KR101398547B1

KR101398547B1 - 저급 지방족 포화 알데하이드류 노출 여부 확인용 마이크로 ｒｎａ 및 이를 이용한 확인 방법

Info

Publication number: KR101398547B1
Application number: KR1020120057452A
Authority: KR
Inventors: 류재천; 송미; 윤지성; 류우인; 이효선; 신찬영
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2012-05-30
Filing date: 2012-05-30
Publication date: 2014-05-27
Also published as: KR20130134152A; US20130324429A1; US8716192B2

Abstract

본 발명은 마이크로 RNA를 이용한 저급 지방족 포화 알데하이드류 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저급 지방족 포화 알데하이드류 노출에 의해 발현수준이 1.5배 이상 과발현되는 마이크로 RNA 1종과 0.66배 이하 저발현되는 마이크로 RNA 1종을 선별함으로써, 총 2종의 마이크로 RNA를 바이오마커로 이용하여 저급 지방족 포화 알데하이드류의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하게 사용할 수 있으며, 저급 지방족 포화 알데하이드류에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있음을 알 수 있다.

Description

저급 지방족 포화 알데하이드류 노출 여부 확인용 마이크로 ＲＮＡ 및 이를 이용한 확인 방법{microRNAs for identification of exposure to lower alipatic saturated aldeydes the method of identification using thereof}

본 발명은 저급 지방족 포화 알데하이드류(lower alipatic saturated aldeydes ) 노출 여부 확인용 마이크로 RNA 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 80%의 세포생존율을 보이는 농도로 처리한 알데하이드류에 의해 발현이 변화하는 마이크로 RNA 및 이를 이용한 알데하이드류에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.

최근 수년 동안, 폭넓은 생물학적 과정들에 대해 깊은 영향을 주는 조절성 RNA의 중요한 부류로서 마이크로 RNA(miR, miRNA)가 대두되었다. 이들 소형(전형적으로 18-24개 뉴클레오티드 길이) 비(非)암호화 RNA 분자는 RNA 분해 촉진, mRNA 번역 저해, 및 또한 유전자 전사에 영향을 주어 단백질 발현 패턴을 조절할 수 있다. 마이크로 RNA는 발달 및 분화, 세포 증식 제어, 스트레스 반응 및 대사작용 등의 다양한 과정에서 중심적 역할을 한다. 현재 약 1000여 개의 인간 마이크로 RNA 가 알려져 있다.

마이크로 RNA는 RNA 폴리머라제 Ⅱ(pol Ⅱ) 또는 RNA 폴리머라제 Ⅲ(pol Ⅲ; Qi, P. et al. Cell . Mol . Immunol . 3, 411-419, 2006 참조)에 의해 전사되고 개개의 마이크로 RNA 유전자, 단백질 암호화 유전자의 인트론 또는 여러 개인, 밀접하게 관련된 마이크로 RNA를 주로 암호화하는 폴리-시스트론 전사물로부터 유도될 수 있다. RNA pol II 또는 pol III에 의한 miRNA 유전자들의 전사는 일반적으로 수천 염기 길이인 프라이머리 miRNA 전사물(pri-miRNAs)로 불리는, 최초 전사물을 생산한다. 핵에서, pri-miRNAs는 RNAse, 드로샤(Drosha)에 의해 가공되어, 70- 내지 100-뉴클레오티드 헤어핀-모양 전구체(pre-miRNAs)를 생산한다. 세포질로 운반된 후, 헤어핀 pre-miRNA는 이중-가닥 miRNA를 생산하기 위해 다이서에 의해 추가로 가공된다. 성숙한 miRNA 가닥은 RNA-유도 침묵 복합체(RISC) 속에 혼합되어, 염기쌍 상보성에 의해 이의 표적 mRNAs와 결합한다. miRNA 염기쌍들이 mRNA 표적과 완벽하게 일치하는 비교적으로 드문 경우, 이것이 mRNA 분해를 촉진한다. 더욱 일반적으로, miRNAs는 표적 mRNAs와 불완전한 이형이중가닥을 형성하여 mRNA 번역에 영향을 준다.

마이크로 RNA 메커니즘은 암 발병, 세포 노화, 장기의 성장 등에 중요한 영향을 미치고 있으며, 이에 따라 마이크로 RNA 관련 연구는 암 발생, 노화 등의 생명현상 인과 관계 규명에 중추적 역할을 할 뿐만 아니라, 향후 발생 및 분화나 줄기세포를 이용한 세포치료제 개발 등의 연구에도 적용시킬 수 있어 우리나라 바이오 연구의 핵심 분야로 자리 잡을 수 있을 것으로 예상된다. 따라서, 마이크로 RNA 마커의 발굴은 암을 포함하여 질병의 조기 진단 가능성을 예측하는 데에 많은 도움을 줄 것이라는 점에서 의의가 있다.

뿐만 아니라 마이크로 RNA 마커는 특정 환경유해물질의 노출 예측에도 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 생각되고 있다. 지금까지는 환경유해물질의 노출에 따른 유전자(mRNA)의 변화 양상과 그에 따른 질병과의 연관성에 관련된 연구가 주로 진행되었으나 최근 마이크로 RNA와의 연관성에 대한 관심이 증가함에 따라 몇몇 연구에서 벤젠(benzene), 비소(arsenic) 또는 RDX와 같은 유해물질의 노출에 따른 마이크로 RNA의 발현 변화를 관찰하였으며 특이적으로 발현이 변화하는 마이크로 RNA와 그 표적 유전자를 유해물질에 대한 마커로 제시하였다(Baccarelli, A. & Bollati, V. Curr . Opin. Prediatr . 21, 243-251, 2009 참조). 또한 발굴된 마이크로 RNA는 노출 예측을 위한 마커로서 뿐만 아니라 표적 유전자의 발현을 조절하는 조절자로서 환경유해물질에 의한 독성 기작 예측을 위한 마커로서도 유용하게 쓰일 수 있다. 이렇듯 마이크로 RNA 마커의 환경유해물질 노출 및 독성기작 예측에서의 역할이 매우 중요하다고 할 수 있음에도 불구하고 현재 마이크로 RNA 관련 연구는 주로 질병 진단용 마커 발굴에 국한되어 있으며 다양한 환경 중에 노출 가능성이 있는 알데하이드류와 같은 유해물질 노출에 의한 마이크로 RNA의 발현 변화에 대한 연구는 부족하다. 또한, 후성유전학적 변화는 유전자의 발현과 같은 유전학적 변화의 다양성에 비해 그 정도가 심하지 않게 때문에 다수의 마커가 필요한 유전자 발현 프로파일링에 비해서 단 하나의 마이크로 RNA나 DNA 메틸레이션과 같은 유전자 외적(epigenetic) 마커로도 질병이나 유해물질 노출을 초기에 진단할 수 있다는 장점뿐만 아니라 비침습적 방법으로 진단할 수 있다는 이점이 있다. 각 마이크로 RNA가 다양한 표적 유전자들을 조절하고 고등진핵생물에서는 천여 개의 마이크로 RNA가 존재하기 때문에 마이크로 RNA에 의해 조절될 수 있는 잠재적인 회로가 막대할 것이라고 예상하고 있다.

알데하이드류 중에서도 저급 지방족 포화 알데하이드류(lower aliphatic saturated aldehydes)는 탄소사슬의 길이가 0~9개이며 각 물질마다 자극적인 냄새를 지닌 기체 또는 액체로 물에 녹는다. 이들 중 탄소사슬의 길이가 6∼9개인 알데하이드는 주로 향료로 쓰이며 식품 첨가물, 향수산업 등에서 활용되고 있다. 저급 지방족 포화 알데하이드류의 실내외 농도는 포름알데하이드, 아세트알데하이드를 제외한 다른 8종의 알데하이드의 농도의 경우 규제대상 혹은 위험 물질로 분류되어 있지 않아 조사된 바가 드물다. 몇몇 조사된 바에 따르면 이들 저급 지방족 포화 알데하이드류의 노출수준은 일정하지 않으며, 실내환경의 경우 건물의 상태, 환경조건에 따라 차이가 매우 컸다. 저급 지방족 포화 알데하이드의 단일 물질 규제 현황으로는 전 세계적으로 일본과 대한민국만 시행하고 있으며 단일 물질로써는 프로피온알데하이드, 부틸알데하이드, 펜틸알데하이드 3종의 물질만이 규제되어 있다.

저농도의 저급 지방족 포화 알데하이드에 노출될 경우 안구 자극과 호흡기 자극증상을 보인다. 고농도의 저급 지방족 포화 알데하이드를 흡입하였을 경우에는 호흡기 자극으로 인한 타는듯한 느낌, 구역질, 어지러움, 기침, 가래, 후두염, 두통, 호흡수 증가, 숨막힘 등을 느낄 수 있고 장기적으로 흡입하는 환경에 노출 될 경우 경련, 발작, 기관지염, 폐렴, 후두 부종등을 일으킬 수 있다 (http://toxnet.nlm.nih.gov). 또한, 저급 지방족 포화 알데하이드류의 생체내 기능적인 효과는 핵산과 단백질의 카르보닐화 반응을 일으켜서 변이를 유발하거나 산화반응을 일으켜 세포독성 기작을 유발하는 것으로 알려져 있다(Crit Rev Toxicol 35(7):609-662, 2005).

혈류를 타고 흐르는 휘발성 유기화합물은 폐포막의 확산현상에 의해 폐에 영향을 미치게 되며, 헥산(hexane), 메틸펜탄(methylpentan), 이소프로펜(isopropene), 벤젠(benzene) 등은 질환의 마커로 사용되고 있으며(J Vet Sci 5(1):11-18, 2004), 최근 날숨 테스트(exhaled breath analysis)를 통해 포집된 물질의 휘발성 유기화합물류 분석 결과로부터 간단한 폐암 진단법이 개발되어 이용되고 있다. 휘발성 유기화합물류 중 알데하이드류(Aldehydes)는 폐암질환자들에게 나타나는 대표적 물질로 보고되고 있다(J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 878(27):2643-2651, 2010). 따라서, 저급 지방족 포화알데하이드류 특이적 바이오마커 발굴은 폐질환 및 저급 지방족 포화알데하이드류의 환경 중 노출을 스크리닝하는데 활용될 수 있다. 알데하이드에 노출이 되면 주로 기관지 관련 증상을 보이게 된다. 기침, 가래, 후두염, 구역질, 천식, 어지러움 등을 보이게 되며, 심한 경우 폐렴, 후두부종, 기관지염, 발작 등을 일으킬 수 있다(http://www.toxnet.nlm.nih.gov).

이처럼 저급 지방족 포화 알데하이드류의 인간에 대한 위해성에도 불구하고 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않다. 근래에 들어 마이크로어레이 칩이 보편화되어 질병 진단을 위한 다양한 실험에 사용됨에도 불구하고 환경유해물질 노출에 대한 검색은 여전히 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법을 사용하여 이루어지고 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 보다 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 마이크로어레이 칩 또는 프라이머(primer)를 이용하는 실시간(real-time) PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 등으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용, 특히 암을 비롯한 다양한 질병 유발에 관여하는 마이크로 RNA 발현 변화 여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 저급 지방족 포화알데하이드류의 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.

1997년 처음으로 마이크로 RNA가 밝혀진 이래 포유류, 미생물 등 여러 종의 마이크로 RNA가 급속도로 밝혀져 Sanger miRBASE 데이타베이스(database)에 보고되었다(http://www.mirbase.org/index.shtml). 이렇게 밝혀진 마이크로 RNA 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드(genome-wide) 발현 연구가 이루어지고 있다. 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M, et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93, 10614-10619, 1996).

마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et. al. J. Am . Acad . Dermatol . 51, 681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al. J. Am . Acad . Dermatol . 51, 681-692, 2004).

유전자의 발현 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 마이크로 RNA를 얻어 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 마이크로 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화한다.

마이크로어레이를 통해 유전자 발현을 측정하는 방법으로는 크게 두 개의 염료(two-dye) 방식과 한 개의 염료(one-dye) 방식이 있다. 상보결합 반응을 측정할 때, 대조군 샘플과 실험군 샘플에 각각 두 개의 다른 형광(예: Cye3 및 Cye5)을 표지한 후 마이크로어레이에서 반응시켜 측정하는 방식을 두 개의 염료 마이크로어레이(two-dye microarray)라고 하고, 두 샘플에 동일한 형광을 입힌 후 두 개의 서로 다른 마이크로어레이에서 반응시켜 측정하는 방식을 한 개의 염료 마이크로어레이(one-dye microarray)라고 한다(Vivian, G. et al. Nature 21, 15-19, 1999).

최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯해 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 마이크로 RNA들의 발현 패턴 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 마이크로 RNA의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 확인이 가능하게 될 것이다.

이에 본 발명자들은 인간 마이크로 RNA 1347개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 80% 생존율을 보이는 농도(IC20)로 처리한 저급 지방족 포화알데하이드류의 마이크로 RNA 발현 프로파일을 인간 폐암 세포인 A549 세포주에서 관찰 및 분석한 결과, 저급 지방족 포화알데하이드류에 의해 발현이 변화되는 마이크로 RNA를 발굴함으로써, 상기 마이크로 RNA를 이용하여 저급 지방족 포화알데하이드류 노출 여부를 확인할 수 있는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인체에 다양한 질병을 유발하는 등 독성작용을 갖는 저급 지방족 포화 알데하이드류(lower aliphatic saturated aldehydes)의 노출 여부 확인용 마이크로 RNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 마이크로 RNA를 이용하여 저급 지방족 포화 알데하이드류의 노출 여부 확인 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로 RNA 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 저급 지방족 포화 알데하이드류(lower aliphatic saturated aldehydes) 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩을 제공한다:

마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003258(hsa-miR-590-5p, Homo sapiens miR-590-5p); 및

마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000085(hsa-miR-28-5p, Homo sapiens miR-28-5p).

또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 저급 지방족 포화 알데하이드류 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나의 마이크로 RNA에 상보적이고, 상기 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 저급 지방족 포화 알데하이드류 노출 여부 확인용 키트를 제공한다:

또한, 본 발명은

1) 실험군인 피검개체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 각각 다른 형광물질로 표지하는 단계;

3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 RNA를 상기 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;

4) 단계 3)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및

5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 실험군의 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA의 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 저급 지방족 포화알데하이드류에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;

3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

4) 단계 3)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 저급 지방족 포화 알데하이드류에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법을 제공한다.

본 발명은 다음과 같은 저급 지방족 포화 알데하이드류(lower aliphatic saturated aldehydes) 7종; 프로피온알데하이드(Prorionaldehyde), 부틸알데히드(Butylaldehyde), 발러알데히드(Valeradehyde), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal), 노나날(Nonanal)을 선정하였으며, 이중 3종 이상의 알데하이드 노출에 의해 1.5배 이상 과발현되는 1종과 0.66배 이하 저발현되는 1종을 선별함으로써, 최종 2종의 마이크로 RNA를 바이오마커로 이용하여 저급 지방족 포화 알데하이드류의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하게 사용할 수 있으며, 저급 지방족 포화 알데하이드류에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

도 1은 저급 지방족 포화 알데하이드류(lower aliphatic saturated aldehydes); 프로피온알데하이드(Prorionaldehyde), 부틸알데히드(Butylaldehyde), 발러알데히드(Valeradehyde), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal), 노나날(Nonanal)의 인간 폐암 세포주에서의 세포독성을 나타내는 도이다.
도 2는 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 이용한 저급 지방족 포화 알데하이드류를 처리한 인간 폐암 세포주의 마이크로 RNA 발현 양상을 분석한 결과를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 저급 지방족 포화 알데하이드류(lower aliphatic saturated aldehydes)의 노출에 의해 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 저급 지방족 포화 알데하이드류 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.

상기 바이오마커는 저급 지방족 포화 알데하이드류 노출에 의해 과발현된 마이크로 RNA 1종, 저발현된 마이크로 RNA 1종으로 구성되어 있다.

상기 바이오마커는 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것이나 이에 한정되지 않는다:

본 발명자들은 저급 지방족 포화 알데하이드류에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 저급 지방족 포화 알데하이드류를 인간 폐암 세포주(A549)에 처리하여 세포독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 저급 지방족 포화 알데하이드류는 인간 폐암 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 저급 지방족 포화 알데하이드류의 농도(세포 생존율 80%인 농도:IC₂₀)를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 저급 지방족 포화 알데하이드류를 인간 폐암 세포주에 처리하고, 상기 물질을 처리한 세포주에서 마이크로 RNA를 포함하는 총 RNA를 분리하여 형광물질(Cy3)로 표지하였다. 상기 형광표지된 마이크로 RNA를 Agilent Human miRNA array v16.0(Agilent, 미국)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다. 분석시 실험군/대조군의 신호 강도(signal intensity) 비율이 1.5배 이상인 경우 발현 증가한 유전자로 분류하였고, 0.66배 이하인 경우 발현 감소한 유전자로 분류하였다. 그 결과, IC₂₀ 농도로 프로피온알데하이드를 처리한 샘플에서 발현이 증가한 마이크로 RNA는 0.97%(1347개의 마이크로 RNA 중 13개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 0.15%(1347개의 마이크로 RNA 중 2개)이며, 부틸알데히드를 처리한 경우는 과발현 마이크로 RNA 1.04%(1347개의 마이크로 RNA 중 14개), 저발현 마이크로 RNA 0.82%(1347개의 마이크로 RNA 중 11개)이다. 발러알데히드 처리 경우는 발현이 증가한 마이크로 RNA는 0.59%(1347개의 마이크로 RNA 중 8개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 0.15%(1347개의 마이크로 RNA 중 2개)이며, 헥사날 처리 경우는 발현이 증가한 마이크로 RNA는 0.37%(1347개의 마이크로 RNA 중 5개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 0.07%(1347개의 마이크로 RNA 중 1개)이며, 헵타날 처리 경우는 발현이 증가한 마이크로 RNA는 0.00%(1347개의 마이크로 RNA 중 0개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 0.30%(1347개의 마이크로 RNA 중 4개)이며, 옥타날 처리 경우는 발현이 증가한 마이크로 RNA는 0.07%(1347개의 마이크로 RNA 중 1개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 1.04%(1347개의 마이크로 RNA 중 14개)이며, 노나날 처리 경우는 발현이 증가한 마이크로 RNA는 0.45%(1347개의 마이크로 RNA 중 6개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 0.00%(1347개의 마이크로 RNA 중 0개)이다 (도 2 참조). 이때, 3종 이상의 저급 지방족 포화알데하이드에 의해 1.5배 이상 과발현 하는 마이크로 RNA 1종, 0.66배 이하 저발현하는 마이크로 RNA가 1종이었다(표 1 참조).

삭제

아울러, 마이크로 RNA 등록번호는 하기와 같다:

마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000085 (hsa-miR-28-5p, Homo sapiens miR-28-5p).

또한, 본 발명은 상기 바이오마커 마이크로 RNA 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보 가닥 분자가 합성/집적된 저급 지방족 포화 알데하이드류에 대한 노출 여부 확인용 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 바이오마커 마이크로 RNA의 15 내지 20개의 핵산을 포함한다.

본 발명의 저급 지방족 포화 알데하이드 검색용 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 구체적으로 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 마이크로 RNA 분자로 이용하여 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 잉크젯 방식 등을 사용하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 SurePrint 잉크젯 마이크로 드롭핑 마이크로어레이(inkjet micro dropping microarray)를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 구체적으로 에폭시(epoxy), 아미노-실란(amino-silane), 폴리-엘-리신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 에폭시가 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 저급 지방족 포화 알데하이드류에 대한 마이크로 RNA 발현 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 방법은 하기와 같이 수행할 수 있다.

3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 RNA를 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;

4) 단계 3)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및

5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 실험군의 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 체세포는 구체적으로 인간의 폐 세포 또는 인간 폐암 세포인 것이나 이에 한정되지 않고, 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 방법에 있어서, 인간 폐암 세포는 구체적으로 A549인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 구체적으로 Cy3, Cy5, 폴리 엘-리신-플루오레세인 이소티오시안산염(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-비-이소티오시안산염(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩은 구체적으로 Agilent Human miRNA array v16.0(Agilent, 미국)등을 사용하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 마이크로 RNA 중 본 발명에서 상기 공통적으로 발현이 변화된 마이크로 RNA(표 1 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 가장 구체적인 것은 상기 본 발명자가 제작한 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 분석 방법은 구체적으로 GeneSpring GX 11 소프트웨어(Agilent, 미국)를 사용하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.

또한, 본 발명은

3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 프라이머는 본 발명에서 탐색된 바이오마커 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머라면 모두 사용가능하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩을 포함하는 저급 지방족 포화 알데하이드류 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

상기 저급 지방족 포화 알데하이드류에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 키트는 추가적으로 인간 폐 세포 또는 인간 폐암 세포를 포함하는 것이나 이에 한정되지 않는다.

상기 인간 폐암 세포는 구체적으로 A549를 사용하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 폐 세포 또는 인간 폐암의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 구체적으로 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3를 사용하였다.

상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

아울러, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나의 마이크로 RNA에 상보적이고, 상기 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 저급 지방족 포화 알데하이드류 노출 여부 확인용 키트를 제공한다:

마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003258 (hsa-miR-590-5p, Homo sapiens miR-590-5p); 및

마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000085 (hsa-miR-28-5p, Homo sapiens miR-28-5p).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 저급 지방족 포화 알데하이드류의 세포독성 확인

<1-1> 세포배양

인간 폐암 세포주인 A549 세포(한국 세포주 은행)를 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지(Gibro-BRL, 미국)를 이용하여 100 ㎜ 디쉬(dish)에서 80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 저급 지방족 포화 알데하이드류 7종(프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헥사날, 헵타날, 옥타날, 노나날)을 선정하였으며, DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.

<1-2> 세포독성 실험( MTT assay ) 및 화학 물질 처리를 통한 저급 지방족 포화 알데하이드류에 미치는 세포독성 여부 확인

Mossman 등(J. Immunol . Methods , 65, 55-63, 1983)의 방법으로 A549 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다.

구체적으로, 세포는 24-웰 플레이트에 3.5 × 10⁵/웰 세포수로 RPMI 배지(Gibro-BRL, 미국)에서 DMSO에 용해된 상기 실시예 <1-1>에서 선정한 저급 지방족 포화 알데하이드류 7종(프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헥사날, 헵타날, 옥타날, 노나날)을 처리하고 48시간 후에 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 A549 세포주에서 저급 지방족 포화 알데하이드류의 세포독성에 80% 생존율을 보이는 농도(IC₂₀)는 프로피온알데하이드 2.5 mM, 부틸알데히드 4.6 mM, 발러알데히드 1.7 mM, 헥사날 0.8 mM, 헵타날 0.6 mM, 옥타날 0.58 mM, 노나날 0.44 mM이었으며, 상기 결과를 바탕으로 하기 마이크로어레이 실험을 수행하였다(도 1).

<실시예 2> 마이크로어레이 실험을 통한 저급 지방족 포화 알데하이드류에 의한 마이크로 RNA의 발현 양상 확인

<2-1> 표적 마이크로 RNA의 분리

25 × 10⁴ 세포/㎖ 농도로 6-웰 플레이트에 A549 세포를 분주한 후, 상기 실시예 <1-2>에서 결정한 저급 지방족 포화 알데하이드류(프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헥사날, 헵타날, 옥타날, 노나날)의 농도들을 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, 미국)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase 세트(set)(Qiagen, 미국)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 농도는 분광광도계인 NanoDrop ND 1000 분광광도계(spectrophotometer)(NanoDrop Technologies Inc., 미국)를 이용하여 측정하였으며 순도는 아가로스 젤 전기영동으로 확인하였다.

<2-2> 표지된 마이크로 RNA 제조 및 형광 물질 표지

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 저급 지방족 포화 알데하이드류(프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헥사날, 헵타날, 옥타날, 노나날) 처리군의 전체 RNA에 형광 물질을 표지하였다.

구체적으로, 형광 표지는 Agilent사의 miRNA 완전한 라벨링 및 혼성화 키트(complete labeling and Hybridization kit)를 사용하여 제조사의 방법대로 수행하였다. 상기 수득한 전체 RNA 2μl(100 ng)에 0.4 ul의 10 X CIP 완충용액, 1.1 ul의 핵산분해효소 자유수(nuclease-free water), 0.5 ul의 캐프 인테스터널 포스파타아제(Calf Intestinal Phosphatase)를 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 2.8 ul의 100% DMSO를 첨가하여 100%에서 5 내지 10분간 반응시키고 즉시 얼음으로 옮겼다. 염료(dye)를 붙여주기 위해 1 ul의 10 X T4 RNA 리가아제(Ligase) 완충용액, 3 ul의 Cyanine3-pCp, 0.5 ul의 T4 RNA 리가아제(ligase)를 넣고 16℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 라벨링(labeling) 된 시료를 Micro Bio-Spin 6 컬럼(column)을 사용하여 정제하였다. 정제된 RNA를 55℃의 진공 농축기(vacuum concentrator)에서 완전히 말려 18 ul의 핵산분해효소 자유수로 녹인 후 4.5 ul의 10 X GE 차단 에이전트(Blocking Agent)를 넣고 22.5 ul의 2 X Hi-RPM 혼성화 완충용액(Hybridization buffer)을 넣어주었다. 준비된 시료를 100℃에서 5분간 반응시키고 즉시 얼음으로 옮겨 5분간 반응시킨 다음 혼성화 반응에 사용하였다.

<2-3> 혼성화 반응

혼성화 및 세척 과정을 이바이오젠(서울, 한국)의 지시방법에 따라 수행하였다. 혼성화를 20시간 동안 55℃ 오븐에서 수행하였다. DNA 마이크로어레이 칩은 인간 miRNA 어레이(array) v16.0(Agilent, 미국)을 이용하였다.

<2-4> 형광 이미지 획득을 통한 마이크로 RNA 발현 양상 확인

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Agilent C 스캐너(scanner)(Agilent technologies, 미국)로 스캔하였으며 추출된 데이터를 Agilent GeneSpring GX 11(Agilent technologies)를 이용하여 정상화(normalization)를 거쳐 각 유전자의 발현양상을 분석하였다.

그 결과, 도 2 및 표 1에 나타낸 바와 같이 올리고 칩 상에 존재하는 대략 1347 개의 마이크로 RNA 중에서 IC₂₀ 농도로 프로피온알데하이드를 처리한 샘플에서 발현이 증가한 마이크로 RNA는 0.97%(1347개의 마이크로 RNA 중 13개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 0.15%(1347개의 마이크로 RNA 중 2개)이며, 부틸알데히드를 처리한 경우는 과발현 마이크로 RNA 1.04%(1347개의 마이크로 RNA 중 14개), 저발현 마이크로 RNA 0.82%(1347개의 마이크로 RNA 중 11개)이다. 발러알데히드 처리 경우는 발현이 증가한 마이크로 RNA는 0.59%(1347개의 마이크로 RNA 중 8개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 0.15%(1347개의 마이크로 RNA 중 2개)이며, 헥사날 처리 경우는 발현이 증가한 마이크로 RNA는 0.37%(1347개의 마이크로 RNA 중 5개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 0.07%(1347개의 마이크로 RNA 중 1개)이며, 헵타날 처리 경우는 발현이 증가한 마이크로 RNA는 0.00%(1347개의 마이크로 RNA 중 0개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 0.30%(1347개의 마이크로 RNA 중 4개)이며, 옥타날 처리 경우는 발현이 증가한 마이크로 RNA는 0.07%(1347개의 마이크로 RNA 중 1개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 1.04%(1347개의 마이크로 RNA 중 14개)이며, 노나날 처리 경우는 발현이 증가한 마이크로 RNA는 0.45%(1347개의 마이크로 RNA 중 6개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 0.00%(1347개의 마이크로 RNA 중 0개)임을 확인하였다. 이때, 3종 이상의 저급 지방족 포화 알데하이드류에 의해 1.5배 이상 과발현되는 마이크로 RNA 1종, 0.66배 이하 저발현되는 마이크로 RNA가 1종이 있다는 것을 확인하였다(도 2 및 표 1).

삭제

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명은 인체에 다양한 질병을 유발하는 등 독성작용을 갖는 저급 지방족 포화 알데하이드류의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하게 사용할 수 있으며, 저급 지방족 포화 알데하이드류에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기 모든 마이크로 RNA 또는 그의 상보 가닥 분자가 집적된, 프로피온알데하이드(propionaldehyde), 부틸알데히드(butylaldehyde), 발러알데히드(valeradehyde), 헵타날(heptanal), 옥타날(octanal) 및 노나날(nonanal)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩:
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003258 (hsa-miR-590-5p, Homo sapiens miR-590-5p); 및
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000085 (hsa-miR-28-5p, Homo sapiens miR-28-5p).
제 1항에 있어서, 상기 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0003258(hsa-miR-590-5p, Homo sapiens miR-590-5p)은 부틸알데히드, 헵타날 및 옥타날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 의해 감소, 또는 상기 마이크로 RNA 등록번호(miRbase) MIMAT0000085(hsa-miR-28-5p, Homo sapiens miR-28-5p)는 프로피온알데하이드, 발러알데히드 및 노나날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 의해 증가하는 것을 특징으로 하는 프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헵타날, 옥타날 및 노나날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 노출 여부 확인용 마이크로 어레이 칩.
제 1항의 마이크로어레이 칩을 포함하는 프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헵타날, 옥타날 및 노나날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 노출 여부 확인용 키트.
제 3항에 있어서, 인간 폐 세포 또는 폐암 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헵타날, 옥타날 및 노나날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 노출 여부 확인용 키트.
하기 모든 마이크로 RNA에 상보적이고, 상기 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헵타날, 옥타날 및 노나날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 노출 여부 확인용 키트:
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0003258 (hsa-miR-590-5p, Homo sapiens miR-590-5p); 및
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0000085 (hsa-miR-28-5p, Homo sapiens miR-28-5p).
1) 실험군인 피검개체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 각각 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 RNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 실험군의 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헵타날, 옥타날 및 노나날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
제 6항에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간의 폐 세포 또는 인간 폐암 세포인 것을 특징으로 하는 프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헵타날, 옥타날 및 노나날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
제 7항에 있어서, 상기 인간 폐암 세포는 A549인 것을 특징으로 하는 프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헵타날, 옥타날 및 노나날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
제 6항에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 엘-리신-플루오레세인 이소티오시안산염(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-비-이소티오시안산염(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헵타날, 옥타날 및 노나날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
1) 실험군인 피검개체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
4) 단계 3)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헵타날, 옥타날 및 노나날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
제 10항에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간의 폐 세포 또는 인간 폐암 세포인 것을 특징으로 하는 프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헵타날, 옥타날 및 노나날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.
제 11항에 있어서, 상기 인간 폐암 세포는 A549인 것을 특징으로 하는 프로피온알데하이드, 부틸알데히드, 발러알데히드, 헵타날, 옥타날 및 노나날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인 방법.