KR101927141B1 - 자일렌 노출 여부 확인용 키트, 및 이를 이용한 자일렌 노출 여부 확인 방법 - Google Patents

자일렌 노출 여부 확인용 키트, 및 이를 이용한 자일렌 노출 여부 확인 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자일렌 노출 여부 확인용 키트, 및 이를 이용한 자일렌 노출 여부 확인 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자일렌에 의해 특이적으로 발현이 변화하는 엑소좀과 세포주 유래 마이크로 RNA를 사용하여 자일렌의 오염을 모니터링 및 판정하는데 사용 가능하고, 자일렌에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 유용하게 이용할 수 있는 노출 여부 확인용 키트, 및 이를 이용한 자일렌 노출 여부 확인 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 자일렌 노출 여부 확인용 키트 및 이를 이용한 자일렌 노출 여부 확인 방법은, 자일렌 인체 노출에 대해 특이적 발현이 변화하는 마이크로 RNA는 자일렌의 오염을 모니터링 및 판정하는데 특이적으로 사용될 수 있으며, 자일렌에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 유용하게 이용할 수 있다. 또한, 엑소좀에서 추출된 RNA를 이용함으로써 정확하고 신속하게 진단 및 예측이 가능하다는 장점이 있다.

Description

자일렌 노출 여부 확인용 키트, 및 이를 이용한 자일렌 노출 여부 확인 방법 {Kit for identification of exposure to xylene and the method of identification using thereof}
본 발명은 자일렌 노출 여부 확인용 키트, 및 이를 이용한 자일렌 노출 여부 확인 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자일렌에 의해 특이적으로 발현이 변화하는 엑소좀과 세포주 유래 마이크로 RNA를 사용하여 자일렌의 오염을 모니터링 및 판정하는데 사용 가능하고, 자일렌에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 유용하게 이용할 수 있는 노출 여부 확인용 키트, 및 이를 이용한 자일렌 노출 여부 확인 방법에 관한 것이다.
자일렌(Xylene)은 휘발성 유기 화합물의 하나로서 합성수지, 합성섬유 등 화학물질의 원료로 사용되며 접착제, 인쇄용 잉크, 유성 도료, 시너 및 농약 등의 용매로도 사용된다. 이러한 자일렌은 주로 공기를 통해 체내에 유입된다. 특히 교통이 혼잡한 지역이나 주유소, 또는 자일렌을 용매로 사용하는 곳이나 정제소와 같은 사업장에서 인체에 노출될 수 있다. 또한, 자일렌에 오염된 물이나 음식을 섭취하는 경우와 피부를 통해 흡수되는 경우에도 자일렌에 노출될 수 있으며 그에 따라 인체에 위해성을 나타낼 수 있다.
자일렌은 새집증후군을 발생시키는 대표적인 물질 중 하나로 높은 농도의 자일렌에 노출될 경우 눈과 목 등에 자극이 유발될 수 있고 중추신경계에 영향을 줄 수 있다고 알려져 있다. 그 밖에도 구역, 구토, 졸린 증상, 현기증, 가슴 통증, 호흡곤란 등의 다양한 증상이 나타날 수 있다. 또한, 자일렌은 생식 독성 또한 일으키는 물질로 보고되고 있다. 자일렌의 생식 독성 확인용 동물실험에서는 마우스의 생식력과 태자 사망, 태자 독성, 유산, 근골격계 이상 등 태자의 발달 이상을 보였으며, 자일렌에 정기적으로 노출된 여성 작업자들은 월경 장애(월경과다, 자궁출혈)와 병적 임신 증세(중독증, 유산 위험, 분만시 출혈)와 불임증을 경험한 것으로 보고되었다(식품의약품안전평가원, 2009: 독성정보제공시스템). 더욱이 근대산업이 발달함에 따라 자일렌의 배출량은 증가하고 있고, 산업체 근로자가 과량의 유기용매에 장기간 노출되는 산업재해의 경우가 증가하고 있어 자일렌의 흡입이 생체기능에 미치는 효과 규명이 중요한 과제로 대두되고 있다.
그러나, 자일렌의 잠재적 위해성에도 불구하고 인체에서의 위해도 평가 자료가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 머물러 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로, 마이크로어레이 칩 또는 프라이머(primer)를 이용하는 실시간(real-time) PCR(Real-time reverse transcription polymerase chain reaction) 등 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용, 특히 암을 비롯한 다양한 질병 유발에 관여하는 마이크로 RNA 발현 변화 여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 자일렌의 인체 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 필요한 실정이다.
한편, 엑소좀(exosome)은 대부분의 세포가 분비하거나 방출하는 30-150nm 크기의 가장 작은 소포체(membrane vesicle)이다. 엑소좀 안에는 기원 세포에서 유래된 다양한 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA) 등이 포함되어 있고 세포 간의 정보 전달 등 여러 생물학적 기능에 관여하기 때문에 생물학 및 병리학 연구의 새로운 도구로서 각광받고 있다. 특히 엑소좀은 혈액, 소변, 점액, 타액, 담즙액, 복수액, 뇌 척수액 등의 다양한 체액에서 발견되기 때문에 이를 이용한 진단 및 치료 방법의 개발에 더욱 주목하고 있다.
엑소좀은 그 안에 마이크로 RNA(miR, miRNA)라는 조절성 RNA를 가지고 있는데 이것이 세포들 간의 거리와 관계없이 세포간의 상호작용을 조절하는 중요한 역할을 한다. 마이크로 RNA는 전형적으로 18-24개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 비(非)암호화 RNA이다. 마이크로 RNA는 작지만 그 영향력이 커서 한 분자만으로도 RNA 분해 촉진, mRNA 번역 저해 및 유전자 전사에의 영향 등을 통해 많은 생물학적 기능을 제어할 수 있다. 마이크로 RNA는 발달 및 분화, 세포 증식 제어, 스트레스 반응 및 대사 작용 등의 다양한 과정에서 중심적 역할을 한다.
한편, 지금까지 동식물을 포함한 223가지의 종에서 28,645개(인간에서 약 2,000여 개)의 마이크로 RNA가 발견되었고, 마이크로 RNA가 유전자의 발현을 조절하는 중요한 생물학적 조절인자임이 밝혀졌다. 또한, 마이크로 RNA의 메커니즘은 암 발병, 세포 노화, 장기의 성장 등에 중요한 영향을 미치고 있으며, 이에 따라 마이크로 RNA 관련 연구는 암 발생, 노화 등의 생명현상 인과 관계 규명에 중추적 역할을 할 것이다. 뿐만 아니라, 향후 발생 및 분화나 줄기세포를 이용한 세포치료제 개발 등의 연구에도 적용시킬 수 있어 우리나라 바이오 연구의 핵심 분야로 자리 잡을 수 있을 것으로 예상된다. 따라서 마이크로 RNA 마커의 발굴은 암을 포함하여 질병의 조기 진단 가능성을 예측하는 데에 많은 도움을 줄 것이라는 점에서 의의가 있다.
더욱이 마이크로 RNA 마커는 특정 환경유해물질의 노출 및 위해성 예측에도 유용하게 쓰일 수 있을 것이다. 마이크로 RNA의 바이오마커로서의 가능성에 대한 관심이 증가함에 따라 지금까지 주로 진행된 환경유해물질의 노출에 따른 유전자(mRNA)의 변화 양상과 그에 따른 질병과의 연관성에 관련된 연구와 달리, 벤젠(benzene), 비소(arsenic), RDX와 많은 수의 유해물질의 노출에 따른 마이크로 RNA의 발현 변화를 관찰하였으며 특이적으로 발현이 변화하는 마이크로 RNA와 그 표적 유전자를 유해물질에 대한 마커로 제시하였다(Baccarelli, A. & Bollati, V. Curr . Opin . Prediatr. 21, 243-251, 2009). 또한, 발굴된 마이크로 RNA는 노출 예측을 위한 마커로서 뿐만 아니라 표적 유전자의 발현을 조절하는 조절자로서 환경유해물질에 의한 독성 기작 예측을 위한 마커로서도 유용하게 쓰일 수 있다. 이렇듯 마이크로 RNA 마커의 환경유해물질 노출 및 독성기작 예측에서의 역할이 매우 중요하다고 할 수 있음에도 불구하고 현재 마이크로 RNA 관련 연구는 주로 질병 진단용 마커 발굴에 국한되어 있으며 다양한 환경 중에 노출 가능성이 있는 휘발성 유기화합물과 같은 유해물질 노출에 의한 마이크로 RNA의 발현 변화에 대한 연구는 부족하다. 또한, 후성유전학적 변화는 유전자의 발현과 같은 유전학적 변화의 다양성에 비해 그 정도가 심하지 않게 때문에 다수의 마커가 필요한 유전자 발현 프로파일링에 비해서 단 하나의 마이크로 RNA나 DNA 메틸레이션과 같은 유전자 외적(epigenetic) 마커로도 질병이나 유해물질 노출을 초기에 진단할 수 있다는 장점뿐만 아니라 비침습적 방법으로 진단할 수 있다는 이점이 있다. 각 마이크로 RNA가 다양한 표적 유전자들을 조절하고 고등진핵생물에서는 수 천여 개의 마이크로 RNA가 존재하기 때문에 마이크로 RNA에 의해 조절될 수 있는 잠재적인 회로가 막대할 것이라고 예상하고 있다.
특히, 엑소좀 안에 포함된 마이크로 RNA는 어떤 질병들의 예측, 진단, 예후들을 측정할 수 있는 바이오마커로서의 이용 가능성이 높다. 현재 이러한 가능성은 암에서 밝혀지고 있는데, 어떤 암들은 측정이 가능한 신호전달 물질과 유전정보를 담고 있는 암 특이적인 엑소좀을 분비하며 체액에서 추출한 엑소좀으로 그 정보를 쉽게 얻을 수 있고, 혈액을 통해 이동하는 암 유래 엑소좀의 마이크로 RNA 프로파일은 정상인으로부터 얻은 엑소좀의 마이크로 RNA와 비교하였을 때 매우 다르고 특이적이라는 연구도 보고된 바 있다(Taylor DD, Gercel-Taylor C. Gynecol. Oncol. 110:13-21, 2008).
1993년 처음으로 마이크로 RNA가 밝혀진 이래 포유류, 미생물 등 여러 종의 마이크로 RNA가 급속도로 밝혀지면서 마이크로 RNA들의 서열 및 정보, 특징들을 저장, 관리하는 데이터베이스(database)가 구축되었다. 그 중 대표적인 것이 Sanger miRBASE 데이터베이스(http://www.mirbase.org/index.shtml)와 miRWalk 데이터베이스(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/)인데, 이렇게 밝혀진 마이크로 RNA 데이터를 바탕으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드(genome-wide) 발현 연구가 이루어지고 있다.
마이크로어레이(microarray) 분석은 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 확인할 수 있게 해준다(Schena, M, et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93, 10614-10619, 1996). 마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리 표면에 집적화한 것이고, cDNA 마이크로어레이는 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et. al. J. Am. Acad . Dermatol. 51, 681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있으며, Agilent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al. J. Am. Acad . Dermatol . 51, 681-692, 2004).
최근 마이크로어레이 기술과 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등을 접목하여 대량(high throughput)으로 신의약 후보 물질, 환경오염물질을 포함한 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 마이크로 RNA들의 발현 패턴 분석, 양적 분석이 가능해졌다.
Baccarelli, A. & Bollati, V. Curr. Opin. Prediatr. 21, 243-251, 2009 Taylor DD, Gercel-Taylor C. Gynecol. Oncol. 110:13-21, 2008 Schena, M, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10614-10619, 1996 Sellheyer K. et. al. J. Am. Acad. Dermatol. 51, 681-692, 2004
본 발명은 두 가지 농도의 자일렌의 노출에 의해 공통적으로 발현이 변화하는 엑소좀과 세포주 유래 마이크로 RNA를 이용한 자일렌 노출 여부 확인용 키트, 및 이를 이용한 자일렌 노출 여부 확인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기 모든 마이크로 RNA 또는 그의 상보가닥 분자가 모두 집적된 자일렌(xylene) 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩을 제공한다.
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004507(hsa-miR-92a-1-5p,Homo sapienshsa-miR-92a-1-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019019(hsa-miR-4485-3p,Homo sapienshsa-miR-4485-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022929(hsa-miR-758-5p,Homo sapienshsa-miR-758-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0002821(hsa-miR-181d-5p,Homo sapienshsa-miR-181d-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027616(hsa-miR-6858-5p,Homo sapienshsa-miR-6858-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019015(hsa-miR-4481, Homo sapienshsa-miR-4481),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019779(hsa-miR-4690-5p,Homo sapienshsa-miR-4690-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023700(hsa-miR-6075, Homo sapienshsa-miR-6075),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023698(hsa-miR-6073, Homo sapienshsa-miR-6073),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0000772(hsa-miR-345-5p,Homo sapienshsa-miR-345-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023693(hsa-miR-6068,Homo sapienshsa-miR-6068),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0003237(hsa-miR-572, Homo sapienshsa-miR-572),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022941(hsa-miR-1227-5p,Homo sapienshsa-miR-1227-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005880(hsa-miR-1290,Homo sapienshsa-miR-1290),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018085(hsa-miR-3663-3p,Homo sapienshsa-miR-3663-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027470(hsa-miR-6785-5p,Homo sapienshsa-miR-6785-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027436(hsa-miR-6768-5p,Homo sapienshsa-miR-6768-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019071(hsa-miR-4532,Homo sapienshsa-miR-4532),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0025855(hsa-miR-6723-5p,Homo sapienshsa-miR-6723-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028113(hsa-miR-7108-5p,Homo sapienshsa-miR-7108-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0030987(hsa-miR-8060,Homo sapienshsa-miR-8060),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019913(hsa-miR-4763-3p,Homo sapienshsa-miR-4763-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019793(hsa-miR-4698,Homo sapienshsa-miR-4698),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004595(hsa-miR-135a-3p,Homo sapienshsa-miR-135a-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0012735(hsa-miR-718,Homo sapienshsa-miR-718),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018981(hsa-miR-4459,Homo sapienshsa-miR-4459),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027404(hsa-miR-6752-5p,Homo sapienshsa-miR-6752-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019878(hsa-miR-4745-5p,Homo sapienshsa-miR-4745-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0003240(hsa-miR-575, Homo sapienshsa-miR-575),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027450(hsa-miR-6775-5p,Homo sapienshsa-miR-6775-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022709(hsa-miR-652-5p,Homo sapienshsa-miR-652-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0021127(hsa-miR-5195-3p,Homo sapienshsa-miR-5195-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019868(hsa-miR-4739,Homo sapienshsa-miR-4739),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022838(hsa-miR-1185-1-3p,Homo sapienshsa-miR-1185-1-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0020924(hsa-miR-642a-3p,Homo sapienshsa-miR-642a-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0000457(hsa-miR-188-5p,Homo sapienshsa-miR-188-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018929(hsa-miR-4417,Homo sapienshsa-miR-4417),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019069(hsa-miR-4530, Homo sapienshsa-miR-4530),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022942(hsa-miR-1229-5p,Homo sapienshsa-miR-1229-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005929(hsa-miR-1275, Homo sapienshsa-miR-1275),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023252(hsa-miR-5787,Homo sapienshsa-miR-5787),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018444(hsa-miR-642b-3p,Homo sapienshsa-miR-642b-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0016901(hsa-miR-4271,Homo sapienshsa-miR-4271),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0016852(hsa-miR-4298,Homo sapienshsa-miR-4298),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0024599(hsa-miR-6126,Homo sapienshsa-miR-6126),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0016900(hsa-miR-4270,Homo sapienshsa-miR-4270),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0003299(hsa-miR-630, Homo sapienshsa-miR-630),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018104(hsa-miR-3679-5p,Homo sapienshsa-miR-3679-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027620(hsa-miR-6769b-5p,Homo sapienshsa-miR-6769b-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022496(hsa-miR-5703,Homo sapienshsa-miR-5703),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019978(hsa-miR-4800-5p,Homo sapienshsa-miR-4800-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005793(hsa-miR-320c,Homo sapienshsa-miR-320c),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028111(hsa-miR-7107-5p,Homo sapienshsa-miR-7107-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004761(hsa-miR-483-5p,Homo sapienshsa-miR-483-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028211(hsa-miR-7150,Homo sapienshsa-miR-7150),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019936(hsa-miR-4778-5p,Homo sapienshsa-miR-4778-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027634(hsa-miR-6867-5p,Homo sapienshsa-miR-6867-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0025476(hsa-miR-6510-5p,Homo sapienshsa-miR-6510-5p), 및
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028117(hsa-miR-7110-5p,Homo sapienshsa-miR-7110-5p).
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 자일렌 노출 여부 확인용 키트가 제공된다.
또한, 상기 자일렌 노출 여부 확인용 키트는 인간 혈액 세포를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 각각의 마이크로 RNA에 상보적이고, 상기 각각의 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 모든 프라이머를 포함하는 자일렌 노출 여부 확인용 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 1) 실험군인 피검개체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 엑소좀을 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 체세포에서 RNA를 추출하고, 단계 1)에서 분리한 엑소좀에서 RNA를 추출하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군의 체세포 및 엑소좀에서 추출된 RNA와, 대조군의 체세포 및 엑소좀에서 추출된 RNA를 각각 다른 형광물질로 표지하는 단계;
4) 단계 3)의 형광물질로 표지된 RNA를 상기 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
5) 단계 4)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 모든 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 자일렌 노출 여부 확인 방법이 제공된다.
또한, 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 엘-리신-플루오레세인 이소티오시안산염(poly Llysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-비-이소티오시안산염(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 1) 실험군인 피검개체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 엑소좀을 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 체세포에서 RNA를 추출하고, 단계 1)에서 분리한 엑소좀에서 RNA를 추출하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군의 체세포 및 엑소좀에서 추출된 RNA와, 대조군의 체세포 및 엑소좀에서 추출된 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;
4) 단계 3)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
5) 단계 4)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 자일렌 노출 여부 확인 방법이 제공된다.
그리고, 상기 체세포는 인간의 혈액 세포일 수 있고, 상기 인간 혈액 세포는 HL-60일 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 하기 프라이머 1 내지 5로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
프라이머 1 - 서열번호 1(5'CUUCCGCCCCGCCGGGCGUCG)로 기재된 프라이머;
프라이머 2 - 서열번호 2(5'AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG)로 기재된 프라이머;
프라이머 3 - 서열번호 3(5'UGAGCACCACACAGGCCGGGCGC)로 기재된 프라이머;
프라이머 4 - 서열번호 4(5'CCCAGCAGGACGGGAGCG)로 기재된 프라이머; 및
프라이머 5 - 서열번호 5(5'GUGGGGGAGAGGCUGUC)로 기재된 프라이머.
본 발명에 따른 자일렌 노출 여부 확인용 키트 및 이를 이용한 자일렌 노출 여부 확인 방법은, 자일렌 인체 노출에 대해 특이적 발현이 변화하는 마이크로 RNA는 자일렌의 오염을 모니터링 및 판정하는데 특이적으로 사용될 수 있으며, 자일렌에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 엑소좀에서 추출된 RNA를 이용함으로써 정확하고 신속하게 진단 및 예측이 가능하다는 장점이 있다.
도 1은, HL-60 세포주에서 분리된 엑소좀을 나타낸 것이다.
도 2는, 자일렌을 처리한 엑소좀 유래 마이크로 RNA와 인간 혈액 세포주의 마이크로 RNA 발현 양상을 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은, 두 가지 농도의 자일렌을 처리한 엑소좀과 세포주 유래 마이크로 RNA에서 공통적으로 과발현 또는 저발현을 보이는 59종의 발현 양상을 나타낸 것이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 자일렌 노출 여부 확인용 키트, 및 이를 이용한 자일렌 노출 여부 확인 방법에 관하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면 하기 모든 마이크로 RNA 또는 그의 상보가닥 분자가 모두 집적된 자일렌(xylene) 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩을 제공한다.
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004507(hsa-miR-92a-1-5p,Homo sapienshsa-miR-92a-1-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019019(hsa-miR-4485-3p,Homo sapienshsa-miR-4485-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022929(hsa-miR-758-5p,Homo sapienshsa-miR-758-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0002821(hsa-miR-181d-5p,Homo sapienshsa-miR-181d-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027616(hsa-miR-6858-5p,Homo sapienshsa-miR-6858-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019015(hsa-miR-4481, Homo sapienshsa-miR-4481),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019779(hsa-miR-4690-5p,Homo sapienshsa-miR-4690-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023700(hsa-miR-6075, Homo sapienshsa-miR-6075),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023698(hsa-miR-6073, Homo sapienshsa-miR-6073),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0000772(hsa-miR-345-5p,Homo sapienshsa-miR-345-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023693(hsa-miR-6068,Homo sapienshsa-miR-6068),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0003237(hsa-miR-572, Homo sapienshsa-miR-572),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022941(hsa-miR-1227-5p,Homo sapienshsa-miR-1227-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005880(hsa-miR-1290,Homo sapienshsa-miR-1290),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018085(hsa-miR-3663-3p,Homo sapienshsa-miR-3663-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027470(hsa-miR-6785-5p,Homo sapienshsa-miR-6785-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027436(hsa-miR-6768-5p,Homo sapienshsa-miR-6768-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019071(hsa-miR-4532,Homo sapienshsa-miR-4532),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0025855(hsa-miR-6723-5p,Homo sapienshsa-miR-6723-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028113(hsa-miR-7108-5p,Homo sapienshsa-miR-7108-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0030987(hsa-miR-8060,Homo sapienshsa-miR-8060),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019913(hsa-miR-4763-3p,Homo sapienshsa-miR-4763-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019793(hsa-miR-4698,Homo sapienshsa-miR-4698),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004595(hsa-miR-135a-3p,Homo sapienshsa-miR-135a-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0012735(hsa-miR-718, Homo sapienshsa-miR-718),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018981(hsa-miR-4459,Homo sapienshsa-miR-4459),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027404(hsa-miR-6752-5p,Homo sapienshsa-miR-6752-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019878(hsa-miR-4745-5p,Homo sapienshsa-miR-4745-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0003240(hsa-miR-575, Homo sapienshsa-miR-575),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027450(hsa-miR-6775-5p,Homo sapienshsa-miR-6775-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022709(hsa-miR-652-5p,Homo sapienshsa-miR-652-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0021127(hsa-miR-5195-3p,Homo sapienshsa-miR-5195-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019868(hsa-miR-4739,Homo sapienshsa-miR-4739),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022838(hsa-miR-1185-1-3p,Homo sapienshsa-miR-1185-1-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0020924(hsa-miR-642a-3p,Homo sapienshsa-miR-642a-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0000457(hsa-miR-188-5p,Homo sapienshsa-miR-188-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018929(hsa-miR-4417,Homo sapienshsa-miR-4417),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019069(hsa-miR-4530, Homo sapienshsa-miR-4530),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022942(hsa-miR-1229-5p,Homo sapienshsa-miR-1229-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005929(hsa-miR-1275, Homo sapienshsa-miR-1275),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023252(hsa-miR-5787,Homo sapienshsa-miR-5787),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018444(hsa-miR-642b-3p,Homo sapienshsa-miR-642b-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0016901(hsa-miR-4271,Homo sapienshsa-miR-4271),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0016852(hsa-miR-4298,Homo sapienshsa-miR-4298),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0024599(hsa-miR-6126,Homo sapienshsa-miR-6126),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0016900(hsa-miR-4270,Homo sapienshsa-miR-4270),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0003299(hsa-miR-630, Homo sapienshsa-miR-630),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018104(hsa-miR-3679-5p,Homo sapienshsa-miR-3679-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027620(hsa-miR-6769b-5p,Homo sapienshsa-miR-6769b-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022496(hsa-miR-5703,Homo sapienshsa-miR-5703),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019978(hsa-miR-4800-5p,Homo sapienshsa-miR-4800-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005793(hsa-miR-320c,Homo sapienshsa-miR-320c),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028111(hsa-miR-7107-5p,Homo sapienshsa-miR-7107-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004761(hsa-miR-483-5p,Homo sapienshsa-miR-483-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028211(hsa-miR-7150,Homo sapienshsa-miR-7150),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019936(hsa-miR-4778-5p,Homo sapienshsa-miR-4778-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027634(hsa-miR-6867-5p,Homo sapienshsa-miR-6867-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0025476(hsa-miR-6510-5p,Homo sapienshsa-miR-6510-5p), 및
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028117(hsa-miR-7110-5p,Homo sapienshsa-miR-7110-5p).
그리고, 상기 마이크로 RNA는 하기 마이크로 RNA인 자일렌(xylene) 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩이 제공된다.
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0012735(hsa-miR-718, Homo sapienshsa-miR-718),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004761(hsa-miR-483-5p,Homo sapienshsa-miR-483-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018085(hsa-miR-3663-3p,Homo sapienshsa-miR-3663-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019069(hsa-miR-4530,Homo sapienshsa-miR-4530), 및
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005929(hsa-miR-1275,Homo sapienshsa-miR-1275).
본 발명자들은 인간 마이크로 RNA 2,549개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 80%와 50% 생존율을 보이는 농도(IC20, IC50)로 처리한 자일렌의 엑소좀과 세포주 유래 마이크로 RNA 발현 프로파일을 인간 혈액 세포인 HL-60 세포주에서 관찰 및 분석한 결과, 자일렌에 의해 발현이 공통으로 변화되는 엑소좀과 세포주 유래 마이크로 RNA를 발굴함으로써, 상기 마이크로 RNA를 이용하여 자일렌 노출 여부를 확인할 수 있는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 자일렌에 대한 마이크로 RNA 발현 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 자일렌을 인간 혈액 세포주(HL-60)에 처리하여 세포독성을 확인하였다. 그 결과 상기 자일렌은 인간 혈액 세포주에 독성을 보였고, 상기 실험을 바탕으로 자일렌의 농도(세포 생존율 80%인 농도:IC20 , 세포 생존율 50%인 농도:IC50)를 결정하였다.
이후 상기 결정된 농도로 자일렌을 인간 혈액 세포주에 처리하고, 상기 물질을 처리한 세포주에서 엑소좀을 분리하였다(도 1). 물질이 처리된 세포주와 엑소좀에서 각각 마이크로 RNA를 포함하는 전체 RNA를 분리하여 형광물질(Cy3)로 표지하였다. 상기 형광표지된 마이크로 RNA를 Agilent Human miRNA array 8 X 60K Release 21.0 (Agilent, 미국)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다. 분석시 실험군/대조군의 신호 강도(signal intensity) 비율이 1.5배 이상인 경우 발현 증가한 유전자로 분류하였고, 0.66배 이하인 경우 발현 감소한 유전자로 분류하였다. 그 결과, IC20 농도로 자일렌을 처리한 엑소좀 유래 샘플에서 발현이 증가한 마이크로 RNA는 31.19%(2,549개의 마이크로 RNA 중 795개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 5.73%(2,549개의 마이크로 RNA 중 146개)이며, IC50 농도로 자일렌을 처리한 엑소좀 유래 마이크로 RMA 샘플에서 발현이 증가한 마이크로 RNA는 37.07%(2,549개의 마이크로 RNA 중 945개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 2.28%(2,549개의 마이크로 RNA 중 58개)였다.
세포주 유래 마이크로 RNA의 경우는 IC20 농도에서 과발현 마이크로 RNA 2.86%(2,549개의 마이크로 RNA 중 73개)이고, 저발현 마이크로 RNA는 1.02%(2,549개의 마이크로 RNA 중 26개)이었다. 또한, IC50 농도에서 과발현 마이크로 RNA는 8.24%(2,549개의 마이크로 RNA 중 210개), 저발현 마이크로 RNA는 1.57%(2,549개의 마이크로 RNA 중 40개)임이 확인되었다. 이때, IC20 농도와 IC50 농도의 엑소좀 유래 마이크로 RNA와 세포주 유래 마이크로 RNA가 공통적으로 발현이 1.5배 이상 과발현 또는 저발현 되는 마이크로 RNA는 59종(과발현 58종, 저발현 1종) 이었으며 이들 마이크로 RNA들은 자일렌의 인체 노출시 독성과 관련되어 있다는 보고는 없다(표 1, 도 2, 도 3 참조).
본 발명자들은 상기 마이크로 RNA 중 과발현된 마이크로 RNA 중 11종을 선별하여, 실시간 RT-PCR(real-time reverse transcription polymerase chain reaction) 방법으로 발현 양상을 조사하였다. 그 결과, 과발현된 마이크로 RNA 5종의 발현 양상이 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩 결과와 유사하게 나타남을 확인하였다(표 5).
이들 마이크로 RNA 등록번호는 하기와 같았다.
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0012735 (hsa-miR-718, Homo sapiens hsa-miR-718),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004761 (hsa-miR-483-5p, Homo sapiens hsa-miR-483-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018085 (hsa-miR-3663-3p, Homo sapiens hsa-miR-3663-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019069 (hsa-miR-4530, Homo sapiens hsa-miR-4530), 및
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005929 (hsa-miR-1275, Homo sapiens hsa-miR-1275).
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 마이크로 RNA 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보 가닥 분자가 합성/집적된 자일렌에 대한 노출 여부 확인용 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 바이오마커 마이크로 RNA의 15 내지 20개의 핵산을 포함한다.
본 발명의 자일렌 검색용 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다.
구체적으로, 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 마이크로 RNA 분자로 이용하여 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 잉크젯 방식 등을 사용하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 일 실시예에서는 SurePrint 잉크젯 마이크로 드롭핑 마이크로어레이(inkjet micro dropping microarray)를 이용하였다.
상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 구체적으로 에폭시(epoxy), 아미노-실란(amino-silane), 폴리-엘-리신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 에폭시가 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 자일렌 노출 여부 확인용 키트가 제공된다.
또한, 상기 키트는 인간 혈액 세포를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 구체적으로 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3를 사용하였다.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 각각의 마이크로 RNA에 상보적이고, 상기 각각의 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 모든 프라이머를 포함하는 자일렌 노출 여부 확인용 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 1) 실험군인 피검개체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 엑소좀을 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 체세포에서 RNA를 추출하고, 단계 1)에서 분리한 엑소좀에서 RNA를 추출하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군의 체세포 및 엑소좀에서 추출된 RNA와, 대조군의 체세포 및 엑소좀에서 추출된 RNA를 각각 다른 형광물질로 표지하는 단계;
4) 단계 3)의 형광물질로 표지된 RNA를 상기 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
5) 단계 4)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 모든 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 자일렌 노출 여부 확인 방법이 제공된다.
상기 자일렌 노출 여부 확인 방법에 있어서, 상기 체세포는 구체적으로 인간의 혈액 세포인 것이나 이에 한정되지 않고, 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 자일렌 노출 여부 확인 방법에 있어서, 인간 혈액 세포는 구체적으로 HL-60인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 자일렌 노출 여부 확인 방법에 있어서, 상기 형광물질은 구체적으로 Cy3, Cy5, 폴리 엘-리신-플루오레세인 이소티오시안산염(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-비-이소티오시안산염(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 자일렌 노출 여부 확인 방법에 있어서, 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩은 구체적으로 Agilent Human miRNA array 8 X 60K Release 21.0 (Agilent, 미국)등을 사용하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 마이크로 RNA 중 본 발명에서 상기 공통적으로 발현이 변화된 마이크로 RNA(표 1 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 가장 바람직한 것은 상기 본 발명자가 제작한 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이다.
상기 자일렌 노출 여부 확인 방법에 있어서, 단계 5)의 분석 방법은 구체적으로 GeneSpring GX 11 소프트웨어(Agilent, 미국)를 사용하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 1) 실험군인 피검개체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 엑소좀을 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 체세포에서 RNA를 추출하고, 단계 1)에서 분리한 엑소좀에서 RNA를 추출하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군의 체세포 및 엑소좀에서 추출된 RNA와, 대조군의 체세포 및 엑소좀에서 추출된 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;
4) 단계 3)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
5) 단계 4)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 자일렌 노출 여부 확인 방법이 제공된다.
상기 자일렌 노출 여부 확인 방법에 있어서, 단계 1)의 체세포는 구체적으로 인간의 혈액 세포인 것이나 이에 한정되지 않고, 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 자일렌 노출 여부 확인 방법에 있어서, 인간 혈액 세포는 구체적으로 HL-60인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 자일렌 노출 여부 확인 방법에 있어서, 단계 4)의 프라이머는 본 발명에서 탐색된 바이오마커 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머라면 모두 사용 가능하다.
상기 프라이머는 하기 프라이머 1 내지 5로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 바이오마커 마이크로 RNA를 증폭할 수 있으며 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 프라이머는 모두 사용 가능하다:
프라이머 1 - 서열번호 1(5'CUUCCGCCCCGCCGGGCGUCG)로 기재된 프라이머;
프라이머 2 - 서열번호 2(5'AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG)로 기재된 프라이머;
프라이머 3 - 서열번호 3(5'UGAGCACCACACAGGCCGGGCGC)로 기재된 프라이머;
프라이머 4 - 서열번호 4(5'CCCAGCAGGACGGGAGCG)로 기재된 프라이머; 및
프라이머 5 - 서열번호 5(5'GUGGGGGAGAGGCUGUC)로 기재된 프라이머.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예 1 : 자일렌의 세포독성 확인
1-1. 세포배양
인간 혈액 세포주인 HL-60 세포(한국 세포주 은행)를 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지(Gibco, 미국)를 이용하여 T75 플라스크(flask)에서 80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 휘발성 유기 화합물의 하나로서 위해성을 가지고 있는 물질인 자일렌을 선정하였으며, DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.
1-2. 세포독성 실험( MTT assay) 및 화학 물질 처리
Mossman 등(J. Immunol . Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 HL-60 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다.
구체적으로, 세포는 50㎖ 튜브에 1 × 106/튜브 세포수로 RPMI 배지(Gibco, 미국)에서 DMSO에 용해된 자일렌을 처리하고 3시간 배양한 후에 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 3㎖에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.
그 결과, HL-60 세포주에서 자일렌의 세포독성에 80% 생존율을 보이는 농도(IC20)는 1.14 mM, 50% 생존율을 보이는 농도(IC50)는 2.74 mM이었으며, 상기 결과를 바탕으로 하기 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
실시예 2 : 엑소좀 분리
상기 실시예 1-1에서 배양한 세포의 배지에서 엑소좀을 분리하기 위하여 ExoQuick-TC™ Exosome Isolation Reagent (SBI System Biosciences cat. no. EXOTC-SAM)을 이용하여 제조사에서 제시한 방법대로 엑소좀을 수득하였다. 노란색을 띄는 엑소좀 펠릿(pellet)을 관찰하였으며, 도 1에 나타낸 바와 같이, TEM 이미지와 사이즈 분석을 통해서 엑소좀이 잘 분리되었음을 확인하였다.
실시예 3 : 마이크로어레이 실험을 통해 자일렌에 의한 마이크로 RNA의 발현 양상 확인
3-1. 표적 마이크로 RNA의 분리
1 × 106 세포/㎖ 농도로 50㎖ 튜브에 HL-60 세포를 분주한 후, 상기 실시예 <1-2>에서 결정한 자일렌의 농도들을 3 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, 미국)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하였다. 엑소좀 전체 RNA는 세포주에서와 동일하게 트리졸(trizol)시약을 사용하여 분리하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase 세트(set)(Qiagen, 미국)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 농도는 분광광도계인 NanoDrop ND 1000 분광광도계(spectrophotometer)(NanoDrop Technologies Inc., 미국)를 이용하여 측정하였다.
3-2. 표지된 마이크로 RNA 제조 및 형광 물질 표지
마이크로 RNA 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <3-1>에서 수득한 자일렌 처리군의 전체 RNA에 형광 물질을 표지하였다.
구체적으로, 형광 표지는 Agilent사의 miRNA 완전한 라벨링 및 혼성화 키트(complete labeling and Hybridization kit)를 사용하여 제조사의 방법대로 수행하였다.
상기 수득한 전체 RNA 2?l(100 ng)에 0.4 ul의 10 X CIP 완충용액, 1.1 ul의 핵산분해효소 자유수(nuclease-free water), 0.5 ul의 캐프 인테스터널 포스파타아제(Calf Intestinal Phosphatase)를 넣고 37에서 30분간 반응시킨 후 2.8 ul의 100% DMSO를 첨가하여 100%에서 5 내지 10분간 반응시키고 즉시 얼음으로 옮겼다. 염료(dye)를 붙여주기 위해 1 ul의 10 X T4 RNA 리가아제(Ligase) 완충용액, 3 ul의 Cyanine3-pCp, 0.5 ul의 T4 RNA 리가아제(ligase)를 넣고 16에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 라벨링(labeling) 된 시료를 Micro Bio-Spin 6 컬럼(column)을 사용하여 정제하였다.
정제된 RNA를 55의 진공 농축기(vacuum concentrator)에서 완전히 말려 18 ul의 핵산분해효소 자유수로 녹인 후 4.5 ul의 10 X GE 차단 에이전트(Blocking Agent)를 넣고 22.5 ul의 2 X Hi-RPM 혼성화 완충용액(Hybridization buffer)을 넣어주었다. 준비된 시료를 100에서 5분간 반응시키고 즉시 얼음으로 옮겨 5분간 반응시킨 다음 혼성화 반응에 사용하였다.
3-3. 혼성화 반응
혼성화 및 세척 과정을 이바이오젠(서울, 한국)의 지시방법에 따라 수행하였다. 혼성화를 20시간 동안 55 오븐에서 수행하였다. 마이크로 RNA 마이크로어레이 칩은 인간 miRNA 어레이(array) Release 21.0(Agilent, 미국)을 이용하였다.
3-4. 형광 이미지 획득을 통한 마이크로 RNA 발현 양상 확인
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Agilent C 스캐너(scanner)(Agilent technologies, 미국)로 스캔 하였으며 추출된 데이터를 Agilent GeneSpring GX 11(Agilent technologies)를 이용하여 정상화(normalization)를 거쳐 각 유전자의 발현양상을 분석하였다.
그 결과, 표 1, 도 2, 도 3에 나타낸 바와 같이 올리고 칩 상에 존재하는 대략 2,549개의 마이크로 RNA 중에서 IC20 농도로 자일렌을 처리한 엑소좀 유래 샘플에서 발현이 증가한 마이크로 RNA는 31.19%(2,549개의 마이크로 RNA 중 795개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 5.73%(2,549개의 마이크로 RNA 중 146개)이며, IC50 농도로 자일렌을 처리한 엑소좀 유래 마이크로 RMA 샘플에서 발현이 증가한 마이크로 RNA는 37.07%(2,549개의 마이크로 RNA 중 945개), 발현이 감소한 마이크로 RNA는 2.28%(2,549개의 마이크로 RNA 중 58개)이었다.
세포주 유래 마이크로 RNA의 경우는 IC20 농도에서 과발현 마이크로 RNA 2.86%(2,549개의 마이크로 RNA 중 73개)이고, 저발현 마이크로 RNA는 1.02%(2,549개의 마이크로 RNA 중 26개)이었다. 또한 IC50 농도에서 과발현 마이크로 RNA는 8.24%(2,549개의 마이크로 RNA 중 210개), 저발현 마이크로 RNA는 1.57%(2,549개의 마이크로 RNA 중 40개)임이 확인되었다. 이 때,IC20 농도와 IC50 농도의 엑소좀 유래 마이크로 RNA와 세포주 유래 마이크로 RNA가 공통적으로 발현이 1.5배 이상 과발현 또는 저발현 되는 마이크로 RNA는 59종 (과발현 58종, 저발현 1종) 이 있다는 것을 확인하였다. (표 1, 도 2, 도 3 참조).
등록번호 마이크로 RNA명 Fold Change
엑소좀 IC20 엑소좀 IC50 세포주 IC20 세포주 IC50
MIMAT0004507 hsa-miR-92a-1-5p 0.08 0.08 0.12 0.12
MIMAT0019019 hsa-miR-4485-3p 1.62 1.93 1.62 4.39
MIMAT0022929 hsa-miR-758-5p 1.89 2.26 37.86 101.91
MIMAT0002821 hsa-miR-181d-5p 2.15 2.69 1.72 2.41
MIMAT0027616 hsa-miR-6858-5p 1.95 2.88 1.87 6.22
MIMAT0019015 hsa-miR-4481 3.32 3.02 14.13 35.71
MIMAT0019779 hsa-miR-4690-5p 3.67 3.59 16.86 25.81
MIMAT0023700 hsa-miR-6075 3.57 4.86 15.34 24.31
MIMAT0023698 hsa-miR-6073 3.07 5.94 17.58 67.49
MIMAT0000772 hsa-miR-345-5p 1.87 7.27 8.45 21.22
MIMAT0023693 hsa-miR-6068 6.39 7.45 1.50 3.13
MIMAT0003237 hsa-miR-572 6.28 7.76 1.85 3.54
MIMAT0022941 hsa-miR-1227-5p 6.56 7.77 1.64 3.48
MIMAT0005880 hsa-miR-1290 3.15 8.13 1.69 2.97
MIMAT0018085 hsa-miR-3663-3p 3.26 9.27 2.55 7.69
MIMAT0027470 hsa-miR-6785-5p 4.88 9.68 1.81 4.51
MIMAT0027436 hsa-miR-6768-5p 4.02 11.02 14.72 23.94
MIMAT0019071 hsa-miR-4532 5.30 11.21 1.65 4.63
MIMAT0025855 hsa-miR-6723-5p 4.87 11.26 35.01 37.85
MIMAT0028113 hsa-miR-7108-5p 6.13 11.66 1.89 3.99
MIMAT0030987 hsa-miR-8060 6.25 12.24 14.63 39.35
MIMAT0019913 hsa-miR-4763-3p 5.85 13.49 1.51 2.87
MIMAT0019793 hsa-miR-4698 8.04 13.95 36.04 110.76
MIMAT0004595 hsa-miR-135a-3p 7.01 14.95 9.39 45.91
MIMAT0012735 hsa-miR-718 4.98 15.99 16.66 45.95
MIMAT0018981 hsa-miR-4459 10.85 16.83 1.67 3.48
MIMAT0027404 hsa-miR-6752-5p 7.22 16.91 18.62 70.77
MIMAT0019878 hsa-miR-4745-5p 11.12 17.70 1.61 2.68
MIMAT0003240 hsa-miR-575 9.87 19.57 2.05 5.33
MIMAT0027450 hsa-miR-6775-5p 7.13 20.11 17.35 56.94
MIMAT0022709 hsa-miR-652-5p 7.81 21.11 18.36 26.74
MIMAT0021127 hsa-miR-5195-3p 11.97 22.10 13.91 42.95
MIMAT0019868 hsa-miR-4739 8.50 22.44 1.83 3.85
MIMAT0022838 hsa-miR-1185-1-3p 7.15 23.46 17.74 43.96
MIMAT0020924 hsa-miR-642a-3p 7.03 23.82 2.05 4.38
MIMAT0000457 hsa-miR-188-5p 10.42 24.61 1.51 2.73
MIMAT0018929 hsa-miR-4417 9.92 25.61 16.27 43.21
MIMAT0019069 hsa-miR-4530 13.20 26.56 1.60 3.46
MIMAT0022942 hsa-miR-1229-5p 10.38 32.04 1.79 3.66
MIMAT0005929 hsa-miR-1275 9.48 32.41 1.55 3.29
MIMAT0023252 hsa-miR-5787 19.66 33.76 2.41 5.66
MIMAT0018444 hsa-miR-642b-3p 11.95 34.62 1.77 3.35
MIMAT0016901 hsa-miR-4271 11.00 37.95 18.95 60.39
MIMAT0016852 hsa-miR-4298 11.78 45.87 2.02 2.52
MIMAT0024599 hsa-miR-6126 34.92 46.23 1.66 2.60
MIMAT0016900 hsa-miR-4270 18.81 47.30 1.61 3.19
MIMAT0003299 hsa-miR-630 45.79 56.46 2.73 7.65
MIMAT0018104 hsa-miR-3679-5p 45.52 62.89 1.68 3.68
MIMAT0027620 hsa-miR-6769b-5p 14.66 69.26 3.28 7.30
MIMAT0022496 hsa-miR-5703 55.02 72.35 2.73 7.70
MIMAT0019978 hsa-miR-4800-5p 19.74 76.62 34.34 95.56
MIMAT0005793 hsa-miR-320c 20.81 81.17 1.75 3.77
MIMAT0028111 hsa-miR-7107-5p 23.11 81.58 1.72 4.09
MIMAT0004761 hsa-miR-483-5p 24.40 87.49 2.00 5.72
MIMAT0028211 hsa-miR-7150 25.72 88.31 2.09 5.44
MIMAT0019936 hsa-miR-4778-5p 24.90 112.12 32.93 111.59
MIMAT0027634 hsa-miR-6867-5p 31.33 123.89 34.15 121.35
MIMAT0025476 hsa-miR-6510-5p 34.91 151.33 1.90 4.83
MIMAT0028117 hsa-miR-7110-5p 39.93 153.52 1.51 3.15
실시예 4 : 실시간 RT- PCR (Real-time reverse transcription polymerase chain reaction)을 통한 마이크로 RNA의 발현 변화 확인
두 가지 농도의 자일렌 노출에 의해 공통으로 발현이 변화된 마이크로 RNA 59종 중 5종의 마이크로 RNA를 선별하였다. 이들 마이크로 RNA들은,
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0012735 (hsa-miR-718, Homo sapiens hsa-miR-718),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0004761 (hsa-miR-483-5p, Homo sapiens hsa-miR-483-5p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0018085 (hsa-miR-3663-3p, Homo sapiens hsa-miR-3663-3p),
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0019069 (hsa-miR-4530, Homo sapiens hsa-miR-4530), 및
마이크로 RNA 등록번호 (miRbase) MIMAT0005929 (hsa-miR-1275, Homo sapiens hsa-miR-1275).
상기 마이크로 RNA들의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 상기 마이크로 RNA를 특이적으로 발현할 수 있는 프라이머를 제작하여(표 2), My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR)(Bio-rad, 미국)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다.
등록번호 마이크로 RNA명 Mature마이크로RNA프라이머서열 (5'→3')
MIMAT0012735 hsa-miR-718 5'CUUCCGCCCCGCCGGGCGUCG (서열번호 1)
MIMAT0004761 hsa-miR-483-5p 5'AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG (서열번호 2)
MIMAT0018085 hsa-miR-3663-3p 5'UGAGCACCACACAGGCCGGGCGC (서열번호 3)
MIMAT0019069 hsa-miR-4530 5'CCCAGCAGGACGGGAGCG (서열번호 4)
MIMAT0005929 hsa-miR-1275 5'GUGGGGGAGAGGCUGUC (서열번호 5)
4-1. cDNA 제조
마이크로 RNA 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <3-1>에서 수득한 자일렌 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다.
구체적으로, cDNA 제조는 Qiagen사의 miScript RT 키트를 사용하여 제조사의 방법대로 수행하였다. 상기 수득한 세포주 유래 전체 RNA 1 ㎍과 엑소좀 유래 전체 RNA 0.5㎍을 하기 표 3과 같이 시약을 혼합한 후 37에서 60분간 반응시킨 후 95에서 5분간 반응시켜 역전사 효소(Reverse Transcriptase)를 불활성화시켰다.
구성 부피(㎕)
RT 완충용액(buffer) 4
RNase-자유수(free water) 잔량(variable)
역전사 효소 믹스(Reverse Trascriptase Mix) 1
주형(Template) 1㎕까지
총 부피 20
4-2. PCR 산물 정량을 통한 마이크로 RNA 발현 변화 확인
PCR 산물을 정량하기 위하여 Qiagen사의 miScript 사이버그린(SYBR Green) PCR 키트를 사용하여 PCR을 수행하였다. 사이버그린 I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저, 하기 표 4와 같이 PCR에 이용한 표적 마이크로 RNA와 Universal 프라이머, 그리고 내재성(endogenous) 대조군(RNU6B2)에 대한 프라이머를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 각각의 프라이머(표 2)를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다.
구성 부피(㎕)
사이버 그린 마스터 믹스(SYBR Green Master Mix) 5
Universal 프라이머(Primer) 1
프라이머(primer) 1
RNase-자유수(free water) 3.8
주형(Template) cDNA 0.2
그 결과, 표 5에서 나타난 바와 같이 과발현된 마이크로 RNA 5종의 발현 양상이 자일렌 의한 마이크로 RNA 발현을 조사한 마이크로 RNA 마이크로어레이 결과와 유사하게 나타남을 확인하였다.
  in vitro 상대적 비율
마이크로 RNA명 마이크로어레이 실시간 PCR
엑소좀 세포주 엑소좀 세포주
Systematic Name XylIC20 XylIC50 XylIC20 XylIC50 XylIC20 XylIC50 XylIC20 XylIC50
hsa-miR-718 4.98 15.99 16.66 45.95 35.75 40.32 1.56 4.73
hsa-miR-483-5p 24.40 87.49 2.00 5.72 362.88 239.96 1.92 6.77
hsa-miR-3663-3p 3.26 9.27 2.55 7.69 46.42 44.84 1.71 2.88
hsa-miR-4530 13.20 26.56 1.60 3.46 84.84 134.99 1.62 3.19
hsa-miR-1275 9.48 32.41 1.55 3.29 46.42 59.3 1.84 2.82
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명은 인체에 다양한 질병을 유발하는 등 독성작용을 갖는 자일렌의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하게 사용할 수 있으며, 자일렌에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 하기 모든 마이크로 RNA 또는 그의 상보가닥 분자가 모두 집적된 자일렌(xylene) 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩:
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004507(hsa-miR-92a-1-5p,Homo sapienshsa-miR-92a-1-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019019(hsa-miR-4485-3p,Homo sapienshsa-miR-4485-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022929(hsa-miR-758-5p,Homo sapienshsa-miR-758-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0002821(hsa-miR-181d-5p,Homo sapienshsa-miR-181d-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027616(hsa-miR-6858-5p,Homo sapienshsa-miR-6858-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019015(hsa-miR-4481, Homo sapienshsa-miR-4481),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019779(hsa-miR-4690-5p,Homo sapienshsa-miR-4690-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023700(hsa-miR-6075, Homo sapienshsa-miR-6075),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023698(hsa-miR-6073, Homo sapienshsa-miR-6073),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0000772(hsa-miR-345-5p,Homo sapienshsa-miR-345-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023693(hsa-miR-6068,Homo sapienshsa-miR-6068),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0003237(hsa-miR-572, Homo sapienshsa-miR-572),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022941(hsa-miR-1227-5p,Homo sapienshsa-miR-1227-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005880(hsa-miR-1290,Homo sapienshsa-miR-1290),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018085(hsa-miR-3663-3p,Homo sapienshsa-miR-3663-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027470(hsa-miR-6785-5p,Homo sapienshsa-miR-6785-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027436(hsa-miR-6768-5p,Homo sapienshsa-miR-6768-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019071(hsa-miR-4532,Homo sapienshsa-miR-4532),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0025855(hsa-miR-6723-5p,Homo sapienshsa-miR-6723-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028113(hsa-miR-7108-5p,Homo sapienshsa-miR-7108-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0030987(hsa-miR-8060,Homo sapienshsa-miR-8060),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019913(hsa-miR-4763-3p,Homo sapienshsa-miR-4763-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019793(hsa-miR-4698,Homo sapienshsa-miR-4698),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004595(hsa-miR-135a-3p,Homo sapienshsa-miR-135a-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0012735(hsa-miR-718, Homo sapienshsa-miR-718),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018981(hsa-miR-4459,Homo sapienshsa-miR-4459),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027404(hsa-miR-6752-5p,Homo sapienshsa-miR-6752-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019878(hsa-miR-4745-5p,Homo sapienshsa-miR-4745-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0003240(hsa-miR-575, Homo sapienshsa-miR-575),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027450(hsa-miR-6775-5p,Homo sapienshsa-miR-6775-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022709(hsa-miR-652-5p,Homo sapienshsa-miR-652-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0021127(hsa-miR-5195-3p,Homo sapienshsa-miR-5195-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019868(hsa-miR-4739,Homo sapienshsa-miR-4739),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022838(hsa-miR-1185-1-3p,Homo sapienshsa-miR-1185-1-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0020924(hsa-miR-642a-3p,Homo sapienshsa-miR-642a-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0000457(hsa-miR-188-5p,Homo sapienshsa-miR-188-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018929(hsa-miR-4417,Homo sapienshsa-miR-4417),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019069(hsa-miR-4530, Homo sapienshsa-miR-4530),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022942(hsa-miR-1229-5p,Homo sapienshsa-miR-1229-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005929(hsa-miR-1275, Homo sapienshsa-miR-1275),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023252(hsa-miR-5787,Homo sapienshsa-miR-5787),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018444(hsa-miR-642b-3p,Homo sapienshsa-miR-642b-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0016901(hsa-miR-4271,Homo sapienshsa-miR-4271),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0016852(hsa-miR-4298,Homo sapienshsa-miR-4298),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0024599(hsa-miR-6126,Homo sapienshsa-miR-6126),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0016900(hsa-miR-4270,Homo sapienshsa-miR-4270),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0003299(hsa-miR-630, Homo sapienshsa-miR-630),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018104(hsa-miR-3679-5p,Homo sapienshsa-miR-3679-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027620(hsa-miR-6769b-5p,Homo sapienshsa-miR-6769b-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022496(hsa-miR-5703,Homo sapienshsa-miR-5703),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019978(hsa-miR-4800-5p,Homo sapienshsa-miR-4800-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005793(hsa-miR-320c,Homo sapienshsa-miR-320c),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028111(hsa-miR-7107-5p,Homo sapienshsa-miR-7107-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004761(hsa-miR-483-5p,Homo sapienshsa-miR-483-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028211(hsa-miR-7150,Homo sapienshsa-miR-7150),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019936(hsa-miR-4778-5p,Homo sapienshsa-miR-4778-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027634(hsa-miR-6867-5p,Homo sapienshsa-miR-6867-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0025476(hsa-miR-6510-5p,Homo sapienshsa-miR-6510-5p), 및
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028117(hsa-miR-7110-5p,Homo sapienshsa-miR-7110-5p).
  2. 제1항에 있어서, 상기 마이크로 RNA는 하기 마이크로 RNA인 자일렌(xylene) 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩:
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0012735(hsa-miR-718, Homo sapienshsa-miR-718),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004761(hsa-miR-483-5p,Homo sapienshsa-miR-483-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018085(hsa-miR-3663-3p,Homo sapienshsa-miR-3663-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019069(hsa-miR-4530,Homo sapienshsa-miR-4530), 및
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005929(hsa-miR-1275,Homo sapienshsa-miR-1275).
  3. 제1항 또는 제2항의 마이크로어레이 칩을 포함하는 자일렌 노출 여부 확인용 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 키트는 인간 혈액 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 자일렌 노출 여부 확인용 키트.
  5. 하기 각각의 마이크로 RNA에 상보적이고, 상기 각각의 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 모든 프라이머를 포함하는 자일렌 노출 여부 확인용 키트:
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004507(hsa-miR-92a-1-5p,Homo sapienshsa-miR-92a-1-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019019(hsa-miR-4485-3p,Homo sapienshsa-miR-4485-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022929(hsa-miR-758-5p,Homo sapienshsa-miR-758-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0002821(hsa-miR-181d-5p,Homo sapienshsa-miR-181d-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027616(hsa-miR-6858-5p,Homo sapienshsa-miR-6858-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019015(hsa-miR-4481, Homo sapienshsa-miR-4481),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019779(hsa-miR-4690-5p,Homo sapienshsa-miR-4690-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023700(hsa-miR-6075, Homo sapienshsa-miR-6075),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023698(hsa-miR-6073, Homo sapienshsa-miR-6073),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0000772(hsa-miR-345-5p,Homo sapienshsa-miR-345-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023693(hsa-miR-6068,Homo sapienshsa-miR-6068),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0003237(hsa-miR-572, Homo sapienshsa-miR-572),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022941(hsa-miR-1227-5p,Homo sapienshsa-miR-1227-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005880(hsa-miR-1290,Homo sapienshsa-miR-1290),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018085(hsa-miR-3663-3p,Homo sapienshsa-miR-3663-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027470(hsa-miR-6785-5p,Homo sapienshsa-miR-6785-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027436(hsa-miR-6768-5p,Homo sapienshsa-miR-6768-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019071(hsa-miR-4532,Homo sapienshsa-miR-4532),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0025855(hsa-miR-6723-5p,Homo sapienshsa-miR-6723-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028113(hsa-miR-7108-5p,Homo sapienshsa-miR-7108-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0030987(hsa-miR-8060,Homo sapienshsa-miR-8060),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019913(hsa-miR-4763-3p,Homo sapienshsa-miR-4763-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019793(hsa-miR-4698,Homo sapienshsa-miR-4698),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004595(hsa-miR-135a-3p,Homo sapienshsa-miR-135a-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0012735(hsa-miR-718, Homo sapienshsa-miR-718),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018981(hsa-miR-4459,Homo sapienshsa-miR-4459),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027404(hsa-miR-6752-5p,Homo sapienshsa-miR-6752-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019878(hsa-miR-4745-5p,Homo sapienshsa-miR-4745-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0003240(hsa-miR-575, Homo sapienshsa-miR-575),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027450(hsa-miR-6775-5p,Homo sapienshsa-miR-6775-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022709(hsa-miR-652-5p,Homo sapienshsa-miR-652-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0021127(hsa-miR-5195-3p,Homo sapienshsa-miR-5195-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019868(hsa-miR-4739,Homo sapienshsa-miR-4739),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022838(hsa-miR-1185-1-3p,Homo sapienshsa-miR-1185-1-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0020924(hsa-miR-642a-3p,Homo sapienshsa-miR-642a-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0000457(hsa-miR-188-5p,Homo sapienshsa-miR-188-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018929(hsa-miR-4417,Homo sapienshsa-miR-4417),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019069(hsa-miR-4530, Homo sapienshsa-miR-4530),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022942(hsa-miR-1229-5p,Homo sapienshsa-miR-1229-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005929(hsa-miR-1275, Homo sapienshsa-miR-1275),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0023252(hsa-miR-5787,Homo sapienshsa-miR-5787),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018444(hsa-miR-642b-3p,Homo sapienshsa-miR-642b-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0016901(hsa-miR-4271,Homo sapienshsa-miR-4271),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0016852(hsa-miR-4298,Homo sapienshsa-miR-4298),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0024599(hsa-miR-6126,Homo sapienshsa-miR-6126),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0016900(hsa-miR-4270,Homo sapienshsa-miR-4270),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0003299(hsa-miR-630, Homo sapienshsa-miR-630),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018104(hsa-miR-3679-5p,Homo sapienshsa-miR-3679-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027620(hsa-miR-6769b-5p,Homo sapienshsa-miR-6769b-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0022496(hsa-miR-5703,Homo sapienshsa-miR-5703),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019978(hsa-miR-4800-5p,Homo sapienshsa-miR-4800-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005793(hsa-miR-320c,Homo sapienshsa-miR-320c),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028111(hsa-miR-7107-5p,Homo sapienshsa-miR-7107-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004761(hsa-miR-483-5p,Homo sapienshsa-miR-483-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028211(hsa-miR-7150,Homo sapienshsa-miR-7150),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019936(hsa-miR-4778-5p,Homo sapienshsa-miR-4778-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0027634(hsa-miR-6867-5p,Homo sapienshsa-miR-6867-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0025476(hsa-miR-6510-5p,Homo sapienshsa-miR-6510-5p), 및
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0028117(hsa-miR-7110-5p,Homo sapienshsa-miR-7110-5p).
  6. 제5항에 있어서, 상기 마이크로 RNA는 하기 마이크로 RNA인 자일렌 노출 여부 확인용 키트:
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0012735(hsa-miR-718, Homo sapienshsa-miR-718),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0004761(hsa-miR-483-5p,Homo sapienshsa-miR-483-5p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0018085(hsa-miR-3663-3p,Homo sapienshsa-miR-3663-3p),
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0019069(hsa-miR-4530,Homo sapienshsa-miR-4530), 및
    마이크로 RNA 등록번호 (miRbase)MIMAT0005929(hsa-miR-1275,Homo sapienshsa-miR-1275).
  7. 1) 실험군인 피검개체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 엑소좀을 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 체세포에서 RNA를 추출하고, 단계 1)에서 분리한 엑소좀에서 RNA를 추출하는 단계;
    3) 단계 2)의 실험군의 체세포 및 엑소좀에서 추출된 RNA와, 대조군의 체세포 및 엑소좀에서 추출된 RNA를 각각 다른 형광물질로 표지하는 단계;
    4) 단계 3)의 형광물질로 표지된 RNA를 제1항 또는 제2항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
    5) 단계 4)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
    6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 상기 마이크로어레이 칩에 집적된 모든 마이크로 RNA의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 자일렌 노출 여부 확인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 체세포는 인간의 혈액 세포인 것을 특징으로 하는 자일렌 노출 여부 확인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 인간 혈액 세포는 HL-60인 것을 특징으로 하는 자일렌 노출 여부 확인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 엘-리신-플루오레세인 이소티오시안산염(poly Llysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-비-이소티오시안산염(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는 자일렌 노출 여부 확인 방법.
  11. 1) 실험군인 피검개체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 엑소좀을 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 체세포에서 RNA를 추출하고, 단계 1)에서 분리한 엑소좀에서 RNA를 추출하는 단계;
    3) 단계 2)의 실험군의 체세포 및 엑소좀에서 추출된 RNA와, 대조군의 체세포 및 엑소좀에서 추출된 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;
    4) 단계 3)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 제1항 또는 제2항의 마이크로어레이 칩에 집적된 마이크로 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    5) 단계 4)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 자일렌 노출 여부 확인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 체세포는 인간의 혈액 세포인 것을 특징으로 하는 자일렌 노출 여부 확인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 인간 혈액 세포는 HL-60인 것을 특징으로 하는 자일렌 노출 여부 확인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 프라이머는 하기 프라이머 1 내지 5를 포함하는 것을 특징으로 하는 자일렌 노출 여부 확인 방법:
    프라이머 1 - 서열번호 1(5'CUUCCGCCCCGCCGGGCGUCG)로 기재된 프라이머;
    프라이머 2 - 서열번호 2(5'AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG)로 기재된 프라이머;
    프라이머 3 - 서열번호 3(5'UGAGCACCACACAGGCCGGGCGC)로 기재된 프라이머;
    프라이머 4 - 서열번호 4(5'CCCAGCAGGACGGGAGCG)로 기재된 프라이머; 및
    프라이머 5 - 서열번호 5(5'GUGGGGGAGAGGCUGUC)로 기재된 프라이머.
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