에 있어서, 인간 폐암조직 유래 세포는 A549인 것을 특징으로 하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인방법.
제 2항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리-L-라이신-플로오르세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate; FITC), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인방법.
1) 프로피온알데히드 노출이 의심되는 실험군 및 정상 대조군으로부터 각각 분리된, 인간 폐세포 또는 인간 폐암조직 유래 세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;
2) 상기 RNA를 하기 유전자에 상보적이고 하기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계:
유전자 등록번호(Genebank) NM_000029(AGT, angiotensinogen), 유전자 등록번호(Genebank) NM_057159(LPAR1, lysophosphatidic acid receptor 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003004(SECTM1, secreted and transmembrane 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003810(TNFSF10, tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10) 및 유전자 등록번호(Genebank) NM_002133(HMOX1, heme oxygenase 1); 및
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인방법.
제 6항에 있어서, 단계 2)의 프라이머 쌍은 단계 2)의 유전자를 증폭할 수 있는, 18 내지 30머 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인방법.
제 6항에 있어서, 단계 2)의 프라이머 쌍은 하기 프라이머 쌍 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인방법:
프라이머 쌍 1: 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머;
프라이머 쌍 2: 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머;
프라이머 쌍 3: 서열번호 5로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 역방향 프라이머;
프라이머 쌍 4: 서열번호 7로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 역방향 프라이머; 및
프라이머 쌍 5: 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머.
제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인용 키트.
제 9항에 있어서, 인간 폐세포 또는 인간 폐암조직 유래 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인용 키트.
삭제
하기 각각의 유전자에 상보적이고 하기 각각의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인용 키트:
유전자 등록번호(Genebank) NM_000029(AGT, angiotensinogen), 유전자 등록번호(Genebank) NM_057159(LPAR1, lysophosphatidic acid receptor 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003004(SECTM1, secreted and transmembrane 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003810(TNFSF10, tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10) 및 유전자 등록번호(Genebank) NM_002133(HMOX1, heme oxygenase 1).
제 12항에 있어서, 프라이머 쌍은 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 18 내지 30머 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인용 키트.
제 12항에 있어서, 프라이머 쌍은 하기 프라이머 쌍 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로피온알데히드에 대한 노출 여부 확인용 키트:
프라이머 쌍 1: 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머;
프라이머 쌍 2: 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머;
프라이머 쌍 3: 서열번호 5로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 역방향 프라이머;
프라이머 쌍 4: 서열번호 7로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 역방향 프라이머; 및
프라이머 쌍 5: 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머.