KR100974228B1 - 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커 및 이를이용한 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 구체적으로 다양한 최기형성 유발 약물에 공통적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오마커는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 새로운 최기형성 및 부작용의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 최기형성을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
최기형성 약물, 마이크로어레이
Description
본 발명은 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커 및 이를 이용한 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 최기형성 유발 약물에 공통적으로 유전자 발현 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 방법에 관한 것이다.
일상생활에서 처방약으로 쓰이는 많은 물질들 중에서 생체에 작용하여 태아나 신생아에 유전자돌연변이·염색체이상·핵산대사이상·세포막이상 및 효소의 저해나 결손, 영양이나 에너지의 부족 등을 일으키며 이와 같은 변화와 함께 세포의 사망, 세포 내의 대사나 형태적 분화의 장애가 일어나 기형에 이어지는 게 하는 약물들이 있다. 미국 FDA 에서는 이런 약물들을 실험동물, 역학 조사등을 통해 그 수위를 결정하기도 하였다(Lo WY, Friedman JM, Obstet Gynecol 2002;100:46573). 이 러한 약물들의 복용에 있어 현재까지는 태아에 기형에 대해 출산 후 태아의 상태를 관찰하고 난 후 진단할 수 밖에 없는 상황에 있다.
사람에게 나타나는 발생이상의 원인 가운데 약 70%는 알려져 있지 않으며 의약품이나 환경화학물질에서 비롯되는 기형발현은 약 2∼3%정도이다. 의약품 가운데 탈리도마이드의 항혈관신생작용(Neubert et al, (1995) Developmental model for thalidomide action. Nature 400:15001502 ; Diggle (2001) Thalidomide: 40 years on. Int J Clin Pract 55:627631)에 의한 최기형성이 보고되었으며 이외에 항종양호르몬제나 항간질제의 특정 종류에서 역학조사로 최기형성이 알려져 있다. 그중 발프론산은 엽산(folic acid) 길항작용(antagonism), 태아 조직 결합, 대사 중간체의 독성 효과 등이 거론되고 있다. 또 환경화학물질에서는 유기수은류 등이 포함된다. 이러한 화학물질의 최기형성을 추측하기 위하여 임신한 동물의 감수기에 여러 물질을 투여하고 나서 태아를 검사하고 최기형작용의 유무를 조사하는 방법이 사용되어 지고 있다.
현재 포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:10614-10619, 1996).
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20-25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer, K and Belbin, T.J., J. Am . Acad. Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성 방법에 의해 만들고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. and Belbin, T.J., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).
유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며, cDNA로 전환시킨다. cDNA 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cye3과 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K., et al ., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).
최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신 의약 후보물질은 물론 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 진단이 가능하게 될 것이다.
이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 4천개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 최기형성을 유발하는 대표적인 2종의 약물들의 유전자 발현 프로파일을 인간 태반 유례의 융모막암 세포주(JEG-3)에서 관찰 및 분석함으로써 최기형성 유발 약물에 의해 공통적으로 과발현 또는 저발현 되는 유전자를 발굴하고, 실시간(real-time) RT-PCR 방법에 의해 상기 유전자들의 발현 양상을 확인함으로써 최기형성 및 부작용 유발 약물을 검출할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 최기형성 및 부작용 유발 약물에 의해 공통적으로 과발현 또는 저발현되는 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용한 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 최기형성 및 부작용 유발 약물에 의해 자극받은 인간 태반 유례의 융모막암 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전체 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오바커를 이용한 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 키트를 제공한다.
본 발명의 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커 및 이를 이용한 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별 된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 새로운 최기형성 및 부작용의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질의 모니터링 및 판정하는데 유용하며, 최기형성을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.
본 발명은 최기형성 및 부작용 유발 약물에 의해 자극받은 인간 태반 유례의 융모막암 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커를 제공한다.
상기 최기형성 및 부작용 유발 약물은 탈리도마이드, 발프론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 제공한다: 유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AB007944(Family with sequence similarity 20, member B), 유전자 등록번호 AJ009985(Annexin A9), 유전자 등록번호 AK000652(Chromosome 20 open reading frame 57), 유전자 등록번호 AK074614[Insulin-like growth factor 2 (somatomedin A)], 유전자 등록번호 AK097654[SPT2, Suppressor of Ty, domain containing 1 (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 AK125154 (Plexin A2), 유전자 등록번호 AY358815(Neural cell adhesion molecule 1), 유전자 등록번호 BX648021(V-set domain containing T cell activation inhibitor 1), 유전자 등록번호 CR735934(Similar to hypothetical protein A230046P18; cDNA sequence BC055759), 유전자 등록번호 DQ097177(HECT, UBA and WWE domain containing 1), 유전자 등록번호 NM_001007271(Dual specificity phosphatase 13), 유전자 등록번호 NM_001618[Poly (ADP-ribose) polymerase family, member 1], 유전자 등록번호 NM_001620 [AHNAK nucleoprotein (desmoyokin)], 유전자 등록번호 NM_002762(Protamine 2), 유전자 등록번호 NM_005933[Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila)], 유전자 등록번호 NM_005971(FXYD domain containing ion transport regulator 3), 유전자 등록번호 NM_007313(V-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1), 유전자 등록번호 NM_015270(Adenylate cyclase 6), 유전자 등록번호 NM_015335(Thyroid hormone receptor associated protein 2), 유전자 등록번호 NM_024342(Glucocorticoid receptor DNA binding factor 1), 유전자 등록번호 NM_032484(Homolog of mouse LGP1), 유전자 등록번호 NM_176822(NACHT, leucine rich repeat and PYD containing 14), 유전자 등록번호 NM_178556(Hypothetical protein FLJ36180), 유전자 등록번호 THC2433340[Q93KJ6 (Q93KJ6) Dissimilatory (Bi-)sulfite reductase beta subunit (Fragment), partial (5%)], 유전자 등록번호 U80628(Thymidine kinase 2, mitochondrial), 유전자 등록번호 XM_031553(U2-associated SR140 protein), 유전자 등록번호 NM_018320(Chromosome 4 open reading frame 19), AB002308(KIAA0310), 유전자 등록번호 AB018258(ATPase, Class V, type 10B), 유전자 등록번호 AB209845(Transcription termination factor, RNA polymerase II), 유전자 등록번호 AF001893(Trophoblast-derived noncoding RNA), 유전자 등록번호 AK023574[Solute carrier family 40 (iron-regulated transporter), member 1], 유전자 등록번호 AK057515(CDNA FLJ32953 fis, clone TESTI2008099), 유전자 등록번호 AK095632[Ankyrin repeat and BTB (POZ) domain containing 2], 유전자 등록번호 AK122757(Tubulin, beta 3), 유전자 등록번호 AK125877(Hypothetical protein MGC27016), 유전자 등록번호 AK126731(Glucocorticoid induced transcript 1), 유전자 등록번호 BC035714(Cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1), 유전자 등록번호 BC036890[Grainyhead-like 3 (Drosophila)], 유전자 등록번호 BC042755(Regulator of G-protein signalling 2, 24kDa), 유전자 등록번호BC063830[ST6(alpha-N-acetyl-neuraminyl-2,3-beta-galactosyl-1,3)-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1], 유전자 등록번호 BQ186674 (Hypothetical gene supported by AF086204), 유전자 등록번호 BX111592 [Transcribed locus, moderately similar to XP_066443.6 PREDICTED: similar to paraneoplastic antigen like 6A [Homo sapiens]], 유전자 등록번호 BX649112(COBL-like 1), 유전자 등록번호 NM_000735(Glycoprotein hormones, alpha polypeptide), 유전자 등록번호 NM_001003793(RNA binding motif, single stranded interacting protein), 유전자 등록번호 NM_002356(Myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate), 유전자 등록번호 NM_004155[Serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 9], 유전자 등록번호 NM_004615(Tetraspanin 7), 유전자 등록번호 NM_005668(ST8 alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase 4), 유전자 등록번호 NM_018018(Solute carrier family 38, member 4), 유전자 등록번호 NM_181659(Nuclear receptor coactivator 3) 및 유전자 등록번호 Y18483[Solute carrier family 7(cationic amino acid transporter, y + system), member 8] 및 유전자 등록번호 AK001879(Hyperthetical protein FLJ11017).
1) 상기 바이오마커 중에서 최기형성 및 부작용 유발 약물로 자극하여 발현이 증가하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다 :
AB002308(KIAA0310), 유전자 등록번호 AB018258(ATPase, Class V, type 10B), 유전자 등록번호 AB209845(Transcription termination factor, RNA polymerase II), 유전자 등록번호 AF001893(Trophoblast-derived noncoding RNA), 유전자 등록번호 AK023574[Solute carrier family 40 (iron-regulated transporter), member 1], 유전자 등록번호 AK057515(CDNA FLJ32953 fis, clone TESTI2008099), 유전자 등록번호 AK095632[Ankyrin repeat and BTB (POZ) domain containing 2], 유전자 등록번호 AK122757(Tubulin, beta 3), 유전자 등록번호 AK125877(Hypothetical protein MGC27016), 유전자 등록번호 AK126731(Glucocorticoid induced transcript 1), 유전자 등록번호 BC035714(Cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1), 유전자 등록번호 BC036890[Grainyhead-like 3 (Drosophila)], 유전자 등록번호 BC042755(Regulator of G-protein signalling 2, 24kDa), 유전자 등록번호 BC063830[ST6 (alpha-N-acetyl-neuraminyl-2,3-beta-galactosyl-1,3)-N- acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1], 유전자 등록번호 BQ186674 (Hypothetical gene supported by AF086204), 유전자 등록번호 BX111592 [Transcribed locus, moderately similar to XP_066443.6 PREDICTED: similar to paraneoplastic antigen like 6A [Homo sapiens]], 유전자 등록번호 BX649112(COBL-like 1), 유전자 등록번호 NM_000735(Glycoprotein hormones, alpha polypeptide), 유전자 등록번호 NM_001003793(RNA binding motif, single stranded interacting protein), 유전자 등록번호 NM_002356(Myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate), 유전자 등록번호 NM_004155[Serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 9], 유전자 등록번호 NM_004615(Tetraspanin 7), 유전자 등록번호 NM_005668(ST8 alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase 4), 유전자 등록번호 NM_018018(Solute carrier family 38, member 4), 유전자 등록번호 NM_181659(Nuclear receptor coactivator 3), 유전자 등록번호 Y18483[Solute carrier family 7(cationic amino acid transporter, y + system), member 8], 유전자 등록번호 AK001879(Hyperthetical protein FLJ11017) 및 유전자 등록번호 AK000652(Chromosome 20 open reading frame 57).
2) 상기 바이오마커 중에서, 최기형성 및 부작용 유발 약물로 자극하여 발현이 감소하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다 :
유전자 등록번호(Genebank Accession No.) AB007944(Family with sequence similarity 20, member B), 유전자 등록번호 AJ009985(Annexin A9), 유전자 등록번호 AK074614[Insulin-like growth factor 2 (somatomedin A)], 유전자 등록번호 AK097654[SPT2, Suppressor of Ty, domain containing 1 (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 AK125154 (Plexin A2), 유전자 등록번호 AY358815(Neural cell adhesion molecule 1), 유전자 등록번호 BX648021(V-set domain containing T cell activation inhibitor 1), 유전자 등록번호 CR735934(Similar to hypothetical protein A230046P18; cDNA sequence BC055759), 유전자 등록번호 DQ097177(HECT, UBA and WWE domain containing 1), 유전자 등록번호 NM_001007271(Dual specificity phosphatase 13), 유전자 등록번호 NM_001618[Poly (ADP-ribose) polymerase family, member 1], 유전자 등록번호 NM_001620 [AHNAK nucleoprotein (desmoyokin)], 유전자 등록번호 NM_002762(Protamine 2), 유전자 등록번호 NM_005933[Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila)], 유전자 등록번호 NM_005971(FXYD domain containing ion transport regulator 3), 유전자 등록번호 NM_007313(V-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1), 유전자 등록번호 NM_015270(Adenylate cyclase 6), 유전자 등록번호 NM_015335(Thyroid hormone receptor associated protein 2), 유전자 등록번호 NM_024342(Glucocorticoid receptor DNA binding factor 1), 유전자 등록번호 NM_032484(Homolog of mouse LGP1), 유전자 등록번호 NM_176822(NACHT, leucine rich repeat and PYD containing 14), 유전자 등록번호 NM_178556(Hypothetical protein FLJ36180), 유전자 등록번호 THC2433340[Q93KJ6 (Q93KJ6) Dissimilatory (Bi-)sulfite reductase beta subunit (Fragment), partial (5%)], 유전자 등록번호 U80628(Thymidine kinase 2, mitochondrial), 유전자 등록번호 XM_031553(U2-associated SR140 protein) 및 유전자 등록번호 NM_018320(Chromosome 4 open reading frame 19).
본 발명자들은 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 기존에 최기형성을 유발하는 탈리도마이드 및 발프론산을 인간 태반 유래의 융모막암 세포주(JEG-3)에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 2종의 최기형성 약물은 인간 태반 유례의 융모막암 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 각각의 약물의 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 각각의 최기형성 유발 약물을 인간 태반 유례의 융모막암 세포주에 처리하고, 상기 약물을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 형광물질로 표지하였다. 상기 형광표지된 44 k Human whole genome 올리고마이크로어레이 칩(Agilent, USA)과 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2 참조). 분석시 Cy5/Cy3 비율이 1.5 배 이상을 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.666 배 이하를 발현 감소된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 발현 증가된 유전자는 탈리도마이드의 경우 0.54%(44,290개의 유전자 중 237개) 발프론산의 경우 8.87%(44,290개의 유전자 중 3927개), 발현이 감소된 유전자는 탈리도마이드의 경우 0.18%(44,290개의 유전자 중 81개), 발프론산의 경우 9.11%(44,290개의 유전자 중 4036개)임을 확인하였다(도 3 참조). 이때, 2종의 최기형성 유발 약물들에 의해 공통적으로 1.5배 이상 과발현되거나 저발현되는 유전자들을 분류하였으며, 27개의 유전자 발현이 증가하고, 26개의 유전자 발현이 감소하였다(표 2, 3 및 도 3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 최기형성을 유발하는 약물(탈리도마이드, 발프론산)을 처리했을 때, 인간 태반 유례의 융모막암 세포주에서 최기형성과 관련이 있다는 보고는 없다.
이후, 본 발명자들은 상기 유전자 중 신호전달, 운반, 전사와 그 외의 기능으로 알려진 유전자 18종을 분리하여 실시간 RT-PCR(real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 방법으로 발현 양상을 조사하였다. 그 결과, 18종의 과발현 유전자들의 유전자 발현 양상이 올리고마이크로어레이 칩 결과와 유사하게 나타남을 확인하였다(표 5 참조).
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전체 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
본 발명의 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람 직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
본 발명의 하기와 같은 과정을 포함하는 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 방법을 제공한다: 1) 인간 태반 유례의 융모막암 세포에 피검화합물을 처리하는 단계; 2) 단계 1)의 피검 화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계; 3) 단계 2)의 실험군과 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질을 표지하는 단계; 4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계; 5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및 6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 본 발명의 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 최기형성 및 부작용 유발 약물을 판별하는 단계.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 태반 유례의 융모막암 세포는 JEG-3을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 태반 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, USA) 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 지놈 중 본 발명에서 상기 공통적으로 과발현 또는 저발현 유전자(표 2 및 표 3 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
또한, 본 발명의 하기와 같은 과정을 포함하는 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 방법을 제공한다: 1) 인간 태반 유례의 융모막암 세포에 피검화합물을 처리하는 단계; 2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계; 3) 단계 2)의 RNA를, 본 발명의 바이오마커에 상보적이고 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하 여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 태반 유례의 융모막암 세포는 JEG-3을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 태반 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 프라이머는 본 발명에서 탐색된 바이오마커 유전자와 상보적이고, 바이오마커를 증폭할 수 있는 프라이머라면 모두 사용가능하다. 본 발명에서는 서열번호 1 내지 36으로 기재되는 정방향 및 역방향 프라이머 18쌍을 제시하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 본 발명은 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 검색 키트에 추가적으로 인간 태반 세포를 포함하는 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 키트를 제공한다. 상기 인간 태반 유례의 융모막암 세포는 JEG-3을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 태반 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다. 아울러, 상기 검색 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자에 상보적이고, 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 최기형성 및 부작용 유발 약품 검색용 키트를 제공한다.
상기 검색 키트의 프라이머는 서열번호 1 내지 36으로 기재되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 바이오마커에 상보적이며, 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머쌍은 모두 사용 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리
<1-1> 세포배양
인간 태반 유례의 융모막암 세포주인 JEG-3 세포(한국세포주은행, KCLB No.: 30036)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)에서 디쉬의 80% 정도 채워질 때까지 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 이미 약물 투여시 부작용으로써 최기형성을 보이는 약물인 탈리도마이드(Thalidomide) 및 발프론산(Valproic acid) 2종을 선정하였으며, 탈리도마이드는 DMSO에 , 발프론산은 물(DW)에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.
<1-2> 세포 독성 실험 (MTT assay) 및 화학 물질 처리
Mossman 등(1995)의 방법으로 JEG-3 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트(well plate)에 웰 당 5×104 세포수로 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)에서 24 시간 동안 처리하여 부착시켰다. 각 매질에 용해된 2종의 최기형성 유발 약물(탈리도마이드, 발프론산)들을 처리하고 48시간 후에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) powder를 DMSO에 4 ㎎/㎖을 혼합하여 웰 당 75㎕ 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.
JEG-3 세포주에서 각 최기형성 유발 약물들의 세포독성을 살펴본 결과, 30% 생존율을 보이는 농도(IC30)는 탈리도마이드의 경우 1.10 ㎎/㎖, 발프론산은 1.23㎎/㎖ 이었으며(도 1), 상기 농도들로 결정하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
<실시예 2> 마이크로어레이 실험
<2-1> 표적 RNA의 분리 및 형광 물질 표지
1.8×105 cell/㎖ 농도로 100 mm 디쉬에 JEG-3 세포에 분주한 후, 24 시간 후 실시예 1-2에서 결정된 각 최기형성 유발 약물들의 농도대로 각 최기형성 유발 약물들을 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 농도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)와 아가로스 젤 전기영동으로 확인하였다.
<2-2> 표지된 cDNA 제조
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시예 2-1에서 수득한 최기형성 유발 약물 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 표 1과 같이 시약을 혼합하였다.
| 구성 | 부피(㎕) |
| 5X first strand buffer | 6 |
| dNTPs | 0.6 |
| 0.1 M DDT | 3 |
| SuperScript II enzyme | 3 |
| Cy-3 or Cy-5 dUTP | 2 |
대조군인 JEG-3 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)으로 표지화하였고, 최기형성 유발 약물들을 처리한 JEG-3 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)를 표지화 하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제되었다.
<2-3>
혼성화
반응
혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로 36k 마이크로어레이 Human V4.0 OpArray(Operon, Germany)를 이용하였다. 세척(2분간 2×SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1×SSC, 2분간 0.2×SSC에 세척) 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.
<2-4> 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon Instruments, USA)로 스캔하였다. 결합되지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)로 분석하였다. 이렇게 얻어진 데이터로부터 각각의 최기형성 유발 약물에 대한 마커 유전자를 선별하였다(도 2).
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 4천 개의 유전자 중에서 분석시 Cy5/Cy3 비율이 1.5 배 이상을 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.666 배 이하를 발현 감소된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 발현 증가된 유전자는 탈리도마이드의 경우 0.54% (44,290개의 유전자 중 237개) 발프론산의 경우 8.87%(44,290개의 유전자 중 3927개), 발현이 감소된 유전자는 탈리도마이드의 경우 0.18%(44,290개의 유전자 중 81개), 발프론산의 경우 9.11%(44,290개의 유전자 중 4036개)임을 확인하였다(도 3 참조). 이때, 2종의 최기형성 유발 약물들에 의해 공통적으로 1.5배 이상 과발현 되거나 저발현 되는 유전자들을 분류하였으며, 27개의 유전자 발현이 증가하고, 26개의 유전자 발현이 감소하였다
* THA : 탈리도마이드
VPA : 발프론산
* THA : 탈리도마이드
VPA : 발프론산
<실시예 3> 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction) 정량
최기형성 유발 약물에 의해 발현 유도된 상기 실시예 2의 과발현 및 저발현된 유전자들 중 신호전달, 수송, 전사등의 기전 관련 유전자를 선별하였다. 이들 유전자들은 유전자 등록번호(Gene Bank Accession No.) NM_181659(Nuclear receptor coactivator 3), 유전자 등록번호 NM_000735(Glycoprotein hormones, alpha polypeptide), 유전자 등록번호 BC042755(Regulator of G-protein signalling 2, 24kDa), 유전자 등록번호 AB018258(ATPase, Class V, type 10B), 유전자 등록번호 BC035714(Cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1), 유전자 등록번호 Y18483[Solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system), member 8], 유전자 등록번호 BC036890[Grainyhead-like 3 (Drosophila)], 유전자 등록번호 NM_032484(Homolog of mouse LGP1), 유전자 등록번호 NM_002356(Myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate), 유전자 등록번호 NM_004615(Tetraspanin 7), 유전자 등록번호 AK095632[Ankyrin repeat and BTB (POZ) domain containing 2], 유전자 등록번호 NM_018320(Chromosome 4 open reading frame 19), 유전자 등록번호 AK126731(Glucocorticoid induced transcript 1), 유전자 등록번호 NM_001003793(RNA binding motif, single stranded interacting protein), 유전자 등록번호 NM_004155rpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 9], 유전자 등록번호 NM_018018(Solute carrier family 38, member 4), 유전자 등록번호 AK023574[Solute carrier family 40 (iron-regulated transporter), member 1] 및 유전자 등록번호 BX648021(V-set domain containing T cell activation inhibitor 1) 이다.
상기 유전자들의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR)(Bio-rad, USA)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다.
구체적으로, 올리고 dT 프라이머와 Superscript kit(Omniscipt™ kit, Qiagen, Co., USA)를 이용하여 역전사반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA 0.2 ㎕와 물 3.8 ㎕, 센스 프라이머 0.5 ㎕, 안티센스 프라이머 0.5 ㎕, 사이버그린 I 염색 수퍼믹스(Bio-rad, USA) 5 ㎕ 를 혼합하여, PCR 튜브에 담아 단계 1: 95℃, 3분; 단계 2(45회 반복): 단계 2-1: 95℃, 10초; 단계 2-2: 55 내지 65℃ 45초; 단계 3: 95℃, 1분; 단계 4: 55℃, 1분; 단계 5(반복 80회): 55℃, 10초로 프로그램을 설계한 My IQ 실시간 PCR 기계에서 반응을 수행하였다. 사이버그린 I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저 PCR에 이용한 표적 유전자와 내재성(endogenous) 대조군(GAPDH)에 대한 프라이머(서열번호 37 및 서열번호 38)를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 각각의 프라이머 (표 4)를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 실시간 RT-PCR을 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다(표 5).
그 결과, 18종의 과발현 및 저발현 유전자들의 유전자 발현 양상은 최기형성 유발 약물들에 의한 유전자 발현을 조사한 올리고 마이크로어레이 결과와 매우 유사하게 나타남을 확인하였다.
도 1은 최기형성 유발 약물(탈리도마이드, 발프론산)의 인간 태반 유례의 융모막암 세포주에서의 세포 독성을 조사한 그래프이다:
A : 탈리도마이드(THA) MTT 어세이 결과; 및
B : 발프론산(VPA) MTT 어세이 결과.
도 2는 마이크로어레이 칩을 이용한 최기형성 유발물질을 처리한 인간 태반 유례의 융모막암 세포주의 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 최기형성 유발 약물들에 의해 공통적으로 발현 변화하는 유전자의 개수를 도식화한 밴다이어그램 도면이다.
<110> Korea Institute of Science and Technology
<120> A biomarker and screening method of drug having teratogenicity
and side effects using thereof
<130> 7p-08-59
<160> 38
<170> KopatentIn 1.71
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<213> Artificial Sequence
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ataccaggtc ctggctactg 20
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accgaaacaa caccgaaaag 20
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gtggagcaca ttgaggaggt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BC036890 antisense primer
<400> 28
gtggagcaca ttgaggaggt 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NM_032484 sense primer
<400> 29
agcagcaacc ctgagtcaat 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NM_032484 antisense primer
<400> 30
cccgcaggaa gtacatgaat 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NM_002356 sense primer
<400> 31
caccttcttc ctctgccttg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NM_002356 antisense primer
<400> 32
tggcaatgtt atgcaccact 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NM_004615 sense primer
<400> 33
gagctcgtag ctggcatttc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NM_004615 antisense primer
<400> 34
agttctgcac accacagcag 20
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AK095632 sense primer
<400> 35
actgcttcag ccactcagc 19
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AK095632 antisense primer
<400> 36
gacagcacgt ccgctttag 19
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH sense primer
<400> 37
tgcaccacca actgcttagc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH antisense primer
<400> 38
ggcatggact gtggtcatga 20
Claims (15)
- 하기 모든 유전자의 핵산서열의 전부 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 탈리도마이드(Thalidomide)와 발프론산(Valproic aicd)에 대한 태아 발생 과정 관련 유전자 발현 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩:서열번호 39의 염기서열을 갖는 유전자 등록번호 NM_005668(SIAT8D, ST8 alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase 4), 서열번호 40의 염기서열을 갖는 유전자 등록번호 NM_004155(SERPINB9, Serpin peptidase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 9), 서열번호 41의 염기서열을 갖는 유전자 등록번호 BC036890(GRHL3, Grainyhead-like 3(Drosophila)), 서열번호 42의 염기서열을 갖는 유전자 등록번호 AK122757(TUBB3, Tubulin, beta 3), 서열번호 43의 염기서열을 갖는 유전자 등록번호 AK095632(ABTB2, Ankyrin repeat and BTB(POZ) domain containing 2)), 서열번호 44의 염기서열을 갖는 유전자 등록번호 AK023574(SLC40A1, Solute carrier family 40(iron- regulated transporter), member 1), 서열번호 45의 염기서열을 갖는 유전자 등록번호 AK125154(PLXNA2, Plexin A2), 서열번호 46의 염기서열을 갖는 유전자 등록번호 NM_001620(AHNAK, AHNAK nucleoprotein(desmoyokin)), 서열번호 47의 염기서열을 갖는 유전자 등록번호 NM_007313(ABL1, V-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1), 서열번호 48의 염기서열을 갖는 유전자 등록번호 NM_176822(NLRP14, NACHT, leucine rich repeat and PYD), 서열번호 49의 염기서열을 갖는 유전자 등록번호 NM_024342(GRLF1, Glucocorticoid receptor DNA binding factor 1), 서열번호 50의 염기서열을 갖는 유전자 등록번호 NM_005933(MLL, Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia(trithorax homolog, Drosophila)), 서열번호 51의 염기서열을 갖는 유전자 등록번호 NM_002762(PRM2, Protamine 2).
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- 1) 인간 태반 유래의 융모막암 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;5) 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및6) 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 탈리도마이드와 발프론산에 대한 태아 발생 과정 관련 유전자 발현 여부 확인 방법.
- 제 6항에 있어서, 단계 1)의 인간 태반 유래의 융모막암 세포는 JEG-3 세포인 것을 특징으로 하는 탈리도마이드와 발프론산에 대한 태아 발생 과정 관련 유전자 발현 여부 확인 방법.
- 제 6항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluoresceinisothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 탈리도마이드와 발프론산에 대한 태아 발생 과정 관련 유전자 발현 여부 확인 방법.
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- 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 탈리도마이드와 발프론산에 대한 태아 발생 과정 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트.
- 제 12항에 있어서, 인간 태반 유례의 융모막암 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 탈리도마이드와 발프론산에 대한 태아 발생 과정 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트.
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|---|---|---|---|
| KR1020070117317A KR100974228B1 (ko) | 2007-11-16 | 2007-11-16 | 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커 및 이를이용한 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 방법 |
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2007
- 2007-11-16 KR KR1020070117317A patent/KR100974228B1/ko not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (3)
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Also Published As
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