KR100901128B1 - 탈리도마이드 처리에 따른, 최기형성 유발 약물 검색용마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 최기형성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 구체적으로 최기형성 유발 약물인 탈리도마이드 (Thalidomide)에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 마커유전자 및 이를 이용한 탈리도마이드의 검색 방법에 관한 것이다. 본 발명의 마커유전자는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 마커유전자로 이용하여 새로운 최기형성 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하며, 최기형성을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
탈리도마이드, 마커유전자, 마이크로어레이, 최기형성

Description

탈리도마이드 처리에 따른, 최기형성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법{Marker genes based on Thalidomide treatment for screening of drug inducing teratogenicity and screening method using thereof}
본 발명은 최기형성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 최기형성 유발 약물인 탈리도마이드에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 마커유전자 및 이를 이용한 최기형성 유발 약물 검색 방법에 관한 것이다.
최근에도 다발성 중증 아프타성 궤양, 만성 루프스, 한센병의 결절성 호안, 만성 숙주 편대이식반응 등의 희귀질환 치료를 위해 사용되고 있지만 탈리도마이드의 가장 잘 알려진 특징은 태아의 사지 기형을 일으키며 심장, 생식기, 신장, 소화기, 신경장애, 눈, 귀의 기형을 일으키고 태아에 대한 부작용 외에도 심각한 부작용이 있는 것으로 알려져 있다. 초기 유럽시장에서 거의 4년 동안 수면제나 진정제로 사용되었고, 임신부의 입덧에 효과가 있어서 임신부들이 많이 사용하게 되었 는데 한번의 복용으로도 태아에게 심각한 기형을 유발하게 되었다. 그러나 이런 부작용에도 항암치료 등에 효과를 나타내지 않는 다발성 골수종 등에 치료효과를 나타내기 때문에 항암제로서 조심스럽게 처방되고 있다.
탈리도마이드의 기전은 신경계 관련, 초기의 신장 관련, 혈관신생 관련, 산화적 스트레스 관련 등 여러 가지 논의되고 있으나 명확하게 밝혀지지 않았다.
탈리도마이드는 특이하게 GC 프로모터 위치에 결합한다. 이것은 혈관신생과 관련된 유전자인 IGF-1과 FGF-2의 프로모터 부위에서 다수의 GC 박스 (GGGCGG)에 결합하여 전사효율을 감소시킨다. 이것은 혈관신생을 방해하여 사지의 기형을 유발한다. 또, 발달과정 초기의 신장은 연골의 형성을 유도하여 사지조직의 형성을 돕는데 탈리도마이드는 원신에 결합하여 유도의 연골형성을 방해한다 (James and Lauri, Developmental Biology 28(1);61-70 1972). 그 외에도 신경능 유래의 세포의 분화에 영향을 준다고 보고되었으며 (McCredie, Journal of the Neurological Sciences 28(3):373-387 1976), 설치류의 배아 줄기 세포에서 ROS를 유발하고 혈관신생을 혼란시킨다고 보고되었다 (Am J Pathol, 156(1): 151-158, 2000).
포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레 이(microarray) 분석을 수행한다 (Schena, M., et al ., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 93:10614-10619, 1996).
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20-25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다 (Sellheyer, K and Belbin, T.J., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정 (photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성 방법에 의해 만들고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다 (Sellheyer, K. and Belbin, T.J., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).
유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며, cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cye3과 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다 (Somasundaram, K., et al ., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).
최근 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체 학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 진단이 가능하게 될 것이다.
이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 1천개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 항암제로서 최기형성을 유발하는 대표적 약물인 탈리도마이드 처리에 의한 유전자 발현 프로파일을 인간 태반 융모막암 세포인 JEG-3 세포주에서 관찰 및 분석함으로써 탈리도마이드에 의해 과발현 또는 저발현 되는 유전자를 발굴하고, 실시간(real-time) 정량 RT-PCR 방법에 의해 상기 유전자들의 발현 양상을 확인함으로써 최기형성 유발 약물을 검출할 수 있는 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 최기형성 유발 약물에 의해 과발현 또는 저발현되는 마커유전자 및 상기 마커유전자를 이용한 최기형성 유발 약물 검색 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 최기형성 유발 약물인 탈리도마이드에 의해 자극받은 인간 태반 융모막암 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 최기형성 유발 약물 검색용 마커유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 최기형성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자를 이용한 최기형성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 최기형성 유발 약물 검색 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 최기형성 유발 약물인 탈리도마이드에 의해 자극받은 인간 태반 융모막암 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 최기형성 유발 약물 검색용 마커유전자를 제공한다.
상기 마커유전자는 아폽토시스 (apoptosis), 임신 (pregnancy), 혈관신생 (angiogenesis), 형태형성 (morphogenesis)에 관련된 유전자로 구성되어 있다.
본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 마커유전자를 제공한다: 유전자등록번호 (Genebank) NM_032199 [AT rich interactive domain 5B (MRF1-like)], 유전자등록번호 (Genebank) BX647857 [Ankyrin repeat and SOCS box-containing 5], 유전자등록번호 (Genebank) AB018258 [ATPase, Class V, type 10B], 유전자등록번호 (Genebank) NM_013314 [B-cell linker], 유전자등록번호 (Genebank) BX111592 [Transcribed locus], 유전자등록번호 (Genebank) AK000652 [Chromosome 20 open reading frame 57], 유전자등록번호 (Genebank) NM_203403 [Chromosome 9 open reading frame 150], 유전자등록번호 (Genebank) AF239668 [Cholecystokinin B receptor], 유전자등록번호 (Genebank) AY268104 [Carboxylesterase 1 (monocyte/macrophage serine esterase 1)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_000735 [Glycoprotein hormones, alpha polypeptide], 유전자등록번호 (Genebank) BC067746 [C-type lectin domain family 1, member A], 유전자등록번호 (Genebank) CR749536 [C-type lectin domain family 7, member A], 유전자등록번호 (Genebank) AL136922 [ClpX caseinolytic peptidase X homolog (E. coli)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001874 [Carboxypeptidase M], 유전자등록번호 (Genebank) 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NM_023915 [G protein-coupled receptor 87], 유전자등록번호 (Genebank) NM_006200 [Proprotein convertase subtilisin/kexin type 5], 유전자등록번호 (Genebank) XM_496826 [NHS-like 1], 유전자등록번호 (Genebank) AK124904 [FYVE, RhoGEF and PH domain containing 6], 유전자등록번호 (Genebank) NM_006317 [Brain abundant, membrane attached signal protein 1], 유전자등록번 호 (Genebank) AL136861 [Cysteine-rich secretory protein LCCL domain containing 2], 유전자등록번호 (Genebank) AK222648 [Calbindin 2, 29kDa (calretinin)], 유전자등록번호 (Genebank) AK023628 [Hypothetical protein LOC199725], 유전자등록번호 (Genebank) NM_006907 [Pyrroline-5-carboxylate reductase 1], 유전자등록번호 (Genebank) CR622352 [Brain specific protein], 유전자등록번호 (Genebank) BC030666 [Ring finger protein 182], 유전자등록번호 (Genebank) BC053619 [Arrestin domain containing 3], 유전자등록번호 (Genebank) NM_003670 [Basic helix-loop-helix domain containing, class B, 2], 유전자등록번호 (Genebank) NM_005576 [Lysyl oxidase-like 1], 유전자등록번호 (Genebank) AF217990 [Homocysteine-inducible, endoplasmic reticulum stress-inducible, 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(Genebank) AY358127 [Leucine rich repeat and fibronectin type III domain containing 3], 유전자등록번호 (Genebank) NM_007313 [V-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1], 유전자등록번호 (Genebank) AB020647 [F-box and leucine-rich repeat protein 7], 유전자등록번호 (Genebank) NM_014476 [PDZ and LIM domain 3], 유전자등록번호 (Genebank) AK123302 [CDNA FLJ41308 fis, clone BRAMY2042612], 유전자등록번 호 (Genebank) BC063872 [Tripartite motif-containing 9], 유전자등록번호 (Genebank) AB007944 [Family with sequence similarity 20, member B], 유전자등록번호 (Genebank) AK027155 [CDNA: FLJ23502 fis, clone LNG02862], 유전자등록번호 (Genebank) NM_178556 [Hypothetical protein FLJ36180], 유전자등록번호 (Genebank) NM_003617 [Regulator of G-protein signalling 5], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001007271 [Dual specificity phosphatase 13], 유전자등록번호 (Genebank) BC045642 [Metadherin], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001618 [Poly (ADP-ribose) polymerase family, member 1], 유전자등록번호 (Genebank) AY358815 [Neural cell adhesion molecule 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_000448 [Recombination activating gene 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_178509 [Syntaxin binding protein 4], 유전자등록번호 (Genebank) AB209376 [SATB family member 2], 유전자등록번호 (GEO) A_24_P918364, 유전자등록번호 (TIGR) THC2328806, 유전자등록번호 (TIGR) THC2272137, 유전자등록번호 (TIGR) THC2433340, 유전자등록번호 (TIGR) THC2343493, 유전자등록번호 (TIGR) THC2288230, 유전자등록번호 (GEO) A_32_P145515, 유전자등록번호 (GEO) A_24_P921636.
1) 상기 마커유전자 중에서 최기형성 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 증가하는 마커유전자는 하기와 같다: 유전자등록번호 (Genebank) NM_032199 [AT rich interactive domain 5B (MRF1-like)], 유전자등록번호 (Genebank) BX647857 [Ankyrin repeat and SOCS box-containing 5], 유전자등록번호 (Genebank) AB018258 [ATPase, Class V, type 10B], 유전자등록번호 (Genebank) NM_013314 [B-cell linker], 유전자등록번호 (Genebank) BX111592 [Transcribed locus], 유전자등록번호 (Genebank) NM_203403 [Chromosome 9 open reading frame 150], 유전자등록번호 (Genebank) AY268104 [Carboxylesterase 1 (monocyte/macrophage serine esterase 1)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_000735 [Glycoprotein hormones, alpha polypeptide], 유전자등록번호 (Genebank) BC067746 [C-type lectin domain family 1, member A], 유전자등록번호 (Genebank) CR749536 [C-type lectin domain family 7, member A], 유전자등록번호 (Genebank) AL136922 [ClpX caseinolytic peptidase X homolog (E. coli)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001874 [Carboxypeptidase M], 유전자등록번호 (Genebank) CR598482 [Chymotrypsin-like], 유전자등록번호 (Genebank) NM_031226 [Cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_214462 [Dapper, antagonist of beta-catenin, homolog 2 (Xenopus laevis)], 유전자등록번호 (Genebank) AF177395 [Dickkopf homolog 2 (Xenopus laevis)], 유전자등록번호 (Genebank) AL832598 [Erythrocyte membrane protein band 4.1-like 3], 유전자등록번호 (Genebank) BX092581 [Developmental pluripotency associated 5], 유전자등록번호 (Genebank) BC064700 [Estrogen-related receptor gamma], 유전자등록번호 (Genebank) AF075292 [Fibroblast growth factor 18], 유전자등록번호 (Genebank) NM_000162 [Glucokinase (hexokinase 4, maturity onset diabetes of the young 2)], 유전자 등록번호 (Genebank) AB209105 [Huntingtin-associated protein 1 (neuroan 1)], 유전자등록번호 (Genebank) AK057515 [CDNA FLJ32953 fis, clone TESTI2008099], 유전자등록번호 (Genebank) AJ556711 [Immunoglobulin gamma heavy chain variable region (IGHV3-30.3 gene), clone 2B 3G 02], 유전자등록번호 (Genebank) R63061 [Keratin 23 (histone deacetylase inducible)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_007360 [Killer cell lectin-like receptor subfamily K, member 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_007015 [Leukocyte cell derived chemotaxin 1], 유전자등록번호 (Genebank) BC013438 [Hypothetical gene supported by BC013438], 유전자등록번호 (Genebank) NM_003681 [Pyridoxal (pyridoxine, vitamin B6) kinase], 유전자등록번호 (Genebank) CR606430 [Pregnancy specific beta-1-glycoprotein 11], 유전자등록번호 (Genebank) BC025767 [Rhophilin, Rho GTPase binding protein 1], 유전자등록번호 (Genebank) AB007937 [Syndecan 3], 유전자등록번호 (Genebank) NM_022367 [Sema domain, immunoglobulin domain (Ig), transmembrane domain (TM) and short cytoplasmic domain, (semaphorin) 4A], 유전자등록번호 (Genebank) BX649005 [Serum/glucocorticoid regulated kinase], 유전자등록번호 (Genebank) BC063830 [ST6 (alpha-N-acetyl-neuraminyl-2,3-beta-galactosyl-1,3)-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_013356 [Solute carrier family 16, member 8 (monocarboxylic acid transporter 3)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_014585 [Solute carrier family 40 (iron-regulated transporter), member 1], 유전자등록번호 (Genebank) BX648244 [Spermatogenesis associated 13], 유전자등록번호 (Genebank) AK056709 [Thrombospondin, type I, domain containing 3], 유전자등록번호 (Genebank) AY728143 [Transmembrane protein 16A], 유전자등록번호 (Genebank) BC052977 [Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1B], 유전자등록번호 (Genebank) AK023755 [Triggering receptor expressed on myeloid cells-like 2], 유전자등록번호 (Genebank) NM_016113 [Transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 2], 유전자등록번호 (Genebank) AK122757 [Tubulin, beta 3], 유전자등록번호 (GEO) A_23_P124177, 유전자등록번호 (GEO) A_23_P210297, 유전자등록번호 (Genebank) NM_003387 [WAS/WASL interacting protein family, member 1], 유전자등록번호 (Genebank) M23575 [Pregnancy specific beta-1-glycoprotein 3], 유전자등록번호 (Genebank) NM_002632 [Placental growth factor, vascular endothelial growth factor-related protein], 유전자등록번호 (Genebank) AK096580 [CDNA FLJ39261 fis, clone OCBBF2009391], 유전자등록번호 (Genebank) CD388102 [Similar to Placental tissue protein 13 (Placenta protein 13) (Galectin-13)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_002288 [Leukocyte-associated Ig-like receptor 2], 유전자등록번호 (Genebank) 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retroviral family W, env(C7), member 1 (syncytin)], 유전자등록번호 (Genebank) AK097398 [Nucleobindin 2], 유전자등록번호 (Genebank) NM_173675 [Hypothetical protein FLJ33708], 유전자등록번호 (Genebank) NM_005975 [PTK6 protein tyrosine kinase 6], 유전자등록번호 (Genebank) AK021606 [CDNA FLJ11544 fis, clone HEMBA1002826], 유전자등록번호 (Genebank) NM_005935 [AF4/FMR2 family, member 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_212482 [Fibronectin 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001753 [Caveolin 1, caveolae protein, 22kDa], 유전자등록번호 (Genebank) BX537968 [Hypothetical LOC51149], 유전자등록번호 (Genebank) NM_181659 [Nuclear receptor coactivator 3], 유전자등록번호 (Genebank) BX111520 [Transcribed locus], 유전자등록번호 (Genebank) CR749722 [RAS p21 protein activator (GTPase activating protein) 1], 유전자등록번호 (Genebank) AK128870 [Synapse defective 1, Rho GTPase, homolog 1 (C. elegans)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_022153 [Chromosome 10 open reading frame 54], 유전자등록번호 (TIGR) THC2301901 [Zinc finger CCCH-type containing 3], 유전자등록번호 (Genebank) NM_015117 [Zinc finger CCCH-type containing 3], 유전자등록번호 (Genebank) AF343078 [ATPase family, AAA domain containing 3B], 유전자등록번호 (Genebank) D89974 [Vanin 2], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001006946 [Syndecan 1], 유전자등록번호 (Genebank) AY055760 [Decay accelerating factor for complement (CD55, Cromer blood group system)], 유전자등록번호 (Genebank) AB016901 [Chromosome 6 open reading frame 123], 유전자등록번호 (Genebank) AK096355 [Myxovirus (influenza virus) resistance 1, interferon-inducible protein p78 (mouse)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_182898 [CAMP responsive element binding protein 5], 유전자등록번호 (Genebank) BC036890 [Grainyhead-like 3 (Drosophila)], 유전자등록번호 (Genebank) AK094505 [Cysteine conjugate-beta lyase; cytoplasmic (glutamine transaminase K, kyneurenine aminotransferase)], 유전자등록번호 (Genebank) AB007940 [RAB GTPase activating protein 1-like], 유전자등록번호 (Genebank) CR936755 [Guanylate binding protein 3], 유전자등록번호 (Genebank) NM_006291 [Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2], 유전자등록번호 (Genebank) NM_006778 [Tripartite motif-containing 10], 유전자등록번호 (Genebank) NM_020809 [Rho GTPase activating protein 20], 유전자등록번호 (Genebank) BQ186674 [Hypothetical gene supported by AF086204], 유전자등록번호 (Genebank) NM_003966 [Sema domain, seven thrombospondin repeats (type 1 and type 1-like), transmembrane domain (TM) and short cytoplasmic domain, (semaphorin) 5A], 유전자등록번호 (Genebank) BM810215 [Chorionic gonadotropin, beta polypeptide], 유전자등록번호 (Genebank) NM_003167 [Sulfotransferase family, cytosolic, 2A, dehydroepiandrosterone (DHEA)-preferring, member 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001620 [AHNAK nucleoprotein (desmoyokin)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_004615 [Tetraspanin 7], 유전자등록번호 (Genebank) CR609484 [Kynureninase (L-kynurenine hydrolase)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_014400 [LY6/PLAUR domain containing 3], 유전자등록번호 (Genebank) AB209845 [Transcription termination factor, RNA polymerase II], 유전자등록번호 (Genebank) AK091125 [Hypothetical protein LOC162427], 유전자등록번호 (Genebank) BX649103 [Chondroitin beta1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase], 유전자등록번호 (Genebank) AY217348 [Armadillo repeat containing 5], 유전자등록번호 (Genebank) AK126079 [Zinc finger protein 692], 유전자등록번호 (Genebank) AK096685 [Transforming growth factor, beta receptor associated protein 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_198479 [Tetra-peptide repeat homeobox 1], 유전자등록번호 (Genebank) AK127349 [Major histocompatibility complex, class I, C], 유전자등록번호 (Genebank) AB023177 [KIAA0960 protein], 유전자등록번호 (Genebank) AK126731 [Glucocorticoid induced transcript 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_014619 [Glutamate receptor, ionotropic, kainate 4], 유전자등록번호 (Genebank) R31293 [suppressor of cytokine signaling 2], 유전자등록번호 (Genebank) AK055190 [Chromosome X open reading frame 36], 유전자등록번호 (Genebank) BC038504 [SNF1-like kinase], 유전자등록번호 (Genebank) NM_018018 [Solute carrier family 38, member 4], 유전자등록번호 (Genebank) AK123704 [Similar to pleckstrin homology domain containing, family M (with RUN domain) member 1; adapter protein 162], 유전자등록번호 (Genebank) BX647357 [Iduronate 2-sulfatase (Hunter syndrome)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001343 [Disabled homolog 2, mitogen-responsive phosphoprotein (Drosophila)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001904 [Catenin (cadherin-associated protein), beta 1, 88kDa], 유전자등록번호 (Genebank) CR599551 [EF-hand domain family, member D1], 유전자등록번호 (Genebank) AK172837 [Organic solute transporter alpha], 유전자등록번호 (Genebank) BC027456 [Similar to interspersed repeat antigen, putative], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001025598 [Rho GTPase activating protein 30], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001003793 [RNA binding motif, single stranded interacting protein], 유전자등록번호 (Genebank) AB022718 [Chromosome 10 open reading frame 10], 유전자등록번호 (Genebank) NM_023915 [G protein-coupled receptor 87], 유전자등록번호 (Genebank) NM_006200 [Proprotein convertase subtilisin/kexin type 5], 유전자등록번호 (Genebank) XM_496826 [NHS-like 1], 유전자등록번호 (Genebank) AK124904 [FYVE, RhoGEF and PH domain containing 6], 유전자등록번호 (Genebank) NM_006317 [Brain abundant, membrane attached signal protein 1], 유전자등록번호 (Genebank) AL136861 [Cysteine-rich secretory protein LCCL domain containing 2], 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유전자등록번호 (Genebank) AF291673 [Giant axonal neuropathy (gigaxonin)], 유전자등록번호 (Genebank) AK056794 [Cytochrome P450, family 11, subfamily A, polypeptide 1], 유전자등록번호 (Genebank) AF001893 [Trophoblast-derived noncoding RNA], 유전자등록번호 (TIGR) THC2343493, 유전자등록번호 (TIGR) THC2288230, 유전자등록번호 (GEO) A_32_P145515, 유전자등록번호 (GEO) A_24_P921636.
2) 상기 마커유전자 중에서, 최기형성 유발 약물 처리에 의하여 발현이 감소하는 마커유전자는 하기와 같다: 유전자등록번호 (Genebank) NM_005971 [FXYD domain containing ion transport regulator 3], 유전자등록번호 (Genebank) AK096306 [Hypothetical protein MGC3032], 유전자등록번호 (Genebank) AF239668 [Cholecystokinin B receptor], 유전자등록번호 (Genebank) AK000652 [Chromosome 20 open reading frame 57], 유전자등록번호 (Genebank) NM_138703 [Melanoma antigen family E, 2], 유전자등록번호 (Genebank) AJ007798 [Stromal antigen 3], 유전자등록번호 (Genebank) NM_024342 [Glucocorticoid receptor DNA binding factor 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_181645 [Hypothetical protein FLJ25393], 유전자등록번호 (Genebank) AK092368 [Empty spiracles homolog 1 (Drosophila)], 유전자등록번호 (Genebank) AB051464 [Kelch-like 15 (Drosophila)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_032484 [Homolog of mouse LGP1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_022371 [Torsin family 3, member A], 유전자등록번호 (Genebank) NM_002033 [Fucosyltransferase 4 (alpha (1,3) fucosyltransferase, myeloid-specific)], 유전자등록번호 (Genebank) AK125154 [Plexin A2], 유전자등록번호 (Genebank) AK125559 [Zymogen granule protein 16], 유전자등록번호 (Genebank) NM_176822 [NACHT, leucine rich repeat and PYD containing 14], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001620 [AHNAK nucleoprotein (desmoyokin)], 유전자등록번호 (Genebank) AK097654 [SPT2, Suppressor of Ty, domain containing 1 (S. cerevisiae)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_004821 [Heart and neural crest derivatives expressed 1], 유전자등록번호 (Genebank) X89399 [RAS p21 protein activator 3], 유전자등록번호 (Genebank) AK090470 [CD33 antigen (gp67)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_018013 [Hypothetical protein FLJ10159], 유전자등록번호 (Genebank) BC038369 [Interleukin 17 receptor D], 유전자등록번호 (Genebank) AJ009985 [Annexin A9], 유전자등록번호 (Genebank) AB032417 [Frizzled homolog 4 (Drosophila)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_003873 [Neuropilin 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_015335 [Thyroid hormone receptor associated protein 2], 유전자등록번호 (Genebank) NM_015270 [Adenylate cyclase 6], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001995 [Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_004457 [Acyl-CoA synthetase long-chain family member 3], 유전자등록번호 (Genebank) NM_005933 [Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_002843 [Protein tyrosine phosphatase, receptor type, J], 유전자등록번호 (Genebank) AK023414 [Steroid 5 alpha-reductase 2-like], 유전자등록번호 (Genebank) U06936 [D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein], 유전자등록번호 (Genebank) DQ097177 [HECT, UBA and WWE domain containing 1], 유전자등록번호 (Genebank) AF234887 [Cadherin, EGF LAG seven-pass G-type receptor 2 (flamingo homolog, Drosophila)], 유전자등록번호 (Genebank) BG483345 [Secretory leukocyte peptidase inhibitor], 유전자등록번호 (Genebank) AK074614 [Insulin-like growth factor 2 (somatomedin A)], 유전자등록번호 (Genebank) NR_000041 [RNA, U12 small nuclear], 유전자등록번호 (Genebank) BC009383 [Kringle containing transmembrane protein 2], 유전자등록번호 (Genebank) AY358127 [Leucine rich repeat and fibronectin type III domain containing 3], 유전자등록번호 (Genebank) NM_007313 [V-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1], 유전자등록번호 (Genebank) AB020647 [F-box and leucine-rich repeat protein 7], 유전자등록번호 (Genebank) NM_014476 [PDZ and LIM domain 3], 유전자등록번호 (Genebank) AK123302 [CDNA FLJ41308 fis, clone BRAMY2042612], 유전자등록번호 (Genebank) BC063872 [Tripartite motif-containing 9], 유전자등록번호 (Genebank) AB007944 [Family with sequence similarity 20, member B], 유전자등 록번호 (Genebank) AK027155 [CDNA: FLJ23502 fis, clone LNG02862], 유전자등록번호 (Genebank) NM_178556 [Hypothetical protein FLJ36180], 유전자등록번호 (Genebank) NM_003617 [Regulator of G-protein signalling 5], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001007271 [Dual specificity phosphatase 13], 유전자등록번호 (Genebank) BC045642 [Metadherin], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001618 [Poly (ADP-ribose) polymerase family, member 1], 유전자등록번호 (Genebank) AY358815 [Neural cell adhesion molecule 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_000448 [Recombination activating gene 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_178509 [Syntaxin binding protein 4], 유전자등록번호 (Genebank) AB209376 [SATB family member 2], 유전자등록번호 (GEO) A_24_P918364, 유전자등록번호 (TIGR) THC2328806, 유전자등록번호 (TIGR) THC2272137, 유전자등록번호 (TIGR) THC2433340.
본 발명자들은 최기형성 유발 약물 검색용 마커유전자를 발굴하기 위하여, 최기형성을 나타내는 항암제인 탈리도마이드를 인간 태반 융모막암 세포주 (JEG-3)에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 탈리도마이드는 인간 태반 융모막암 세포주(JEG-3)에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 탈리도마이드의 처리를 위한 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 탈리도마이드를 인간 태반 융모막암 세포주에 처리하고, 상기 약물을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 형광물질 Cy5로 표지하였으며, 약물을 처리하지 않은 대조군의 경우 형광물질 Cy3로 표지하였다. 상기 형광 표지된 cDNA를 44 k Human whole genome 올리고마이크로어레이 칩 (Agilent, USA)과 혼성화 하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2와 도 3 참조). 분석 시 중간값 비(Cy5/Cy3 비율)가 1.5 배 이상인 경우 발현이 증가한 유전자로 분류하였고, 0.666 배 이하인 경우 발현이 감소한 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 발현이 증가된 유전자는 0.44% (44,290개의 유전자 중 197개) 발현이 감소된 유전자는 0.16% (44,290개의 유전자 중 71개)임을 확인하였다. 이때, 최기형성에 작용하는 기능으로 판단되는 아폽토시스 (apoptosis), 임신 (pregnancy), 혈관신생 (angiogenesis), 형태형성 (morphogenesis)에 관련되는 유전자들을 선별하였다 (표 2 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 탈리도마이드를 처리했을 때, 인간 태반 융모막암 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
이후, 본 발명자들은 상기 유전자 중 아폽토시스 관련 유전자 6종, 임신 관련 유전자 2종, 및 혈관신생 관련 유전자 1종을 분리하여 실시간 RT-PCR (real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 방법으로 발현 양상을 다시 조사해 보았다. 그 결과, 9종의 유전자의 발현 양상이 올리고마이크로어레이 칩 결과와 유사하게 나타남을 확인하였다(표 4 참조).
또한, 본 발명은 상기 마커유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 최기형성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다. 상기 올리고 뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분 자는 상기 마커유전자의 18 내지 30 개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25 개의 핵산을 포함한다.
본 발명의 최기형성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 마커유전자를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 바람직하게는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자를 이용한 최기형성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
본 발명의 하기와 같은 과정을 포함하는 최기형성 유발 약물 검색 방법을 제공한다: 1) 인간 자궁 조직 유래 세포에 피검화합물을 처리하는 단계; 2) 단계 1)의 피검 화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포 에서 RNA를 분리하는 단계; 3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질을 표지하는 단계; 4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계; 5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및 6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 본 발명의 마커유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 자궁 조직 유래 세포는 인간 태반 융모막암 세포를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 자궁 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole Human Genome Oligo Microarray (Agilent, USA)등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 과발현 또는 저발현 유전자가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하 다.
또한, 본 발명의 하기와 같은 과정을 포함하는 최기형성 유발 약물 검색 방법을 제공한다: 1) 인간 자궁 조직 유래 세포에 피검화합물을 처리하는 단계; 2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계; 3) 단계 2)의 RNA를, 본 발명의 마커유전자에 상보적이고 마커유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR (Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 4) 단계 3)의 증폭산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 자궁 조직 유래 세포는 인간 태반 융모막암 세포를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 자궁 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 프라이머는 본 발명에서 탐색된 마커유전자와 상보적이고, 상기 마커유전자를 증폭할 수 있으며 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 프라이머라면 모두 사용 가능하고, 상기 프라이머의 길이는 15 내지 30머, 바람직하게는 18 내지 28머 이다. 본 발명에서는 서열번호 1 내지 18로 기재되는 정방향 및 역방향 프라이머 9쌍을 제시하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 본 발명은 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 최기형성 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 최기형성 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 검색 키트에 추가로 인간 자궁 조직 유래 세포를 포함하는 최기형성 유발 약물 검색용 키트를 제공한다. 상기 인간 자궁 조직 유래 세포는 인간 태반 융모막암 세포를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 자궁 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 키트에 추가로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질 (streptavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질 (chemifluorescence) 및 화학발광물질 (chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 형광물질 Cy3와 형광물질 Cy5를 사용하였다. 아울러, 상기 검색 키트에 추가로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP (사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자에 상보적이고, 마커유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 최기형성 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.
상기 검색 키트의 프라이머는 서열번호 1 내지 18으로 기재되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 마커유전자에 상보적이며, 마커유전자를 증폭할 수 있으며 증폭산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머쌍은 모두 사용 가능하다.
본 발명의 최기형성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 최기형성 유발 약물 검색 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 마커유전자로 이용하여 새로운 최기형성의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하며, 최기형성을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리
<1-1> 세포배양
인간 태반 융모막암 세포주인 JEG-3 세포(HTB-36, ATCC, USA)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)를 이용하여 T75 플라스크에서 5 × 105 세포/㎖이 되도록 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 최기형성을 부작용으로 나타나는 대표적인 약물인 탈리도마이드를 선정하였으며, DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.
<1-2> 세포 독성 실험 ( MTT assay ) 및 화학 물질 처리
Mossman 등 (J. Immunol . Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 JEG-3 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트에 5× 104/웰 세포수로 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)에서 DMSO에 용해된 탈리도마이드를 처리하고 48시간 후에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈 (formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.
JEG-3 세포주에서 탈리도마이드의 세포독성을 살펴본 결과, 70% 생존율을 보이는 농도(IC30)는 4.283 mM 이었으며(도 1), 상기 농도로 결정하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
< 실시예 2> 마이크로어레이 실험
<2-1> 표적 RNA 의 분리 및 형광 물질 표지
1.8 × 106 cell/㎖ 농도로 100 mm dish에 JEG-3 세포를 분주한 후, 실시예 1-2에서 결정된 탈리도마이드의 농도를 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 순도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)으로 확인하였다.
<2-2> 표지된 cDNA 제조
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시예 2-1에서 수득한 탈리도마이드 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)을 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링 (annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사 (Reverse Transcript) 반응을 위해 표 1과 같이 시약을 혼합하였다.
구성 부피(㎕)
5X first strand buffer 6
dNTPs 0.6
0.1 M DDT 3
SuperScript II enzyme 3
Cy-3 또는 Cy-5 dUTP 2
대조군인 JEG-3 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP (녹색)으로 표지화 하였고, 탈리도마이드를 처리한 JEG-3 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP (적색)를 표지화 하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼 (Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제되었다.
<2-3> 혼성화 반응
혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로 44 k Whole Human Genome 올리고 마이크로어레이 (Agilent, USA)를 이용하였다. 세척 (2분간 2SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1SSC, 2분간 0.2SSC에 세척) 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.
<2-4> 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B (Axon Instruments, USA)로 스캔하였다. 결합되지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너 (laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어 (Axon Instruments, USA)로 분석하였다. 이렇게 얻어진 데이터로부터 탈리도마이드에 대한 마커 유전자를 선별하였다 (도 2 및 도 3).
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 4천 개의 유전자 중에서 탈리도마이드의 처리에 의해 중간값의 비(Cy5/Cy3의 비율)가 1.5배 이상으로 유전자 발현 증가를 보이는 유전자는 0.44% (44,290개의 유전자 중 197개)이고, 0.666배 이하로 유전자 발현 감소를 보이는 유전자는 0.16% (44,290개의 유전자 중 71개)임을 확인하였다.
이때, 탈리도마이드에 의해 발현이 유의하게 변화된 유전자들을 기능별로 분류하였을 때, 최기형성에 작용하는 기능으로 판단되는 아폽토시스 (apoptosis), 임신 (pregnancy), 혈관신생 (angiogenesis), 형태형성 (morphogenesis) 에 관련된 유전자를 선별하였다(표 2 참조). 상기 유전자들이 본 발명에서 사용한 탈리도마이드를 처리했을 때, 인간 태반 융모막암 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
탈리도마이드에 의해 발현이 유의하게 변한 유전자의 기능별 분류
등록번호 유전자약어 유전자 명 중간값의비
혈 관 신 생 NM_002632 PGF placental growth factor, vascular endothelial growth factor-related protein 1.989
NM_006291 TNFAIP2 tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2 1.601
AK074614 IGF2 insulin-like growth factor 2 (somatomedin a) 0.641
NM_003873 NRP1 neuropilin 1 0.623
임 신 CR601901 INSL4 insulin-like 4 (placenta) 1.908
AK075446 P11 26 serine protease 1.700
CR606430 PSG11 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 11 2.117
NM_031246 PSG2 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 2 1.747
M23575 PSG3 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 3 1.989
BC063127 PSG4 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 4 1.811
형 태 형 성 AK095632 ABTB2 ankyrin repeat and btb (poz) domain containing 2 1.782
BX649103 ChGn chondroitin beta1,4 n-acetylgalactosaminyltransferase 1.578
NM_001874 CPM carboxypeptidase m 2.044
NM_014590 ERVWE1 endogenous retroviral family w, env(c7), member 1 (syncytin) 1.676
AK124904 FGD6 fyve, rhogef and ph domain containing 6 1.538
AF075292 FGF18 fibroblast growth factor 18 2.008
M57609 GLI3 gli-kruppel family member gli3 (greig cephalopolysyndactyly syndrome) 1.838
NM_004235 KLF4 kruppel-like factor 4 (gut) 1.917
CR749722 RASA1 ras p21 protein activator (gtpase activating protein) 1 1.638
NM_014585 SLC40A1 solute carrier family 40 (iron-regulated transporter), member 1 2.137
BX648582 SPRY2 sprouty homolog 2 (drosophila) 1.806
NM_016569 TBX3 t-box 3 (ulnar mammary syndrome) 1.806
NM_024342 GRLF1 glucocorticoid receptor dna binding factor 1 0.554
NM_004821 HAND1 heart and neural crest derivatives expressed 1 0.606
아 폽 토 시 스 BX386171 CGB5 Chorionic gonadotropin, beta polypeptide 8 1.824
BM810215 CGB8 chorionic gonadotropin, beta polypeptide 1.589
NM_001904 CTNNB1 catenin (cadherin-associated protein), beta 1, 88kda 1.549
NM_002182 IL1RAP Interleukin 1 receptor accessory protein 1.798
AK096355 MX1 myxovirus (influenza virus) resistance 1, interferon-inducible protein p78 (mouse) 1.606
NM_004570 PIK3C2G Phosphoinositide-3-kinase, class 2, gamma polypeptide 1.795
NM_021127 PMAIP1 Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1 1.903
CR749722 RASA1 rasp21proteinactivator(gtpaseactivatingprotein)1 1.638
NM_001003793 RBMS3 RNA binding motif, single stranded interacting protein 1.545
NM_004155 SERPINB9 serpin peptidase inhibitor, clade b (ovalbumin), member9 1.733
BX649005 SGK serum/glucocorticoid regulated kinase 2.981
R31293 SOCS2 suppressor of cytokine signaling 2 1.557
BC052977 TNFRSF1B tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1b 2.026
NM_007313 ABL1 v-abl abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 0.652
< 실시예 3> 실시간 RT - PCR ( Real - time reverse transcriptase polymerase chain reaction ) 정량
탈리도마이드에 의해 발현이 유도되어 상기 실시예 2에서 선별된 과발현 및 저발현된 유전자 중 탈리도마이드에 의해 주로 야기되는 최기형성 관련 기전으로 아폽토시스, 임신 및 혈관신생 관련 유전자 12종을 선별하였다. 이들 유전자들은 유전자등록번호 (Genebank) NM_004155 [Serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 9], 유전자등록번호 (Genebank) BC063127 [Pregnancy specific beta-1-glycoprotein 4], 유전자등록번호 (Genebank) NM_005627 [Serum/glucocorticoid regulated kinase], 유전자등록번호 (Genebank) NM_002182 [Interleukin 1 receptor accessory protein], 유전자등록번호 (Genebank) NM_004570 [Phosphoinositide-3-kinase, class 2, gamma polypeptide], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001003793 [RNA binding motif, single stranded interacting protein], 유전자등록번호 (Genebank) NM_021127 [Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001066 [Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1B], 유전자등록번호 (Genebank) NM_002632 [Placental growth factor, vascular endothelial growth factor-related protein] 이다.
상기 유전자들의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCRl; Bio-rad, USA) 기계를 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다.
구체적으로, 올리고 dT 프라이머와 Superscript kit(Omniscipt™ kit, Qiagen, Co., USA)를 이용하여 역전사반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA 0.2 ㎕와 물 3.8 ㎕, 센스 프라이머 0.5 ㎕, 안티센스 프라이머 0.5 ㎕, 사이버그린 I 염색 수퍼믹스 (Bio-rad, USA) 5 ㎕ 를 혼합하여, PCR 튜브에 담아 단계 1: 95℃, 3분; 단계 2(45회 반복): 단계 2-1: 95℃, 10초; 단계 2-2: 55 내지 65℃ 45초; 단계 3: 95℃, 1분; 단계 4: 55℃, 1분; 단계 5(반복 80회): 55℃, 10초로 프로그램을 설계한 My IQ 실시간 PCR 기계에서 반응을 수행하였다. 사이버그린 I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저 PCR에 이용한 표적 유전자와 내재성(endogenous) 대조군(GAPDH)에 대한 프라이머 (서열번호 19 및 서열번호 20)를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 각각의 프라이머 (표 3)를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 실시간 RT-PCR을 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다(표 4).
프라이머 서열
등록번호 유전자명 PCR 프라이머 서열 (5'->3') 프라이머 반응온도(℃)
NM_004155 Serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 9 센스 (서열번호 1) TGAGAAACTCACAGCCTGGACCAA 64.3
안티센스 (서열번호 2) CCAAATGCCGAAGCACAGATTCCA
BC063127 Pregnancy specific beta-1-glycoprotein 4 센스 (서열번호 3) TGTGAGCCACTCAGAACTCACCAA 61.2
안티센스 (서열번호 4) AGGCATGAGCAAGGACGGTTAAGA
BX649005 Serum/glucocorticoid regulated kinase 센스 (서열번호 5) CCTGAGCTTATGAATGCCAAC 63.1
안티센스 (서열번호 6) GCCAAGGTTGATTTGCTGAG
NM_002182 Interleukin 1 receptor accessory protein 센스 (서열번호 7) CCTCTCAGCTTCCCAAGAAA 55.8
안티센스 (서열번호 8) GGGCAAGAGTGAGGCTTCTA
NM_004570 Phosphoinositide-3-kinase, class 2, gamma polypeptide 안티센스 (서열번호 9) GCACAACCACTTAAAGGCAGA 58.7
안티센스 (서열번호 10) CCCAGGATGAATGTTACCACA
NM_001003793 RNA binding motif, single stranded interacting protein 안티센스 (서열번호 11) CCACCAGCTGTTGTGTCAGT 58.7
안티센스 (서열번호 12) CACAGGCGTGTACTGAGGAA
NM_021127 Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1 안티센스 (서열번호 13) TTGGAGACAAACTGAACTTCCGGC 61.2
안티센스 (서열번호 14) GCACCCATGAATGCACCTTCACAT
BC052977 Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1B 안티센스 (서열번호 15) CTCCTTCCTGCTCCCAATG 63.1
안티센스 (서열번호 16) CACACCCACAATCAGTCCAA
NM_002632 Placental growth factor, vascular endothelial growth factor-related protein 안티센스 (서열번호 17) CGCACCCGGCTCGTGTATTTATTA 57
안티센스 (서열번호 18) TGTGGCTGGCTTCTCTCTTTCTCT
등록번호 유전자명 실시간 PCR (상대적 배율) cDNA 마이크로어레이 ( Cy3 / Cy5 비율)
NM_004155 Serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 9 2.3866 1.7327
BC063127 Pregnancy specific beta-1-glycoprotein 4 1.5139 1.8113
BX649005 Serum/glucocorticoid regulated kinase 3.2963 2.9805
NM_002182 Interleukin 1 receptor accessory protein 1.9282 1.7982
NM_004570 Phosphoinositide-3-kinase, class 2, gamma polypeptide 2.4337 1.7953
NM_0010037 93 RNA binding motif, single stranded interacting protein 1.4883 1.5449
NM_021127 Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1 2.2390 1.9032
BC052977 Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1B 1.7493 2.0262
NM_002632 Placental growth factor, vascular endothelial growth factor-related protein 2.5908 1.9886
그 결과, 9종의 과발현 유전자들의 유전자 발현 양은 최기형성 유발 약물들에 의한 유전자 발현을 조사한 올리고 마이크로어레이 결과와 매우 유사하게 나타남을 확인하였다.
도 1은 탈리도마이드에 의한 인간 태반 융모막암 세포주에서의 세포 독성을 조사한 그래프이다.
도 2는 각각 Cy3 및 Cy5로 표지된 탈리도마이드 처리 및 비처리군의 mRNA를 마이크로어레이 칩에서 혼성화한 후 발현정도를 볼케이노 플랏(volcano plot)으로 분석한 것이고,
도 3은 마이크로어레이 칩을 이용한 탈리도마이드를 처리한 인간 태반 융모막암 세포주의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Marker genes based on Thalidomide treatment for screening of drug inducing teratogenicity and screening method using thereof <130> 7P-06-38 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SERPINB9 sense primer <400> 1 tgagaaactc acagcctgga ccaa 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SERPINB9 antisense primer <400> 2 ccaaatgccg aagcacagat tcca 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSG4 sense primer <400> 3 tgtgagccac tcagaactca ccaa 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSG4 antisense primer <400> 4 aggcatgagc aaggacggtt aaga 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SGK sense primer <400> 5 cctgagctta tgaatgccaa c 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SGK antisense primer <400> 6 gccaaggttg atttgctgag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL1RAP sense primer <400> 7 cctctcagct tcccaagaaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL1RAP antisense primer <400> 8 gggcaagagt gaggcttcta 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3C2G sense primer <400> 9 gcacaaccac ttaaaggcag a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3C2G antisense primer <400> 10 cccaggatga atgttaccac a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBMS3 sense primer <400> 11 ccaccagctg ttgtgtcagt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBMS3 antisense primer <400> 12 cacaggcgtg tactgaggaa 20 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMAIP1 sense primer <400> 13 ttggagacaa actgaacttc cggc 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMAIP1 antisense primer <400> 14 gcacccatga atgcaccttc acat 24 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFRSF1B sense primer <400> 15 ctccttcctg ctcccaatg 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFRSF1B antisense primer <400> 16 cacacccaca atcagtccaa 20 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGF sense primer <400> 17 cgcacccggc tcgtgtattt atta 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGF antisense primer <400> 18 tgtggctggc ttctctcttt ctct 24 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 19 tgcaccacca actgcttagc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH antisense primer <400> 20 ggcatggact gtggtcatga 20

Claims (15)

  1. 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열의 전부 또는 18 내지 30개의 핵산 서열로 구성되는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 탈리도마이드에 대한 노출 여부 측정용 DNA 마이크로어레이 칩:
    유전자등록번호 (Genebank) NM_032199 [AT rich interactive domain 5B (MRF1-like)], 유전자등록번호 (Genebank) BX647857 [Ankyrin repeat and SOCS box-containing 5], 유전자등록번호 (Genebank) AB018258 [ATPase, Class V, type 10B], 유전자등록번호 (Genebank) NM_013314 [B-cell linker], 유전자등록번호 (Genebank) BX111592 [Transcribed locus], 유전자등록번호 (Genebank) AK000652 [Chromosome 20 open reading frame 57], 유전자등록번호 (Genebank) NM_203403 [Chromosome 9 open reading frame 150], 유전자등록번호 (Genebank) AF239668 [Cholecystokinin B receptor], 유전자등록번호 (Genebank) AY268104 [Carboxylesterase 1 (monocyte/macrophage serine esterase 1)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_000735 [Glycoprotein hormones, alpha polypeptide], 유전자등록번호 (Genebank) BC067746 [C-type lectin domain family 1, member A], 유전자등록번호 (Genebank) CR749536 [C-type lectin domain family 7, member A], 유전자등록번호 (Genebank) AL136922 [ClpX caseinolytic peptidase X homolog (E. coli)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001874 [Carboxypeptidase M], 유전자등록번호 (Genebank) CR598482 [Chymotrypsin-like], 유전자등록번호 (Genebank) NM_031226 [Cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_214462 [Dapper, antagonist of beta-catenin, homolog 2 (Xenopus laevis)], 유전자등록번호 (Genebank) AF177395 [Dickkopf homolog 2 (Xenopus laevis)], 유전자등록번호 (Genebank) AL832598 [Erythrocyte membrane protein band 4.1-like 3], 유전자등록번호 (Genebank) BX092581 [Developmental pluripotency associated 5], 유전자등록번호 (Genebank) BC064700 [Estrogen-related receptor gamma], 유전자등록번호 (Genebank) AF075292 [Fibroblast growth factor 18], 유전자등록번호 (Genebank) NM_005971 [FXYD domain containing ion transport regulator 3], 유전자등록번호 (Genebank) NM_000162 [Glucokinase (hexokinase 4, maturity onset diabetes of the young 2)], 유전자등록번호 (Genebank) AB209105 [Huntingtin-associated protein 1 (neuroan 1)], 유전자등록번호 (Genebank) AK057515 [CDNA FLJ32953 fis, clone TESTI2008099], 유전자등록번호 (Genebank) AJ556711 [Immunoglobulin gamma heavy chain variable region (IGHV3-30.3 gene), clone 2B 3G 02], 유전자등록번호 (Genebank) R63061 [Keratin 23 (histone deacetylase inducible)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_007360 [Killer cell lectin-like receptor subfamily K, member 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_007015 [Leukocyte cell derived chemotaxin 1], 유전자등록번호 (Genebank) BC013438 [Hypothetical gene supported by BC013438], 유전자등록번호 (Genebank) NM_138703 [Melanoma antigen family E, 2], 유전자등록번호 (Genebank) AJ007798 [Stromal antigen 3], 유전자등록번호 (Genebank) AK096306 [Hypothetical protein MGC3032], 유전자등록번호 (Genebank) NM_003681 [Pyridoxal (pyridoxine, vitamin B6) kinase], 유전자등록번호 (Genebank) CR606430 [Pregnancy specific beta-1-glycoprotein 11], 유전자등록번호 (Genebank) BC025767 [Rhophilin, Rho GTPase binding protein 1], 유전자등록번호 (Genebank) AB007937 [Syndecan 3], 유전자등록번호 (Genebank) NM_022367 [Sema domain, immunoglobulin domain (Ig), transmembrane domain (TM) and short cytoplasmic domain, (semaphorin) 4A], 유전자등록번호 (Genebank) BX649005 [Serum/glucocorticoid regulated kinase], 유전자등록번호 (Genebank) BC063830 [ST6 (alpha-N-acetyl-neuraminyl-2,3-beta-galactosyl-1,3)-N-acetylgalactosaminide 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vascular endothelial growth factor-related protein], 유전자등록번호 (Genebank) AK096580 [CDNA FLJ39261 fis, clone OCBBF2009391], 유전자등록번호 (Genebank) CD388102 [Similar to Placental tissue protein 13 (Placenta protein 13) (Galectin-13)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_002288 [Leukocyte-associated Ig-like receptor 2], 유전자등록번호 (Genebank) AB002308 [KIAA0310], 유전자등록번호 (Genebank) AL136646 [Rho GTPase activating protein 24], 유전자등록번호 (Genebank) AB208809 [Solute carrier family 13 (sodium/sulfate symporters), member 4], 유전자등록번호 (Genebank) NM_004454 [Ets variant gene 5 (ets-related molecule)], 유전자등록번호 (Genebank) AB075819 [ATPase, Class I, type 8B, member 4], 유전자등록번호 (Genebank) NM_004235 [Kruppel-like factor 4 (gut)], 유전자등록번호 (Genebank) AF450487 [Kinesin family member 21A], 유전자등록번호 (Genebank) AK075130 [G protein-coupled receptor 1], 유전자등록번호 (Genebank) CR601901 [Insulin-like 4 (placenta)], 유전자등록번호 (Genebank) NM_022482 [Zinc finger protein 336], 유전자등록번호 (Genebank) D90070 [Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1], 유전자등록번호 (Genebank) X97758 [Rho family GTPase 3], 유전자등록번호 (Genebank) BC068585 [HERV-FRD provirus ancestral Env polyprotein], 유전자등록번호 (Genebank) NM_000494 [Collagen, type XVII, alpha 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_001005325 [Olfactory receptor, family 6, subfamily M, member 1], 유전자등록번호 (Genebank) NM_004419 [Dual specificity phosphatase 5], 유전자등록번호 (Genebank) R45075 [Transcribed locus, weakly similar to XP_219319.3 PREDICTED: similar to deleted in malignant brain tumors 1 [Rattus norvegicus]], 유전자등록번호 (Genebank) BX649112 [COBL-like 1], 유전자등록번호 (Genebank) AI939596 [Transcribed locus], 유전자등록번호 (Genebank) NM_004561 [Ovo-like 1(Drosophila)], 유전자등록번호 (Genebank) BG571732 [S100 calcium binding protein P], 유전자등록번호 (Genebank) BX537382 [Solute carrier family 38, member 3], 유전자등록번호 (Genebank) CR749205 [DKFZP686A01247 hypothetical protein], 유전자등록번호 (Genebank) AK056776 [Hypothetical protein FLJ32214], 유전자등록번호 (Genebank) M57609 [GLI-Kruppel family member GLI3 (Greig cephalopolysyndactyly 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  12. 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 탈리도마이드에 대한 노출 여부 측정용 키트.
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  14. 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는, 15 내지 30머 길이의 프라이머 쌍을 포함하는 탈리도마이드에 대한 노출 여부 측정용 키트.
  15. 제 14항에 있어서, 프라이머 쌍은 하기 프라이머 쌍 1 내지 9로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 탈리도마이드에 대한 노출 여부 측정용 키트:
    프라이머 쌍 1: 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 2: 서열번호 3로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 3: 서열번호 5로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6로 기재되는 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 4: 서열번호 7로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 5: 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10로 기재되는 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 6: 서열번호 11로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 12로 기재되는 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 7: 서열번호 13로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14로 기재되는 역방향 프라이머;
    프라이머 쌍 8: 서열번호 15로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 16로 기재되는 역방향 프라이머; 및,
    프라이머 쌍 9: 서열번호 17로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 18로 기재되는 역방향 프라이머.
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