KR20080045987A - 발프론산의 최기형성 검색용 바이오마커 및 이를 이용한검색 방법 - Google Patents

발프론산의 최기형성 검색용 바이오마커 및 이를 이용한검색 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20080045987A
KR20080045987A KR1020060115345A KR20060115345A KR20080045987A KR 20080045987 A KR20080045987 A KR 20080045987A KR 1020060115345 A KR1020060115345 A KR 1020060115345A KR 20060115345 A KR20060115345 A KR 20060115345A KR 20080045987 A KR20080045987 A KR 20080045987A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
genebank
registration number
protein
gene registration
Prior art date
Application number
KR1020060115345A
Other languages
English (en)
Inventor
류재천
김연정
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to KR1020060115345A priority Critical patent/KR20080045987A/ko
Publication of KR20080045987A publication Critical patent/KR20080045987A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 발프론산 (valproic acid)의 최기형성 검색용 바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 구체적으로 발프론산에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 발프론산의 검색 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오마커는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 간질 및 조울증 등과 같은 질환 치료시 발프론산에 의한 최기형성 및 부작용을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 발프론산이 최기형성 및 부작용을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
Figure P1020060115345
발프론산, 바이오마커, 마이크로어레이

Description

발프론산의 최기형성 검색용 바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법{Biomarker and screening method of valproic acid having teratogenicity using thereof}
도 1은 발프론산의 인간 융모막암 세포주에서의 세포 독성을 조사한 그래프이다.
도 2는 각 Cy3 및 Cy5로 표지된 발프론산 처리 및 비처리군 유전자들을 마이크로어레이 칩에 혼성화한 후 형광 강도를 스케터 플랏(scatter plot)으로 분석한 것이고,
도 3은 마이크로어레이 칩을 이용한 발프론산를 처리한 인간 융모막암 세포주의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명은 발프론산의 최기형성 검색용 바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 발프론산에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감 소하는 바이오마커 및 이를 이용한 발프론산의 검색 방법에 관한 것이다.
임상적으로 널리 이용되고 있는 여러가지 항경련제가 태아에 있어 기형원(teratogen)으로 작용할 수 있다는 점에 대하여는 많은 보고가 있으며, 동물실험에 있어서도 일부 항경련제의 기형발생에 대한 연구가 이루어지고 있다. 임산부에서 간질의 치료를 위하여 항경련제를 투여해야 하는 경우가 많은데 특히 디페닐히단토인(diphenylhydantoin)은 태아에서 하이단토인 증후군(hydantoin syndrome)을 일으키며, 발프론산은 이분척추증(spina bifida)을 잘 일으키고, 페노바르비탈(phenobarbital)도 디페닐히단토인과 유사한 안면열(facial clefts), 발달장애 등을 일으키는 것으로 보고되고 있다6). 항경련제가 선천성 기형을 유발시키는 기전에 대하여는 명확히 밝혀지지 않았으나 가능성 있는 기전으로서 엽산(folic acid) 길항작용(antagonism), 태아 조직 결합, 대사 중간체의 독성 효과 등이 거론되고 있다.
발프론산은 억제성신경전달물질 GABA의 합성효소인 글루탐산 탈탄산효소 (GAD)의 활성을 높이고 GABA의 유리를 항진시키며, 대사효소인 GABA-T의 활성을 억제하여 GABA 활성을 항진시킨다. 또한 전압의존성 나트륨통로와 T-형 칼슘 통로를 억제하고 칼륨의 전도를 촉진한다. 이 외에 흥분성신경전달물질 아스팜산의 뇌 농도를 저하시킨다. 발프론산의 항경련 작용은 이들 중 어느 한 기전에 의하기보다는 다양한 작용들에 의한 것으로 추정된다. 발프론산의 부작용은 앞서 언급한 바와 같이 태아에서 기형 유발의 위험이 높은 물질로 FDA에서 카테고리 D 군으로 분류하여 임부가 이 약물을 복용하는 동안에는 주의를 요하도록 권고하고 있다. 그 외 위장관계나 내분비계 및 중추신경계에서 두통 및 불안감 등에서 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.
이와 같은 부작용 때문에 환자들이 발프론산을 처방받을 시엔 적절한 모니터링이 필수적이며, 최근 약물유전체학적 접근법의 증가로 발프론산의 세포내 흡수 및 대사에 관여하는 효소들의 유전적 다양성을 조사하는 방법에 대한 연구도 진행중이다.
이처럼 발프론산의 인체내 부작용에도 불구하고, 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 고전적인 방법에 국한되어 있어 보다 빠르고 정확한 위해성 평가 방법을 통해 인체에서의 부작용을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 발프론산을 이용한 치료 및 진단에 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.
포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고 되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996).
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20-25 염기쌍(base pair) 길이 의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer, K and Belbin, T.J., J. Am. Acad. Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성 방법에 의해 만들고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. and Belbin, T.J., J. Am. Acad. Dermatol. 51:681-692, 2004).
유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며, cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cye3과 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K., et al., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).
최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에 서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 진단이 가능하게 될 것이다.
이에, 본 발명자들은 인간 유전자 4만 1천개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 발프론산의 유전자 발현 프로파일을 인간 융모막암 세포인 JEG-3 세포주에서 관찰 및 분석함으로써 발프론산에 의해 과발현 또는 저발현 되는 유전자를 발굴하고 발현 양상을 확인함으로써 발프론산을 검출할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 발프론산에 의해 과발현 또는 저발현되는 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용한 발프론산 검색 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 발프론산에 의해 자극받은 인간 융모막암 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 발프론산 검색용 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 발프론산 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오바커를 이용한 발프론산 검색 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 발프론산 검색 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 발프론산에 의해 자극받은 인간 융모막암 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 발프론산 검색용 바이오마커를 제공한다.
상기 바이오마커는 아팝토시스(apoptosis), 신경 재생(neurogenesis) 및 발달(development)에 관련된 유전자들 및 발현이 4배 이상 증가 및 감소한 유전자들로 구성되어 있다.
본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 제공한다: 유전자 등록번호(Genebank) NM_001465[FYN binding protein (FYB-120/130)], 유전자 등록번호 NM_005953(Metallothionein 2A), 유전자 등록번호 NM_005931(MHC class I polypeptide-related sequence B), 유전자 등록번호 NM_021626(Serine carboxypeptidase 1), 유전자 등록번호 NM_145058(Hypothetical protein MGC7036), 유전자 등록번호 NM_003311(CD63 molecule), 유전자 등록번호 AF316855(Hypothetical protein FLJ22795), 유전자 등록번호 NM_006705(Growth arrest and DNA-damage-inducible, gamma), 유전자 등록번호 NM_022157(Ras-related GTP binding C), 유전자 등록번호 NM_001005360(Dynamin 2), 유전자 등록 번호 NM_006290(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3), 유전자 등록번호 NM_002305[Lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)], 유전자 등록번호 BC051787[NACHT, leucine rich repeat and PYD (pyrin domain) containing 1], 유전자 등록번호 NM_001446(Fatty acid binding protein 7, brain), 유전자 등록번호 NM_001386(Dihydropyrimidinase-like 2), 유전자 등록번호 NM_015103(Plexin D1), 유전자 등록번호 NM_002165(Inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 NM_002166(Inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 NM_002167(Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 NM_152243[CDC42 effector protein (Rho GTPase binding) 1], 유전자 등록번호 NM_012234(RING1 and YY1 binding protein), 유전자 등록번호 NM_002389(CD46 molecule, complement regulatory protein), 유전자 등록번호 AB044807[InaD-like (Drosophila)], 유전자 등록번호 NM_017512(Enolase superfamily member 1), 유전자 등록번호 NM_018269(Acireductone dioxygenase 1), 유전자 등록번호 NM_004403(Deafness, autosomal dominant 5), 유전자 등록번호 AK094629(CDNA FLJ37310 fis, clone BRAMY2016706), 유전자 등록번호 NM_005139(Annexin A3), 유전자 등록번호 NM_199286(Developmental pluripotency associated 3), 유전자 등록번호 NM_024091(Hypothetical protein MGC5297), 유전자 등록번호 NM_005871(Survival motor neuron domain containing 1), 유전자 등록번호 NM_018147(Fas apoptotic inhibitory molecule), 유전자 등록번호 NM_006265[RAD21 homolog (S. pombe)], 유전자 등록번호 NM_020371(Apoptosis, caspase activation inhibitor), 유전자 등록번호 NM_004331(BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like), 유전자 등록번호 NM_000254(5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase), 유전자 등록번호 NM_205842(NCK-associated protein 1), 유전자 등록번호 NM_006522(Wingless-type MMTV integration site family, member 6), 유전자 등록번호 AA399656[Nerve growth factor receptor (TNFRSF16) associated protein 1], 유전자 등록번호 NM_004010[Dystrophin (muscular dystrophy, Duchenne and Becker types)], 유전자 등록번호 NM_016441[Cysteine rich transmembrane BMP regulator 1 (chordin-like)].
1) 상기 바이오마커 중에서 발프론산으로 자극하여 발현이 증가하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다: 유전자 등록번호(Genebank) NM_001465[FYN binding protein (FYB-120/130)], 유전자 등록번호 NM_005953(Metallothionein 2A), 유전자 등록번호 NM_005931(MHC class I polypeptide-related sequence B), 유전자 등록번호 NM_021626(Serine carboxypeptidase 1), 유전자 등록번호 NM_145058(Hypothetical protein MGC7036), 유전자 등록번호 NM_003311(CD63 molecule), 유전자 등록번호 AF316855(Hypothetical protein FLJ22795), 유전자 등록번호 NM_006705(Growth arrest and DNA-damage-inducible, gamma), 유전자 등록번호 NM_022157(Ras-related GTP binding C), 유전자 등록번호 NM_001005360(Dynamin 2), 유전자 등록번호 NM_006290(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3), 유전자 등록번호 NM_002305[Lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)], 유전자 등록번호 BC051787[NACHT, leucine rich repeat and PYD (pyrin domain) containing 1], 유전자 등록번호 NM_001446(Fatty acid binding protein 7, brain), 유전자 등록번호 NM_001386(Dihydropyrimidinase-like 2), 유전자 등록번호 NM_015103(Plexin D1), 유전자 등록번호 NM_002165(Inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 NM_002166(Inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 NM_002167(Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 NM_152243[CDC42 effector protein (Rho GTPase binding) 1], 유전자 등록번호 NM_012234(RING1 and YY1 binding protein).
2) 상기 바이오마커 중에서, 발프론산으로 자극하여 발현이 감소하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다: 유전자 등록번호 NM_002389(CD46 molecule, complement regulatory protein), 유전자 등록번호 AB044807[InaD-like (Drosophila)], 유전자 등록번호 NM_017512(Enolase superfamily member 1), 유전자 등록번호 NM_018269(Acireductone dioxygenase 1), 유전자 등록번호 NM_004403(Deafness, autosomal dominant 5), 유전자 등록번호 AK094629(CDNA FLJ37310 fis, clone BRAMY2016706), 유전자 등록번호 NM_005139(Annexin A3), 유전자 등록번호 NM_199286(Developmental pluripotency associated 3), 유전자 등록 번호 NM_024091(Hypothetical protein MGC5297), 유전자 등록번호 NM_005871(Survival motor neuron domain containing 1), 유전자 등록번호 NM_018147(Fas apoptotic inhibitory molecule), 유전자 등록번호 NM_006265[RAD21 homolog (S. pombe)], 유전자 등록번호 NM_020371(Apoptosis, caspase activation inhibitor), 유전자 등록번호 NM_004331(BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like), 유전자 등록번호 NM_000254(5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase), 유전자 등록번호 NM_205842(NCK-associated protein 1), 유전자 등록번호 NM_006522(Wingless-type MMTV integration site family, member 6), 유전자 등록번호 AA399656[Nerve growth factor receptor (TNFRSF16) associated protein 1], 유전자 등록번호 NM_004010[Dystrophin (muscular dystrophy, Duchenne and Becker types)], 유전자 등록번호 NM_016441[Cysteine rich transmembrane BMP regulator 1 (chordin-like)].
본 발명자들은 발프론산의 최기형성 검색 및 진단용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 발프론산을 인간 융모막암 세포주(JEG-3)에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 발프론산은 인간 융모막암 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 발프론산의 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 발프론산을 인간 융모막암 세포주에 처리하고, 상기 약제를 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 형광물질(Cy5)로 표지하였으며, 화학물질을 처리하지 않은 대조군의 경우 Cy3로 표지하였다. 상기 형광표지된 cDNA를 44 k 올리고마이크로어레이 칩 Whole human genome oligmicroarray(Agilent, USA)과 혼 성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2 참조). 분석시 Cy5/Cy3 비율이 2.0 배 이상인 경우 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.5 배 이하인 경우 발현 감소된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 발현 증가된 유전자는 0.43%(44,290개의 유전자 중 192개) 그리고 발현이 감소된 유전자는 0.95%(44,290개의 유전자 중 423개) 임을 확인하였다(도 3 참조). 이들 유전자들을 기능별로 분류하여 아팝토시스(apoptosis), 신경 재생(neurogenesis) 및 발달(development)에 관련된 유전자들 및 발현이 4배 이상 증가 및 감소한 유전자들을 선별하였다(표 2 및 표3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 발프론산을 처리 했을 때, 인간 융모막암 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 발프론산 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
본 발명의 발프론산 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레 이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
또한, 본 발명은 상기 바이오바커를 이용한 발프론산의 최기형성 검색 및 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 하기와 같은 과정을 포함하는 발프론산의 최기형성 검색 및 진단 검색 방법을 제공한다: 1) 인간 융모막암 세포에 피검화합물을 처리하는 단계; 2) 단계 1)의 피검 화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계; 3) 단계 2)의 실험군과 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질을 표지하는 단계; 4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계; 5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및 6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 본 발명의 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 융모막암 세포는 JEG-3를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 자궁 세포 및 조직에서 유 래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 44k 올리고마이크로어레이 Whole human genome oligomicroarray (Agilent, USA) 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 지놈 중 본 발명에서 상기 공통적으로 과발현 또는 저발현 유전자(표 2 및 표 3 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 융모막암 세포는 JEG-3를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 자궁 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 프라이머는 본 발명에서 탐색된 바이오마커 유전자와 상보적이고, 바이오마커를 증폭할 수 있는 프라이머라면 모두 사용가능하다.
아울러, 본 발명은 발프론산의 최기형성 검색 및 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 발프 론산의 최기형성 검색 및 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 검색 키트에 추가적으로 인간 융모막암 세포를 포함하는 발프론산의 최기형성 검색 및 진단용 키트를 제공한다. 상기 인간 융모막암 세포는 JEG-3를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 자궁 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다. 아울러, 상기 검색 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자에 상보적이고, 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 발프론산의 최기형성 검색 및 진단용 키트를 제공한다.
상기 검색 키트의 프라이머는 상기 바이오마커에 상보적이며, 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머쌍은 모두 사용 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리
<1-1> 세포배양
인간 융모막암 세포주인 JEG-3 세포(HTB-36, ATCC, USA)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)를 이용하여 T75 플라스크에서 1 × 106 세포/ml이 되도록 배양하였다. 매질(vehicle)인 DMSO의 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.
<1-2> 세포 독성 실험 (MTT assay) 및 화학 물질 처리
Mossman 등 (J. Immunol. Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 JEG-3 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트에 튜브 당 2 × 105 세포수로 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)에서 DMSO에 용해된 발프론산을 처리하고 48시간 후에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 플레이트에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.
JEG-3 세포주에서 발프론산들의 세포독성을 살펴본 결과, 50% 생존율을 보이는 농도(IC50)는 5.94 mM이었으며(도 1), 상기 농도로 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
<실시예 2> 마이크로어레이 실험
<2-1> 표적 RNA의 분리 및 형광 물질 표지
1 × 106 cell/㎖ 농도로 100 mm 디쉬에 JEG-3 세포를 분주한 후, 실시예 1-2에서 결정된 발프론산의 농도대로 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 농도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)와 아가로스 젤 전기영동으로 확인하였다.
<2-2> 표지된 cDNA 제조
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시예 2-1에서 수득한 발프론산 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 표 1과 같이 시약을 혼합하였다.
구성 부피(㎕)
5X first strand buffer 6
dNTPs 0.6
0.1 M DDT 3
SuperScript II enzyme 3
Cy-3 or Cy-5 dUTP 2
대조군인 JEG-3 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)으로 표지화하였고, 발프론산을 처리한 JEG-3 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)를 표지화 하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제되었다.
<2-3> 혼성화 반응
혼성화 및 세척 과정은 디지탈지노믹스(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로 36k 마이크로어레이 Human V4.0 OpArray(Operon, Germany)를 이용하였다. 세척(2분간 2×SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1×SSC, 2분간 0.2× SSC에 세척) 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.
<2-4> 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon Instruments, USA)로 스캔하였다. 결합되지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)로 분석하였다. 이렇게 얻어진 데이터로부터 발프론산에 대한 마커 유전자를 선별하였다(도 2 및 도3).
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 1천 개의 유전자 중에서 Cy5/Cy3의 비율이 2.0배 이상으로 유전자 발현 증가를 보이는 유전자는 분석 결과, 0.43%(44,290개의 유전자 중 192개) 그리고 발현이 감소된 유전자는 0.95%(44,290개의 유전자 중 423개) 임을 확인하였다(도 3 참조). 이들 유전자들을 기능별로 분류하여 아팝토시스(apoptosis), 신경 재생(neurogenesis) 및 발달(development)에 관련된 유전자들 및 발현이 4배 이상 증가 및 감소한 유전자들을 선별하였다(표 2 및 표3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 발프론산을 처리 했을 때, 인간 융모막암 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
표 2: 발프론산에 의해 발현이 증가하는 유전자
유전자 등록번호 유전자 약어 유전자 명 중간값의 비 생물학적 기능
(a) 4배이상 증가
NM_001465 FYB FYN binding protein (FYB-120/130) 5.573 immune response
NM_005953 MT2A Metallothionein 2A 4.55 copper ion homeostasis
NM_005931 MICB MHC class I polypeptide-related sequence B 4.199 cellular defense response;response to stress
NM_021626 SCPEP1 Serine carboxypeptidase 1 4.028 proteolysis and peptidolysis
NM_145058 MGC7036 Hypothetical protein MGC7036 6.604 unknown
NM_003311 CD63 CD63 molecule 5.391 unknown
AF316855 FLJ22795 Hypothetical protein FLJ22795 4.067 unknown
(b) 기능별 선별
NM_006705 GADD45G Growth arrest and DNA-damage-inducible, gamma 2.57 apoptosis
NM_022157 RRAGC Ras-related GTP binding C 2.443 apoptosis
NM_001005360 DNM2 Dynamin 2 2.042 apoptosis
NM_006290 TNFAIP3 Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3 2.236 apoptosis
NM_002305 LGALS1 Lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1) 4.202 apoptosis
BC051787 NALP1 NACHT, leucine rich repeat and PYD (pyrin domain) containing 1 4.717 apoptosis
NM_001446 FABP7 Fatty acid binding protein 7, brain 4.218 neurogenesis
NM_001386 DPYSL2 Dihydropyrimidinase-like 2 2.068 neurogenesis
NM_015103 PLXND1 Plexin D1 3.299 development
NM_002165 ID1 Inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein 2.415 development
NM_002166 ID2 Inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein 2.5 development
NM_002167 ID3 Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein 3.007 development
NM_152243 CDC42EP1 CDC42 effector protein (Rho GTPase binding) 1 2.216 development
NM_012234 RYBP RING1 and YY1 binding protein 3.549 development
표 3: 발프론산에 의해 발현이 감소하는 유전자
유전자 등록번호 유전자 약어 유전자 명칭 중간값의 비 생물학적 기능
(a) 4배이상 감소
NM_002389 CD46 CD46 molecule, complement regulatory protein 0.238 complement activation, classical pathway
AB044807 INADL InaD-like (Drosophila) 0.152 intracellular signaling cascade
NM_017512 ENOSF1 Enolase superfamily member 1 0.224 metabolism
NM_018269 ADI1 Acireductone dioxygenase 1 0.246 methionine biosynthesis
NM_004403 DFNA5 Deafness, autosomal dominant 5 0.231 perception of sound
AK094629 -- CDNA FLJ37310 fis, clone BRAMY2016706 0.233 biological_process unknown
NM_005139 ANXA3 Annexin A3 0.232 biological_process unknown
NM_199286 DPPA3 Developmental pluripotency associated 3 0.224 biological_process unknown
(b) 기능별 선별
NM_024091 MGC5297 Hypothetical protein MGC5297 0.493 apoptosis
NM_005871 SMNDC1 Survival motor neuron domain containing 1 0.487 apoptosis
NM_018147 FAIM Fas apoptotic inhibitory molecule 0.304 apoptosis
NM_006265 RAD21 RAD21 homolog (S. pombe) 0.462 apoptosis
NM_020371 AVEN Apoptosis, caspase activation inhibitor 0.497 apoptosis
NM_004331 BNIP3L BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like 0.437 apoptosis
NM_000254 MTR 5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase 0.474 central nervous system development
NM_205842 NCKAP1 NCK-associated protein 1 0.453 central nervous system development
NM_006522 WNT6 Wingless-type MMTV integration site family, member 6 0.408 development
AA399656 NGFRAP1 Nerve growth factor receptor (TNFRSF16) associated protein 1 0.382 development
NM_004010 DMD Dystrophin (muscular dystrophy, Duchenne and Becker types) 0.492 development
NM_016441 CRIM1 Cysteine rich transmembrane BMP regulator 1 (chordin-like) 0.403 neurogenesis
본 발명의 발프론산의 최기형성 검색 및 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 발프론산 검색 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 발프론산의 부작용 모니터링 및 최기형성을 판정하는데 유용하며, 발프론산에 의해 야기되는 최기형성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

Claims (11)

  1. 하기의 군으로부터 선택되는 유전자를 포함하는 발프론산의 최기형성 검색 및 진단용 바이오마커:
    유전자 등록번호(Genebank) NM_001465[FYN binding protein (FYB-120/130)], 유전자 등록번호 NM_005953(Metallothionein 2A), 유전자 등록번호 NM_005931(MHC class I polypeptide-related sequence B), 유전자 등록번호 NM_021626(Serine carboxypeptidase 1), 유전자 등록번호 NM_145058(Hypothetical protein MGC7036), 유전자 등록번호 NM_003311(CD63 molecule), 유전자 등록번호 AF316855(Hypothetical protein FLJ22795), 유전자 등록번호 NM_006705(Growth arrest and DNA-damage-inducible, gamma), 유전자 등록번호 NM_022157(Ras-related GTP binding C), 유전자 등록번호 NM_001005360(Dynamin 2), 유전자 등록번호 NM_006290(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3), 유전자 등록번호 NM_002305[Lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)], 유전자 등록번호 BC051787[NACHT, leucine rich repeat and PYD (pyrin domain) containing 1], 유전자 등록번호 NM_001446(Fatty acid binding protein 7, brain), 유전자 등록번호 NM_001386(Dihydropyrimidinase-like 2), 유전자 등록번호 NM_015103(Plexin D1), 유전자 등록번호 NM_002165(Inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 NM_002166(Inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 NM_002167(Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 NM_152243[CDC42 effector protein (Rho GTPase binding) 1], 유전자 등록번호 NM_012234(RING1 and YY1 binding protein), 유전자 등록번호 NM_002389(CD46 molecule, complement regulatory protein), 유전자 등록번호 AB044807[InaD-like (Drosophila)], 유전자 등록번호 NM_017512(Enolase superfamily member 1), 유전자 등록번호 NM_018269(Acireductone dioxygenase 1), 유전자 등록번호 NM_004403(Deafness, autosomal dominant 5), 유전자 등록번호 AK094629(CDNA FLJ37310 fis, clone BRAMY2016706), 유전자 등록번호 NM_005139(Annexin A3), 유전자 등록번호 NM_199286(Developmental pluripotency associated 3), 유전자 등록번호 NM_024091(Hypothetical protein MGC5297), 유전자 등록번호 NM_005871(Survival motor neuron domain containing 1), 유전자 등록번호 NM_018147(Fas apoptotic inhibitory molecule), 유전자 등록번호 NM_006265[RAD21 homolog (S. pombe)], 유전자 등록번호 NM_020371(Apoptosis, caspase activation inhibitor), 유전자 등록번호 NM_004331(BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like), 유전자 등록번호 NM_000254(5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase), 유전자 등록번호 NM_205842(NCK-associated protein 1), 유전자 등록번호 NM_006522(Wingless-type MMTV integration site family, member 6), 유전자 등록번호 AA399656[Nerve growth factor receptor (TNFRSF16) associated protein 1], 유전자 등록번호 NM_004010[Dystrophin (muscular dystrophy, Duchenne and Becker types)], 유전자 등록번호 NM_016441[Cysteine rich transmembrane BMP regulator 1 (chordin-like)].
  2. 제 1항에 있어서, 하기 유전자가 발프론산의 처리에 의하여 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 바이오마커:
    유전자 등록번호(Genebank) NM_001465[FYN binding protein (FYB-120/130)], 유전자 등록번호 NM_005953(Metallothionein 2A), 유전자 등록번호 NM_005931(MHC class I polypeptide-related sequence B), 유전자 등록번호 NM_021626(Serine carboxypeptidase 1), 유전자 등록번호 NM_145058(Hypothetical protein MGC7036), 유전자 등록번호 NM_003311(CD63 molecule), 유전자 등록번호 AF316855(Hypothetical protein FLJ22795), 유전자 등록번호 NM_006705(Growth arrest and DNA-damage-inducible, gamma), 유전자 등록번호 NM_022157(Ras-related GTP binding C), 유전자 등록번호 NM_001005360(Dynamin 2), 유전자 등록번호 NM_006290(Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3), 유전자 등록번호 NM_002305[Lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)], 유전자 등록번호 BC051787[NACHT, leucine rich repeat and PYD (pyrin domain) containing 1], 유전자 등록번호 NM_001446(Fatty acid binding protein 7, brain), 유전자 등록번호 NM_001386(Dihydropyrimidinase-like 2), 유전자 등록번호 NM_015103(Plexin D1), 유전자 등록번호 NM_002165(Inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 NM_002166(Inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 NM_002167(Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 NM_152243[CDC42 effector protein (Rho GTPase binding) 1], 유전자 등록번호 NM_012234(RING1 and YY1 binding protein).
  3. 제 1항에 있어서, 하기 유전자가 발프론산의 처리에 의하여 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 바이오마커:
    유전자 등록번호 NM_002389(CD46 molecule, complement regulatory protein), 유전자 등록번호 AB044807[InaD-like (Drosophila)], 유전자 등록번호 NM_017512(Enolase superfamily member 1), 유전자 등록번호 NM_018269(Acireductone dioxygenase 1), 유전자 등록번호 NM_004403(Deafness, autosomal dominant 5), 유전자 등록번호 AK094629(CDNA FLJ37310 fis, clone BRAMY2016706), 유전자 등록번호 NM_005139(Annexin A3), 유전자 등록번호 NM_199286(Developmental pluripotency associated 3), 유전자 등록번호 NM_024091(Hypothetical protein MGC5297), 유전자 등록번호 NM_005871(Survival motor neuron domain containing 1), 유전자 등록번호 NM_018147(Fas apoptotic inhibitory molecule), 유전자 등록번호 NM_006265[RAD21 homolog (S. pombe)], 유 전자 등록번호 NM_020371(Apoptosis, caspase activation inhibitor), 유전자 등록번호 NM_004331(BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like), 유전자 등록번호 NM_000254(5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase), 유전자 등록번호 NM_205842(NCK-associated protein 1), 유전자 등록번호 NM_006522(Wingless-type MMTV integration site family, member 6), 유전자 등록번호 AA399656[Nerve growth factor receptor (TNFRSF16) associated protein 1], 유전자 등록번호 NM_004010[Dystrophin (muscular dystrophy, Duchenne and Becker types)], 유전자 등록번호 NM_016441[Cysteine rich transmembrane BMP regulator 1 (chordin-like)].
  4. 제 1항에 있어서, 최기형성 유발물질은 발프론산으로 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커.
  5. 제 1항의 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 발프론산 검색용 DNA 마이크로어레이 칩.
  6. 1) 인간 융모막암 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
    3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
    4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 5항의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
    5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
    6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 제 1항의 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 발프론산의 최기형성 검색 및 진단 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 단계 1)의 인간 융모막암 세포는 JEG-3 세포, 1차 인간 자궁 세포 및 유사 조직으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 검색 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 검색 방법.
  9. 제 5항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 발프론산 검색용 키트.
  10. 제 11항에 있어서, 인간 융모막암 세포인 JEG-3 세포, 1차 인간 자궁 세포 및 유사 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 융모막암 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 발프론산의 최기형성 검색 및 진단용 키트.
  11. 제 1항의 바이오마커에 상보적이고 마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 발프론산 검색 키트.
KR1020060115345A 2006-11-21 2006-11-21 발프론산의 최기형성 검색용 바이오마커 및 이를 이용한검색 방법 KR20080045987A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060115345A KR20080045987A (ko) 2006-11-21 2006-11-21 발프론산의 최기형성 검색용 바이오마커 및 이를 이용한검색 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060115345A KR20080045987A (ko) 2006-11-21 2006-11-21 발프론산의 최기형성 검색용 바이오마커 및 이를 이용한검색 방법

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110059226A Division KR101131843B1 (ko) 2011-06-17 2011-06-17 발프론산의 최기형성 검색용 바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080045987A true KR20080045987A (ko) 2008-05-26

Family

ID=39663159

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020060115345A KR20080045987A (ko) 2006-11-21 2006-11-21 발프론산의 최기형성 검색용 바이오마커 및 이를 이용한검색 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20080045987A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101108694B1 (ko) * 2008-07-07 2012-01-25 한국과학기술연구원 메토트렉세이트 처리에 따른, 최기형성 유발 약물 검색용바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101108694B1 (ko) * 2008-07-07 2012-01-25 한국과학기술연구원 메토트렉세이트 처리에 따른, 최기형성 유발 약물 검색용바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Emilsson et al. Alzheimer's disease: mRNA expression profiles of multiple patients show alterations of genes involved with calcium signaling
US20110150775A1 (en) Genomic approaches to fetal treatment and diagnosis
KR101618950B1 (ko) 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 피부 자극 물질의 스크리닝 방법
KR101342035B1 (ko) 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커 및 이를이용한 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색 방법
JP2004507206A (ja) 診断上重要な組織特異的遺伝子
KR101131843B1 (ko) 발프론산의 최기형성 검색용 바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법
KR100901128B1 (ko) 탈리도마이드 처리에 따른, 최기형성 유발 약물 검색용마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법
CA2455649A1 (en) Scoring system for the prediction of cancer recurrence
KR101398548B1 (ko) 저급 지방족 포화 알데하이드류 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법
KR20080045987A (ko) 발프론산의 최기형성 검색용 바이오마커 및 이를 이용한검색 방법
KR100957055B1 (ko) 트리클로로에틸렌 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를이용한 확인 방법
KR100974228B1 (ko) 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커 및 이를이용한 최기형성 및 부작용 유발 약물 검색 방법
US20230340611A1 (en) Biomarkers For Immune Checkpoint Inhibitors Treatment
KR101749566B1 (ko) 디젤 배기 미립자(diesel exhaust particle) 노출에 따른 염증반응 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법
KR20090034011A (ko) 다이벤조에이에이취안트라센 노출 여부 확인용 바이오마커및 이를 이용한 확인 방법
KR101138954B1 (ko) 갑상선 과산화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법
KR101340949B1 (ko) 메토트렉세이트의 폐독성 검색용 바이오마커 및 이를이용한 검색 방법
KR101011155B1 (ko) 아미오다론 및 카르바마제핀 처리에 따른, 폐독성 유발약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법
KR101108694B1 (ko) 메토트렉세이트 처리에 따른, 최기형성 유발 약물 검색용바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법
KR100936286B1 (ko) 아미오다론 처리에 따른, 폐독성 유발 약물 검색용마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법
KR101927141B1 (ko) 자일렌 노출 여부 확인용 키트, 및 이를 이용한 자일렌 노출 여부 확인 방법
KR101386075B1 (ko) 헥사클로로벤젠 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법
KR100915898B1 (ko) ３―메틸콜란트렌 노출 여부 진단용 바이오마커 및 이를이용한 진단 방법
KR101383653B1 (ko) 프로피온알데히드 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법
KR101062784B1 (ko) 미렉스 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A107 Divisional application of patent
WITB Request for withdrawal (abandonment) before grant