KR100936286B1 - 아미오다론 처리에 따른, 폐독성 유발 약물 검색용마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폐독성 유발 약물인 아미오다론(Amiodarone)에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 마커유전자 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법에 관한 것이다. 본 발명의 마커유전자는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 마커유전자로 이용하여 폐독성의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 아미오다론이 폐독성 및 부작용을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
아미오다론, 마커유전자, 마이크로어레이, 폐독성

Description

아미오다론 처리에 따른, 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법{Marker genes based on Amiodarone treatment for screening of drug inducing pulmonary toxicity and screening method using thereof}
본 발명은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폐독성 유발 약물인 아미오다론에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 마커유전자 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법에 관한 것이다.
아미오다론은 항우울제, 부정맥, 협심증 치료제로서 사용된다. 아미오다론 처방으로 약 50%의 환자에게서 부작용이 발견되었으며, 이 중 약 5~15%의 환자에게서 폐독성이 유발되는 것으로 보고 되었다(Kaori Okayasu et al, Intern . Med, 45(22), 1303-7, 2006). 아미오다론을 처방받은 환자의 20~40%에서 권태감, 피로, 진전, 보행 장해, 말초신경장해가 발생한다. 약 25% 환자에게서 위장장해와 대부분 구역질, 구토, 변비. 식욕감퇴가 발생하는 것으로 보고되었다. 이 외에 안과질 환으로 시신경장애, 시각신경염 등이 유발되고 호흡기계에 폐 염증, 폐섬유증을 유발하는 것으로 알려졌다. 드물게는 갑상선기능저하증, 불면증. 두통, 부정맥, 천식이 발생하기도 한다. 극히 드물게 약 1% 미만의 환자에게서 발진, 피부색이 청회색으로 변하는 피부질환이 발생하고 반상출혈, 탈모증, 저혈압 등이 일어나는 것으로 보고되고 있다.
아미오다론의 처방으로 폐손상 관련 질환 중 대표적으로 인지질증이 유발되는 것으로 보고되었다. 인지질증은 지질대사와 관련된 것으로서 세포의 리소좀 내에 포스포리파아제 A1, 포스포리파아제 A2의 작용을 억제시켜 인지질이 과도하게 축적되어 나타난다(Martin WJ et al, J. Pharmacol . Exp . Ther, 251(1), 272-8, 1989) ASAH1N-acylsphingosine amidohydrolase(acid ceramidase) 1; MGC4171hypothetical protein MGC4171; LSSlanosterol synthase(2,3-oxidosqualene-lanosterol cyclase); NR0B2nuclear receptor subfamily 0, group B, member 2; FABP1fatty acid binding protein 1, liver; HPNhepsin(transmembrane protease, serine 1); SERPINA3serine(or cysteine) proteinase inhibitor; clade A(alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 3; C10orf10chromosome 10 open reading frame 10; FLJ10055hypothetical protein FLJ10055; FRCP1likely ortholog of mouse fibronectin type III repeat containing protein 1; SLC2A3solute carrier family 2(facilitated glucose transporter) member 3; and TAGLNtransgelin 이 유전자들은 인지질증의 마커로 발견되었다(H. Sawada et al. Toxicology in Vitro 20, 15061513, 2006).
칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin gene-related peptide, CGRP)는 상피세포의 성장인자로서 작용을 하여 폐 손상을 회복시키는 것으로 보고되었다(Morimoto Y et al. Inhal Toxicol . Mar: 19(3): 283-9, 2007). 또한, 아미오다론에 의해 유도되는 핵 전사인자인 c-Jun과 성장인자인 TGF-β1은 폐섬유증을 유발하는 것으로 보고된바 있다(Chung WH et al . Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol , Nov; 281(5): L1180-8, 2001).
포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고 되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93: 10614-10619, 1996).
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20-25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 에질런트(Agilent), 제노믹 솔루션(Genomic Solutions) 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer, K and Belbin, T.J., J. Am . Acad . Dermatol. 51: 681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 애피메트릭스(Affymetrix)사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성 방법에 의해 만들고 있으며, 에질런트(Agillent)사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al., Am . Acad . Dermatol. 51: 681-692, 2004).
유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며, cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cye3과 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K., et al., Genomics Proteomics I: 1-10, 2002).
최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 진단이 가능하게 될 것이다.
이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 1천 개가 집적된 올리고 마이크로어레이를 이용하여 아미오다론의 유전자 발현 프로파일을 인간 기관지 상피 세포인 BEAS-2B 세포주에서 관찰 및 분석함으로써 아미오다론에 의해 과발현 또는 저발현 되는 유전자를 발굴하고, 실시간(real-time) 정량 RT-PCR 방법에 의해 상기 유전자들의 발현 양상을 확인하여 폐독성 유발 약물을 검출할 수 있는 마커유전자 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 폐독성 유발 약물인 아미오다론에 의해 과발현 또는 저발현되는 마커유전자 및 상기 마커유전자를 이용한 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폐독성 유발 약물인 아미오다론에 의해 기관지 상피 세포에서 발현변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 폐독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자를 이용한 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 폐독성 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.
본 발명의 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 폐독성 유발 약물의 검색 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 마커유전자로 이용하여 새로운 폐독성의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질을 모니터링하거나 위해성을 판정하는데 유용하며, 아미오다론에 의해 야기되는 폐독성 및 부작용을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 제공한다.
상기 마커 유전자는 아미오다론에 의해 자극받은 인간 기관지 상피 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 한다.
상기 마커유전자는 세포자살(apoptosis), 지질대사(lipid metabolism), 세포주기(cell cycle), 세포증식(cell proliferation), 신호전달(signal transduction) 또는 전사(transcription)에 관련된 유전자로 구성되어 있다.
본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 마커유전자를 제공한다:
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Homo sapiens clone DNA41374 SIGLEC5(UNQ294) mRNA, partial cds.], 유전자 등록번호(Genebank) BE300829[Transcribed locus, moderately similar to NP_005021.2 polo-like kinase; polo(Drosophia)-like kinase; polo-like kinase(Drosophila)(Homo sapiens)], 유전자 등록번호(Genebank) AY791349(Kinesin family member 18A), 유전자 등록번호(Genebank) AK025790(Kinesin family member 20A), 유전자 등록번호(Genebank) BC029844(Hypothetical protein LOC256021), 유전자 등록번호(Genebank) AF001540[metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1(non-coding RNA)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001620[AHNAK nucleoprotein(desmoyokin)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_00593[Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia(trithorax homolog, Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_012333(C-myc binding protein), 유전자 등록번호(Genebank) AJ002535(Obscurin, cytoskeletal calmodulin and titin-interacting RhoGEF), 유전자 등록번호(Genebank) AB209179[Polo-like kinase 1(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_006904(Protein kinase, DNA-activated, catalytic polypeptide), 유전자 등록번호(Genebank) BC050630[RAB3 GTPase activating protein subunit 2(non-catalytic)], 유전자 등록번호(Genebank) AB095943(SNF2 histone linker PHD RING helicase), 유전자 등록번호(Genebank) AB016092(Serine/arginine repetitive matrix 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_006472(Thioredoxin interacting protein), 유전자 등록번호(Genebank) DQ097177(HECT, UBA and WWE domain containing 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016267[Vestigial like 1(Drosophila)], 유전자 등록번호(TIGR) THC2428713.
1) 상기 마커유전자 중에서 폐독성 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 증가하는 마커유전자는 하기와 같다:
유전자 등록번호(Genebank) NM_014391[Ankyrin repeat domain 1(cardiac muscle)], 유전자 등록번호(Genebank) BC050651(Brain expressed X-linked 2), 유전자 등록번호(Genebank) AK128526(Chromosome 9 open reading frame 58), 유전자 등록번호(Genebank) BC000054(7-dehydrocholesterol reductase), 유전자 등록번 호(Genebank) NM_004265(Fatty acid desaturase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_004864(Growth differentiation factor 15), 유전자 등록번호(Genebank) AJ002231(Glucosamine-6-phosphate deaminase 1), 유전자 등록번호(Genebank) BC032783(Glycoprotein(transmembrane) nmb), 유전자 등록번호(Genebank) NM_014707(Histone deacetylase 9), 유전자 등록번호(Genebank) T92260(Transcribed locus), 유전자 등록번호(Genebank) BE614991[Transcribed locus, strongly similar to XP_514491.1 PREDICTED: similar to hypothetical protein(Pan troglodytes)], 유전자 등록번호(Genebank) BE614991[Transcribed locus, strongly similar to XP_514491.1 PREDICTED: similar to hypothetical protein(Pan troglodytes)], 유전자 등록번호(Genebank) AF026246, 유전자 등록번호(Genebank) NM_006850(Interleukin 24), 유전자 등록번호(Genebank) NM_198336(Insulin induced gene 1), 유전자 등록번호(Genebank) XM_044178(KIAA1211 protein), 유전자 등록번호(Genebank) NM_014079(Kruppel-like factor 15), 유전자 등록번호(Genebank) NM_005559(Laminin, alpha 1), 유전자 등록번호(Genebank) AK090454(Family with sequence similarity 59, member B), 유전자 등록번호(Genebank) AK094730(Hypothetical protein LOC283454), 유전자 등록번호(Genebank) AK124869(Hypothetical protein LOC149194), 유전자 등록번호(Genebank) BX537968(Hypothetical LOC51149), 유전자 등록번호(Genebank) BM918324(Lymphocyte antigen 96), 유전자 등록번호(Genebank) CR617492(Family with sequence similarity 89, member A), 유전자 등록번호(Genebank) NM_007289[Membrane metallo-endopeptidase (neutral endopeptidase, enkephalinase, CALLA, CD10)], 유전자 등록번호(Genebank) BC013875[Matrix metallopeptidase 1(interstitial collagenase)], 유전자 등록번호(Genebank) BG284742[P8 protein(candidate of metastasis 1)], 유전자 등록번호(Genebank) AK124635(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9), 유전자 등록번호(Genebank) NM_138711(Peroxisome proliferative activated receptor, gamma), 유전자 등록번호(Genebank) BX648997(Peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1, beta), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003621[PTPRF interacting protein, binding protein 2(liprin beta 2)], 유전자 등록번호(Genebank) XM_350880[Protein phosphatase 1H(PP2C domain containing)], 유전자 등록번호(Genebank) BC033883(Retinol binding protein 7, cellular), 유전자 등록번호(Genebank) AL137502(Ras-related GTP binding D), 유전자 등록번호(Genebank) NM_005063[Stearoyl-CoA desaturase(delta-9-desaturase)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_003627(Solute carrier family 43, member 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_012449(Six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1), 유전자 등록번호(Genebank) AL834346[Syntaxin binding protein 6(amisyn)], 유전자 등록번호(Genebank) AL832142[Transmembrane 7 superfamily member 1(upregulated in kidney)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_003820[Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14(herpesvirus entry mediator)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_033035(Thymic stromal lymphopoietin), 유전자 등록번호(Genebank) AW665665[Transcribed locus, strongly similar to XP_509406.1 PREDICTED: similar to hypothetical protein FLJ14627(Pan troglodytes)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_003377(Vascular endothelial growth factor B), 유전자 등록번호(EnsEMBL) ENST00000313481.
2) 상기 마커유전자 중에서, 폐독성 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 감소하는 마커유전자 유전자는 하기와 같다:
유전자 등록번호(Genebank) NM_170589(Cancer susceptibility candidate 5), 유전자 등록번호(Genebank) BC053619(Arrestin domain containing 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_000046(Arylsulfatase B), 유전자 등록번호(Genebank) AY367065[Asp(abnormal spindle)-like, microcephaly associated (Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_052876[BTB(POZ) domain containing 14B], 유전자 등록번호(Genebank) NM_031966(Cyclin B1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001813(Centromere protein E, 312kDa), 유전자 등록번호(Genebank) BC036307(Calponin 1, basic, smooth muscle), 유전자 등록번호(Genebank) M28016(Human mitochondrial cytochrome b gene, partial cds.), 유전자 등록번호(Genebank) BC065304(DEP domain containing 1), 유전자 등록번호(Genebank) AB209653[Dehydrogenase/reductase(SDR family) member 2], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001964(Early growth response 1), 유전자 등록번호(Genebank) AK122613(ATPase type 13A5), 유전자 등록번호(Genebank) CR600908[full-length cDNA clone CS0DL005YJ22 of B cells(Ramos cell line) Cot 25-normalized of Homo sapiens(human).], 유전자 등록번호(Genebank) BC043371[Growth factor independent 1B(potential regulator of CDKN1A, translocated in CML)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_016548(Golgi phosphoprotein 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_005319(Histone 1, H1c), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003512(Histone 1, H2ac), 유전자 등록번호(Genebank) BC082232(Histone 1, H2bg), 유전자 등록번호(Genebank) BC101655(Histone 1, H2bi), 유전자 등록번호(Genebank) NM_080593(Histone 1, H2bk), 유전자 등록번호(Genebank) BM752802(Histone 1, H2bm), 유전자 등록번호(Genebank) BX647290(Histone 1, H2bo), 유전자 등록번호(Genebank) BC069193(Histone 2, H2be), 유전자 등록번호(Genebank) AF032862[Hyaluronan-mediated motility receptor (RHAMM)], 유전자 등록번호(Genebank) BE620675[Transcribed locus, moderately similar to NP_536855.1 cytochrome b(Homo sapiens)], 유전자 등록번호(Genebank) AY358369[PRO333; Homo sapiens clone DNA41374 SIGLEC5(UNQ294) mRNA, partial cds.], 유전자 등록번호(Genebank) BE300829[Transcribed locus, moderately similar to NP_005021.2 polo-like kinase; polo(Drosophia)-like kinase; polo-like kinase(Drosophila)(Homo sapiens)], 유전자 등록번호(Genebank) AY791349(Kinesin family member 18A), 유전자 등록번호(Genebank) AK025790(Kinesin family member 20A), 유전자 등록번호(Genebank) BC029844(Hypothetical protein LOC256021), 유전자 등록번호(Genebank) AF001540[metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1(non-coding RNA)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001620[AHNAK nucleoprotein(desmoyokin)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_00593[Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia(trithorax homolog, Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_012333(C-myc binding protein), 유전자 등록번호(Genebank) AJ002535(Obscurin, cytoskeletal calmodulin and titin-interacting RhoGEF), 유전자 등록번호(Genebank) AB209179[Polo-like kinase 1(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_006904(Protein kinase, DNA-activated, catalytic polypeptide), 유전자 등록번호(Genebank) BC050630[RAB3 GTPase activating protein subunit 2(non-catalytic)], 유전자 등록번호(Genebank) AB095943(SNF2 histone linker PHD RING helicase), 유전자 등록번호(Genebank) AB016092(Serine/arginine repetitive matrix 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_006472(Thioredoxin interacting protein), 유전자 등록번호(Genebank) DQ097177(HECT, UBA and WWE domain containing 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016267[Vestigial like 1(Drosophila)], 유전자 등록번호(TIGR) THC2428713.
본 발명자들은 폐독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 발굴하기 위하여, 폐독성을 나타내는 아미오다론을 인간 기관지 상피 세포주(BEAS-2B)에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 아미오다론은 인간 기관지 상피 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 아미오다론의 처리를 위 한 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 아미오다론을 인간 기관지 상피 세포주에 처리하고, 상기 약물을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 Cy5 형광물질로 표지하였으며, 약물을 처리하지 않은 대조군의 경우 Cy3 형광물질로 표지하였다. 상기 형광표지된 cDNA를 44 k 인간 유전체 전체(Human whole genome) 올리고마이크로어레이 칩(Agilent, USA)과 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2 참조). 분석시 Cy5/Cy3 비율이 2.0 배 이상인 경우 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.5 배 이하인 경우 발현 감소화된 유전자로 분류하였다. 그 결과, 발현이 증가된 유전자는 0.1%(44,290개의 유전자 중 44개), 발현이 감소된 유전자는 0.10%(44,290개의 유전자 중 45개)임을 확인하였다. 이때, 아미오다론에 의해 2.0 배 이상 발현이 변화된 유전자들을 기능별로 분류하였을 때, 폐독성에 작용하는 기능으로 판단되는 세포자살(apoptosis), 지질대사(lipid metabolism), 세포주기(cell cycle), 세포증식(cell proliferation), 신호전달(signal transduction) 또는 전사(transcription)에 관련된 유전자를 선별하였다(표 2 및 표 3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 아미오다론을 처리했을 때, 인간 기관지 상피 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
본 발명의 실시예에서는 상기 유전자 중 세포주기 관련 유전자 3종, 지질대사 관련 유전자 3종, 그리고 신호전달 관련 유전자 7종을 분리하여 실시간 역전사유전자증폭기술(real-time reverse transcript polymerase chain reaction, RT-PCR) 방법으로 발현 양상을 조사하였다. 그 결과, 8종의 과발현 유전자들과 4종의 저발현 유전자의 발현 양상이 올리고 마이크로어레이 칩 결과와 유사하게 나타남을 확인하였다(표 5 참조).
또한, 본 발명은 상기 마커유전자 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 폐독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 마커유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함한다.
본 발명의 폐독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이칩을 제작하는 방법은 하기와 같다:
상기 탐색된 마커유전자를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자를 이용한 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
본 발명은
1) 인간 기관지 상피 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 피검 화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군과 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질을 표지하는 단계;
4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 본 발명의 마커유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 기관지 상피 세포는 BEAS-2B를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 인간 기관지 또는 폐로부터 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, USA)을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 공통적으로 과발현 또는 저발현 유전자(표 2 및 표 3 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 모두 사용 가능하며 본 발명의 실시예에서는 직접 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하였다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어라면 모두 사용 가능하다.
또한, 본 발명은
1) 인간 기관지 상피 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
3) 단계 2)의 RNA를, 본 발명의 마커유전자에 상보적이고 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 폐독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 프라이머는 본 발명에서 탐색된 마커유전자 유전자와 상보적이고, 마커유전자를 증폭할 수 있으며, 증폭산물이 100 내지 300 bp(base pair)가 되도록 설계된 프라이머라면 모두 사용가능하다. 본 발명에서는 서열번호 1 내지 24로 기재되는 정방향 및 역방향 프라이머 12쌍을 제시하였으나 이에 한정하는 것은 아니다.
아울러, 본 발명은 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 폐독성 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.
상기 DNA 마이크로어레이 칩은 본 발명의 방법으로 제작한 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 검색용 키트는 추가적으로 인간 기관지 상피 세포를 포함할 수 있으며, 인간 기관지 상피 세포는 BEAS-2B를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 기관지 또는 폐로부터 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색용 키트는 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.
상기 검색용 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.
상기 검색용 키트에 추가적으로 상기 마커유전자 유전자에 상보적이고, 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함할 수 있으며, 프라이머는 서열번호 1 내지 24로 기재되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프라이머를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 마커유전자에 상보적이고, 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있으며 증폭산물이 100 내지 300bp가 되도록 설계된 정방향 또는 역방향 프라이머쌍은 모두 사용 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리
<1-1> 세포배양
인간 기관지 상피 세포주인 BEAS-2B 세포(CRL-9609, ATCC, USA)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)를 이용하여 T 75 플라스크에서 5 × 105 세포/ml가 되도록 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 폐독성을 부작용으로 나타나는 대표적인 약물인 아미오다론을 선정하였으며, DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.
<1-2> 세포 독성 실험( MTT assay ) 및 화학 물질 처리
Mossman 등(J. Immunol . Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 BEAS-2B 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트에 3× 104/웰 세포수로 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)에서 DMSO에 용해된 아미오다론을 처리하고 48시간 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다. BEAS-2B 세포주에서 아미오다론의 세포독성을 살펴본 결과, 20% 생존 저해율을 보이는 농도(IC20)는 29.388 uM 이었으며(도 1 참조), 상기 농도로 결정하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
< 실시예 2> 마이크로어레이 실험
<2-1> 표적 RNA 의 분리 및 형광 물질 표지
1.24 × 106 cell/㎖ 농도로 100 mm 디쉬에 BEAS-2B 세포를 분주한 후, 실시예<1-2>에서 결정된 아미오다론의 농도를 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 순도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)으로 확인하였다.
<2-2> 표지된 cDNA 제조
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시예<2-1>에서 수득한 아미오다론 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 표 1과 같이 시약을 혼합하였다.
구성 부피(㎕)
5X first strand buffer 6
dNTPs 0.6
0.1 M DDT 3
SuperScript II enzyme 3
Cy-3 or Cy-5 dUTP 2
대조군인 BEAS-2B 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)으로 표지화하였고, 아미오다론을 처리한 BEAS-2B 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)를 표지화하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제되었다.
<2-3> 혼성화 반응
혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로 44 k Whole Human Genome 올리고 마이크로어레이(Agilent, USA)를 이용하였다. 세척(2분간 2×SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1×SSC, 2분간 0.2× SSC에 세척) 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.
<2-4> 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon Instruments, USA)로 스캔하였다. 결합하지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)로 분석하였다. 이렇게 얻어진 데이터로부터 아미오다론에 대한 마커 유전자를 선별하였다(도 2 참조).
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 4천 개의 유전자 중에서 아미오다론에 의해 Cy5/Cy3의 비율이 2.0배 이상으로 유전자 발현 증가를 보이는 유전자는 0.1%(44,290개의 유전자 중 44개)이고, 발현이 감소된 유전자는 0.10%(44,290개의 유전자 중 45개)임을 확인하였다.
이때, 아미오다론에 의해 2.0 배 이상 발현이 변화된 유전자들을 기능별로 분류하였을 때, 폐독성에 작용하는 기능으로 판단되는 세포자살(apoptosis), 지질대사(lipid metabolism), 세포주기(cell cycle), 세포증식(cell proliferation), 신호전달(signal transduction), 전사(transcription)에 관련된 유전자를 선별하였다(표 2 및 표 3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 아미오다론을 처리 했을 때, 인간 기관지 상피 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
아미오다론에 의해 발현이 증가하는 유전자
등록번호 유전자 약어 유전자 명 중간값의 비
(a) 세포자살( apoptosis )
NM_006850 IL24 Interleukin 24 3.9944716
NM_003820 TNFRSF14 Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14(herpesvirus entry mediator) 2.0416014
BG284742 P8 P8 protein(candidate of metastasis 1) 2.4063197
(b) 세포주기
NM_014707 HDAC9 Histone deacetylase 9 2.2424666
NM_003377 VEGFB Vascular endothelial growth factor B 2.0523348
(c) 세포증식
NM_198336 INSIG1 Insulin induced gene 1 2.1351621
NM_003377 VEGFB Vascular endothelial growth factor B 2.0523348
BC032783 GPNMB Glycoprotein(transmembrane) nmb 7.3201273
(d) 지질대사
NM_004265 FADS2 Fatty acid desaturase 2 2.0322247
AK124635 PCSK9 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 2.2880026
NM_138711 PPARG Peroxisome proliferative activated receptor, gamma 2.0454861
NM_005063 SCD Stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase) 2.8126784
BX648997 PPARGC1B Peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1, beta 2.1692484
(e) 신호전달
AK124869 sh2 domain containg 5 2.7275673
NM_003377 VEGFB Vascular endothelial growth factor B 2.0523348
NM_014391 ANKRD1 Ankyrin repeat domain 1(cardiac muscle) 2.3639879
NM_138711 PPARG Peroxisome proliferative activated receptor, gamma 2.0454861
BM918324 LY96 Lymphocyte antigen 96 2.5142013
NM_004864 GDF15 Growth differentiation factor 15 2.8658757
NM_003820 TNFRSF14 Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14(herpesvirus entry mediator) 2.0416014
BX648997 PPARGC1B Peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1, beta 2.1692484
(f) 전사
NM_014707 HDAC9 Histone deacetylase 9 2.2424666
NM_014079 KLF15 Kruppel-like factor 15 3.2587896
NM_138711 PPARG Peroxisome proliferative activated receptor, gamma 2.0454861
NM_014707 HDAC9 Histone deacetylase 9 2.2424666
(g) 기타
BC000054 DHCR7 7-dehydrocholesterol reductase 2.2186108
AJ002231 GNPDA1 Glucosamine-6-phosphate deaminase 1 2.5003378
NM_005559 LAMA1 Laminin, alpha 1 2.0728022
AK124869 LOC400745 Hypothetical protein LOC149194 2.7275673
NM_007289 MME Membrane metallo-endopeptidase (neutral endopeptidase, enkephalinase, CALLA, CD10) 2.1173943
BC013875 MMP1 Matrix metallopeptidase 1 (interstitial collagenase) 2.7112987
NM_003621 PPFIBP2 PTPRF interacting protein, binding protein 2(liprin beta 2) 2.0116139
BC033883 RBP7 Retinol binding protein 7, cellular 2.0115712
AL137502 RRAGD Ras-related GTP binding D 4.0888656
NM_003627 SLC43A1 Solute carrier family 43, member 1 2.0899673
AL834346 STXBP6 Syntaxin binding protein 6 (amisyn) 2.1482119
NM_033035 TSLP Thymic stromal lymphopoietin 2.0715997
(h) 생물학적 기능이 밝혀지지 않은 유전자( Biological process unknown )
BC050651 BEX2 Brain expressed X-linked 2 2.3649894
AK128526 C9orf58 Chromosome 9 open reading frame 58 2.0017072
XM_044178 KIAA1211 KIAA1211 protein 2.1775467
AK090454 LOC150946 Family with sequence similarity 59, member B 3.2247295
AK094730 LOC283454 Hypothetical protein LOC283454 2.3452545
BX537968 LOC51149 Hypothetical LOC51149 2.1573757
CR617492 MGC15887 Family with sequence similarity 89, member A 2.1979278
XM_350880 PPM1H Protein phosphatase 1H(PP2C domain containing) 2.536865
NM_012449 STEAP Six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1 2.0866588
AL832142 TM7SF1 Transmembrane 7 superfamily member 1 (upregulated in kidney) 2.0007024
ENST00000313481 Unknown 2.0008635
AW665665 Unknown Transcribed locus, strongly similar to XP_509406.1 PREDICTED: similar to hypothetical protein FLJ14627[Pan troglodytes] 2.0599298
아미오다론에 의해 발현이 감소하는 유전자
등록번호 유전자 약어 유전자 명 중간값의 비
(a) 세포주기
AB209179 PLK1 Polo-like kinase 1 (Drosophila) 0.4237926
AY367065 ASPM Asp (abnormal spindle)-like, microcephaly associated(Drosophila) 0.4140736
NM_031966 CCNB1 Cyclin B1 0.4422999
NM_001813 CENPE Centromere protein E, 312kDa 0.4713322
BC043371 GFI1B Growth factor independent 1B (potential regulator of CDKN1A, translocated in CML) 0.4864506
(b) 세포증식
AB209179 PLK1 Polo-like kinase 1 (Drosophila) 0.4237926
BC043371 GFI1B Growth factor independent 1B (potential regulator of CDKN1A, translocated in CML) 0.4864506
(c) 신호전달
BC065304 DEPDC1 DEP domain containing 1 0.4510642
(d) 전사
NM_001964 EGR1 Early growth response 1 0.4390462
BC043371 GFI1B Growth factor independent 1B (potential regulator of CDKN1A, translocated in CML) 0.4864506
NM_005933 MLL Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila) 0.4820172
NM_012333 MYCBP C-myc binding protein 0.4922388
AB095943 SHPRH SNF2 histone linker PHD RING helicase 0.4682101
NM_016267 VGLL1 Vestigial like 1 (Drosophila) 0.442002
(e) 기타
NM_170589 AF15Q14 Cancer susceptibility candidate 5 0.4207353
NM_000046 ARSB Arylsulfatase B 0.3982376
BC036307 CNN1 Calponin 1, basic, smooth muscle 0.475635
AB209653 DHRS2 Dehydrogenase/reductase (SDR family) member 2 0.4920274
AK122613 FLJ16025 ATPase type 13A5 0.4491728
NM_005319 HIST1H1C Histone 1, H1c 0.4988284
NM_003512 HIST1H2AC Histone 1, H2ac 0.4876834
NM_080593 HIST1H2BK Histone 1, H2bk 0.3641802
BC069193 HIST2H2BE Histone 2, H2be 0.3240014
AF032862 HMMR Hyaluronan-mediated motility receptor (RHAMM) 0.492606
AY791349 KIF18A Kinesin family member 18A 0.4719817
AK025790 KIF20A Kinesin family member 20A 0.3397137
NM_001620 MGC5395 AHNAK nucleoprotein (desmoyokin) 0.2681892
NM_012333 MYCBP C-myc binding protein 0.4922388
NM_006472 TXNIP Thioredoxin interacting protein 0.3991791
DQ097177 UREB1 HECT, UBA and WWE domain containing 1 0.3849775
NM_006904 PRKDC Protein kinase, DNA-activated, catalytic polypeptide 0.4833296
(f)생물학적 기능이 밝혀지지 않은 유전자( Biological process unknown )
BC053619 ARRDC3 Arrestin domain containing 3 0.4160297
NM_052876 BTBD14B BTB (POZ) domain containing 14B 0.4198905
M28016 cytochrome b Human mitochondrial cytochrome b gene, partial cds. 0.4492316
BC082232 HIST1H2BG Histone 1, H2bg 0.4080795
BC101655 HIST1H2BI Histone 1, H2bi 0.4471735
BM752802 HIST1H2BM Histone 1, H2bm 0.3949135
BX647290 HIST1H2BO Histone 1, H2bo 0.433098
BC029844 LOC256021 Hypothetical protein LOC256021 0.4326738
AF001540 MALAT-1 metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 (non-coding RNA) 0.3449582
AJ002535 OBSCN Obscurin, cytoskeletal calmodulin and titin-interacting RhoGEF 0.3870984
BC050630 RAB3-GAP150 RAB3 GTPase activating protein subunit 2 (non-catalytic) 0.4663124
AB016092 SRRM2 Serine/arginine repetitive matrix 2 0.3916611
CR600908 full-length cDNA clone CS0DL005YJ22 of B cells (Ramos cell line) Cot 25-normalized of Homo sapiens (human). 0.4399871
THC2428713 AF136551 cytochrome b{Sus scrofa;} , partial (48%) [THC2428713] 0.4469303
BE620675 Transcribed locus, moderately similar to NP_536855.1 cytochrome b [Homo sapiens] 0.4453037
AY358369 PRO333; Homo sapiens clone DNA41374 SIGLEC5 (UNQ294) mRNA, partial cds. 0.4609807
BE300829 Transcribed locus, moderately similar to NP_005021.2 polo-like kinase; polo (Drosophia)-like kinase; polo-like kinase (Drosophila) [Homo sapiens] 0.3894044
< 실시예 3> 실시간 RT - PCR ( Real - time reverse transcriptase polymerase chain reaction) 정량
아미오다론에 의해 발현 유도된 상기 실시예 2의 과발현 및 저발현된 유전자 중 아미오다론에 의해 주로 야기되는 폐독성 관련 기전으로 지질대사, 세포주기, 신호전달 관련 유전자 12종을 선별하였다. 이들 유전자들은 유전자 등록번호(Genebank) AB209179[Polo-like kinase 1(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_031966(Cyclin B1), 유전자 등록번호(Genebank) BC043371[Growth factor independent 1B (potential regulator of CDKN1A, translocated in CML)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_004265(Fatty acid desaturase 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_138711(Peroxisome proliferative activated receptor, gamma), 유전자 등록번호(Genebank) NM_005063[Stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase)], 유전자 등록번호(Genebank) AK124869(sh2 domain containg 5), 유전자 등록번호(Genebank) NM_014391[Ankyrin repeat domain 1 (cardiac muscle)], 유전자 등록번호(Genebank) BM918324(Lymphocyte antigen 96), 유전자 등록번호(Genebank) NM_004864(Growth differentiation factor 15), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003820[Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14 (herpesvirus entry mediator)], 유전자 등록번호(Genebank) BC065304(DEP domain containing 1)이다.
상기 유전자들의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR)(Bio-rad, USA)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다. 구체적으로, 올리고 dT 프라이머와 Superscript kit(Omniscipt™ kit, Qiagen, Co., USA)를 이용하여 역전사반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA 0.2 ㎕와 물 3.8 ㎕, 센스 프라이머 0.5 ㎕, 안티센스 프라이머 0.5 ㎕, 사이버그린 I 염색 수퍼믹스(Bio-rad, USA) 5 ㎕ 를 혼합하여, PCR 튜브에 담아 단계 1: 95℃, 3분; 단계 2(45회 반복): 단계 2-1: 95℃, 10초; 단계 2-2: 55 내지 65℃ 45초; 단계 3: 95℃, 1분; 단계 4: 55℃, 1분; 단계 5(반복 80회): 55℃, 10초로 프로그램을 설계한 My IQ 실시간 PCR 기계에서 반응을 수행하였다. PCR 산물을 정량하기 위하여 사이버그린(SYBR Green) I 염색 (Bio-rad, USA)으로 염색하였다. 사이버그린 I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저 PCR에 이용한 표적 유전자와 내재성(endogenous) 대조군(GAPDH)에 대한 프라이머를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 각각의 프라이머(표 4)를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다(표 5 참조).
프라이머 서열
등록번호 유전자명 PCR 프라이머 서열 (5'->3')
AB209179 Polo-like kinase 1 (Drosophila) 센스 (서열번호 1) CTCAACACGCCTCATCCTC
안티센스 (서열번호 2) GTGCTCGCTCATGTAATTGC
NM_031966 Cyclin B1 센스 (서열번호 3) TCTGGATAATGGTGAATGGACA
안티센스 (서열번호 4) CGATGTGGCATACTTGTTCTTG
BC043371 Growth factor independent 1B(potential regulator of CDKN1A, translocated in CML) 센스 (서열번호 5) TTCCTGGTGAAGAGCAAGAAGGCT
안티센스 (서열번호 6) TCCAGGCACTGGTTTGGGAATAGA
NM_004265 Fatty acid desaturase 2 센스 (서열번호 7) TGGATGGAACAGCTAAGGCCAAGA
안티센스 (서열번호 8) CTGTGGTTTGCAGCCAGATGGTTT
NM_138711 Peroxisome proliferative activated receptor, gamma 센스 (서열번호 9) CACAAGAACAGATCCAGTGGTTGCAG
안티센스 (서열번호 10) AATAATAAGGTGGAGATGCAGGCTCC
NM_005063 Stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase) 센스 (서열번호 11) AACTTGATACGTCCGTGTGTCCCA
안티센스 (서열번호 12) CTGTATGTTTCCGTGGCAATGCGT
AK124869 sh2 domain containg 5 센스 (서열번호 13) AGACCTGGTCATTGGTCCAGACTT
안티센스 (서열번호 14) AACATGGCCCTGATAGCTTCTCCA
NM_014391 Ankyrin repeat domain 1 (cardiac muscle) 센스 (서열번호 15) AAGCGAGAAACAACGAGAGGCAGA
안티센스 (서열번호 16) AGAAACGTAGGCACATCCACAGGT
BM918324 Lymphocyte antigen 96 센스 (서열번호 17) AGCTCTGAAGGGAGAGACTGTGAA
안티센스 (서열번호 18) GGTGTAGGATGACAAACTCCAAGC
NM_004864 Growth differentiation factor 15 센스 (서열번호 19) AAGAACTCAGGACGGTGAATGGCT
안티센스 (서열번호 20) TTTCCGCAACTCTCGGAATCTGGA
NM_003820 Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14(herpesvirus entry mediator) 센스 (서열번호 21) AGGAATGTCAGCACCAGACCAAGT
안티센스 (서열번호 22) GGCCAACTGTGGAGCAAACAATGA
BC065304 DEP domain containing 1 센스 (서열번호 23) GCCACCAAGCTGTGGAATGAAGTT
안티센스 (서열번호 24) ATCCACTGCTTCTCCTGCTGTGAA
등록번호 유전자명 실시간 PCR (상대적 배율) cDNA 마이크로어레이 (Cy3/Cy5 비율)
AB209179 Polo-like kinase 1 (Drosophila) 0.4238 0.349492
NM_031966 Cyclin B1 0.4423 0.480742
BC043371 Growth factor independent 1B (potential regulator of CDKN1A, translocated in CML) 0.4865 0.382447
NM_004265 Fatty acid desaturase 2 2.0322 3.498331
NM_138711 Peroxisome proliferative activated receptor, gamma 2.0455 4.037139
NM_005063 Stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase) 2.8127 3.990769
AK124869 sh2 domain containg 5 2.7276 3.792984
NM_014391 Ankyrin repeat domain 1 (cardiac muscle) 2.364 5.464161
BM918324 Lymphocyte antigen 96 2.5142 5.426417
NM_004864 Growth differentiation factor 15 2.8659 3.317278
NM_003820 Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14 (herpesvirus entry mediator) 2.0416 4.8121
BC065304 DEP domain containing 1 0.4511 0.403321
그 결과, 8종의 과발현 유전자들과 4종의 저발현 유전자들의 유전자 발현 양상은 폐독성 유발 약물들에 의한 유전자 발현을 조사한 올리고 마이크로어레이 결과와 매우 유사하게 나타남을 확인하였다.
도 1은 아미오다론의 인간 기관지 상피 세포주에서의 세포 독성을 조사한 그래프이고,
도 2는 마이크로어레이 칩을 이용한 아미오다론을 처리한 인간 기관지 상피 세포주의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Marker genes and screening method of Amiodarone having pulmonary toxicity using thereof <130> 7p-07-13 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Polo-like kinase 1(Drosophila) sense primer <400> 1 ctcaacacgc ctcatcctc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Polo-like kinase 1(Drosophila) antisense primer <400> 2 gtgctcgctc atgtaattgc 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Cyclin B1 sense primer <400> 3 tctggataat ggtgaatgga ca 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Cyclin B1 antisense primer <400> 4 cgatgtggca tacttgttct tg 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Growth factor independent 1B sense primer <400> 5 ttcctggtga agagcaagaa ggct 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Growth factor independent 1B antisense primer <400> 6 tccaggcact ggtttgggaa taga 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Fatty acid desaturase 2 sense primer <400> 7 tggatggaac agctaaggcc aaga 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Fatty acid desaturase 2 antisense primer <400> 8 ctgtggtttg cagccagatg gttt 24 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Peroxisome proliferative activated receptor, gamma sense primer <400> 9 cacaagaaca gatccagtgg ttgcag 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Peroxisome proliferative activated receptor, gamma antisense primer <400> 10 aataataagg tggagatgca ggctcc 26 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Stearoyl-CoA desaturase(delta-9-desaturase) sense primer <400> 11 aacttgatac gtccgtgtgt ccca 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Stearoyl-CoA desaturase(delta-9-desaturase) antisense primer <400> 12 ctgtatgttt ccgtggcaat gcgt 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> sh2 domain containg 5 sense primer <400> 13 agacctggtc attggtccag actt 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> sh2 domain containg 5 antisense primer <400> 14 aacatggccc tgatagcttc tcca 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Ankyrin repeat domain 1(cardiac muscle) sense primer <400> 15 aagcgagaaa caacgagagg caga 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Ankyrin repeat domain 1(cardiac muscle) antisense primer <400> 16 agaaacgtag gcacatccac aggt 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Lymphocyte antigen 96 sense primer <400> 17 agctctgaag ggagagactg tgaa 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Lymphocyte antigen 96 antisense primer <400> 18 ggtgtaggat gacaaactcc aagc 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Growth differentiation factor 15 sense primer <400> 19 aagaactcag gacggtgaat ggct 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Growth differentiation factor 15 antisense primer <400> 20 tttccgcaac tctcggaatc tgga 24 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14 sense primer <400> 21 aggaatgtca gcaccagacc aagt 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14 antisense primer <400> 22 ggccaactgt ggagcaaaca atga 24 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> DEP domain containing 1 sense primer <400> 23 gccaccaagc tgtggaatga agtt 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> DEP domain containing 1 antisense primer <400> 24 atccactgct tctcctgctg tgaa 24

Claims (16)

  1. 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산서열의 전부 또는 18 내지 30개의 핵산 서열로 구성되는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 아미오다론에 대한 노출 여부 진단용 DNA 마이크로어레이 칩:
    유전자 등록번호(Genebank) NM_004265(Fatty acid desaturase), 유전자 등록번호(Genebank) AK124635(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9), 유전자 등록번호(Genebank) NM_138711(Peroxisome proliferative activated receptor, gamma), 유전자 등록번호(Genebank) NM_005063[Stearoyl-CoA desaturase(delta-9-desaturase)], 유전자 등록번호(Genebank) BX648997(Peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1, beta).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 아미오다론에 대한 노출 여부 측정용 키트.
  12. 제 11항에 있어서, 인간 기관지 상피 세포주(Human bronchial epithelial cells, BEAS-2B)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 제 11항에 있어서, 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin- like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 형광물질군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  14. 제 11항에 있어서, 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 표식시약, 및 세척 완충용액으로 이루어진 반응시약군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  15. 제 11항에 있어서, 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자에 상보적이고, 상기 유전자를 증폭할 수 있는, 18 내지 30개의 핵산으로 구성되는 프라이머 쌍을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  16. 제15항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 하기 프라이머쌍 1 내지 3으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트:
    프라이머쌍 1: 서열번호 7로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 역방향 프라이머;
    프라이머쌍 2: 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머; 및,
    프라이머쌍 3: 서열번호 11로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 12로 기재되는 역방향 프라이머.
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