KR101735417B1 - 헥산알 노출 여부 확인용 마이크로 rna 및 이를 이용한 확인 방법 - Google Patents

헥산알 노출 여부 확인용 마이크로 rna 및 이를 이용한 확인 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환경 중에서 노출되는 휘발성 유기 화합물 중의 하나인 헥산알(Hexanal)의 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 구체적으로 헥산알에 의해 발현 변화를 일으키는 특이적인 마이크로 RNA 및 이를 이용하여 헥산알에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오마커는 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 마이크로 RNA이며, 이를 이용하여 헥산알의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 헥산알에 의해 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

Description

헥산알 노출 여부 확인용 마이크로 RNA 및 이를 이용한 확인 방법{MicroRNAs for identification of exposure to hexanal and the method of identification using there of}
본 발명은 헥산알 노출 여부 확인용 마이크로 RNA 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 헥산알 노출에 의해 특이적으로 발현이 변화하는 마이크로 RNA 및 이를 이용한 헥산알에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
최근 들어 유전자 발현을 조절하는 새로운 조절성 RNA의 한 부류로서 마이크로 RNA(miR, miRNA)가 대두되고 있다. 이들 소형(전형적으로 18-24개 뉴클레오티드 길이) 비(非)암호화 RNA 분자는 RNA 분해 촉진, mRNA 번역 저해, 및 유전자 전사에의 영향을 통해 단백질 발현 패턴을 조절할 수 있다. 마이크로 RNA는 표적 유전자의 발현을 억제함으로써 발달 및 분화, 세포 증식 제어, 스트레스 반응, 세포사멸(apoptosis) 등 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 현재 대략 1800개 이상의 인간 마이크로 RNA가 알려져 있으며, 국내외에서 활발하게 연구가 진행되고 있다.
마이크로 RNA는 RNA 폴리머라제 II(pol II) 또는 RNA 폴리머라제 III(pol III; Qi, P. et al . Cell . Mol . Immunol . 3, 411-419, 2006 참조)에 의해 전사되고 개개의 마이크로 RNA 유전자, 단백질 암호화 유전자의 인트론 또는 여러 개인, 밀접하게 관련된 마이크로 RNA를 주로 암호화하는 폴리-시스트론 전사물로부터 유도될 수 있다. RNA pol II 또는 pol III에 의한 miRNA 유전자들의 전사는 일반적으로 수천 염기 길이인 프라이머리 miRNA 전사물(pri-miRNAs)로 불리는, 최초 전사물을 생산한다. 핵에서, pri-miRNAs는 RNAse, 드로샤(Drosha)에 의해 가공되어, 70- 내지 100-뉴클레오티드 헤어핀-모양 전구체(pre-miRNAs)를 생산한다. 세포질로 운반된 후, 헤어핀 pre-miRNA는 이중-가닥 miRNA를 생산하기 위해 다이서에 의해 추가로 가공된다. 성숙한 miRNA 가닥은 RNA-유도 침묵 복합체(RISC) 속에 혼합되어, 여기서 성숙한 miRNA는 염기쌍 상보성에 의해 이의 표적 mRNAs와 결합한다. MiRNA 염기쌍들이 mRNA 표적과 완벽하게 일치하는 비교적으로 드문 경우, 이것이 mRNA 분해를 촉진한다. 더욱 일반적으로, miRNAs는 표적 mRNAs와 불완전한 이형 이중가닥을 형성하여 mRNA 번역에 영향을 준다.
마이크로 RNA 메커니즘은 암 발병, 세포 노화, 장기의 성장 등에 중요한 영향을 미치고 있으며, 이에 따라 마이크로 RNA 관련 연구는 암 발생, 노화 등의 생명현상 인과 관계 규명에 중추적 역할을 할 뿐만 아니라, 향후 발생 및 분화나 줄기세포를 이용한 세포치료제 개발 등의 연구에도 적용시킬 수 있는 우리나라 바이오 연구의 핵심 분야로 자리 잡을 수 있을 것으로 예상된다. 따라서, 마이크로 RNA 마커의 발굴은 암을 포함하여 질병의 조기 진단 가능성을 예측하는 데에 많은 도움을 줄 것이라는 점에서 의의가 있다.
뿐만 아니라 마이크로 RNA 마커는 환경성 질환이 가파르게 증가하고 있는 상황에서 특정 환경유해물질의 노출 예측에도 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 사료된다. 지금까지는 환경유해물질의 노출에 따른 유전자(mRNA)의 변화 양상과 그에 따른 질병과의 연관성에 관련된 연구가 주로 진행되었으나 최근 마이크로 RNA와의 연관성에 대한 관심이 증가함에 따라 benzene(벤젠), arsenic(비소) 또는 RDX와 같은 유해물질의 노출에 따른 마이크로 RNA의 발현 변화를 관찰하였으며 특이적으로 발현이 변화하는 마이크로 RNA와 그 표적 유전자를 유해물질에 대한 마커로 제시하였다(A. Baccarelli & V. Bollati , Curr Opin Pediatr . 21, 243-251, 2009 참조). 또한 발굴된 마이크로 RNA는 노출 예측을 위한 마커로서 뿐만 아니라 표적 유전자의 발현을 조절하는 조절자로서 환경유해물질에 의한 독성 기작 예측을 위한 마커로서도 유용하게 쓰일 수 있다. 이렇듯 마이크로 RNA 마커의 환경유해물질 노출 및 독성기작 예측에서의 역할이 매우 중요하다고 할 수 있음에도 불구하고 현재 마이크로 RNA 관련 연구는 주로 질병 진단용 마커 발굴에 국한되어 있으며 다양한 환경 중에 노출 가능성이 매우 큰 휘발성 유기 화합물류와 같은 유해물질 노출에 의한 마이크로 RNA의 발현 변화에 대한 연구는 부족하다. 또한, 후성 유전학적 변화는 유전자의 발현과 같은 유전학적 변화의 다양성에 비해 그 정도가 심하지 않게 때문에 다수의 마커가 필요한 유전자 발현 프로파일링에 비해서 단 하나의 마이크로 RNA나 DNA 메틸레이션과 같은 epigenetic 마커로도 질병이나 유해물질 노출을 초기에 진단할 수 있다는 장점뿐만 아니라 비침습적 방법으로 진단할 수 있다는 이점이 있다. 각 마이크로 RNA가 다양한 표적 유전자들을 조절하고 고등 진핵생물에서는 천여 개의 마이크로 RNA가 존재하기 때문에 마이크로 RNA에 의해 조절될 수 있는 잠재적인 회로가 막대할 것이라고 예상하고 있다.
헥산알은 대표적인 휘발성 유기 화합물류인 알데하이드류 중의 하나이다. 알데하이드는 대부분 호흡을 통하여 노출되며, 호흡을 통한 노출은 혈관을 통해 빠른 속도로 온몸에 전해지게 된다. 알데하이드류 중에서도 헥산알은 호흡기의 상부기도 및 점막은 물론 눈과 피부 조직에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있으며, 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD) 및 폐암 환자의 진단용 마커로 사용될 만큼 폐질환과 밀접한 관련이 있는 물질로 보고되어 있다. 혈류를 타고 흐르는 휘발성 유기화합물은 폐포막의 확산현상에 의해 폐에 영향을 미치게 되며, 헥산(hexane), 메틸펜탄(methylpentan), 이소프로펜(isopropene), 벤젠(benzene) 등은 질환의 마커로 사용되고 있으며(J Vet Sci 5(1):11-18, 2004), 최근 날숨 테스트(exhaled breath analysis)를 통해 포집된 물질의 휘발성 유기화합물류 분석 결과로부터 간단한 폐암 진단법이 개발되어 이용되고 있다. 휘발성 유기화합물류 중 알데하이드류(Aldehydes)는 폐암질환자들에게 나타나는 대표적 물질로 보고되고 있다(J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 878(27):2643-2651, 2010). 따라서, 헥산알 등의 알데히드류 특이적 바이오마커 발굴은 폐 질환 및 헥산알의 환경 중 노출을 스크리닝하는데 활용될 수 있다.
또한 휘발성 유기 화합물류인 알데하이드류의 인체 독성 정도와 유전자 발현 변화에 대한 연구는 일부 보고되고 있지만, 대표적인 알데하이드로 알려진 포름알데하이드, 아세트알데하이드(Formaldehyde, Acetaldehyde)등에 대한 연구에 거의 국한되어 있다. 이처럼 헥산알의 인간에 대한 잠재적 위해성에도 불구하고 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 DNA 마이크로어레이 칩 또는 프라이머(primer)를 사용하는 실시간(real time) PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 등으로 보다 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법이 가능해졌다. 이러한 분석 방법을 이용한 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용, 특히 암을 비롯한 다양한 질병 유발에 관여하는 마이크로 RNA 발현 변화 여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 헥산알의 인체 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.
1997년 처음으로 마이크로 RNA가 밝혀진 이래 포유류, 미생물 등 여러 종의 마이크로 RNA가 급속도로 밝혀져 Sanger miRBASE database, miRDB, miRNA Target database등 여러 종류의 데이터베이스에 등록되어 있다. 이렇게 밝혀진 마이크로 RNA 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 오믹스(Omics) 기반의 연구가 활발히 이루어지고 있다. 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M. et al . Proc. Natl . Acad . Sci . USA 93, 10614-10619, 1996).
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et. al. J. Am. Acad. Dermatol. 51, 681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 시각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있으며, Agilent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et . al . J. Am . Acad . Dermatol . 51, 681-692, 2004).
유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 마이크로 RNA를 얻어 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 마이크로 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화한다.
마이크로어레이를 통해 유전자 발현을 측정하는 방법으로는 크게 two-dye 방식과 one-dye 방식이 있다. 상보결합 반응을 측정할 때, 대조군 시료와 실험군 시료에 각각 두 개의 다른 형광(예: Cye3 및 Cye5)으로 표지한 후 microarray에서 반응시켜 측정하는 방식을 two-dye microarray 라고 하고, 두 샘플에 동일한 형광을 입힌 후 두 개의 서로 다른 microarray에서 반응시켜 측정하는 방식을 one-dye microarray 라고 한다(Vivian, G. et al . Nature 21, 15-19, 1999).
최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯해 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 마이크로 RNA들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 마이크로 RNA의 발현 빈도를 분석함으로써 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해 작용과 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성을 유발하는 물질의 검색 및 확인이 가능하게 될 것이다.
이에, 본 발명자들은 랫트 마이크로 RNA 약 719개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 헥산알의 마이크로 RNA 발현 프로파일을 실제 헥산알을 노출시킨 랫트의 폐 조직으로부터 헥산알의 노출에 의해 특이적으로 발현이 변화되는 마이크로 RNA를 발굴하고 헥산알 노출 시 마이크로 RNA 발현 여부를 검출할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 노출 여부를 확인하는 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 헥산알의 노출에 의해 특이적으로 발현이 변화되는 마이크로 RNA 및 상기 바이오마커를 이용한 헥산알에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헥산알 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 헥산알 노출 여부 확인용 마이크로 RNA 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 헥산알에 대한 노출 여부 확인용 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 헥산알에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 헥산알에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 검색 키트를 제공한다.
본 발명의 헥산알(Hexanal) 노출에 대한 마이크로 RNA　발현 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법은 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 마이크로 RNA들을 바이오마커로 이용하여 헥산알의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하며, 헥산알에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.
도 1은 마이크로어레이 칩을 이용하여 헥산알을 노출시킨 Fischer 344(SD계통) 랫트 폐 조직의 전체 마이크로 RNA 발현 양상을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 세 가지 헥산알 노출 농도에 의해 공통적으로 발현이 변화하는 56종의 마이크로 RNA의 발현 양상을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 헥산알 노출에 의해 발현이 변화한 마이크로 RNA를 마이크로어레이 칩과 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 사용하여 대조군 대비하여 발현 증감을 비교한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 헥산알(Hexanal)의 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 헥산알(Hexanal) 특이적 노출 여부 확인용 마이크로 RNA 바이오마커를 제공한다.
상기 바이오마커는 헥산알 노출에 의해 1.3배 이상 발현이 증가 또는 감소한 마이크로 RNA로 구성되어 있다.
본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 제공한다:
마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000838(rno-miR-132-3p, Rattus norvegicus miR 132-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017369(rno-miR-667-5p,Rattus norvegicus miR 667-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003119(rno-miR-224-5p,Rattus norvegicus miR 224-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017878(rno-miR-3585-5p,Rattus norvegicus miR 3585-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0004726(rno-miR-101a-5p,Rattus norvegicus miR 101a-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003201(rno-miR-382-5p,Rattus norvegicus miR 382-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000861(rno-miR-184,Rattus norvegicus miR 184), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017139(rno-miR-181b-1-3p,Rattus norvegicus miR 181b-1-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012846(rno-miR-201-5p,Rattus norvegicus miR 201-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003198(rno-miR-376a-3p,Rattus norvegicusmiR 376a-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000855 (rno-miR-153-3p,Rattus norvegicus miR 153-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0024851(rno-miR-1306-5p,Rattus norvegicus miR 1306-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000901(rno-miR-299a-5p,Rattus norvegicus miR 299a-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000561(rno-miR-327,Rattus norvegicus miR 327), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017872 (rno-miR-3582,Rattus norvegicus miR 3582), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0024845(rno-miR-3068-5p,Rattus norvegicus miR 3068-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017028(rno-miR-326-5p,Rattus norvegicus miR 326-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017892(rno-miR-1249,Rattus norvegicus miR 1249), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0005312(rno-miR-411-5p,Rattus norvegicus miR 411-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000896(rno-miR-292-5p,Rattus norvegicus miR 292-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017848(rno-miR-3568,Rattus norvegicus miR 3568), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003177(rno-miR-541-5p,Rattus norvegicus miR 541-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000587(rno-miR-341,Rattus norvegicus miR 341), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017175(rno-miR-421-3p,Rattus norvegicus miR 421-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017304(rno-miR-411-3p,Rattus norvegicus miR 411-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000865(rno-miR-190a-5p,Rattus norvegicus miR 190a-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017229(rno-miR-664-2-5p,Rattus norvegicus miR 664-2-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0001626(rno-miR-431,Rattus norvegicus miR 431), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003199(rno-miR-381-3p,Rattus norvegicus miR 381-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017898(rno-miR-3594-5p,Rattus norvegicus miR 3594-5p), 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0017855(rno-miR-1188-3p,Rattus norvegicus miR 1188-3p), 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003194(rno-miR-376c-3p,Rattus norvegicus miR 376c-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000577(rno-miR-337-3p,Rattus norvegicus miR 337-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012857(rno-miR-678,Rattus norvegicus miR 678), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012827(rno-miR-1224,Rattus norvegicus miR 1224), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025054(rno-miR-6317,Rattus norvegicus miR 6317), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0024848(rno-miR-1843-3p,Rattus norvegicus miR 1843-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017151(rno-miR-200a-5p,Rattus norvegicus miR 200a-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017192(rno-miR-433-5p,Rattus norvegicus miR 433-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0004717(rno-miR-29b-2-5p,Rattus norvegicus miR 29b-2-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0005301(rno-miR-188-5p,Rattus norvegicus miR 188-5p), 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0017306(rno-miR-425-3p,Rattus norvegicus miR 425-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003121(rno-miR-483-3p,Rattus norvegicus miR 483-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025073(rno-miR-6332,Rattus norvegicus miR 6332), 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000780(rno-miR-7b,Rattus norvegicus miR 7b), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017163(rno-miR-221-5p,Rattus norvegicus miR 221-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017904(rno-miR-328b-3p,Rattus norvegicus miR 328b-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017131(rno-miR-145-3p,Rattus norvegicus miR 145-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017807(rno-miR-3549,Rattus norvegicus miR 3549), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017089(rno-let-7f-1-3p,Rattus norvegicus let 7f-1-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0004733(rno-miR-136-3p,Rattus norvegicus miR 136-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017201(rno-miR-483-5p,Rattus norvegicus miR 483-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025051(rno-miR-3102,Rattus norvegicus miR 3102), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025050(rno-miR-6315,Rattus norvegicus miR 6315), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000887(rno-miR-217-5p,Rattus norvegicus miR 217-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025057(rno-miR-3075,Rattus norvegicus miR 3075).
본 발명자들은 헥산알의 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 기존에 확립한 in vivo 실험 기법을 기반으로 헥산알의 흡입 노출 실험을 수행하였다. 헥산알 노출 농도는 기존 문헌에서 보고된 알데하이드를 이용한 랫트 모델 노출 실험 결과와 헥산알의 물리화학적 특성에 의한 포화농도, 가스 발생기의 특징 등을 고려하여 선정하였으며(표 1), 노출 방법은 비부-노출 흡입 장치(Nose-only inhalation chamber)를 사용하여 1일 1회, 회당 약 4시간, 5주 동안 흡입시켰다. 대조군 물질은 filtered clean air를 사용하였다.
물질명 그룹명 노출 농도(ppm)

헥산알
(Hexanal)
 대조군 0
실험군(저농도) 600
실험군(중농도) 1000
실험군(고농도) 1500
이후 상기 농도로 헥산알을 노출시켜 대조군과 실험군 랫트의 폐 조직으로부터 마이크로 RNA를 포함하는 total RNA를 분리하여 형광물질(Cy3)로 표지하였다. 상기 형광 표지된 마이크로 RNA를 Agilent사의 Rat miRNA array v19.0(8 x 15k)(Agilent, USA)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 마이크로 RNA 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 1 참조). 마이크로 RNA 발현 양상을 분석한 결과, 발현이 1.3배 이상 변화된 마이크로 RNA 338종을 선별하였다. 이들 중, 발현이 1.3배 이상 증가된 마이크로 RNA가 22종, 감소된 마이크로 RNA가 316종으로 총 338종이었으며 노출 농도별 발현 변화한 마이크로 RNA는 아래 표와 같다(표 2). 저농도 처리군에서는 86종(1종 발현 증가, 85종 발현 감소)의 마이크로 RNA, 중농도 처리군에서는 86종(18종 발현 증가, 68종 발현 감소)의 마이크로 RNA, 고농도 처리군에서는 166종(3종 발현 증가, 163종 발현 감소)의 마이크로 RNA가 헥산알 노출에 의해 발현이 변화한 것을 확인할 수 있었다. 이들 마이크로 RNA들은 헥산알의 노출 시 독성과 관련되어 있다는 보고는 없다.
랫트 모델에서 헥산알 노출에 의해 발현이 변화하는 마이크로 RNA 수
Up-regulated
마이크로 RNA		 Down-regulated
마이크로 RNA		 Total
마이크로 RNA
저농도 1 85 86
중농도 18 68 86
고농도 3 163 166
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 마이크로 RNA 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보 가닥 분자가 합성/집적된 헥산알에 특이적인 노출 여부 확인용 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000838(rno-miR-132-3p, Rattus norvegicus miR 132-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017369(rno-miR-667-5p,Rattus norvegicus miR 667-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003119(rno-miR-224-5p,Rattus norvegicus miR 224-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017878(rno-miR-3585-5p,Rattus norvegicus miR 3585-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0004726(rno-miR-101a-5p,Rattus norvegicus miR 101a-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003201(rno-miR-382-5p,Rattus norvegicus miR 382-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) IMAT0000861(rno-miR-184,Rattus norvegicus miR 184), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017139(rno-miR-181b-1-3p,Rattus norvegicus miR 181b-1-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012846(rno-miR-201-5p,Rattus norvegicus miR 201-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003198(rno-miR-376a-3p,Rattus norvegicus miR 376a-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000855(rno-miR-153-3p,Rattus norvegicus miR 153-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0024851(rno-miR-1306-5p,Rattus norvegicus miR 1306-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000901(rno-miR-299a-5p,Rattus norvegicus miR 299a-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000561(rno-miR-327,Rattus norvegicus miR 327), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017872(rno-miR-3582,Rattus norvegicus miR 3582), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0024845(rno-miR-3068-5p,Rattus norvegicus miR 3068-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017028(rno-miR-326-5p,Rattus norvegicus miR 326-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017892(rno-miR-1249,Rattus norvegicus miR 1249), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0005312(rno-miR-411-5p,Rattus norvegicus miR 411-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000896(rno-miR-292-5p,Rattus norvegicus miR 292-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017848(rno-miR-3568,Rattus norvegicus miR 3568), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003177(rno-miR-541-5p,Rattus norvegicus miR 541-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000587(rno-miR-341,Rattus norvegicus miR 341), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017175(rno-miR-421-3p,Rattus norvegicus miR 421-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017304(rno-miR-411-3p,Rattus norvegicus miR 411-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000865(rno-miR-190a-5p,Rattus norvegicus miR 190a-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017229(rno-miR-664-2-5p,Rattus norvegicus miR 664-2-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0001626(rno-miR-431,Rattus norvegicus miR 431), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003199(rno-miR-381-3p,Rattus norvegicus miR 381-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017898(rno-miR-3594-5p,Rattus norvegicus miR 3594-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017855(rno-miR-1188-3p,Rattus norvegicus miR 1188-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003194(rno-miR-376c-3p,Rattus norvegicus miR 376c-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000577(rno-miR-337-3p,Rattus norvegicus miR 337-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012857(rno-miR-678,Rattus norvegicus miR 678), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012827(rno-miR-1224,Rattus norvegicus miR 1224), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025054(rno-miR-6317,Rattus norvegicus miR 6317), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0024848(rno-miR-1843-3p,Rattus norvegicus miR 1843-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017151(rno-miR-200a-5p,Rattus norvegicus miR 200a-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017192(rno-miR-433-5p,Rattus norvegicus miR 433-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0004717(rno-miR-29b-2-5p,Rattus norvegicus miR 29b-2-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0005301(rno-miR-188-5p,Rattus norvegicus miR 188-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017306(rno-miR-425-3p,Rattus norvegicus miR 425-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003121(rno-miR-483-3p,Rattus norvegicus miR 483-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025073(rno-miR-6332,Rattus norvegicus miR 6332), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000780(rno-miR-7b,Rattus norvegicus miR 7b), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017163(rno-miR-221-5p,Rattus norvegicus miR 221-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017904(rno-miR-328b-3p,Rattus norvegicus miR 328b-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017131(rno-miR-145-3p,Rattus norvegicus miR 145-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017807(rno-miR-3549,Rattus norvegicus miR 3549), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017089(rno-let-7f-1-3p,Rattus norvegicus let 7f-1-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0004733(rno-miR-136-3p,Rattus norvegicus miR 136-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017201(rno-miR-483-5p,Rattus norvegicus miR 483-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025051(rno-miR-3102,Rattus norvegicus miR 3102), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025050(rno-miR-6315,Rattus norvegicus miR 6315), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000887(rno-miR-217-5p,Rattus norvegicus miR 217-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025057(rno-miR-3075,Rattus norvegicus miR 3075).
본 발명의 헥산알 검색용 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 마이크로 RNA 분자로 이용하여 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 ink-jet 방식 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 SurePrint inkjet micro dropping 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 에폭시(epoxy), 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 에폭시가 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 헥산알의 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 헥산알의 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법을 제공한다:
1) 헥산알을 노출시킨 실험군 및 정상 대조군의 체세포에서 마이크로 RNA를 포함하는 total RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 각각의 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 RNA를 상기 마이크로 RNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 본 발명의 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 헥산알에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 체세포는 인간 폐세포 또는 인간 폐암세포, 또는 폐조직인 것이 바람직하며, 상기 폐 조직은 Fischer 344(SD계통) 랫트를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 랫트 폐 조직이라면 모두 사용 가능하다.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 3)의 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩은 Agilent사의 Rat miRNA array v19.0(8 x 15k)(Agilent, USA)등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 랫트 마이크로 RNA 중 본 발명에서 상기 공통적으로 발현이 변화된 마이크로 RNA(표 3 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 4)의 분석 방법은 GeneSpring GX 12.6.1 소프트웨어(Agilent, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
또한, 본 발명은,
1) 헥산알을 노출시킨 실험군 및 정상 대조군의 폐 조직에서 마이크로 RNA를 포함하는 total RNA를 분리하는 단계;
2) 상기 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계:
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000861(rno-miR-184,Rattus norvegicus miR 184), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000561(rno-miR-327,Rattus norvegicus miR 327), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017892(rno-miR-1249,Rattus norvegicus miR 1249), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017848(rno-miR-3568,Rattus norvegicus miR 3568), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0001626(rno-miR-431,Rattus norvegicus miR 431), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017898(rno-miR-3594-5p,Rattus norvegicus miR 3594-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017855(rno-miR-1188-3p,Rattus norvegicus miR 1188-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012857(rno-miR-678,Rattus norvegicus miR 678), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012827(rno-miR-1224,Rattus norvegicus miR 1224), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017807(rno-miR-3549,Rattus norvegicus miR 3549); 및
4) 상기 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 헥산알에 대한 노출 여부 확인방법을 제공한다.
상기 단계 2)의 프라이머는 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
따라서, 본 발명의 바이오마커는 헥산알에 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소되므로, 헥산알의 노출을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있다.
랫트 모델에서 세 가지 농도(저농도, 중농도, 고농도)의 헥산알 노출에 의해 공통적으로 발현 변화를 보이는 마이크로 RNA
Accession No . Systematic Name Fold change
Low dose Middle dose High dose
MIMAT0000838 rno-miR-132-3p 2.26 3.02 1.85
MIMAT0017369 rno-miR-667-5p 0.13 0.3 0.13
MIMAT0003119 rno-miR-224-5p 0.33 0.27 0.08
MIMAT0017878 rno-miR-3585-5p 0.56 0.43 0.25
MIMAT0004726 rno-miR-101a-5p 0.41 0.49 0.39
MIMAT0003201 rno-miR-382-5p 0.5 0.5 0.5
MIMAT0000861 rno-miR-184 0.34 0.34 0.34
MIMAT0017139 rno-miR-181b-1-3p 0.43 0.43 0.43
MIMAT0012846 rno-miR-201-5p 0.46 0.35 0.24
MIMAT0003198 rno-miR-376a-3p 0.28 0.28 0.28
MIMAT0000855 rno-miR-153-3p 0.32 0.32 0.32
MIMAT0024851 rno-miR-1306-5p 0.64 0.64 0.64
MIMAT0000901 rno-miR-299a-5p 0.54 0.54 0.54
MIMAT0000561 rno-miR-327 0.47 0.47 0.32
MIMAT0017872 rno-miR-3582 0.24 0.24 0.24
MIMAT0024845 rno-miR-3068-5p 0.28 0.28 0.28
MIMAT0017028 rno-miR-326-5p 0.51 0.51 0.51
MIMAT0017892 rno-miR-1249 0.29 0.26 0.25
MIMAT0005312 rno-miR-411-5p 0.3 0.3 0.3
MIMAT0000896 rno-miR-292-5p 0.73 0.73 0.73
MIMAT0017848 rno-miR-3568 0.72 0.72 0.72
MIMAT0003177 rno-miR-541-5p 0.62 0.62 0.62
MIMAT0000587 rno-miR-341 0.34 0.34 0.34
MIMAT0017175 rno-miR-421-3p 0.48 0.48 0.48
MIMAT0017304 rno-miR-411-3p 0.36 0.36 0.36
MIMAT0000865 rno-miR-190a-5p 0.34 0.11 0.11
MIMAT0017229 rno-miR-664-2-5p 0.25 0.25 0.25
MIMAT0001626 rno-miR-431 0.64 0.64 0.64
MIMAT0003199 rno-miR-381-3p 0.24 0.24 0.24
MIMAT0017898 rno-miR-3594-5p 0.62 0.62 0.62
MIMAT0017855 rno-miR-1188-3p 0.48 0.48 0.48
MIMAT0003194 rno-miR-376c-3p 0.62 0.62 0.62
MIMAT0000577 rno-miR-337-3p 0.29 0.29 0.29
MIMAT0012857 rno-miR-678 0.23 0.33 0.18
MIMAT0012827 rno-miR-1224 0.64 0.63 0.66
MIMAT0025054 rno-miR-6317 0.74 0.74 0.74
MIMAT0024848 rno-miR-1843-3p 0.22 0.2 0.12
MIMAT0017151 rno-miR-200a-5p 0.36 0.36 0.36
MIMAT0017192 rno-miR-433-5p 0.65 0.65 0.65
MIMAT0004717 rno-miR-29b-2-5p 0.68 0.68 0.68
MIMAT0005301 rno-miR-188-5p 0.62 0.6 0.63
MIMAT0017306 rno-miR-425-3p 0.47 0.47 0.47
MIMAT0003121 rno-miR-483-3p 0.44 0.44 0.44
MIMAT0025073 rno-miR-6332 0.35 0.39 0.15
MIMAT0000780 rno-miR-7b 0.44 0.44 0.44
MIMAT0017163 rno-miR-221-5p 0.41 0.41 0.41
MIMAT0017904 rno-miR-328b-3p 0.7 0.7 0.7
MIMAT0017131 rno-miR-145-3p 0.23 0.3 0.11
MIMAT0017807 rno-miR-3549 0.72 0.72 0.72
MIMAT0017089 rno-let-7f-1-3p 0.75 0.75 0.75
MIMAT0004733 rno-miR-136-3p 0.27 0.27 0.27
MIMAT0017201 rno-miR-483-5p 0.63 0.58 0.54
MIMAT0025051 rno-miR-3102 0.39 0.44 0.3
MIMAT0025050 rno-miR-6315 0.23 0.23 0.23
MIMAT0000887 rno-miR-217-5p 0.68 0.68 0.68
MIMAT0025057 rno-miR-3075 0.45 0.45 0.45
또한, 본 발명은 헥산알 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 헥산알 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 확인용 키트에 추가적으로 랫트 폐 조직을 포함하는 헥산알 노출에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 키트를 제공한다. 상기 랫트 폐 조직은 Fischer344(SD 계통) 랫트의 폐 조직이며 대조군과 실험군 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3를 사용하였다.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에서 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 동물 모델 선정 및 화학물질 노출
<1-1> 랫트 모델 선정 및 화학 물질 처리
본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 헥산알 노출 실험을 위한 적정 동물 모델로 Fischer 344(SD계통) 랫트를 선정하였으며, 기존 문헌에서 보고된 알데하이드를 이용한 랫트 모델 노출 실험 결과와 헥산알의 물리화학적 특성에 의한 포화농도, 가스 발생기의 특징을 고려하여 노출 농도를 600ppm, 1000ppm, 1,500ppm으로 선정하였다. 노출 방법은 비부노출 흡입 장치(Nose-only inhalation chamber)를 사용한 반복 흡입 방식을 선택하여 5주 동안 흡입시켰다. 대조물질은 filtered clean air를 사용하여 1일 1회, 회당 약 4시간 노출하였으며, 시험 물질인 헥산알 또한 1일 1회, 회당 약 4시간, 총 20회 노출시켰다.
<1-2> 폐 조직 시료 수득
랫트에서 적출된 폐 조직을 중량 측정한 후, RNA 추출에 적당한 양으로 잘라 cryo tube에 수득하였다. 수득한 폐 조직은 액체 질소를 이용하여 snap frozen한 후 -80℃에서 보관하였다.
< 실시예 2> 마이크로어레이 실험
<2-1> 표적 마이크로 RNA 의 분리 및 형광 물질 표지
헥산알 노출군과 비노출군의 폐 조직으로부터의 RNA 추출은 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 마이크로 RNA를 포함하는 전체 RNA를 분리하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 농도는 분광광도계인 NanoDrop ND 1000 spectrophotometer(NanoDrop Technologies Inc., USA)를 이용하여 측정하였으며 순도는 Experion(Automated Electrophoresis station, Bio-Rad) 로 확인하였다.
<2-2> 표지된 마이크로 RNA 제조
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 헥산알 노출군 전체 RNA에 형광 물질을 표지하였다. 형광 표지는 Agilent사의 miRNA complete labeling and Hybridization kit를 사용하여 제조사의 방법대로 수행하였다. 상기 수득한 전체 RNA 2μl(100 ng)에 0.4 ul의 10X CIP buffer, 1.1 ul의 nuclease-free water, 0.5 ul의 Calf Intestinal Phosphatase를 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 2.8 ul의 100% DMSO를 첨가하여 100%에서 5~10분간 반응시키고 즉시 ice로 옮겼다. Dye를 붙여주기 위해 1 ul의 10X T4 RNA Ligase buffer, 3 ul의 Cyanine3-pCp, 0.5 ul의 T4 RNA ligase를 넣고 16℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 labeling 된 시료는 Micro Bio-Spin 6 column을 사용하여 정제되었다. 정제된 RNA는 55℃의 vacuum concentrator에서 완전히 말려 18 ul의 nuclease-free water로 녹인 후 4.5 ul의 10X GE Blocking Agent를 넣고 22.5 ul의 2X Hi-RPM Hybridization buffer를 넣어주었으며 준비된 sample은 100℃에서 5분간 반응시키고 즉시 ice로 옮겨 5분간 반응시킨 다음 혼성화 반응에 사용되었다.
<2-3> 혼성화 반응
혼성화 및 세척 과정은 (주)이바이오젠의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 20시간 동안 55℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로는 Rat miRNA array v19.0(8 x 15k)(Agilent, USA)를 이용하였다.
<2-4> 형광 이미지 획득 및 유전자 선별
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Agilent C scanner(Agilent technologies, USA)로 스캔하였으며 추출된 데이터는 Agilent GeneSpring GX 12.6.1(Agilent technologies)를 이용하여 normalization을 거쳐 각 마이크로 RNA의 발현양상을 분석하였다.
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 719 개의 마이크로 RNA 중에서 대조군에 비해 헥산알 노출군 그룹에서 유의하게 발현 변이를 나타낸 마이크로 RNA들을 GeneSpring GX 12.6.1 software를 사용하여 대조군과 실험군의 마이크로 RNA발현 양상을 분석한 결과, 발현이 1.3배 이상 증가된 마이크로 RNA가 22종, 감소된 마이크로 RNA가 316종으로 총 338종이었다(표 2 및 도 1). 이들 마이크로 RNA들은 헥산알의 인체노출 시 독성과 관련되어 있다는 보고는 없다. 저농도 처리군에서는 86종(1종 발현 증가 , 85종 발현 감소)의 마이크로RNA, 중농도 처리군에서는 86종(18종 발현 증가, 68종 발현 감소)의 마이크로 RNA, 고농도 처리군에서는 166종(3종 발현 증가 , 163종 발현 감소)의 마이크로 RNA가 헥산알 노출에 의해 발현이 변화한 것을 확인할 수 있었다(표 2).
위의 마이크로 RNA 발현 데이터를 통해 세 가지 농도의 헥산알 처리군에서 공통적으로 발현 변화를 보이는 56종(1종 발현 증가, 55종 발현 감소)의 마이크로 RNA를 선별하였다(도 2 및 표 3). 아울러, 상기 유전자는 본 발명에서 사용한 헥산알을 처리했을 때, 랫트의 폐 조직에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없었다.
< 실시예 3> 실시간 RT -PCR( Real - time reverse transcriptase polymerase chain reaction) 정량 확인
상기 마이크로어레이 결과로부터 헥산알의 세 가지 노출 농도에 의해 공통적으로 발현이 변화된 상기 <실시예 2> 유전자 중 10종의 유전자 [마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000861(rno-miR-184,Rattus norvegicus miR 184), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000561(rno-miR-327,Rattus norvegicus miR 327), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017892(rno-miR-1249,Rattus norvegicus miR 1249), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017848(rno-miR-3568,Rattus norvegicus miR 3568), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0001626(rno-miR-431,Rattus norvegicus miR 431), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017898(rno-miR-3594-5p,Rattus norvegicus miR 3594-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017855(rno-miR-1188-3p,Rattus norvegicus miR 1188-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012857(rno-miR-678,Rattus norvegicus miR 678), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012827(rno-miR-1224,Rattus norvegicus miR 1224), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017807(rno-miR-3549,Rattus norvegicus miR 3549)]의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR)(Bio-rad, 미국)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 전체 RNA와 miScript RT kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 제조사의 방법대로 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA 를 miScript SYBR Green PCR kit(Qiagen, 미국)를 이용하여 하기 <표 4>와 같이 시약을 혼합한 후, PCR 튜브에 담아 단계 1: 95℃, 15분; 단계 2(40회 반복): 단계 2-1: 94℃, 15초; 단계 2-2: 55℃, 30초; 단계 2-3: 70℃, 30초로 프로그램을 설계한 My IQ 실시간 PCR 기계에서 반응을 수행하였다. PCR 산물을 정량하기 위하여 사이버그린(SYBR Green)으로 염색하였다. 사이버그린 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저 PCR에 이용한 표적 유전자와 내재성(endogenous) 대조군(RNU6B)에 대한 프라이머를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 각각의 프라이머(표 5)를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다.
Component Volume(㎕) per reaction
cDNA 0.2
Nuclease free water 3.8
10 X miScript Universal primer 1
miScript primer(Target primer) 1
SYBR PCR Master Mix 5
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000861(rno-miR-184,Rattus norvegicus miR 184), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000561(rno-miR-327,Rattus norvegicus miR 327), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017892(rno-miR-1249,Rattus norvegicus miR 1249), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017848(rno-miR-3568,Rattus norvegicus miR 3568), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0001626(rno-miR-431,Rattus norvegicus miR 431), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017898(rno-miR-3594-5p,Rattus norvegicus miR 3594-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017855(rno-miR-1188-3p,Rattus norvegicus miR 1188-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012857(rno-miR-678,Rattus norvegicus miR 678), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012827(rno-miR-1224,Rattus norvegicus miR 1224) 및 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017807(rno-miR-3549,Rattus norvegicus miR 3549)의 발현 양상은 상기 실시예 <2-4>의 마이크로어레이 칩 결과와 매우 유사하게 나타남을 확인하였다(도 3).
Accession No . Systematic Name Mature 마이크로 RNA 프라이머 서열(5'->3')
MIMAT0000861 rno-miR-184 UGGACGGAGAACUGAUAAGGGU
MIMAT0000561 rno-miR-327 CCUUGAGGGGCAUGAGGGU
MIMAT0017892 rno-miR-1249 ACGCCCUUCCCCCCCUUCUUCA
MIMAT0017848 rno-miR-3568 UGUUCUUCCCGUGCAGAAGCAG
MIMAT0001626 rno-miR-431 UGUCUUGCAGGCCGUCAUGCA
MIMAT0017898 rno-miR-3594-5p CCCAGGGCAGAGCAGUGUGAA
MIMAT0017855 rno-miR-1188-3p CGAGGCUCCCCACCACA
MIMAT0012857 rno-miR-678 GUCUCGGGGCAAGGACUGGAGG
MIMAT0012827 rno-miR-1224 GUGAGGACUGGGGAGGUGGAG
MIMAT0017807 rno-miR-3549 AUCUUGCCCGCAAAGACCC
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> MicroRNAs for identification of exposure to hexanal and the method of identification using there of <130> 2014P-11-013 <160> 56 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-132-3p <400> 1 uaacagucua cagccauggu cg 22 <210> 2 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-667-5p <400> 2 cggugcuggu ggagcaguga gcac 24 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-3585-5p <400> 3 caagucacua gugguuccgu uu 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-3585-5p <400> 4 uucacaagaa ggugucuuuc au 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-101a-5p <400> 5 ucaguuauca cagugcugau gc 22 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-382-5p <400> 6 gaaguuguuc gugguggauu cg 22 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-184 <400> 7 uggacggaga acugauaagg gu 22 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-181b-1-3p <400> 8 cucacugaac aaugaaugca a 21 <210> 9 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-201-5p <400> 9 cacucaguaa ggcauuguuc 20 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-376a-3p <400> 10 aucguagagg aaaauccacg u 21 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-153-3p <400> 11 uugcauaguc acaaaaguga uc 22 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-1306-5p <400> 12 ccaccucccc ugcaaacguc ca 22 <210> 13 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-299a-5p <400> 13 ugguuuaccg ucccacauac au 22 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-327 <400> 14 ccuugagggg caugagggu 19 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-133c <400> 15 cagcugguug aaggggacca a 21 <210> 16 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-3068-5p <400> 16 uuggaguuca ugcaaguucu aacca 25 <210> 17 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-326-5p <400> 17 gggggcaggg ccuuugugaa 20 <210> 18 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-1249 <400> 18 acgcccuucc cccccuucuu ca 22 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-411-5p <400> 19 uaguagaccg uauagcguac g 21 <210> 20 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-292-5p <400> 20 acucaaacug ggggcucuuu ug 22 <210> 21 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-3568 <400> 21 uguucuuccc gugcagaagc ag 22 <210> 22 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-541-5p <400> 22 aagggauucu gauguugguc acacu 25 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-341 <400> 23 ucggucgauc ggucggucgg u 21 <210> 24 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-421-3p <400> 24 aucaacagac auuaauuggg 20 <210> 25 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-411-3p <400> 25 uauguaacac gguccacuaa 20 <210> 26 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-190a-5p <400> 26 ugauauguuu gauauauuag gu 22 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-664-2-5p <400> 27 cuggcugggg aaaaugauug g 21 <210> 28 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-431 <400> 28 ugucuugcag gccgucaugc a 21 <210> 29 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-381-3p <400> 29 uauacaaggg caagcucu 18 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-3594-5p <400> 30 cccagggcag agcaguguga a 21 <210> 31 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-1188-3p <400> 31 cgaggcuccc caccaca 17 <210> 32 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-376c-3p <400> 32 aacauagagg aaauuucacg u 21 <210> 33 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-337-3p <400> 33 uucagcuccu auaugaugcc uuu 23 <210> 34 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-678 <400> 34 gucucggggc aaggacugga gg 22 <210> 35 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-1224 <400> 35 gugaggacug gggaggugga g 21 <210> 36 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-6317 <400> 36 gugaaccuga gagaaaggcu c 21 <210> 37 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-1843a-3p <400> 37 ucugaucguu caccuccaua ca 22 <210> 38 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-200a-5p <400> 38 caucuuaccg gacagugcug g 21 <210> 39 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-433-5p <400> 39 uacggugagc cugucauuau uc 22 <210> 40 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-29b-5p <400> 40 cugguuucac augguggcuu ag 22 <210> 41 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-188-5p <400> 41 caucccuugc augguggagg g 21 <210> 42 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-425-3p <400> 42 aucgggaaua ucguguccgc c 21 <210> 43 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-483-3p <400> 43 cacuccuccc cucccgucuu gu 22 <210> 44 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-6332 <400> 44 cgcagggacu gcaaggagcc gca 23 <210> 45 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-7b <400> 45 uggaagacuu gugauuuugu ugu 23 <210> 46 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-221-5p <400> 46 accuggcaua caauguagau uuc 23 <210> 47 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-328b-3p <400> 47 cuggcccucu cugcccua 18 <210> 48 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-145-3p <400> 48 ggauuccugg aaauacuguu c 21 <210> 49 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-3549 <400> 49 aucuugcccg caaagaccc 19 <210> 50 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-let-7f-1-3p <400> 50 cuauacaauc uauugccuuc c 21 <210> 51 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-136-3p <400> 51 caucaucguc ucaaaugagu cu 22 <210> 52 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-483-5p <400> 52 aagacgggag aagagaaggg ag 22 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-3102 <400> 53 cucuacuccc ugccccagcc a 21 <210> 54 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-6315 <400> 54 ucuggacagg acaggcccug agc 23 <210> 55 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-217-5p <400> 55 uacugcauca ggaacugacu gg 22 <210> 56 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rno-miR-3075 <400> 56 ugucugggag cagccaagga caag 24

Claims (10)

  1. 하기 모든 마이크로 RNA 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 헥산알 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩:
    마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000838(rno-miR-132-3p, Rattus norvegicus miR 132-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017369(rno-miR-667-5p,Rattus norvegicus miR 667-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003119(rno-miR-224-5p,Rattus norvegicus miR 224-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017878(rno-miR-3585-5p,Rattus norvegicus miR 3585-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0004726(rno-miR-101a-5p,Rattus norvegicus miR 101a-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003201(rno-miR-382-5p,Rattus norvegicus miR 382-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000861(rno-miR-184,Rattus norvegicus miR 184), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017139(rno-miR-181b-1-3p,Rattus norvegicus miR 181b-1-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012846(rno-miR-201-5p,Rattus norvegicus miR 201-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003198(rno-miR-376a-3p,Rattus norvegicus miR 376a-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000855(rno-miR-153-3p,Rattus norvegicus miR 153-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0024851(rno-miR-1306-5p,Rattus norvegicus miR 1306-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000901(rno-miR-299a-5p,Rattus norvegicus miR 299a-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000561(rno-miR-327,Rattus norvegicus miR 327), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017872(rno-miR-3582,Rattus norvegicus miR 3582), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0024845 (rno-miR-3068-5p,Rattus norvegicus miR 3068-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017028(rno-miR-326-5p,Rattus norvegicus miR 326-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017892(rno-miR-1249,Rattus norvegicus miR 1249), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0005312(rno-miR-411-5p,Rattus norvegicus miR 411-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000896(rno-miR-292-5p,Rattus norvegicus miR 292-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017848(rno-miR-3568,Rattus norvegicus miR 3568), 마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003177(rno-miR-541-5p,Rattus norvegicus miR 541-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000587(rno-miR-341,Rattus norvegicus miR 341), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017175(rno-miR-421-3p,Rattus norvegicus miR 421-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017304(rno-miR-411-3p,Rattus norvegicus miR 411-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000865(rno-miR-190a-5p,Rattus norvegicus miR 190a-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017229(rno-miR-664-2-5p,Rattus norvegicus miR 664-2-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0001626(rno-miR-431,Rattus norvegicus miR 431), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003199(rno-miR-381-3p,Rattus norvegicus miR 381-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017898 (rno-miR-3594-5p,Rattus norvegicus miR 3594-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017855(rno-miR-1188-3p,Rattus norvegicus miR 1188-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003194(rno-miR-376c-3p,Rattus norvegicus miR 376c-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000577(rno-miR-337-3p,Rattus norvegicus miR 337-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012857(rno-miR-678,Rattus norvegicus miR 678), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012827(rno-miR-1224,Rattus norvegicus miR 1224), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025054(rno-miR-6317,Rattus norvegicus miR 6317), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0024848(rno-miR-1843-3p,Rattus norvegicus miR 1843-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017151(rno-miR-200a-5p,Rattus norvegicus miR 200a-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017192(rno-miR-433-5p,Rattus norvegicus miR 433-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0004717(rno-miR-29b-2-5p,Rattus norvegicus miR 29b-2-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0005301(rno-miR-188-5p,Rattus norvegicus miR 188-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017306(rno-miR-425-3p,Rattus norvegicus miR 425-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003121(rno-miR-483-3p,Rattus norvegicus miR 483-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025073(rno-miR-6332,Rattus norvegicus miR 6332), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000780(rno-miR-7b,Rattus norvegicus miR 7b), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017163(rno-miR-221-5p,Rattus norvegicus miR 221-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017904(rno-miR-328b-3p,Rattus norvegicus miR 328b-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017131(rno-miR-145-3p,Rattus norvegicus miR 145-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017807(rno-miR-3549,Rattus norvegicus miR 3549), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017089(rno-let-7f-1-3p,Rattus norvegicus let 7f-1-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0004733(rno-miR-136-3p,Rattus norvegicus miR 136-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017201(rno-miR-483-5p,Rattus norvegicus miR 483-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025051(rno-miR-3102,Rattus norvegicus miR 3102), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025050(rno-miR-6315,Rattus norvegicus miR 6315), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000887(rno-miR-217-5p,Rattus norvegicus miR 217-5p) 및 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0025057(rno-miR-3075,Rattus norvegicus miR 3075).
  2. 1) 헥산알을 노출시킨 실험군 및 정상 대조군의 체세포에서 마이크로 RNA를 포함하는 total RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 각각의 다른 형광물질로 표지하는 단계;
    3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 RNA를 제 1항의 마이크로 RNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
    4) 단계 3)의 반응한 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
    5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이칩에 집적된 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 헥산알 노출 여부 확인 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간 폐세포 또는 인간 폐암세포, 또는 폐조직인 것을 특징으로 하는 헥산알 노출 여부 확인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 폐 조직은 Fischer344(SD계통) 랫트 폐 조직인 것을 특징으로 하는 헥산알 노출 여부 확인 방법.
  5. 제 2항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 헥산알 노출 여부 확인 방법.
  6. 1) 헥산알을 노출시킨 실험군 및 정상 대조군의 체세포에서 마이크로 RNA를 포함하는 total RNA를 분리하는 단계;
    2) 상기 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하는 단계;
    3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계:
    마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000861(rno-miR-184,Rattus norvegicus miR 184), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000561(rno-miR-327,Rattus norvegicus miR 327), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017892(rno-miR-1249,Rattus norvegicus miR 1249), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017848(rno-miR-3568,Rattus norvegicus miR 3568), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0001626(rno-miR-431,Rattus norvegicus miR 431), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017898(rno-miR-3594-5p,Rattus norvegicus miR 3594-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017855(rno-miR-1188-3p,Rattus norvegicus miR 1188-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012857(rno-miR-678,Rattus norvegicus miR 678), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012827(rno-miR-1224,Rattus norvegicus miR 1224) 및 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017807(rno-miR-3549,Rattus norvegicus miR 3549); 및
    4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 헥산알에 대한 노출 여부 확인방법.
  7. 제 1항의 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 헥산알에 대한 노출 여부 확인용 키트.
  8. 제 7항에 있어서, 랫트의 폐 조직을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 헥산알에 대한 노출 여부 확인용 키트.
  9. 제 8항에 있어서, 랫트의 폐 조직은 Fischer 344(SD계통) 랫트인 것을 특징으로 하는 헥산알에 대한 노출 여부 확인용 키트.
  10. 하기 마이크로 RNA에 상보적이고 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 모두 포함하는 헥산알 노출 여부 확인용 키트:
    마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000861(rno-miR-184,Rattus norvegicus miR 184), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000561(rno-miR-327,Rattus norvegicus miR 327), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017892(rno-miR-1249,Rattus norvegicus miR 1249), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017848(rno-miR-3568,Rattus norvegicus miR 3568), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0001626(rno-miR-431,Rattus norvegicus miR 431), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017898(rno-miR-3594-5p,Rattus norvegicus miR 3594-5p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017855(rno-miR-1188-3p,Rattus norvegicus miR 1188-3p), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012857(rno-miR-678,Rattus norvegicus miR 678), 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0012827(rno-miR-1224,Rattus norvegicus miR 1224) 및 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0017807(rno-miR-3549,Rattus norvegicus miR 3549).
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