KR101294787B1

KR101294787B1 - 벤조에이안트라센 노출 여부 확인용 마이크로 ｒｎａ 및 이를 이용한 확인 방법

Info

Publication number: KR101294787B1
Application number: KR1020110092903A
Authority: KR
Inventors: 류재천; 송미경; 송미; 최한샘
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2011-09-15
Filing date: 2011-09-15
Publication date: 2013-08-08
Also published as: KR20130029567A

Abstract

본 발명은 마이크로 RNA를 이용한 다환 방향족 탄화수소류 중의 하나인 벤조에이안트라센(benzo[a]anthracene) 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 벤조에이안트라센 노출에 의해 발현수준이 2배 이상 과발현되는 마이크로 RNA를 선별함으로써, 이들 7종의 마이크로 RNA를 바이오마커로 이용하여 벤조에이안트라센의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하게 사용할 수 있으며, 벤조에이안트라센에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있음을 알 수 있다.

Description

벤조에이안트라센 노출 여부 확인용 마이크로 ＲＮＡ 및 이를 이용한 확인 방법{microRNAs for identification of exposure to benzo[a]anthracene and the method of identification using thereof}

본 발명은 벤조에이안트라센(benzo[a]anthracene) 노출 여부 확인용 마이크로 RNA 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 두 가지 농도로 처리된 벤조에이안트라센에 의해 공통적으로 발현이 변화하는 마이크로 RNA 및 이를 이용한 벤조에이안트라센에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.

최근 수년 동안, 폭넓은 생물학적 과정들에 대해 깊은 영향을 주는 조절성 RNA 의 중요한 부류로서 마이크로 RNA (miR, miRNA) 가 대두되었다. 이들 소형 (전형적으로 18-24 개 뉴클레오티드 길이) 비(非)암호화 RNA 분자는 RNA 분해 촉진, mRNA 번역 저해, 및 또한 유전자 전사에의 영향을 통해 단백질 발현 패턴을 조절할 수 있다. 마이크로 RNA 는 발달 및 분화, 세포 증식 제어, 스트레스 반응 및 대사작용 등의 다양한 과정에서 중심적 역할을 한다. 현재 약 1000여 개의 인간 마이크로 RNA 가 알려져 있다.

마이크로 RNA는 RNA 폴리머라제 Ⅱ(pol Ⅱ) 또는 RNA 폴리머라제 Ⅲ(pol Ⅲ; Qi, P. et al. Cell . Mol . Immunol . 3, 411-419, 2006 참조)에 의해 전사되고 개개의 마이크로 RNA 유전자, 단백질 암호화 유전자의 인트론 또는 여러 개인, 밀접하게 관련된 마이크로 RNA 를 주로 암호화하는 폴리-시스트론 전사물로부터 유도될 수 있다. RNA pol II 또는 pol III에 의한 miRNA 유전자들의 전사는 일반적으로 수천 염기 길이인 프라이머리 miRNA 전사물(pri-miRNAs)로 불리는, 최초 전사물을 생산한다. 핵에서, pri-miRNAs는 RNAse, 드로샤(Drosha)에 의해 가공되어, 70- 내지 100-뉴클레오티드 헤어핀-모양 전구체(pre-miRNAs)를 생산한다. 세포질로 운반된 후, 헤어핀 pre-miRNA는 이중-가닥 miRNA를 생산하기 위해 다이서에 의해 추가로 가공된다. 성숙한 miRNA 가닥은 RNA-유도 침묵 복합체(RISC) 속에 혼합되어, 여기서 성숙한 miRNA는 염기쌍 상보성에 의해 이의 표적 mRNAs와 결합한다. miRNA 염기쌍들이 mRNA 표적과 완벽하게 일치하는 비교적으로 드문 경우, 이것이 mRNA 분해를 촉진한다. 더욱 일반적으로, miRNAs는 표적 mRNAs와 불완전한 이형이중가닥을 형성하여 mRNA 번역에 영향을 준다.

마이크로 RNA 메커니즘은 암 발병, 세포 노화, 장기의 성장 등에 중요한 영향을 미치고 있으며, 이에 따라 마이크로 RNA 관련 연구는 암 발생, 노화 등의 생명현상 인과 관계 규명에 중추적 역할을 할 뿐 만 아니라, 향후 발생 및 분화나 줄기세포를 이용한 세포치료제 개발 등의 연구에도 적용시킬 수 있는 우리나라 바이오 연구의 핵심 분야로 자리 잡을 수 있을 것으로 예상된다. 따라서, 마이크로 RNA 마커의 발굴은 암을 포함하여 질병의 조기 진단 가능성을 예측하는 데에 많은 도움을 줄 것이라는 점에서 의의가 있다.

뿐만 아니라 마이크로 RNA 마커는 특정 환경유해물질의 노출 예측에도 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 생각되고 있다. 지금까지는 환경유해물질의 노출에 따른 유전자 (mRNA)의 변화 양상과 그에 따른 질병과의 연관성에 관련된 연구가 주로 진행되었으나 최근 마이크로 RNA와의 연관성에 대한 관심이 증가함에 따라 몇몇 연구에서 벤젠(benzene), 비소(arsenic) 또는 RDX와 같은 유해물질의 노출에 따른 마이크로 RNA의 발현 변화를 관찰하였으며 특이적으로 발현이 변화하는 마이크로 RNA와 그 표적 유전자를 유해물질에 대한 마커로 제시하였다(Baccarelli, A. & Bollati, V. Curr . Opin . Prediatr . 21, 243-251, 2009 참조). 또한 발굴된 마이크로 RNA는 노출 예측을 위한 마커로서 뿐만 아니라 표적 유전자의 발현을 조절하는 조절자로서 환경유해물질에 의한 독성 기작 예측을 위한 마커로서도 유용하게 쓰일 수 있다. 이렇듯 마이크로 RNA 마커의 환경유해물질 노출 및 독성기작 예측에서의 역할이 매우 중요하다고 할 수 있음에도 불구하고 현재 마이크로 RNA 관련 연구는 주로 질병 진단용 마커 발굴에 국한되어 있으며 다양한 환경 중에 노출 가능성이 매우 큰 다환방향족 탄화수소류와 같은 유해물질 노출에 의한 마이크로 RNA의 발현 변화에 대한 연구는 부족하다. 또한, 후성유전학적 변화는 유전자의 발현과 같은 유전학적 변화의 다양성에 비해 그 정도가 심하지 않게 때문에 다수의 마커가 필요한 유전자 발현 프로파일링에 비해서 단 하나의 마이크로 RNA나 DNA 메틸레이션과 같은 유전자 외적(epigenetic) 마커로도 질병이나 유해물질 노출을 초기에 진단 할 수 있다는 장점뿐만 아니라 비침습적 방법으로 진단할 수 있다는 이점이 있다. 각 마이크로 RNA가 다양한 표적 유전자들을 조절하고 고등진핵생물에서는 천여 개의 마이크로 RNA가 존재하기 때문에 마이크로 RNA에 의해 조절될 수 있는 잠재적인 회로가 막대할 것이라고 예상하고 있다.

다환 방향족 탄화수소류 중에서 벤조에이안트라센은 화재로부터 불완전 연소에 의해 자연적으로 발생하거나, 트럭, 선반 등에서 연소된 기체로부터 발생하거나, 토탄 침전물에서 발견된다. 벤조에이안트라센은 상업적으로 생산되는 물질은 아니지만 주로 연구목적으로 생산되어진다.

벤조에이안트라센은 휘발성이 없어서 토양 중 이동성이 아주 미미하며, 토양중 반감기는 750일 정도이다. 물 표면에서의 휘발성도 거의 없어서, 주로 저질과 부유물질에 흡착되어지고, 수중에서의 가수분해반응은 일어나지 않으며 수생생물 중 생물농축이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 대기 중에서는 입자 상태로만 존재하여 주로 물리적인 방법으로 제거될 수 있다. 또한 태양광에 강하게 흡착하여 환경 중에서 직접적인 광분해반응이 일어난다. 국내 식품 중 다환방향족 탄화수소류의 오염도 조사연구에서 전국 9개 도시에서 유통되는 육류, 육류 가공품 및 유지류의 벤조에이안트라센의 함량을 조사한 결과 훈연제품, 가금류 식품, 육류에서 0.022~0.046 ㎍/㎏으로 검출되었고(김명철 등, 2001), 식용유지에서 평균 0.16 ㎍/㎏으로 조사되었다(이종옥 등, 2002).

동물실험에서 벤조에이안트라센은 경구를 통해 흡수되며 피부흡수는 느리고 공기 중 흡입에 의한 흡수는 그리 연구되지 않았다고 알려져 있다. 흡수된 벤조에이안트라센은 대부분 변으로 분비되며 배출되도록 포접화합물로 대사된다. 벤조에이안트라센은 베이 부분(bay region)의 반응성이 있는 다이올-에폭사이드 유도체로 대사되어 유전독성 및 발암성을 일으킨다고 알려져 있다(ASTDR 1990).

또한, 벤조에이안트라센은 세계보건기구(WHO) 산하의 국제암연구기관(IARC)에서 '인체 발암 가능성 물질'인 2B등급으로 분류하고 있으며(IARC, IARC Monogr . Eval. Carcinog . Risks Hum . 82, 367-435, 2002), 미국 환경부의 발암성 분류 등급에서는 '잠재적인 인체 발암물질'로 발암성 C등급으로 구분하고 있다(IRIS, U.S. Environ. Protect . Agency http://www.epa.gov/iris/, 2003).

다환방향족 탄화수소류의 발암성 정도와 유전자 발현 변화에 대한 연구는 일부 보고되고 있지만, 대표적인 다환방향족 탄화수소류로 알려진 벤조에이파이렌(Benzo[a]pyrene)에 대한 연구에 거의 국한되어 있다. 앞서 설명한바와 같이 벤조에이안트라센의 노출은 인간에 발암 가능성 뿐 아니라 다양한 질병에 대한 가능성을 나타내고 있음에도 불구하고 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 마이크로 RNA와 같은 후성유전체적 영향에 대한 연구는 거의 전무하다.

근래에 들어 마이크로어레이 칩이 보편화되어 질병 진단을 위한 다양한 실험에 사용됨에도 불구하고 환경유해물질 노출에 대한 검색은 여전히 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법을 사용하여 이루어지고 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 보다 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 마이크로어레이 칩 또는 프라이머(primer)를 이용하는 실시간(real-time) PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 등으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용, 특히 암을 비롯한 다양한 질병 유발에 관여하는 마이크로 RNA 발현 변화 여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 벤조에이안트라센의 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.

1997년 처음으로 마이크로 RNA가 밝혀진 이래 포유류, 미생물 등 여러 종의 마이크로 RNA가 급속도로 밝혀져 Sanger miRBASE 데이타베이스(database)에 보고되었다(http://www.mirbase.org/index.shtml). 이렇게 밝혀진 마이크로 RNA 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드(genome-wide) 발현 연구가 이루어지고 있다. 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M, et al. Proc . Natl . Acad. Sci . USA 93, 10614-10619, 1996).

마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et. al. J. Am . Acad . Dermatol . 51, 681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어 지고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al. J. Am . Acad . Dermatol . 51, 681-692, 2004).

유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 마이크로 RNA를 얻어 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 마이크로 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화한다.

마이크로어레이를 통해 유전자 발현을 측정하는 방법으로는 크게 두 개의 염료(two-dye) 방식과 한 개의 염료(one-dye) 방식이 있다. 상보결합 반응을 측정할 때, 대조군 샘플과 실험군 샘플에 각각 두 개의 다른 형광(예: Cye3 및 Cye5)으로 표지한 후 마이크로어레이에서 반응시켜 측정하는 방식을 두 개의 염료 마이크로어레이(two-dye microarray) 라고 하고, 두 샘플에 동일한 형광을 입힌 후 두 개의 서로 다른 마이크로어레이에서 반응시켜 측정하는 방식을 한 개의 염료 마이크로어레이(one-dye microarray) 라고 한다(Vivian, G. et al. Nature 21, 15-19, 1999).

최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯해 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 마이크로 RNA들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 마이크로 RNA의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 확인이 가능하게 될 것이다.

이에 본 발명자들은 인간 마이크로 RNA 887개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 세포독성을 나타내지 않는 농도인 1μM 또는 80%의 세포생존율을 보이는 농도인 36.09μM로 처리한 벤조에이안트라센의 마이크로 RNA 발현 프로파일을 인간 간암 세포인 HepG2 세포주에서 관찰 및 분석한 결과, 두 가지 농도의 벤조에이안트라센에 의해 발현이 변화되는 마이크로 RNA를 발굴함으로써, 상기 마이크로 RNA를 이용하여 두 가지 농도의 벤조에이안트라센 노출 여부를 확인할 수 있는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인체에 다양한 질병을 유발하는 등 독성작용을 갖는 벤조에이안트라센(benzo[a]anthracene)의 노출 여부 확인용 마이크로 RNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 마이크로 RNA를 이용하여 벤조에이안트라센의 노출 여부 확인 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로 RNA 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 벤조에이안트라센(benzo[a]anthracene) 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩을 제공한다:

마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0002821 (hsa-mir-181d, Homo sapiens miR-181d);

마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000257 (hsa-miR-181b, Homo sapiens miR-181b);

마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000063 (hsa-let-7b, Homo sapiens let-7b);

마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005825 (hsa-miR-1180, Homo sapiens miR-1180);

마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004810 (hsa-miR-629, Homo sapiens miR-629);

마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000764 (hsa-miR-339-5p, Homo sapiens miR-339-5p); 및

마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MI0009987 (hsa-miR-1977, Homo sapiens miR-1977).

또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 벤조에이안트라센 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

또한, 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나의 마이크로 RNA에 상보적이고, 상기 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 벤조에이안트라센 노출 여부 확인용 키트를 제공한다:

또한, 본 발명은

1) 실험군인 피검개체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 각각 다른 형광물질로 표지하는 단계;

3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 RNA를 상기 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;

4) 단계 3)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및

5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 실험군의 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 벤조에이안트라센에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;

3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

4) 단계 3)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 벤조에이안트라센에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법을 제공한다.

본 발명은 벤조에이안트라센(benzo[a]anthracene) 노출에 의해 2배 이상 과발현되는 7종의 마이크로 RNA를 선별함으로써, 이들 7종의 마이크로 RNA를 바이오마커로 이용하여 벤조에이안트라센의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하게 사용할 수 있으며, 벤조에이안트라센에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

도 1은 벤조에이안트라센(benzo[a]anthracene)의 인간 간암 세포주에서의 세포독성을 나타내는 그림이다.
도 2는 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 이용한 벤조에이안트라센을 처리한 인간 간암 세포주의 마이크로 RNA 발현 양상을 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 3은 벤조에이안트라센에서 공통적으로 발현이 변화한 3종의 마이크로 RNA의 올리고마이크로어레이 칩과 실시간 RT-PCR(real-time reverse transcript polymerase chain reaction)에서의 발현 양상을 비교한 결과를 나타내는 그림이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 벤조에이안트라센(benzo[a]anthracene)의 노출에 의해 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.

상기 바이오마커는 두 가지 농도의 벤조에이안트라센 노출에 의해 공통적으로 2배 이상 발현이 증가한 마이크로 RNA로 구성되어 있다.

상기 두 가지 농도는 구체적으로 1μM 또는 36.09μM이나 이에 한정되지 않는다.

상기 바이오마커는 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것이나 이에 한정되지 않는다:

본 발명자들은 벤조에이안트라센에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 벤조에이안트라센을 인간 간암 세포주(HepG2)에 처리하여 세포독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 벤조에이안트라센은 인간 간암 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 벤조에이안트라센의 농도(세포독성을 나타내지 않는 농도: NT, 세포 생존율 80%인 농도:IC₂₀)를 결정하였다. 이후 상기 결정된 두 가지 농도로 벤조에이안트라센을 인간 간암 세포주에 처리하고, 상기 물질을 처리한 세포주에서 마이크로 RNA를 포함하는 총 RNA를 분리하여 형광물질(Cy3)로 표지하였다. 상기 형광표지된 마이크로 RNA를 Agilent Human miRNA array v14.0(Agilent, USA)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다. 분석시 실험군/대조군의 신호 강도(signal intensity) 비율이 2.0배 이상인 경우 발현 증가한 유전자로 분류하였고, 0.5배 이하인 경우 발현 감소한 유전자로 분류하였다. 그 결과, NT 농도로 벤조에이안트라센을 처리한 샘플에서 발현 증가한 마이크로 RNA는 1.58%(887개의 마이크로 RNA 중 14개)이고 발현이 감소한 마이크로 RNA는 없음을 확인하였고 IC₂₀ 농도로 벤조에이안트라센을 처리한 샘플에서 발현이 증가한 마이크로 RNA는 2.37%(887개의 마이크로 RNA 중 21개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 0.45%(887개의 마이크로 RNA 중 4개)임을 확인하였다(도 2 참조). 이때, NT과 IC₂₀의 벤조에이안트라센 모두에 의해 공통적으로 발현이 2배 이상 과발현, 저발현하는 마이크로 RNA가 7종 (과발현 7종, 저발현 0종) 이었으며(표 1 참조) 이들 마이크로 RNA들은 본 발명에서 사용한 벤조에이안트라센을 처리했을 때, 인간 간암 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.

본 발명자들은 상기 유전자 중 과발현된 유전자 3종을 분리하여, 실시간 RT-PCR(real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 방법으로 발현 양상을 조사하였다. 그 결과, 3종의 과발현 유전자들의 발현 양상이 올리고마이크로어레이 칩 결과와 유사하게 나타남을 확인하였다(도 3, 표 5 참조). 이들 유전자들은 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0002821 (hsa-mir-181d, Homo sapiens miR-181d);

마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000257 (hsa-miR-181b, Homo sapiens miR-181b); 및

마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000063 (hsa-let-7b, Homo sapiens let-7b) 등이다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커 마이크로 RNA 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보 가닥 분자가 합성/집적된 벤조에이안트라센에 대한 노출 여부 확인용 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 바이오마커 마이크로 RNA의 15 내지 20개의 핵산을 포함한다.

본 발명의 벤조에이안트라센 검색용 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 구체적으로 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 마이크로 RNA 분자로 이용하여 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 잉크젯 방식 등을 사용하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 SurePrint 잉크젯 마이크로 드롭핑 마이크로어레이(inkjet micro dropping microarray)를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 구체적으로 에폭시(epoxy), 아미노-실란(amino-silane), 폴리-엘-리신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 에폭시가 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 벤조에이안트라센에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 방법은 하기와 같이 수행할 수 있다.

3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 RNA를 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;

4) 단계 3)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및

5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 실험군의 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 체세포는 구체적으로 인간의 간 세포 또는 인간 간암 세포인 것이나 이에 한정되지 않고, 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 방법에 있어서, 인간 간암 세포는 구체적으로 HepG2이나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 구체적으로 Cy3, Cy5, 폴리 엘-리신-플루오레세인 이소티오시안산염(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-비-이소티오시안산염(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩은 구체적으로 Agilent Human miRNA array v14.0(Agilent, USA)등을 사용하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 마이크로 RNA 중 본 발명에서 상기 공통적으로 발현이 변화된 마이크로 RNA(표 1 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 가장 구체적인 것은 상기 본 발명자가 제작한 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 분석 방법은 구체적으로 GeneSpring GX 11 소프트웨어(Agilent, USA)를 사용하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.

또한, 본 발명은

3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 프라이머는 본 발명에서 탐색된 바이오마커 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머라면 모두 사용가능하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩을 포함하는 벤조에이안트라센 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

상기 벤조에이안트라센에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 키트는 추가적으로 인간 간 세포 또는 인간 간암 세포를 포함하는 것이나 이에 한정되지 않는다.

상기 인간 간암 세포는 구체적으로 HepG2를 사용하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 간 세포 또는 인간 간암의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 구체적으로 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3를 사용하였다.

상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

아울러, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나의 마이크로 RNA에 상보적이고, 상기 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 벤조에이안트라센 노출 여부 확인용 키트를 제공한다:

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 벤토에이안트라센의 세포독성 확인

<1-1> 세포배양

인간 간암 세포주인 HepG2 세포(한국 세포주 은행)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)를 이용하여 100 ㎜ 디쉬(dish)에서 80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 다환방향족 탄화수소류의 하나로서 발암성을 가지고 있는 물질인 벤조에이안트라센을 선정하였으며, DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.

<1-2> 세포독성 실험( MTT assay ) 및 화학 물질 처리를 통한 벤조에이안트라 센이 미치는 세포독성 여부 확인

Mossman 등(J. Immunol . Methods , 65, 55-63, 1983)의 방법으로 HepG2 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트에 4× 10⁵/웰 세포수로 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)에서 DMSO에 용해된 벤조에이안트라센을 처리하고 48시간 후에 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 HepG2 세포주에서 벤조에이안트라센의 세포독성을 나타내지 않는 농도(NT)는 1 μM이고 80% 생존율을 보이는 농도(IC₂₀)는 36.09 μM 임을 확인하였다(도 1).

< 실시예 2> 마이크로어레이 실험을 통한 벤조에이안트라센에 의한 마이크로 RNA 의 발현 양상 확인

<2-1> 표적 마이크로 RNA 의 분리

6 × 10⁶ 세포/㎖ 농도로 100 mm 디쉬에 HepG2 세포를 분주한 후, 상기 실시예 <1-2>에서 결정된 벤조에이안트라센의 농도들을 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase 세트(set)(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 농도는 분광광도계인 NanoDrop ND 1000 분광광도계(spectrophotometer)(NanoDrop Technologies Inc., USA)를 이용하여 측정하였으며 순도는 아가로스 젤 전기영동으로 확인하였다.

<2-2> 표지된 마이크로 RNA 제조 및 형광 물질 표지

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 벤조에이안트라센 처리군의 전체 RNA에 형광 물질을 표지하였다. 형광 표지는 Agilent사의 miRNA 완전한 라벨링 및 혼성화 키트(complete labeling and Hybridization kit)를 사용하여 제조사의 방법대로 수행하였다. 상기 수득한 전체 RNA 2μl(100 ng)에 0.4 ul의 10X CIP 완충용액, 1.1 ul의 핵산분해효소 자유수(nuclease-free water), 0.5 ul의 Calf Intestinal Phosphatase를 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 2.8 ul의 100% DMSO를 첨가하여 100%에서 5 내지 10분간 반응시키고 즉시 얼음으로 옮겼다. 염료(dye)를 붙여주기 위해 1 ul의 10X T4 RNA 리가아제(Ligase) 완충용액, 3 ul의 Cyanine3-pCp, 0.5 ul의 T4 RNA 리가아제(ligase)를 넣고 16℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 라벨링(labeling) 된 시료를 Micro Bio-Spin 6 컬럼(column)을 사용하여 정제하였다. 정제된 RNA를 55℃의 진공 농축기(vacuum concentrator)에서 완전히 말려 18 ul의 핵산분해효소 자유수로 녹인 후 4.5 ul의 10X GE 차단 에이전트(Blocking Agent)를 넣고 22.5 ul의 2X Hi-RPM 혼성화 완충용액(Hybridization buffer)을 넣어주었다. 준비된 시료를 100℃에서 5분간 반응시키고 즉시 얼음으로 옮겨 5분간 반응시킨 다음 혼성화 반응에 사용하였다.

<2-3> 혼성화 반응

혼성화 및 세척 과정을 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행하였다. 혼성화를 20시간 동안 55℃ 오븐에서 수행하였다. DNA 마이크로어레이 칩으로는 8×60 k 인간 miRNA 어레이(array) v14.0(Agilent, USA)를 이용하였다.

<2-4> 형광 이미지 획득을 통한 마이크로 RNA 발현 양상 확인

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Agilent C 스캐너(scanner)(Agilent technologies, USA)로 스캔하였으며 추출된 데이터를 Agilent GeneSpring GX 11(Agilent technologies)를 이용하여 정상화(normalization)를 거쳐 각 유전자의 발현양상을 분석하였다.

그 결과, 도 2, 표 1에서 보는 바와 같이 올리고 칩 상에 존재하는 대략 887 개의 마이크로 RNA 중에서 NT의 벤조에이안트라센에 의해 실험군/대조군의 비율이 2.0배 이상으로 유전자 발현 증가를 보이는 마이크로 RNA는 1.58%(887개의 마이크로 RNA 중 14개)이고 발현 감소를 보이는 마이크로 RNA는 없음을 확인하였다. 또한, IC₂₀의 벤조에이안트라센에 의해 실험군/대조군의 비율이 2.0배 이상으로 유전자 발현 증가를 보이는 마이크로 RNA는 2.37%(887개의 마이크로 RNA 중 21개), 발현 감소를 보이는 마이크로 RNA는 0.45%(887개의 마이크로 RNA 중 4개)임을 확인하였다. 이때, NT과 IC₂₀의 벤조에이안트라센 모두에 의해 공통적으로 발현이 2배 이상 과발현, 저발현되는 마이크로 RNA가 7종 (과발현 7종, 저발현 0종)이 있다는 것을 확인하였다(도 2, 표 1).

NT , IC20 의 벤조에이안트라센에 의해 공통적으로 발현이 변화하는 마이크로 RNA

등록번호	유전자명	Fold 변화
등록번호	유전자명	NT	IC ₂₀
MIMAT0002821	hsa-miR-181d	9.58	7.94
MIMAT0000257	hsa-miR-181b	4.97	8.74
MIMAT0000063	hsa-let-7b	3.92	2.80
MIMAT0005825	hsa-miR-1180	3.62	3.78
MIMAT0004810	hsa-miR-629	2.74	2.52
MIMAT0000764	hsa-miR-339-5p	2.31	2.18
MI0009987	hsa-miR-1977	2.01	2.15

< 실시예 3> 실시간 RT -PCR( Real - time reverse transcriptase polymerase chain reaction)을 통한 과발현된 마이크로 RNA 의 발현 변화 확인

두 가지 농도의 벤조에이안트라센 노출에 의해 공통으로 과발현 유도된 상기 실시예 2의 마이크로 RNA 3종을 선별하였다. 이들 마이크로 RNA들은 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0002821 (hsa-mir-181d, Homo sapiens miR-181d);

상기 마이크로 RNA들의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 상기 마이크로 RNA를 특이적으로 발현할 수 있는 프라이머를 제작하여(표 2), My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR)(Bio-rad, USA)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다.

등록번호	유전자명	Mature 마이크로 RNA 프라이머 서열
등록번호	유전자명	(5'->3')
MIMAT0002821	hsa-miR-181d	5'AACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGU (서열번호 1)
MIMAT0000257	hsa-miR-181b	5'AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU (서열번호 2)
MIMAT0000063	hsa-let-7b	5'UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (서열번호 3)

<3-1> cDNA 제조

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 벤조에이안트라센 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다.

cDNA 제조는 Qiagen사의 miScript RT 키트를 사용하여 제조사의 방법대로 수행하였다. 상기 수득한 전체 RNA 1 ㎍을 하기 <표 3>과 같이 시약을 혼합한 후 37℃에서 60분간 반응시킨 후 95℃에서 5분간 반응시켜 역전사 효소(Reverse Transcriptase)를 불활성화시켰다.

구성	부피(㎕)
RT 완충용액(buffer)	4
RNase-자유수(free water)	잔량(variable)
역전사 효소 믹스(Reverse Trascriptase Mix)	1
주형(Template)	1 ㎍ 까지
총 부피	20

<3-2> PCR 산물 정량을 통한 마이크로 RNA 발현 변화 확인

PCR 산물을 정량하기 위하여 사이버그린(SYBR Green) I 염색(Bio-rad, USA)으로 염색하였다. 사이버그린 I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저 <표 4>와 같이 PCR에 이용한 표적 마이크로 RNA와 Universal 프라 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 각각의 프라이머(표 2)를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다.

구성	부피(㎕)
사이버 그린 마스터 믹스(SYBR Green Master Mix)	5
Universal 프라이머(Primer)	1
프라이머(primer)	1
RNase-자유수(free water)	3.8
주형(Template) cDNA	0.2

유전자명	실시간 PCR		마이크로어레이
유전자명	(상대적 비율)		(상대적 비율)
hsa-miR-181d	NT	1.94	NT	9.58
hsa-miR-181d	IC₂₀	4.80	IC₂₀	7.94
hsa-miR-181b	NT	2.84	NT	4.97
hsa-miR-181b	IC₂₀	5.66	IC₂₀	8.74
hsa-let-7b	NT	1.83	NT	3.92
hsa-let-7b	IC₂₀	1.89	IC₂₀	2.80

그 결과, 도 3, 표 5에서 나타난 바와 같이 3종의 공통 과발현 마이크로 RNA의 발현 양상이 벤조에이안트라센에 의한 마이크로 RNA 발현을 조사한 올리고 마이크로어레이 결과와 매우 유사하게 나타남을 확인하였다(도 3, 표 5).

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명은 인체에 다양한 질병을 유발하는 등 독성작용을 갖는 벤조에이안트라센의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하게 사용할 수 있으며, 벤조에이안트라센에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로 RNA 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 벤조에이안트라센(benzo[a]anthracene) 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩:
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0002821 (hsa-mir-181d, Homo sapiens miR-181d);
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000257 (hsa-miR-181b, Homo sapiens miR-181b);
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000063 (hsa-let-7b, Homo sapiens let-7b);
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005825 (hsa-miR-1180, Homo sapiens miR-1180);
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004810 (hsa-miR-629, Homo sapiens miR-629);
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000764 (hsa-miR-339-5p, Homo sapiens miR-339-5p); 및
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MI0009987 (hsa-miR-1977, Homo sapiens miR-1977).
제 1항의 마이크로어레이 칩을 포함하는 벤조에이안트라센 노출 여부 확인용 키트.
제 2항에 있어서, 인간 간 세포 또는 간암 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센 노출 여부 확인용 키트.
하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나의 마이크로 RNA에 상보적이고, 상기 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 서열번호 1 내지 3으로 기재되는 프라이머를 포함하는 벤조에이안트라센 노출 여부 확인용 키트:
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0002821 (hsa-mir-181d, Homo sapiens miR-181d);
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000257 (hsa-miR-181b, Homo sapiens miR-181b); 및
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000063 (hsa-let-7b, Homo sapiens let-7b).
1) 실험군인 피검개체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 각각 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 RNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 실험군의 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 벤조에이안트라센에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
제 5항에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간의 간 세포 또는 인간 간암 세포인 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
제 6항에 있어서, 상기 인간 간암 세포는 HepG2인 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
제 5항에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 엘-리신-플루오레세인 이소티오시안산염(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-비-이소티오시안산염(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
1) 실험군인 피검개체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
4) 단계 3)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 벤조에이안트라센에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
제 9항에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간의 간 세포 또는 인간 간암 세포인 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
제 10항에 있어서, 상기 인간 간암 세포는 HepG2인 것을 특징으로 하는 벤조에이안트라센에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.