KR101079250B1

KR101079250B1 - 카바릴 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법

Info

Publication number: KR101079250B1
Application number: KR1020090080406A
Authority: KR
Inventors: 류재천; 김연정; 송미; 김지희; 이지나
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2011-11-03
Also published as: KR20110022906A

Abstract

본 발명은 카바릴(carbaryl)에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 구체적으로 카바마이트계 살충제 중 하나인 카바릴에 의해 대조군에 비해 특이적으로 유전자 발현이 증가하는 바이오마커 및 이를 이용한 카바릴에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오마커가 집적된 DNA 마이크로어레이 칩은 인간의 갑상선에 대한 카바릴 노출을 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 카바릴에 의해 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 유용하게 이용될 수 있다.

카바릴, 바이오마커, 마이크로어레이, 갑상선 과산화효소, 갑상선 소포암

Description

카바릴 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법{Biomarker for identification of exposure to carbaryl and the method of identification using thereof}

본 발명은 카바릴(carbaryl)에 대한 노출 여부 확인 방법에 관한 것이다.

카바마이트계 살충제 중 대표적인 카바릴(carbaryl)은 농작물 및 가금류, 가축 등의 해충 제거를 위해 널리 사용되고 있으며, 생식기능 및 발달 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다(Cheng S et al ., Toxicology, 220:37-45, 2006). 카바릴은 사람, 척추동물 및 곤충의 신경계에 중요 효소인 콜린에스테라아제(cholinesterase)의 억제제로 작용하는 것으로 보고되었다. 콜린에스테라아제 중 한 종류인 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinexterase, AChE)는 신경계에서 신호전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine, Ach)을 분해시키는 것으로 알려져 있고 카바릴은 콜린에스테라아제의 억제작용을 유도하는 것으로 보고되었다. 따라서 카바릴이 아세틸콜린에스테라아제가 아세틸콜린을 분해하는 것을 방해하여 신경계 내 에 고농도의 아세틸콜린을 축적시키는 것이 근육세포에 영향을 주어 근육 마비, 경련 등을 일으키는 것으로 보고되고 있다(Chang PA et al ., Chem Biol Interact . 159(1):65-72, 2006).

카바릴은 생체이물질(xenobiotics)을 세포독성 유도체 또는 돌연변이원성 유도체로 대사시키는 효소인 시토크롬 P450 1A1(CYP1A1)의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있고, 산화 스트레스(oxidative stress) 관련된 유전자인 c-fos(FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog), NF-κBRE(nuclear factor-κBRE), HSP70(70 kilodalton heat shock proteins), GRP78(glucose regulated protein 78) 및 GADD153(Growth Arrest and DNA Damage 153)의 전사 조절을 활성화시키는 것으로 보고되고 있으며, 이들에 의한 DNA 손상으로 유전독성을 나타내는 것으로 보고된바 있다(Delescluse C et al ., Biochem . Pharmacol . 61:399-407, 2001). CYP1A1 이외에 CYP1A2, CYP2B6, CYP2C19, CYP3A4 또한 인체 내 카바릴의 대사작용에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있다(Usmani K A et al ., Drug Metab Dispos . 34(9):1606-1614, 2006). 카바릴은 환상 아데노신 일인산(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)의 생성을 감소시키고 미토콘드리아 단백질인 스테로이드생성 고도 조절 단백질(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)의 유전자 발현을 억제함으로써 미토콘드리아 막을 통한 콜레스테롤 수송을 방해하여 스테로이드 생성(steroidogenesis)을 억제하는 것으로 보고되었다(Cheng S et al ., 2006). 또한, 카바릴은 호르몬 조절 불균형으로 인체 기관 및 기관계에 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 카바릴은 어류 중 차나 펀타투스(Channa punctatus) 종에서 생 식선 자극 호르몬(gonadotropic hormone, GtH), 생식선 자극 방출 호르몬(gonadotropin-releasing hormone, GnRH) 및 뇌하수체 호르몬의 분비를 감소시켜 생식기능 손상을 유발하는 것으로 보고되었다(Cheng S et al ., 2006). 또한, 카바릴은 에스트로겐 수용체 알파 또는 베타(estrogen receptor α, β)에 결합하여 에스트로겐 길항제(estrogen antagonist)로서 작용하여 내분비계 장애를 유발하는 것으로 보고된바 있다(Lemaire G et al ., Life Sci . 79(12):1160-1169, 2006).

이 외에 카바릴은 대리석상어속 어류인 클라리아스 박트라츄스(Clarias bactrachus) 종에서 티록신(thyroxine, T₄)의 감소, 트리이오도티로닌(triiodothyronine, T₃)의 증가 및 T₃/T₄ 비율의 증가에 의한 갑상선 호르몬 순환의 변화에 의해 갑상선 기능 장애를 유발하는 것으로 보고되고 있다(Cheng S et al ., 2006). 또한, 카바릴은 갑상선호르몬 수용체(thyroid hormone receptor)에 결합하여 갑상선 호르몬에 의한 전이활성화(transactivation)를 억제하는 것으로 보고되었다(Sun H et al ., Toxicology, 249:238-242, 2008).

갑상선 과산화효소는 갑상선 상피세포의 세포막에 위치한 단백질로 갑상선 호르몬 생합성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었으며, 갑상선 과산화효소의 억제는 체내 대사율을 조절하는 갑상선 호르몬인 티록신(T₄)의 구성성분인 요오드의 결핍 및 갑상선종 발달을 촉진시키는 것으로 보고되고 있기 때문에 내분비계 장애물질의 갑상선에의 독성 여부를 관찰하는데 있어 중요한 표적이 된다(Schmutzler C et al ., Endocrinology, 148(6):2835-2844, 2007).

갑상선호르몬 장애물질의 갑상선호르몬 활성 및 호르몬 수용체 결합과 유전자 발현 변화에 대한 연구가 일부 보고되고 있지만, 주로 마우스를 이용한 연구에 거의 국한되어 있다. 그리고 상기에서 언급한 것과 같이 카바릴의 인간의 갑상선에의 장애 가능성에서도 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 보다 빠르고 간편한 스크리닝 방법, 예를 들면 프라이머를 이용하는 실시간 PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 카바릴의 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.

포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 즉, 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레 이(microarray) 분석을 수행했다(Schena M et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:10614-10619, 1996).

마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20-25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K et al ., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer K et al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).

유전자 발현의 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 수득하여 형광이나 동위원소로 표지화하며 cDNA로 전환시킨 후, DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 혼성화 반응을 수행한다. 올리고마이크로어레이는 주로 두 개의 다른 형광(예: Cy3 및 Cy5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 혼성화 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram K et al ., Genomics Proteomics I:1-10, 2002). 최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등 과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯한 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석 및 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색이 가능하게 될 것이다.

이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 4천개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 카바릴에 노출된 인간 갑상선 소포암 세포에서의 유전자 발현 프로파일을 관찰 및 분석함으로써 카바릴에 의해 대조군에 비해 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 유전자를 발굴하여 카바릴 노출 여부를 확인할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 노출 여부를 확인하는 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 카바릴(carbaryl) 특이적 바이오마커가 집적된 DNA 마이크로어레이 칩 및 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩을 이용한 카바릴에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AJ489257[트리아딘(triadin)] 유전자의 핵산 서열의 전부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된, 카바릴에 대한 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

또한, 본 발명은

카바릴에 대한 노출이 의심되는 개체(실험군) 및 대조군으로부터 분리된 RNA 시료로부터

1) cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;

2) 단계 1)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 상기 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화 시키는 단계;

3) 단계 2)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및

4) 단계 3)의 분석한 데이터에서 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 카바릴에 대한 노출 여부를 측정하는 단계를 포함하는 카바릴에 대한 노출 여부 확인을 위한 유전자 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 상기 RNA를, 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

2) 단계 1)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 카바릴에 대한 노출 여부를 측정하는 단계를 포함하는 카바릴에 대한 노출 여부 확인을 위한 유전자 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 카바릴에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 카바릴에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

본 발명의 카바릴(carbaryl)에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자를 바이오마커로 이용하여 카바릴의 노출을 판정하는데 유용하며, 카바릴에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 카바릴(carbaryl)의 노출에 의해 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 카바릴에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커[유전자등록번호(Genbank) AJ489257; 트리아딘(triadin)]를 제공한다.

상기 바이오마커는 카바릴의 인간 갑상선 소포암 세포에서 카바릴을 갑상선 과산화효소 억제 농도로 처리하였을 때 1.5배 이상 유전자 발현이 증가된 유전자이다.

본 발명자들은 카바릴에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 카바릴을 인간 갑상선 소포암 세포주에 처리하여 세포 독성 및 갑상선 호르몬 생산에 중요하다고 알려진 갑상선 과산화효소의 활성 여부를 확인하였다. 그 결과, 카바릴은 인간 갑상선 소포암 세포주에 독성을 나타내었고(도 1 참조), 인간 갑상선 소포암 세포주에서 갑상선 과산화효소의 작용을 활성화 시키는 것을 확인하였으며(도 2 참조), 상기 실험을 바탕으로 세포독성을 나타내지 않으면서 갑상선 과산화효소를 활성화시키는 카바릴의 농도를 결정하였다. 이후 상기에서 결정된 농도로 인간 갑상선 소포암 세포주에 카바릴을 처리한 후, mRNA를 분리하여 4× 44 k 인간 유전체 전체 올리고마이크로어레이 칩(Human whole genome microarray, Agilent, 미국)을 이용하여 유전자 발현양상을 분석하였다. 분석시 Cy5/Cy3 비율이 1.5배 이상인 경우 발현이 증가된 유전자로 분류하였고, 0.67배 이하인 경우 발 현이 감소된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 발현이 증가한 유전자는 1.38%(44,290개의 유전자 중 613개), 발현이 감소된 유전자는 1.72%(44,290개의 유전자 중 761개)임을 확인하였다(도 3 참조). 이때, 발현이 변화된 유전자들 중 폐독성, 신장독성, 최기형성, 심혈관독성, 다환방향족탄화수소, 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기오염물질, 돌연변이원성, 내분비계 장애물질, 갑상선호르몬 장애물질로 각각 분류되는 각 44종의 화학물질(표 1)에 의해 발현이 변화되는 유전자와 비교하였을 때, 이들 유전자와 중복되지 않고 카바릴에 의해 특이적으로 발현이 변화된 유전자들을 확인하였다(도 4 참조). 그 결과, 발현이 증가된 유전자는 0.002%[44,290개의 유전자 중 1개, 유전자등록번호(Genbank) AJ489257; 트리아딘(triadin)]였고, 발현이 감소된 유전자는 없었다. 상기 유전자는 본 발명에서 사용한 카바릴을 처리했을 때, 인간 갑상선 소포암 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.

44종의 화학물질 목록

독성 유형	화학물질
폐독성	메토트렉사트(Methotrexate)
	나이트로푸란토인(Nitrofurantoin)
	카르바마제핀(Carbamazepine)
	아미오다론(Amiodarone)
신장독성	시스플라틴(Cisplatin)
	젠타마이신(Gentamicin)
	암포테리신(Amphotericin B)
최기형성	메토트렉사트(Methotrexate)
	타리도마이드(Thalidomide)
	밸프로산(Valproic acid)
심혈관 독성	독소루비신(Doxorubicin)
심혈관 독성	다우노루비신(Daunorubicin)
다환방향족탄화수소(PAHs)	벤조피렌(Benzo[a]pyrene)
	디벤조 안트라센(Dibenzo[a,h]anthracene)
	나프탈렌(Naphthalene)
	페난트렌(Phenanthrene)
	3-메틸코란트렌(3-methylcholanthrene)
	크리센(Chrysene)
	벤조 안트라센(Benzo[a]anthracene)
	벤조 플루오란텐(Benzo[k]fluoranthene)
	인데노 피렌(Indeno[1,2,3-c,d]pyrene)
휘발성유기화합물(VOCs)	벤젠(Benzene)
	톨루엔(Toluene)
	o-자일렌(o-xylene)
	에틸벤젠(Ethylbenzene)
	트리클로로에틸렌(Trichloroethylene)
	디클로로메탄(Dichloromethane)
	포름알데히드(Formaldehyde)
잔류성 유기오염물질(POPs)	클로르덴(Chlordane)
	톡사펜(Toxaphene)
	헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene)
	미렉스(Mirex)
돌연변이원성(Mutagens)	N-니트로소-N-메틸유레아(N-Nitroso-N-Methylurea)
	2-니트로플루오렌(2-Nitrofluorene)
	4-니트로퀴노리네온-옥사이드(4-Nitroquinoline0N-Oxide)
	퓨릴푸라미드(Furylfuramid)
	메틸 메탄설폰산(Methyl Methanesulfonate)
내분비계 장애물질(EDCs)	17β-에스트라디올(17β-estradiol)
	벤조페논(Benzophenone)
	2,2'-디히록시-4-메톡시 벤조페논(2,2'-Dihydroxy-4-methoxy benzophenone)
	4-히드록시-벤조페논(4-hydroxy-benzophenone)
	2-Hydroxy-4-메톡시 벤조페논(2-Hydroxy-4-methoxy benzophenone)
갑상선 호르몬 장애물질	벤조페논-2(Benzophenone-2)
갑상선 호르몬 장애물질	카바릴(Carbaryl)

또한, 본 발명은 AJ489257[트리아딘(triadin)] 유전자의 핵산 서열의 전부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된, 카바릴에 대한 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

상기 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함한다.

본 발명의 카바릴 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 유전자를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

또한, 본 발명은

상기 RNA 시료는 인간 갑상선 소포암 세포 또는 조직으로부터 유래하고, 바람직하게는 인간 갑상선 소포암 세포인 FTC-238로부터 유래한 것이다. 이때, 대조군은 건강한 개체로부터 유래한 것이다.

또한, 단계 1)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 혼성화는 40℃ 내지 50℃에서 10 내지 20시간 동안 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 DNA 마이크로어레이 칩은 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 AJ489257[트리아딘(triadin)] 유전자가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, 미국) 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 분석은 혼성화된 마이크로어레이 칩을 세척 및 염색한 후 스캔하여 이미지 프로세싱을 수행한 다음 통계적 분석을 수행하는 것이 바람직하다. 상기 염색 및 세척은 Fluidics Station 450을 이용하고, 스캔은 GeneChip scanner3000을 이용하며, 이미지 프로세싱은 Affymetrix GeneChip Operating System(GCOS)을 이용하며, 모든 절차는 Affymetrix사의 프로토콜에 따라 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 통계학적 분석은 GenPlex software version 2.3을 이용하여 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.

또한, 본 발명은

상기 단계 1)의 프라이머 쌍은 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 15 내지 50머 길이, 바람직하게는 15 내지 30머 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 25머의 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 모두 사용 가능하다.

상기 확인용 키트에 추가로 갑상선 소포암 세포를 포함하는 카바릴에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다. 상기 갑상선 소포암 세포는 인간 갑상선 소포암 세포인 FTC-238 세포주를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 갑상선 또는 갑상선암 유래의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 키트에 추가로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인산화효소 접합물질(streptavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemifluorescent agent) 및 화학발광물질(chemiluminescent agent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 키트에 추가로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표시 시약 및 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.

상기 확인용 키트의 프라이머 쌍은 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 15 내지 50머의 길이, 바람직하게는 15 내지 30머의 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 25머의 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 모두 사용 가능하다.

또한, 상기 키트에 추가로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 상기 반응 시약은 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), DNA 중합 효소 및, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 RT-PCR 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리

<1-1> 세포배양

인간 갑상선 소포암 세포주인 FTC-238 세포(ECACC, European Collection of Cell Cultures, 9460902)를 5% FBS가 첨가된 DMEM/F12 배지(Gibro-BRL, 미국)를 이용하여 100 ㎜ 디쉬(dish)에서 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 카바마이트계 살충제의 하나로서 갑상선호르몬 장애물질인 카바릴(carbaryl)을 선정하였으며, 이를 DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.

<1-2> 세포 독성 실험( MTT assay ) 및 화학 물질 처리

본 발명자들은 Mossman 등(J. Immunol . Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 FTC-238 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트의 DMEM/F12 배지에서 5×10⁴/웰 세포수로 분주하여 DMSO에 용해된 카바릴을 처리하였고, 48시간 후에 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal, Sigma, 미국)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.

FTC-238 세포주에서 카바릴의 세포독성을 살펴본 결과, 세포가 독성을 나타내지 않는 농도는 70 μM이었다(도 1).

<1-3> 갑상선 과산화효소 활성화 농도 결정 및 화학 물질 처리

FTC-238 세포주에서 카바릴의 갑상선 과산화효소 활성화 농도를 결정하기 위해 과이어콜 분석(guaiacol assay) 실험을 수행하였다. 2×10⁶ cell/㎖의 FTC-238 세포를 100 ㎜ 디쉬에 분주한 후, 24시간이 지난 후 헤마틴(hematin, Sigma, 미국)을 1 ㎍/㎖로 처리하고, 48시간 후 1.5 ㎖ 튜브에 세포를 모아 초음파기로 0.6초 10번 펄스(pulse)로 세포막을 깬 뒤, 1시간 30분 동안 4℃에서 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 원심분리 후에 상층액은 버리고 침전물은 잘 풀어준 후 1% 디기토닌(digitonin, Sigma, 미국) 500 ㎕를 첨가한 후 4℃에서 24시간 배양하였다. 이 후 다시 1시간 30분 동안 4℃에서 14,000 rpm으로 원심분리하고 원심분리 후의 튜브에서 상층액을 새 튜브로 옮겼다. 추출한 상층액의 단백질량을 BCA assay kit(pierce, 미국)을 이용하여 정량한 후, 농도가 325 ㎍이 되도록 각 튜브에 옮겼다. 상기 전체 단백질 325 ㎍, 100 mM 인산칼륨완충액(potassium phosphate buffer) 및 10 μM의 과산화수소(H₂O₂)가 포함된 용액에 카바릴을 각 농도별로 첨가하고 증류수를 이용하여 600 ㎕로 부피를 맞춘 다음, 이 중 100 ㎕를 취해 새로운 튜브에 옮겼다. 새로 옮긴 튜브에 50 mM 인산칼륨완충액, 40 mM 과이어콜(guaiacol) 및 220 μM 과산화수소(H₂O₂)를 첨가하여 섞은 후, 이 중 100 ㎕를 취해 470 nm에서의 흡광도를 측정하여 갑상선 과산화효소가 활성화되는 농도를 측정하였다. 카바릴에 의해 갑상선 과산화효소가 활성화되는 농도는 1 μM이었다(도 2). 상기 실험 결과는 Windows SPSS 12.0(Statistical Package for Social sciences. SPSS Inc., 미국) software package 프로그램을 이용하여 분산 분 석(ANOVA)을 실시하였고, 유의성이 있는 경우에 Duncan의 다중범위검정(Duncan's multiple range test)으로 시료간의 유의한 차이를 검증하였다.

상기에서 확인한 카바릴에 의한 갑상선 과산화효소의 억제 농도 및 상기 실시예 1-2에서 확인한 세포가 죽지 않는 카바릴 농도를 고려하여 세포가 죽지 않고 갑상선 과산화효소를 활성화시키는 처리 농도인 1 μM로 결정하여 하기 마이크로어레이 실험을 수행하였다.

< 실시예 2> 마이크로어레이 실험

<2-1> 표적 RNA 의 분리 및 형광 물질 표지

2 × 10⁶ cell/㎖ 농도로 100 ㎜ 디쉬에 FTC-238 세포를 분주한 후, 1 μM의 카바릴을 48시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포로부터 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, 미국)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하였고, RNeasy mini kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, 미국)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 농도는 엑스페리온(Experion, Automated Electrophoresis station, Bio-Rad, 미국)으로 확인하였다.

<2-2> 표지된 cDNA 제조

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시 예 2-1에서 수득한 카바릴 처리 군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 표 2와 같이 시약을 혼합하였다.

구성	부피(㎕)
5X first strand buffer	6
dNTPs	0.6
0.1 M DDT	3
SuperScript II enzyme	3
Cy-3 or Cy-5 dUTP	2

대조군인 FTC-238 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)로 표지하였고, 카바릴을 처리한 FTC-238 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)로 표지하였다. 상기 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, 미국)을 사용하여 혼합, 정제되었다.

<2-3> 혼성화 반응

혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)(한국)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로는 4×44 k 인간 유전체 전체(Human whole genome) 올리고마이크로어레이 칩(Agilent, 미국)을 이용하였다. 세척 과정(2분간 2× SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1× SSC, 2분간 0.2× SSC에 세척)을 거친 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.

<2-4> 형광 이미지 획득

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon Instruments, 미국)로 스캔하였다. 결합하지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, 미국)로 분석하였다. 상기 방법에 의해 수득한 데이터로부터 카바릴에 대한 마커 유전자를 선별하였다.

그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 4천 개의 유전자 중에서 카바릴에 의해 분석시 Cy5/Cy3 비율이 1.5배 이상인 경우 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.67배 이하인 경우 발현 감소된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 카바릴의 갑상선 과산화효소 억제 농도 처리에 의해 발현 증가된 유전자는 1.38%(44,290개의 유전자 중 613개), 발현이 감소된 유전자는 1.72%(35,000개의 유전자 중 761개)임을 확인하였다(도 3).

이때, 발현이 변화된 유전자들 중 폐독성, 신장독성, 최기형성, 심혈관독성, 다환방향족탄화수소, 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기오염물질, 돌연변이원성, 내분비계 장애물질, 갑상선호르몬 장애물질로 각각 분류되는 각 44종의 화학물질(표 1)에 의해 발현이 변화되는 유전자와 비교하였을 때, 이들 유전자와 중복되지 않고 카바릴에 의해 1.5 배 이상 특이적으로 발현이 변화된 유전자들을 확인하였다(도 4). 그 결과, 1개의 유전자[44,290개 유전자 중 1개(0.002%), 유전자등록번호(Genbank) AJ489257; 트리아딘(triadin)]가 대조군과 비교하였을 때 1.705배 발현이 증가하였고, 발현이 감소된 유전자는 없었다.

< 실시예 3> 실시간 RT - PCR 정량

상기 결과를 확인하기 위해 카바릴에 의해 발현이 증가된 상기 실시예 2의 과발현 및 저발현된 유전자 중 카바릴에 의해 특이적으로 발현 되는 1종의 유전자[유전자등록번호(Genbank) AJ489257(triadin)]의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR)(Bio-rad, 미국)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다.

구체적으로, 올리고 dT 프라이머와 Superscript kit(Omniscipt™ kit, Qiagen, Co., 미국)를 이용하여 역전사반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA 0.2 ㎕와 물 3.8 ㎕, 센스 프라이머 0.5 ㎕, 안티센스 프라이머 0.5 ㎕, 사이버그린 I 염색 수퍼믹스(Bio-rad, 미국) 5 ㎕를 혼합하여, PCR 튜브에 담아 단계 1: 95℃, 3분; 단계 2(45회 반복): 단계 2-1: 95℃, 10초; 단계 2-2: 57℃ 45초; 단계 3: 95℃, 1분; 단계 4: 55℃, 1분; 단계 5(반복 80회): 55℃, 10초로 프로그램을 설계한 My IQ 실시간 PCR 기계에서 반응을 수행하였다. PCR 산물을 정량하기 위하여 사이버그린(SYBR Green) I 염색(Bio-rad, 미국)으로 염색하였다. 사이버그린 I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저 PCR에 이용한 표적 유전자와 내재성(endogenous) 대조군(MDH1)에 대한 프라이머를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 각각의 프라이머(표 3)를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다(표 4).

그 결과, 트리아딘(triadin) 유전자의 발현 양상은 상기 실시예 2-4의 마이크로어레이 칩 결과와 매우 유사하게 나타남을 확인하였다.

Genbank 등록번호	유전자명	PCR 프라이머 서열 (5'->3')
AJ489257	TRDN(Traidin)	센스(서열번호 1)	AACAACATGCGGAGGAAAGCACTG
		안티센스(서열번호 2)	AGACCAACCCAGATTGCTGTCTCA
NM_005917	MDH1(Malate dehydrogenase 1)	센스(서열번호 3)	CTGCTCTACTCATTCCCTGTTGT
		안티센스(서열번호 4)	CATTAATAGGGAGACCTTCAACAAA

Genbank 등록번호	유전자명	카바릴
		실시간 PCR(상대적 배율)	cDNA 마이크로어레이(Cy3/Cy5 비율)
AJ489257	TRDN(Traidin)	2.26	1.727

도 1은 카바릴(carbaryl)의 인간 갑상선 소포암 세포주에서의 세포 독성을 조사한 그래프이다.

도 2는 카바릴의 인간 갑상선 소포암 세포주에서의 갑상선 과산화효소활성화 정도를 조사한 그래프이다.

도 3은 각 44종의 화학물질에 의한 유전자 발현 변화 양상을 마이크로어레이 칩을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도이다.

도 4는 44종의 화학물질에 의한 유전자 발현 변화 양상을 마이크로어레이 칩을 이용하여 분석한 다음 다른 화합물과 중복되지 않는 유전자를 고른 뒤, 그 중에서 카바릴 특이적으로 발현에 변화를 보이는 유전자를 분석한 결과를 나타낸 도이다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Biomarker for identification of exposure to carbaryl and the method of identification using thereof <130> 9p-08-21 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRDN sense primer <400> 1 aacaacatgc ggaggaaagc actg 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRDN antisense primer <400> 2 agaccaaccc agattgctgt ctca 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MDH1 sense primer <400> 3 ctgctctact cattccctgt tgt 23 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MDH1 antisense primer <400> 4 cattaatagg gagaccttca acaaa 25

Claims

트리아딘(triadin)(GenBank 등록 번호: AJ489257) 유전자의 핵산 서열의 전부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된, 카바릴에 대한 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩.
제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 트리아딘 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로 어레이 칩.
카바릴에 대한 노출이 의심되는 개체(실험군) 및 대조군으로부터 분리된 RNA 시료로부터

1) cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;

2) 단계 1)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화 시키는 단계;

3) 단계 2)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 카바릴에 대한 노출 여부를 측정하는 단계를 포함하는 카바릴에 대한 노출 여부 확인을 위한 유전자 검출 방법.
제 3항에 있어서, RNA 시료는 인간 갑상선 소포암 세포 또는 조직에서 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 갑상선 소포암 세포는 FTC-238인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 단계 1)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
카바릴에 대한 노출이 의심되는 개체(실험군) 및 대조군으로부터 분리된 RNA 시료로부터

1) 상기 RNA를, 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적 이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및,

2) 단계 1)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 카바릴에 대한 노출 여부를 측정하는 단계를 포함하는 카바릴에 대한 노출 여부 확인을 위한 유전자 검출 방법.
제 7항에 있어서, RNA 시료는 인간 갑상선 소포암 세포 또는 조직에서 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 단계 2)의 프라이머 쌍은 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자를 증폭할 수 있는, 18 내지 30머 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항의 마이크로어레이 칩을 포함하는 카바릴에 대한 노출 여부 확인용 키트.
제 10항에 있어서, 추가로 갑상선 소포암 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 11항에 있어서, 상기 갑상선 소포암 세포는 FTC-238인 것을 특징으로 하는 키트.
제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 카바릴에 대한 노출 여부 확인용 키트.
제 13항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자 내에서 선택되는 18 내지 30머 길이의 폴리뉴클레오티드를 갖는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 키트.
제 13항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머로 구성되는 것을 특징으로 하는 키 트.
제 13항에 있어서, 추가로 갑상선 소포암 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.