KR100991755B1 - 카르바마제핀 처리에 따른, 폐독성 유발 약물 검색용마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법 - Google Patents

카르바마제핀 처리에 따른, 폐독성 유발 약물 검색용마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폐독성 유발 약물인 카르바마제핀(carbamazepine)에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 마커유전자 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법에 관한 것이다. 본 발명의 마커유전자는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 마커유전자로 이용하여 폐독성의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 카르바마제핀이 폐독성 및 부작용을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
카르바마제핀, 마커유전자, 마이크로어레이, 폐독성

Description

카르바마제핀 처리에 따른, 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법{Marker genes based on carbamazepine treatment for screening of drug inducing pulmonary toxicity and screening method using thereof}
본 발명은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폐독성 유발 약물인 카르바마제핀에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 마커유전자 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법에 관한 것이다.
카르바마제핀은 일반적으로 간질 치료제로서 삼환계 항우울제와 유사한 구조를 가지는 이미노스틸벤(iminostilbene) 유도체이며 1960년대 초 유럽에서 항간질 효과가 입증되었고, 1974년 미국 식품의약품부가 성인에게 사용하는 것을 공인한 이후 간대성 근경련성 발작과 결신성 발작을 제외한 대부분의 간질에 대한 1차 치료제로 널리 사용되고 있다(Byung-Kun K., et al., J Korean Neurol . Assoc . 18: 276-280, 2000).
카르바마제핀의 처방으로 흔히 나타나는 부작용으로는 오심, 구토, 식욕부진, 설사, 어지러움증, 피로, 두통 등이 있으며 가끔 나타나는 부작용으로는 항이뇨효과에 의한 수분 저류, 안구진탕증, 복시, 홍반성 발진, 광과민 반응, 색소침착, 박탈성 피부염 등이 나타난다. 또한 드물지만 심각한 부작용으로는 호중구 감소증, 재생불량성 빈혈, 과립세포 감소증, 호산구증가증, 루프스양 증후군, 울혈성 심부전, 부종, 간질성 폐렴 등이 나타나는 것으로 보고되었다.
카르바마제핀에 의한 부작용 기전은 시토크롬 P450 효소계에 의한 대사산물의 생성이 주를 이루는 것으로 보고되었다. 시토크롬 P450은 주로 간에서 대사가 이루어지지만 대사가 활발하게 일어날 경우 다른 조직에도 영향을 미치는 것으로 알려져있다(Sylvia M., et al., Int . J. Immunopharmac ., 17: 445-452, 1995). CYP3A4, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP1A2, 에폭사이드 하이드로라제(epoxide hydrolase) 1의 발현은 카르바마제핀에 의한 피부 염증 질환인 중독성 표피괴사 융해, 스티븐스-존슨 증후군의 발병과 관련된 것으로 보고되었다(Shuen-Iu H., et al., Pharmacogenet . Genomics . 16: 297-306, 2006). 또한 카르바마제핀에 대한 과민증으로 HSP-70, HSPA1L이 발현하는 것으로 보고되었다(Pirmohamed M., AAPS J. 8: 20-26, 2006).
카르바마제핀은 면역기능에 관여하는 것으로 알려져 있다. 카르바마제핀을 복용한 경우 혈청내에 IgA와 IgM의 농도가 감소하는 것으로 보고되었다(Sylvia M., et al., Int . J. Immunopharmac ., 17:445-452, 1995). 또한 중성구의 활성으로 카르바마제핀이 대사되어 9-아크리딘 카르복시알데하이드(acridine carboxyaldehyde) 가 생성되며 이 대사물질로 백혈구의 기능손상 및 괴사를 일으키는 것으로 보고되었다(Omer D., et al., Turk . J. Med . Sci . 30:509-510, 2000).
이처럼 카르바마제핀의 인체내 부작용에도 불구하고, 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 고전적인 방법에 국한되어 있어, 보다 빠르고 정확한 위해성 평가 방법을 통해 인체에서의 부작용을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 카르바마제핀을 이용한 치료 및 진단에 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.
포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고 되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:10614-10619, 1996).
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20-25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 에질런트(Agilent), 제노믹 솔루션(Genomic Solutions) 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer, K. et.al., J. Am . Acad . Dermatol. 51: 681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 애피메트릭스(Affymetrix)사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성 방법에 의해 만들고 있으며, 에질런트(Agillent)사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K., et.al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).
유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며, cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cye3과 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K., et al ., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).
최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 진단이 가능하게 될 것이다.
이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 1천 개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 카르바마제핀의 유전자 발현 프로파일을 인간 기관지 상피 세포인 BEAS-2B 세포주에서 관찰 및 분석함으로써 카르바마제핀에 의해 과발현 또는 저발현 되는 유전자를 발굴하고, 실시간(real-time) 정량 RT-PCR 방법에 의해 상기 유전자들의 발현 양상을 확인하여 폐독성 유발 약물을 검출할 수 있는 마커유전자 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 폐독성 유발 약물인 카르바마제핀에 의해 과발현 또는 저발현되는 마커유전자 및 상기 마커유전자를 이용한 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폐독성 유발 약물인 카르바마제핀에 의해 기관지 상피 세포에서 발현변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 폐독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자를 이용한 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 폐독성 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.
본 발명의 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 마커유전자로 이용하여 새로운 폐독성의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질을 모니터링하거나 위해성을 판정하는데 유용하며, 카르바마제핀에 의해 야기되는 폐독성 및 부작용을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 제공한다.
상기 마커유전자는 카르바마제핀에 의해 자극받은 인간 기관지 상피 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 한다.
상기 마커유전자는 발달(development), 아팝토시스(apoptosis), 지질대사(lipid metabolism), 세포주기(cell cycle), 전사(transcription), 면역반응(immune response), 수송(transport), 단백질 분해(proteolysis) 또는 전사(transcription)에 관련된 유전자로 구성되어 있다.
본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 마커유전자를 제공한다:
유전자 등록번호(Genebank) NM_133436(Asparagine synthetase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_170735(Brain-derived neurotrophic factor opposite strand), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001759(Cyclin D2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_005318(H1 histone family, member 0), 유전자 등록번호(Genebank) NM_000575(Interleukin 1, alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_000600[Interleukin 6(interferon, beta 2)], 유전자 등록번호(Genebank) AL833069(Hypothetical protein KIAA1434), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016269(Hypothetical protein LOC641518), 유전자 등록번호(Genebank) NM_005574[LIM domain only 2(rhombotin-like 1)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_006203[Phosphodiesterase 4D, cAMP-specific(phosphodiesterase E3 dunce homolog, Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_171998(RAB39B, member RAS oncogene family), 유전자 등록번호(Genebank) BC065524[Solute carrier family 16 (monocarboxylic acid transporters), member 14], 유전자 등록번호(Genebank) AB209591[Solute carrier family 7(cationic amino acid transporter, y+ system), member 7], 유전자 등록번호(Genebank) BC053619(Arrestin domain containing 3), 유전자 등록번호(Genebank) CR933688[Chaperonin containing TCP1, subunit 6B(zeta 2)], 유전자 등록번호(Genebank) AF424541(hypothetical LOC401491), 유전자 등록번호(Genebank) AK094995(CDNA FLJ37676 fis, clone BRHIP2012627) 유전자 등록번호(Genebank) AK057709[MRNA; 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1) 상기 마커유전자 중에서 폐독성 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 증가하는 마커유전자는 하기와 같다:
유전자 등록번호(Genebank) NM_133436(Asparagine synthetase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_170735(Brain-derived neurotrophic factor opposite strand), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001759(Cyclin D2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_005318(H1 histone family, member 0), 유전자 등록번호(Genebank) NM_000575(Interleukin 1, alpha), 유전자 등록번호(Genebank) NM_000600[Interleukin 6(interferon, beta 2)], 유전자 등록번호(Genebank) AL833069(Hypothetical protein KIAA1434), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016269(Hypothetical protein LOC641518), 유전자 등록번호(Genebank) NM_005574[LIM domain only 2(rhombotin-like 1)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_006203[Phosphodiesterase 4D, cAMP-specific(phosphodiesterase E3 dunce homolog, Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_171998(RAB39B, member RAS oncogene family), 유전자 등록번호(Genebank) BC065524[Solute carrier family 16(monocarboxylic acid transporters), member 14], 유전자 등록번호(Genebank) AB209591[Solute carrier family 7(cationic amino acid transporter, y+ system), member 7], 유전자 등록번호(Genebank) BC053619(Arrestin domain containing 3), 유전자 등록번호(Genebank) CR933688[Chaperonin containing TCP1, subunit 6B(zeta 2)], 유전자 등록번호(Genebank) AF424541(hypothetical LOC401491), 유전자 등록번호(Genebank) AK094995(CDNA FLJ37676 fis, clone BRHIP2012627) 유전자 등록번호(Genebank) AK057709[MRNA; cDNA DKFZp434B122(from clone DKFZp434B122)], 유전자 등록번호(Genebank) XM_374983(KIAA0748 gene product), 유전자 등록번호(Genebank) AK096179(Hypothetical protein LOC285958), 유전자 등록번호(Genebank) XM_496241(Similar to solute carrier family 16, member 6; monocarboxylate transporter 6), 유전자 등록번호(Genebank) AK095849(RNA, U22 small nucleolar), 유전자 등록번호(Genebank) NM_012338(Tetraspanin 12), 유전자 등록번호(Genebank) BC029580(DTFT5783), 유전자 등록번호(Genebank) NM_032494(Zinc finger CCCH-type containing 8), 유전자 등록번호(Genebank) AL137617[MRNA; cDNA DKFZp434C0512(from clone DKFZp434C0512)], 유전자 등록번호(Genebank) AW450033[Transcribed locus, moderately similar to XP_530339.1 PREDICTED: hypothetical protein XP_530339(Pan troglodytes)], 유전자 등록번호(TIGR) THC2356527.
2) 상기 마커유전자 중에서, 폐독성 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 감소하는 마커유전자는 하기와 같다:
유전자 등록번호(Genebank) NM_015071(Rho GTPase activating protein 26), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001733(Complement component 1, r subcomponent), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001734(Complement component 1, s subcomponent), 유전자 등록번호(Genebank) AK091170(Cyclin-dependent kinase inhibitor 2C(p18, inhibits CDK4)), 유전자 등록번호(Genebank) NM_005195[CCAAT/enhancer binding protein(C/EBP), delta], 유전자 등록번호(Genebank) Z74615(Collagen, type I, alpha 1), 유전자 등록번호(Genebank) U81234[Chemokine(C-X-C motif) ligand 6(granulocyte chemotactic protein 2)], 유전자 등록번호(Genebank) BC060883(Epsin 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_000503[Eyes absent homolog 1(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_004265(Fatty acid desaturase 2), 유전자 등록번호(Genebank) BC036314(Family with sequence similarity 3, member B), 유전자 등록번호(Genebank) NM_033480(F-box protein 9), 유전자 등록번호(Genebank) NM_005345(Heat shock 70kDa protein 1A), 유전자 등록번호(Genebank) NM_006597(Heat shock 70kDa protein 8), 유전자 등록번호(Genebank) NM_198336(Insulin induced gene 1), 유전자 등록번호(Genebank) BX648281[Low density lipoprotein receptor(familial hypercholesterolemia)], 유전자 등록번호(Genebank) XM_371647(Similar to CG9996-PA), 유전자 등록번호(Genebank) NM_005576(Lysyl oxidase-like 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001620AHNAK nucleoprotein(desmoyokin)], 유전자 등록번호(Genebank) AK124635(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007173(Protease, serine, 23), 유전자 등록번호(Genebank) NM_005063[Stearoyl-CoA desaturase(delta-9-desaturase)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_003004(Secreted and transmembrane 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_006306[SMC1 structural maintenance of chromosomes 1-like 1(yeast)], 유전자 등록번호(Genebank) BC051385(Sterol regulatory element binding transcription factor 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_002353(Tumor-associated calcium signal transducer 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_004202(Thymosin, beta 4, Y-linked), 유전자 등록번호(Genebank) BQ186674(Hypothetical gene supported by AF086204), 유전자 등록번호(Genebank) NM_199511(Steroid sensitive gene 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003379[Villin 2(ezrin)], 유전자 등록번호(Genebank) AK093924(Vimentin), 유전자 등록번호(Genebank) AB018341(Zinc finger protein 432), 유전자 등록번호(Genebank) BX641022(Ankyrin repeat domain 10), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001155(Annexin A6), 유전자 등록번호(Genebank) AB176708(Chromosome 13 open reading frame 25), 유전자 등록번호(Genebank) AK074056(Chromosome 16 open reading frame 44), 유전자 등록번호(Genebank) AJ243662(Chromosome 1 open reading frame 42), 유전자 등록번호(Genebank) AF113007(DKFZP586A0522 protein), 유전자 등록번호(Genebank) CR627373(Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 2), 유전자 등록번호(Genebank) AF450484(Family with sequence similarity 70, member A), 유전자 등록번호(Genebank) AK093343(Zinc finger CCCH-type containing 12A), 유전자 등록번호(Genebank) AL831967(Opposite strand transcription unit to STAG3), 유전자 등록번호(Genebank) BX339282(Transcribed locus), 유전자 등록번호(Genebank) AK131570(CDNA FLJ16824 fis, clone UTERU2025415), 유전자 등록번호(Genebank) AA662846(Transcribed locus), 유전자 등록번호(Genebank) U51869, 유전자 등록번호(Genebank) AK095515(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1), 유전자 등록번호(Genebank) BC042028(Integrin, beta 8), 유전자 등록번호(Genebank) BC052951(Lamin B1), 유전자 등록번호(Genebank) BC068575[Slit-like 2(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) BC065180(Hypothetical protein LOC144501), 유전자 등록번호(Genebank) AF001540[metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1(non-coding RNA)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005764(PDZK1 interacting protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_145040(Protein kinase C, delta binding protein), 유전자 등록번호(Genebank) CD388106[S100 calcium binding protein A10(annexin II ligand, calpactin I, light polypeptide(p11))], 유전자 등록번호(Genebank) BG564326(Serum amyloid A4, constitutive), 유전자 등록번호(TIGR) THC2345721, 유전자 등록번호(TIGR) THC2316748.
본 발명자들은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 발굴하기 위하여, 폐독성을 나타내는 카르바마제핀을 인간 기관지 상피 세포주(BEAS-2B)에 처리하여 세 포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 카르바마제핀은 인간 기관지 상피 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 카르바마제핀의 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 카르바마제핀을 인간 기관지 상피 세포주에 처리하고, 상기 약물을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 형광물질(Cy5)로 표지하였으며, 약물을 처리하지 않은 대조군의 경우 Cy3로 표지하였다. 상기 형광표지된 cDNA를 44 k 인간 유전체 전체(Human whole genome) 올리고마이크로어레이 칩(Agilent, USA)과 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2 참조). 분석시 Cy5/Cy3 비율이 2.0 배 이상인 경우 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.5 배 이하인 경우 발현 감소화된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 발현 증가된 유전자는 0.063%(44,290개의 유전자 중 28개), 발현이 감소된 유전자는 0.131%(44,290개의 유전자 중 58개)임을 확인하였다. 이때, 카르바마제핀에 의해 2.0 배 이상 발현이 변화된 유전자들을 기능별로 분류하였을 때, 폐독성에 작용하는 기능으로 판단되는 발달(development), 아팝토시스(apoptosis), 지질대사(lipid metabolism), 세포주기(cell cycle), 전사(transcription), 면역반응(immune response), 수송(transport) 또는 단백질 분해(proteolysis)에 관련된 유전자를 선별하였다(표 2 및 표 3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 카르바마제핀을 처리했을 때, 인간 기관지 상피 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
본 발명에서는 상기 유전자 중 지질대사 관련 유전자 4종과 면역반응 관련 유전자 8종을 분리하여 실시간 RT-PCR(real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 방법으로 발현 양상을 조사하였다. 그 결과, 3종의 과발현 유전자들과 9종의 저발현 유전자의 발현 양상이 올리고마이크로어레이 칩 결과와 유사하게 나타남을 확인하였다(표 5 참조).
또한, 본 발명은 상기 마커유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 폐독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 마커유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함한다.
본 발명의 폐독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이칩을 제작하는 방법은 하기와 같다:
상기 탐색된 마커유전자를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라 스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자를 이용한 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
본 발명은
1) 인간 기관지 상피 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 피검 화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군과 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질을 표지하는 단계;
4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 본 발명의 마커유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 기관지 상피 세포는 BEAS-2B를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 기관지 또는 폐로부터 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 전체 인간 게놈 올리고 마이크로어레이(Whole Human Genome Oligo Microarray)(Agilent, USA)를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 공통적으로 과발현 또는 저발현 유전자(표 2 및 포 3 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 모두 사용 가능하며 본 발명의 실시예에서는 직접 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하였다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어라면 모두 사용 가능하다.
또한, 본 발명은
1) 인간 기관지 상피 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
3) 단계 2)의 RNA를, 본 발명의 마커유전자에 상보적이고 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 기관지 상피 세포는 BEAS-2B를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 기관지 또는 폐로부터 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 3)의 프라이머는 본 발명에서 탐색된 마커유전자 유전자와 상보적이고, 마커유전자를 증폭할 수 있으며, 증폭산물이 100 내지 300 bp(base pair)가 되도록 설계된 프라이머라면 모두 사용가능하다. 본 발명에서는 서열번호 1 내지 26로 기재되는 정방향 및 역방향 프라이머 13쌍을 제시하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 본 발명은 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 폐독성 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.
상기 DNA 마이크로어레이 칩은 본 발명의 방법으로 제작한 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 검색용 키트는 추가적으로 인간 기관지 상피 세포를 포함할 수 있으며, 인간 기관지 상피 세포는 BEAS-2B를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 기관지 또는 폐로부터 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색용 키트는 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.
상기 검색용 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
상기 검색용 키트에 추가적으로 상기 마커유전자 유전자에 상보적이고, 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함할 수 있으며, 프라이머는 서열번호 1 내지 26로 기재되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 마커유전자에 상보적이고, 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있으며 증폭산물이 100 내지 300bp가 되도록 설계된 정방향 또는 역방향 프라이머쌍은 모두 사용 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리
<1-1> 세포배양
인간 기관지 상피 세포주인 BEAS-2B 세포(CRL-9609, ATCC, USA)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)를 이용하여 T75 플라스크에서 5 × 105 세포/ml이 되도록 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 폐독성을 부작용으로 나타나는 대표적인 약물인 카르바마제핀을 선정하였으며, DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.
<1-2> 세포 독성 실험 ( MTT assay ) 및 화학 물질 처리
Mossman 등 (J. Immunol . Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 BEAS-2B 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트에 3× 104/웰 세포수로 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)에서 DMSO에 용해된 카르바마제핀을 처리하고 48시간 후에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다. BEAS-2B 세포주에서 카르바마제핀의 세포독성을 살펴본 결과, 20%의 생존 저 해를 보이는 농도(IC20)는 324.313 uM 이었으며(도 1 참조), 상기 농도들로 결정하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
< 실시예 2> 마이크로어레이 실험
<2-1> 표적 RNA 의 분리 및 형광 물질 표지
1.24 × 106 cell/㎖ 농도로 100 mm 디쉬(dish)에 BEAS-2B 세포를 분주한 후, 실시예 1-2에서 결정된 카르바마제핀의 농도를 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 순도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)으로 확인하였다.
<2-2> 표지된 cDNA 제조
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시예 2-1에서 수득한 카르바마제핀 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 표 1과 같이 시약을 혼합하였다.
구성 부피(㎕)
5X first strand buffer 6
dNTPs 0.6
0.1 M DDT 3
SuperScript II enzyme 3
Cy-3 or Cy-5 dUTP 2
대조군인 BEAS-2B 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)으로 표지화하였고, 카르바마제핀을 처리한 BEAS-2B 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)를 표지화하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제되었다.
<2-3> 혼성화 반응
혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로 44 k Whole Human Genome 올리고 마이크로어레이(Agilent, USA)를 이용하였다. 세척(2분간 2×SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1×SSC, 2분간 0.2× SSC에 세척) 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.
<2-4> 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon Instruments, USA)로 스캔하였다. 결합되지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)로 분석하였다. 이렇게 얻어진 데이터로부터 카르바마제핀에 대한 마커 유전자를 선별하였다(도 2 참조).
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 4천 개의 유전자 중에서 카르바마제핀에 의해 Cy5/Cy3의 비율이 2.0배 이상으로 유전자 발현 증가를 보이는 유전자는 0.063%(44,290개의 유전자 중 28개) 발현이 감소된 유전자는 0.131%(44,290개의 유전자 중 58개)임을 확인하였다.
이때, 카르바마제핀에 의해 2.0 배 이상 발현이 변화된 유전자들을 기능별로 분류하였을 때, 폐독성에 작용하는 기능으로 판단되는 발달(development), 아팝토시스(apoptosis), 지질대사(lipid metabolism), 세포주기(cell cycle), 전사(transcription), 면역반응(immune response), 수송(transport) 또는 단백질 분해(proteolysis)에 관련된 유전자를 선별하였다(표 2 및 표 3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 카르바마제핀을 처리했을 때, 인간 기관지 상피 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
카르바마제핀에 의해 발현이 증가하는 유전자
등록번호 유전자 약어 유전자 명 중간값의 비
1. 발달(development)
NM_170735 BDNF Brain-derived neurotrophic factor opposite strand 2.119213
NM_000600 IL6 Interleukin 6 (interferon, beta 2) 2.980584
NM_005574 LMO2 LIM domain only 2 (rhombotin-like 1) 2.262782
2. 아폽토시스(apoptosis)
NM_000575 IL1A Interleukin 1, alpha 2.338073
NM_000600 IL6 Interleukin 6(interferon, beta 2) 2.980584
3. 세포주기(cell cycle)
NM_001759 CCND2 Cyclin D2 3.025394
NM_000575 IL1A Interleukin 1, alpha 2.338073
4. 수송(transport)
AB209591 SLC7A7 Solute carrier family 7(cationic amino acid transporter, y+ system), member 7 2.17117
BC065524 SLC16A14 Solute carrier family 16(monocarboxylic acid transporters), member 14 2.096865
5. 면역반응(immune response)
NM_000600 IL6 Interleukin 6(interferon, beta 2) 2.980584
NM_000575 IL1A Interleukin 1, alpha 2.338073
AK095849 SNORD22 RNA, U22 small nucleolar 2.173501
6. 기타
NM_133436 ASNS Asparagine synthetase 2.095247
NM_005318 H1F0 H1 histone family, member 0 2.54493
AL833069 KIAA1434 Hypothetical protein KIAA1434 2.102194
NM_016269 LEF1 Hypothetical protein LOC641518 2.161112
NM_006203 PDE4D Phosphodiesterase 4D, cAMP-specific (phosphodiesterase E3 dunce homolog,
Drosophila)		 2.060747
NM_171998 RAB39B RAB39B, member RAS oncogene family 2.668004
7. 생물학적 기능이 알려지지 않은 유전자(biological process unknown)
THC2356527 ALU1_HUMAN(P39188) Alu subfamily J
sequence contamination warning entry,
partial(4%)[THC2356527]		 2.07814
BC053619 ARRDC3 Arrestin domain containing 3 3.185865
CR933688 CCT6B Chaperonin containing TCP1, subunit 6B(zeta 2) 2.020246
AF424541 FLJ35024 hypothetical LOC401491 2.0423
AK094995 Homo sapiens cDNA FLJ37676 fis, clone
BRHIP2012627. [AK094995]		 2.210553
AK057709 Homo sapiens, clone IMAGE:4823248, mRNA.[BC034285] 2.014673
XM_374983 KIAA0748 KIAA0748 gene product 2.421593
AK096179 LOC285958 Hypothetical protein LOC285958 2.413523
XM_496241 LOC440459 Similar to solute carrier family 16, member 6; monocarboxylate transporter 6 2.81302
AK095849 RNU22 RNA, U22 small nucleolar 2.173501
NM_012338 TM4SF12 Tetraspanin 12 2.06978
BC029580 UNQ5783 DTFT5783 2.491394
NM_032494 ZC3HDC8 Zinc finger CCCH-type containing 8 2.07481
8. 알려지지 않은 유전자(unknown gene)
AL137617 Unknown MRNA; cDNA DKFZp434C0512(from clone DKFZp434C0512) 2.004506
AW450033 Unknown Transcribed locus, moderately similar to XP_530339.1 PREDICTED: hypothetical protein XP_530339[Pan troglodytes] 3.009731
카르바마제핀에 의해 발현이 감소하는 유전자
등록번호 유전자 약어 유전자 명 중간값의 비
1. 지질대사(lipid metabolism)
NM_004265 FADS2 Fatty acid desaturase 2 0.470737
BX648281 LDLR Low density lipoprotein receptor(familial hypercholesterolemia) 0.263719
AK124635 PCSK9 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 0.38483
NM_005063 SCD Stearoyl-CoA desaturase(delta-9-desaturase) 0.31289
BC051385 SREBF2 Sterol regulatory element binding transcription factor 2 0.485788
2. 단백질분해(proteolysis)
AK124635 PCSK9 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 0.38483
NM_007173 PRSS23 Protease, serine, 23 0.484332
NM_001733 C1R Complement component 1, r subcomponent 0.403645
NM_001734 C1S Complement component 1, s subcomponent 0.379712
3. 면역반응(immune response)
U81234 CXCL6 Chemokine(C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2) 0.416608
NM_003004 SECTM1 Secreted and transmembrane 1 0.478433
NM_001733 C1R Complement component 1, r subcomponent 0.403645
NM_001734 C1S Complement component 1, s subcomponent 0.379712
BG564326 SAA4 Serum amyloid A4, constitutive 0.411892
AK095515 IFIT1 Interferon-induced protein with
tetratricopeptide repeats 1		 0.442454
U51869 KLF6 kruppel-like factor 6 0.424528
4. 전사(transcription)
U51869 KLF6 kruppel-like factor 6 0.424528
NM_005195 CEBPD CCAAT/enhancer binding protein(C/EBP), delta 0.489373
NM_000503 EYA1 Eyes absent homolog 1(Drosophila) 0.386468
BC051385 SREBF2 Sterol regulatory element binding transcription factor 2 0.485788
AB018341 ZNF432 Zinc finger protein 432 0.414943
5. 세포주기(cell cycle)
NM_006306 SMC1L1 SMC1 structural maintenance of chromosomes 1-like 1(yeast) 0.494641
AK091170 CDKN2C Cyclin-dependent kinase inhibitor 2C(p18, inhibits CDK4) 0.49684
6. 기타
NM_015071 ARHGAP26 Rho GTPase activating protein 26 0.352149
Z74615 COL1A1 Collagen, type I, alpha 1 0.319687
BC060883 EPN2 Epsin 2 0.415894
BC036314 FAM3B Family with sequence similarity 3, member B 0.497387
NM_033480 FBXO9 F-box protein 9 0.456888
NM_005345 HSPA1A Heat shock 70kDa protein 1A 0.465741
NM_006597 HSPA8 Heat shock 70kDa protein 8 0.4763
NM_198336 INSIG1 Insulin induced gene 1 0.260857
XM_371647 LOC389129 Similar to CG9996-PA 0.400533
NM_005576 LOXL1 Lysyl oxidase-like 1 0.432617
NM_001620 MGC5395 AHNAK nucleoprotein(desmoyokin) 0.348993
NM_002353 TACSTD2 Tumor-associated calcium signal transducer 2 0.448029
NM_004202 TMSB4Y Thymosin, beta 4, Y-linked 0.474325
BQ186674 Hypothetical gene supported by AF086204
UI-E-EJ1-ajr-f-10-0-UI.r1 UI-E-EJ1 Homo sapiens cDNA clone UI-E-EJ1-ajr-f-10-0-UI 5', mRNA sequence [BQ186674]		 0.398382
NM_199511 URB Steroid sensitive gene 1 0.451744
NM_003379 VIL2 Villin 2(ezrin) 0.496066
AK093924 VIM Vimentin 0.459119
7. 생물학적 기능이 밝혀지지 않은 유전자
BX641022 ANKRD10 Ankyrin repeat domain 10 0.490164
NM_001155 ANXA6 Annexin A6 0.462604
AB176708 C13orf25 Chromosome 13 open reading frame 25 0.485911
AK074056 C16orf44 Chromosome 16 open reading frame 44 0.478059
AJ243662 C1orf42 Chromosome 1 open reading frame 42 0.489974
AF113007 DKFZP586A0522 DKFZP586A0522 protein 0.376194
CR627373 EIF4EBP2 Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 2 0.467018
AF450484 FLJ20716 Family with sequence similarity 70, member A 0.255893
AK093343 FLJ23231 Zinc finger CCCH-type containing 12A 0.444195
AL831967 GATS Opposite strand transcription unit to STAG3 0.479045
BX339282 Homo sapiens mesoderm specific transcript homolog(mouse)(MEST), transcript variant 1, mRNA [NM_002402] 0.479832
AK131570 Homo sapiens polymerase I and transcript release factor(PTRF), mRNA [NM_012232] CDNA FLJ16824 fis, clone UTERU2025415 0.381722
AA662846 Homo sapiens promyelocytic leukemia(PML), transcript variant 1, mRNA [NM_033238] 0.310852
BC042028 ITGB8 Integrin, beta 8 0.435035
BC052951 LMNB1 Lamin B1 0.454698
BC068575 LOC114990 Slit-like 2(Drosophila) 0.475588
BC065180 LOC144501 Hypothetical protein LOC144501 0.476558
AF001540 MALAT-1 metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1(non-coding RNA) 0.298961
NM_005764 MAP17 PDZK1 interacting protein 1 0.334567
NM_145040 PRKCDBP Protein kinase C, delta binding protein 0.458744
CD388106 S100A10 S100 calcium binding protein A10(annexin II ligand, calpactin I, light polypeptide(p11)) 0.385621
8. 밝혀지지 않은 유전자(unknown)
THC2345721 Unknown 0.183552
THC2316748 Unknown 0.479933
< 실시예 3> 실시간 RT - PCR ( Real - time reverse transcriptase polymerase chain reaction ) 정량
카르바마제핀에 의해 발현 유도된 상기 실시예 2의 과발현 및 저발현된 유전자 중 카르바마제핀에 의해 주로 야기되는 폐독성 관련 기전으로 지질대사, 세포주기, 신호전달 관련 유전자 12종을 선별하였다. 이들 유전자들은 유전자 등록번호(Genebank NM_000600[Interleukin 6(interferon, beta 2)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_000575(Interleukin 1, alpha), 유전자 등록번호(Genebank) AK095849(RNA, U22 small nucleolar), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003004(Secreted and transmembrane 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001733(Complement component 1, r subcomponent), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001734(Complement component 1, s subcomponent), 유전자 등록번호(Genebank U81234[Chemokine(C-X-C motif) ligand 6(granulocyte chemotactic protein 2)], 유전자 등록번호(Genebank) BG564326(Serum amyloid A4, constitutive), 유전자 등록번호(Genebank) NM_004265(Fatty acid desaturase 2), 유전자 등록번호(Genebank) AK124635(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9), 유전자 등록번호(Genebank) NM_005063[Stearoyl-CoA desaturase(delta-9-desaturase)], 유전자 등록번호(Genebank) BX648281[Low density lipoprotein receptor(familial hypercholesterolemia)]이다.
상기 유전자들의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR)(Bio-rad, USA)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다. 구체적으로, 올리고 dT 프라이머와 Superscript kit(Omniscipt™ kit, Qiagen, Co., USA)를 이용하여 역전사반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA 0.2 ㎕와 물 3.8 ㎕, 센스 프라이머 0.5 ㎕, 안티센스 프라이머 0.5 ㎕, 사이버그린 I 염색 수퍼믹스(Bio-rad, USA) 5 ㎕ 를 혼합하여, PCR 튜브에 담아 단계 1: 95℃, 3분; 단계 2(45회 반복): 단계 2-1: 95℃, 10초; 단계 2-2: 55 내지 65℃ 45초; 단계 3: 95℃, 1분; 단계 4: 55℃, 1분; 단계 5(반복 80회): 55℃, 10초로 프로그램을 설계한 My IQ 실시간 PCR 기계에서 반응을 수행하였다. PCR 산물을 정량하기 위하여 사이버그린(SYBR Green) I 염색 (Bio-rad, USA)으로 염색하였다. 사이버그린 I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저 PCR에 이용한 표적 유전자와 내재성(endogenous) 대조군(GAPDH)에 대한 프라이머를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 각각의 프라이머(표 4 참조)를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다(표 5 참조).
프라이머 서열
등록번호 유전자
약어		 유전자명 프라이머
혼성화 융점
(Tm, ℃)		 PCR 프라이머 서열
(5'->3')
NM_000600 IL6 Interleukin 6(interferon, beta 2) 64.3 센스
(서열번호 1)		 ACTGGTGTTCAAACCCTCACCACT
NM_000600 IL6 Interleukin 6(interferon, beta
2)		 64.3 안티센스
(서열번호 2)		 ATGGGTCTGCGGCATATGGAAACA
NM_000575 IL1A Interleukin 1, alpha 64.3 센스
(서열번호 3)		 TCTCCACAAGCGCCTTCG
NM_000575 IL1A Interleukin 1, alpha 64.3 안티센스
(서열번호 4)		 CTCAGGGCTGAGATGCCG
AK095849 SNORD22 RNA, U22 small nucleolar 57 센스
(서열번호 5)		 AGAGCTGCGTTGCACTTGTTTACG
AK095849 SNORD22 RNA, U22 small nucleolar 57 안티센스
(서열번호 6)		 AACTTGCTTCCCGTTCTTCAGGGA
NM_003004 SECTM1 Secreted and transmembrane 1 57 센스
(서열번호 7)		 ACTGGTGTTCAAACCCTCACCACT
NM_003004 SECTM1 Secreted and transmembrane 1 57 안티센스
(서열번호 8)		 ATGGGTCTGCGGCATATGGAAACA
NM_001733 C1R Complement component 1, r
subcomponent		 57 센스
(서열번호 9)		 TATTACCACATGGGCAGACTGGCA
NM_001733 C1R Complement component 1, r
subcomponent		 57 안티센스
(서열번호10)		 GGCCTTGGCCCGTTCATAATTCTT
NM_001734 C1S Complement component 1, s
subcomponent		 64.3 센스
(서열번호11)		 TGGGCAGAGCCTATTGGGACATAA
NM_001734 C1S Complement component 1, s
subcomponent		 64.3 안티센스
(서열번호12)		 ACCCTGGAACGGCTGATGAGTTTA
U81234 CXCL6 Chemokine(C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2) 64.3 센스
(서열번호13)		 AACCTGCCTAATGGTGACTTCCGT
U81234 CXCL6 Chemokine(C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2) 64.3 안티센스
(서열번호14)		 TTCTTCCAAATGCCCTGTGCTGTG
BG564326 SAA4 Serum amyloid A4, constitutive 57 센스
(서열번호15)		 ACACCTGAGAAACTGGAGAACGCA
BG564326 SAA4 Serum amyloid A4, constitutive 57 안티센스
(서열번호16)		 GCCCTTTGAGCCAAGCAGGTTATT
NM_004265 FADS2 Fatty acid desaturase 2 64.5 센스
(서열번호17)		 AGGACGGCTACAGCTACCC
NM_004265 FADS2 Fatty acid desaturase 2 64.5 안티센스
(서열번호18)		 CTCCAGGCAGATGTTCACG
AK124635 PCSK9 Proprotein convertase
subtilisin/kexin type 9		 55 센스
(서열번호19)		 ACTCGGTGAGCTGTGAAAGGCTAT
AK124635 PCSK9 Proprotein convertase
subtilisin/kexin type 9		 55 안티센스
(서열번호20)		 ACCCAAGTCATCCTGCTCCTTCAT
NM_005063 SCD Stearoyl-CoA desaturase
(delta-9-desaturase)		 65 센스
(서열번호21)		 AACTTGATACGTCCGTGTGTCCCA
NM_005063 SCD Stearoyl-CoA desaturase
(delta-9-desaturase)		 65 안티센스
(서열번호22)		 CTGTATGTTTCCGTGGCAATGCGT
BX648281 LDLR Low density lipoprotein receptor(familial hypercholesterolemia) 63.3 센스
(서열번호23)		 AGGACGGCTACAGCTACCC
BX648281 LDLR Low density lipoprotein receptor(familial hypercholesterolemia) 63.3 안티센스
(서열번호24)		 CTCCAGGCAGATGTTCACG
NM_002046 GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase		 센스
(서열번호25)		 TGCACCACCAACTGCTTAGC
NM_002046 GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase		 안티센스
(서열번호26)		 GGCATGGACTGTGGTCATGA
등록번호 유전자
약어		 유전자명 cDNA
마이크로어레이
(Cy3/Cy5 비율)		 실시간 PCR
(상대적 배율)
NM_000600 IL6 Interleukin 6(interferon, beta 2) 2.980584 3.801758
NM_000575 IL1A Interleukin 1, alpha 2.338073 3.234031
AK095849 SNORD22 RNA, U22 small nucleolar 2.173501 1.861759
NM_003004 SECTM1 Secreted and transmembrane 1 0.478433 0.559936
NM_001733 C1R Complement component 1, r subcomponent 0.403645 0.537126
NM_001734 C1S Complement component 1, s subcomponent 0.379712 0.464366
U81234 CXCL6 Chemokine(C-X-C motif) ligand 6(granulocyte chemotactic protein 2) 0.416608 0.457973
BG564326 SAA4 Serum amyloid A4, constitutive 0.411892 0.454809
NM_004265 FADS2 Fatty acid desaturase 2 0.470737 0.31498
AK124635 PCSK9 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 0.38483 0.499423
NM_005063 SCD Stearoyl-CoA desaturase(delta-9-desaturase) 0.31289 0.449585
BX648281 LDLR Low density lipoprotein receptor(familial hypercholesterolemia) 0.263719 0.166855
그 결과, 3종의 과발현 유전자들과 9종의 저발현 유전자들의 유전자 발현 양상은 폐독성 유발 약물들에 의한 유전자 발현을 조사한 올리고 마이크로어레이 결과와 매우 유사하게 나타남을 확인하였다.
도 1은 카르바마제핀의 인간 기관지 상피 세포주에서의 세포 독성을 조사한 그래프이고,
도 2는 마이크로어레이 칩을 이용한 카르바마제핀을 처리한 인간 기관지 상피 세포주의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Marker genes based on carbamazepine treatment for screening of drug inducing pulmonary toxicity and screening method using thereof <130> 7p-08-13 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Interleukin 6(interferon, beta 2) sense primer <400> 1 actggtgttc aaaccctcac cact 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Interleukin 6 (interferon, beta 2) antisense primer <400> 2 atgggtctgc ggcatatgga aaca 24 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Interleukin 1, alpha sense primer <400> 3 tctccacaag cgccttcg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Interleukin 1, alpha antisense primer <400> 4 ctcagggctg agatgccg 18 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> RNA, U22 small nucleolar sense primer <400> 5 agagctgcgt tgcacttgtt tacg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> RNA, U22 small nucleolar antisense primer <400> 6 aacttgcttc ccgttcttca ggga 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Secreted and transmembrane 1 sense primer <400> 7 actggtgttc aaaccctcac cact 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Secreted and transmembrane 1 antisense primer <400> 8 atgggtctgc ggcatatgga aaca 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Complement component 1, r subcomponent sense primer <400> 9 tattaccaca tgggcagact ggca 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Complement component 1, r subcomponent antisense primer <400> 10 ggccttggcc cgttcataat tctt 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Complement component 1, s subcomponent sense primer <400> 11 tgggcagagc ctattgggac ataa 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Complement component 1, s subcomponent antisense primer <400> 12 accctggaac ggctgatgag ttta 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Chemokine(C-X-C motif) ligand 6 sense primer <400> 13 aacctgccta atggtgactt ccgt 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Chemokine(C-X-C motif) ligand 6 antisense primer <400> 14 ttcttccaaa tgccctgtgc tgtg 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Serum amyloid A4, constitutive sense primer <400> 15 acacctgaga aactggagaa cgca 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Serum amyloid A4, constitutive antisense primer <400> 16 gccctttgag ccaagcaggt tatt 24 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Fatty acid desaturase 2 sense primer <400> 17 aggacggcta cagctaccc 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Fatty acid desaturase 2 antisense primer <400> 18 ctccaggcag atgttcacg 19 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 sense primer <400> 19 actcggtgag ctgtgaaagg ctat 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 antisense primer <400> 20 acccaagtca tcctgctcct tcat 24 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Stearoyl-CoA desaturase(delta-9-desaturase) sense primer <400> 21 aacttgatac gtccgtgtgt ccca 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Stearoyl-CoA desaturase(delta-9-desaturase) antisense primer <400> 22 ctgtatgttt ccgtggcaat gcgt 24 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Low density lipoprotein receptor(familial hypercholesterolemia) sense primer <400> 23 aggacggcta cagctaccc 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Low density lipoprotein receptor(familial hypercholesterolemia) antisense primer <400> 24 ctccaggcag atgttcacg 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase sense primer <400> 25 tgcaccacca actgcttagc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase antisense primer <400> 26 ggcatggact gtggtcatga 20

Claims (16)

  1. 하기의 모든 유전자의 핵산서열의 전부 또는 그로부터 선택되는 18 내지 30개의 핵산 서열로 구성되는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 카르바마제핀에 대한 지질대사 관련 유전자 발현 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩:
    유전자 등록번호(Genebank) NM_004265(Fatty acid desaturase 2), 유전자 등록번호(Genebank) BX648281[Low density lipoprotein receptor(familial hypercholesterolemia)], 유전자 등록번호(Genebank) AK124635(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_005063[Stearoyl-CoA desaturase(delta-9-desaturase)], 유전자 등록번호(Genebank) BC051385(Sterol regulatory element binding transcription factor 2).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 1) 인간 기관지 상피 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
    3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
    4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
    5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
    6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 카르바마제핀에 대한 지질대사 관련 유전자 발현 여부 확인 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 단계 1)의 인간 기관지 상피 세포는 BEAS-2B 세포인 것을 특징으로 하는 카르바마제핀에 대한 지질대사 관련 유전자 발현 여부 확인 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3(Cyanine 3), Cy5(Cyanine 5), 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 카르바마제핀에 대한 지질대사 관련 유전자 발현 여부 확인 방법.
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  11. 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 카르바마제핀에 대한 지질대사 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트.
  12. 제 11항에 있어서, 인간 기관지 상피 세포인 BEAS-2B 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 카르바마제핀에 대한 지질대사 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트.
  13. 제 11항에 있어서, 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 형광물질군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 카르바마제핀에 대한 지질대사 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트.
  14. 제 11항에 있어서, 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 표식시약, 및 세척 완충용액으로 이루어진 반응시약군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 카르바마제핀에 대한 지질대사 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트.
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