KR101457481B1 - 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갑상선 호르몬 장애를 일으키는 주요 표적인 탈요오드화효소 활성저해 화학물질에 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 구체적으로 탈요오드화효소 활성저해 화학물질에 의해 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 탈요오드화효소 활성저해 화학물질에 특이적 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이며, 본 발명의 바이오마커는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 이용하여, 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질을 스크리닝할 수 있는 바이오마커 및 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부를 확인하는 방법으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법{The biomarkers for identification of exposure to deiodinase inhibiting disruptors and the identification method of deiodinase inhibiting disruptors exposure using the same biomarkers}

본 발명은 탈요오드화효소 활성을 저해하는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 탈요오드화효소 활성을 저해하는 화학물질에 의해 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질의 특이적 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.

갑상선 과산화효소(Thyroid peroxidase), 나트륨/요오드화물 심포터(sodium iodide symporter), 갑상선 호르몬 수송 단백질 트랜스티레틴(TH transport protein transthyretin), 갑상선 호르몬 수용체(TH receptor) 등은 갑상선 호르몬의 장애를 일으키는 작용 연구에 중요 표적이라 보고되고 있다(Schmutzler C. et al., Endocrinology, 148(6):2835-2844, 2007). 이 외에 탈요오드화효소(Deiodinase)를 표적으로 이용하여 탈요오드화효소의 갑상선 호르몬 작용에 의한 표적 조직에서의 작용과 관련된 연구도 진행되고 있다.

갑상선호르몬(T3, T4)은 요오드가 타이로신(tyrosine)과 결합한 형태의 유도체들이며, T3, T4는 활성(active) 형태, 자유(free) T3는 비활성(inactive) 형태로 구분된다. 혈중의 요오드는 20% 정도가 갑상선으로 능동섭취 및 제거된다. 요오드는 유기화, 커플링(coupling)(T3, T4), 단백분해로 인해 탈요오드화(deiodination)되어 혈액 내로 방출된다. 이렇게 생성된 갑상선호르몬은 각 조직에서 탈요오드화, 탈아민화, 탈카르복실화, 포합 등을 거쳐 대사된다. 갑상선에서 분비되는 갑상선호르몬의 대부분은 T4 형태이며 이는 간 및 신장 등의 조직에서 탈요오드화에 의해 T3로 전환되어 갑상선호르몬 수용체에 작용하여 신경세포 등 다양한 조직에서 작용하게 된다. 따라서, 탈요오드화효소에 의한 갑상선호르몬의 탈요오드화 과정은 중요하며, 화학물질 노출에 의한 탈요오드화효소의 갑상선 호르몬 작용에 의한 표적 조직에의 작용 평가는 인체 영향 평가에 있어 중요 표적이라 할 수 있다.

혈중 T3의 85%는 T4가 5'-탈요오드화에 의해 T3로 전환된 형태이다. T4의 30%는 탈요오드화효소 제 1형(type 1 deiodinase; DIO1) 또는 제 2형(type 2 deiodinase; DIO2)에 의해 T3로 5'-탈요오드화되고, T4의 40%는 탈요오드화효소 제 3형(type 3 deiodinase; DIO3)에 의해 역으로 T3으로 5-탈요오드화된다. 이들 탈요오드화효소는 갑상선호르몬의 조직 특이성에 관여하는 것으로 최근 보고된 바 있으며, 특히 뇌 조직에서의 특이적 발현 및 활성 정도는 갑상선호르몬의 발달과정 중에 중요한 작용을 한다. 이러한 연구는 제노푸스(Xenopus)를 이용하여 수행되고 있으며, 신생아의 뇌 조직에서 갑상선호르몬 발현 수준을 통해 뇌 발달 과정에서 어떻게 작용하는지 등의 연구도 수행되고 있다.

탈요오드화효소의 활성은 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin), 프로필티오우라실(propylthiouracil), 베타에스트라디올(β-estradiol), 3-메틸콜란트렌(3-methylcholanthrene), 아미오다론(amiodarone), 아로클러 1254(arochlor 1254), 카드뮴 클로라이드(cadmium chloride), 디메토에이트(dimethoate), 펜발레레이트(fenvalerate), 이오파노익산(iopanoic acid), 메톡시클로르(methoxychlor), 4-메틸벤질리덴 캠포르(4-methylbenzylidene-camphor) 등의 화학물질들에 의해 활성이 저해되는 것으로 보고되었다(표 1 참조). 즉, 다양한 화학물질 노출에 의해 탈요오드화효소 활성 저해 영향을 나타냄으로써 인체 각 조직에 영향을 미치기 때문에, 이들 화학물질 노출을 평가할 수 있는 방법이 요구되고 있다.

탈요오드화효소에 영향을 미치는 화학물질들

화학물질	탈요오드화효소활성	참고문헌
2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신	D1 ↓, D2 ↓	Boas et al., 2006; Ahmed, 2011
프로필티오우라실	D1 ↓	Mol et al., 1997; Howdeshell, 2002; Miller et al., 2009; Liu et al., 2011
베타에스트라디올	D1 ↓	Schmutzler et al., 2004; 2007b
3-메틸콜란트렌	D1 ↓	Howdeshell, 2002
아미오다론	D1 ↓, D2 ↓	Howdeshell, 2002; Tedelind et al., 2006; Rosene et al., 2010
아로클러 1254	D1 ↓	Howdeshell, 2002; Coimbra et al., 2005
카드뮴 클로라이드	D1 ↓	Ghosh et al., 1992; Howdeshell, 2002
디메토에이트	D1 ↓	Maiti & Kar, 1997; Howdeshell, 2002
펜발레레이트	D1 ↓	Maiti et al., 1995; Howdeshell 2002
이오파노익산	D1 ↓, D2 ↓, D3 ↓	Cardoso et al., 2002; Howdeshell, 2002; Colantuoni et al., 2005
메톡시클로르	D1 ↓	Howdeshell, 2002; Boas et al., 2006
4-메틸벤질리덴 캠포르	D1 ↓	Schmutzler et al., 2004; 2007b

D1: 탈요오드화효소 제 1형;

D2: 탈요오드화효소 제 2형; 및

D3: 탈요오드화효소 제 3형.

갑상선 호르몬 장애물질의 갑상선 호르몬 활성 및 호르몬 수용체 결합과 그에 따른 유전자 발현 변화에 대한 연구가 일부 보고되고 있지만, 주로 마우스를 이용한 연구에 거의 국한되어 있다. 그리고 상기에서 언급한 것과 같이 탈요오드화효소의 활성 방해에 의한 인간의 갑상선 및 기타 조직의 장애 가능성이 존재함에도 인체 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법도 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. 상기 GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용할 경우, 정량적 분석은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 더욱 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 프라이머(primer)를 이용하는 실시간 RT-PCR(real-time reverse transcription polymerase chain reaction) 또는 DNA 마이크로어레이(microarray) 등의 방법으로 신속하게 위해성 평가를 수행하여 인체에서 독성작용, 유전자 발현 여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 탈요오드화효소 활성을 저해시키는 화학물질 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제이다.

포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었고, 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 즉, 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이 분석을 일반적으로 수행한다(Schena, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996).

마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 애질런트(Agilent), 지노믹 솔루션(Genomic Solutions) 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et al., J. Am. Acad. Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 어피매트릭스(Affymetrix)사에서 사진 시각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있으며, 애질런트(Agillent)사 등에서는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et al., J. Am. Acad. Dermatol. 51:681-692, 2004).

유전자 발현의 분석을 위해서는 조직, 세포 등 시료에서 RNA를 수득하여 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 혼성화(hybridzation) 반응을 수행한다. 상기 수득한 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며 cDNA로 전환시키고, 올리고마이크로어레이는 주로 두 개의 다른 형광(예를 들어, Cy3 또는 Cy5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 혼성화 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 그 결과, 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K. et al., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).

최근 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법이 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여, 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯한 모든 화학물질에 의한 특정 조직 및 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석 및 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 상기 작용의 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색이 가능하게 될 것이다.

이에 본 발명자들은 인간 유전자 6만 2천 개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여, 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질에 의한 유전자 발현 프로파일을 탈요오드화효소가 넉다운(knockdown)된 인간 신경세포 유래 세포주인 신경아세포종(neuroblastoma) SH-SY5Y 세포주에서 관찰 및 분석하여 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질에 의해서만 특이적으로 과발현 또는 저발현되는 유전자를 발굴하여 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질만을 특이적으로 검출할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 노출 여부를 확인하는 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 탈요오드화효소(Deiodinase) 활성 저해 화학물질의 노출에 의해 특이적으로 과발현 또는 저발현되는 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용한 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 특이적 노출여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탈요오드화효소(Deiodinase) 활성 저해 화학물질의 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열 또는 그 상보 가닥 분자가 집적된 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 특이적 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다:

유전자 등록번호(Genebank) NM_016569(T-box 3) 및 NM_002213(integrin, beta 5).

또한, 본 발명은,

1) 탈요오드화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출이 의심되는 실험군인 피검체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상 개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;

3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;

4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및,

5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인방법을 제공한다.

또한, 본 발명은,

1) 탈요오드화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출이 의심되는 실험군인 피검체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상 개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 하기 유전자에 상보적이고 하기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계:

유전자 등록번호 NM_016569(T-box 3) 및 NM_002213(integrin, beta 5); 및

3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 탈요오드화효소의 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 마이크로어레이 칩을 포함하는 탈요오드화효소의 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 하기 각각의 유전자에 상보적이고 하기 각각의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다:

유전자 등록번호 NM_016569(T-box 3) 및 NM_002213(integrin, beta 5).

본 발명의 탈요오드화효소(Deiodinase)의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법은 DNA 마이크로어레이를 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 탈요오드화효소의 활성을 저해시키는 화학물질의 모니터링(monitoring) 및 위해성을 판정하는데 사용하여, 탈요오드화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 탈요오드화효소(Deiodinase) 넉다운(knockdown) 인간 신경세포 유래 세포주에서 3종의 탈요오드화효소 유전자 발현 정도를 나타내는 도이다:
D1: 탈요오드화효소 제 1형(type 1 deiodinase, DIO1),
D2: 탈요오드화효소 제 2형(type 2 deiodinase, DIO2), 및
D3: 탈요오드화효소 제 3형(type 3 deiodinase, DIO3).
도 2는 탈요오드화효소 넉다운 인간 신경세포 유래 세포주에서 갑상선호르몬(T3)의 변화를 나타내는 도이다:
NC: 음성대조군, 및
DKD: 탈요오드화효소가 넉다운 된 DKD 세포주.
도 3은 실시간 정량 PCR을 이용하여 탈요오드화효소 활성을 저해하는 다양한 화학물질이 인간 신경세포 유래 세포주에 노출시, TBX3 유전자의 발현 양상을 나타내는 도이다:
propylthiouracil: 프로필티오우라실,
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin: 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신,
β-estradiol: 베타에스트라디올,
3-methylcholanthrene: 3-메틸콜란트렌,
amiodarone: 아미오다론,
arochlor 1254: 아로클러 1254,
cadmium chloride: 카드뮴 클로라이드,
dimethoate: 디메토에이트,
fenvalerate: 펜발레레이트,
iopanoic acid: 이오파노익산,
methoxychlor: 메톡시클로르, 및
4-methylbenzylidene-camphor: 4-메틸벤질리덴 캠포르.
도 4는 실시간 정량 PCR을 이용하여 탈요오드화효소 활성을 저해하는 다양한 화학물질이 인간 신경세포 유래 세포주에 노출시, ITGB5 유전자의 발현 양상을 나타내는 도이다:
propylthiouracil: 프로필티오우라실,
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin: 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신,
β-estradiol: 베타에스트라디올,
3-methylcholanthrene: 3-메틸콜란트렌,
amiodarone: 아미오다론,
arochlor 1254: 아로클러 1254,
cadmium chloride: 카드뮴 클로라이드,
dimethoate: 디메토에이트,
fenvalerate: 펜발레레이트,
iopanoic acid: 이오파노익산,
methoxychlor: 메톡시클로르, 및
4-methylbenzylidene-camphor: 4-메틸벤질리덴 캠포르.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.

상기 바이오마커는 1.5배 이상 발현이 증가 또는 감소한 유전자로써, 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질에 의해서만 특이적으로 발현하는 2종의 유전자로 구성되어 있다.

상기 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 노출 정도에 따라 특이적으로 발현 변화를 나타내는 바이오마커는 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다:

유전자 등록번호(Genebank) NM_016569(T-box 3) 및 NM_002213(integrin, beta 5).

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 인간 신경세포 유래 SH-SY5Y 세포주에 탈요오드화효소의 siRNA를 이용하여 탈요오드화효소 넉다운(knockdown) 인간 신경세포 유래 세포주를 만들어, 각 3종의 탈요오드화효소 유전자의 저발현 여부를 확인하였고, T3 갑상선호르몬의 생성이 감소하는 것을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조). 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 특이적 바이오마커 발굴을 위해, 상기 실험을 바탕으로 확보된 탈요오드화효소 넉다운 인간 신경세포 유래 세포주로부터 유전자 발현 프로파일을 확보하고자 하였다. 탈요오드화효소 넉다운 인간 신경세포 유래 세포주에서 mRNA를 분리하여 8 × 60 k 인간 유전체 전체 올리고마이크로어레이 칩(Human whole genome microarray, Agilent, 미국)을 이용하여 유전자 발현양상을 분석하였다. 분석시 Cy5/Cy3 비율이 1.5배 이상인 경우 과발현된 유전자로 분류하였고, 0.67배 이하인 경우 발현이 감소된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, Cy5/Cy3의 비율이 1.5배 이상 증가된 유전자는 1.858%(62,000개의 유전자 중 1,152개), 발현이 감소된 유전자는 1.845%(62,000개의 유전자 중 1,144개)임을 확인하였다. 상기에서, 탈요오드화효소 넉다운 인간 신경세포 유래 세포주에서 유전자 등록번호 NM_016569(T-box 3)는 1.5배 이상 과발현, 유전자 등록번호 NM_002213(integrin, beta 5)은 1.5배 이상 저발현 되었다(표 4 참조).

상기 2종의 유전자에 대하여, 탈요오드화효소 활성 저해와 관련하여, 기존에 보고된 화학물질이 세포독성을 보이지 않는 농도(표 5 참조)로 정상 인간 신경세포 유래 세포주에 노출되면, 상기 2종의 유전자는 각각 과발현 및 저발현 되는 것을 관찰하였다(도 3 및 도 4 참조). 상기 유전자는 인간 신경세포 유래 세포주에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.

따라서, 본 발명의 유전자 등록번호 NM_016569(T-box 3) 및 NM_002213(integrin, beta 5)을 바이오마커로 이용하여 탈요오드화효소의 활성을 저해시키는 화학물질의 모니터링 및 위해성 판정 및 탈요오드화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 의해 야기되는 독성작용 기작을 규명하는 도구로 유용하게 이용될 수 있다.

또한 본 발명은, 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열 또는 그 상보 가닥 분자가 집적된 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 특이적 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다:

유전자 등록번호(Genebank) NM_016569(T-box 3) 및 NM_002213(integrin, beta 5).

본 발명의 프로피온알데히드 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

본 발명의 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 특이적 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩에 있어서, 탈요오드화효소의 활성 저해 화학물질은 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin), 프로필티오우라실(propylthiouracil), 베타에스트라디올(β-estradiol), 3-메틸콜란트렌(3-methylcholanthrene), 아미오다론(amiodarone), 아로클러 1254(arochlor 1254), 카드뮴 클로라이드(cadmium chloride), 디메토에이트(dimethoate), 펜발레레이트(fenvalerate), 이오파노익산(iopanoic acid), 메톡시클로르(methoxychlor) 및 4-메틸벤질리덴 캠포르(4-methylbenzylidene-camphor)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 바이오마커를 이용한 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 특이적 노출 여부 확인방법을 제공한다.

본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 특이적 노출 여부 확인방법을 제공한다:

1) 탈요오드화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출이 의심되는 실험군인 피검체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상 개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;

3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;

4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및,

5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.

상기 노출 여부 확인방법에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간 신경세포 유래 세포인 SH-SY5Y 세포주를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 노출 여부 확인방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하는 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 노출 여부 확인방법에 있어서, 단계 3)의 혼성화는 40℃ 내지 50℃에서 10 내지 20시간 동안 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 노출 여부 확인방법에 있어서, 단계 4)의 DNA 마이크로어레이 칩은 인간 게놈 중 본 발명의 유전자 등록번호 NM_016569(T-box 3) 또는 NM_002213(integrin, beta 5)이 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 전체 인간 게놈 올리고 마이크로어레이(Whole Human Genome Oligo Microarray, Agilent, 미국) 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 본 발명자가 제작한 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다.

상기 노출 여부 확인방법에 있어서, 단계 4)의 분석은 혼성화된 마이크로어레이 칩을 세척 및 염색한 후 스캔하여 이미지 프로세싱을 수행한 다음 통계적 분석을 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 염색 및 세척은 플루이딕스 스테이션 450(Fluidics Station 450), 스캔은 진칩 스캐너 3000(GeneChip scanner3000), 및 이미지 프로세싱은 어피매트릭스 진칩 운영 시스템(Affymetrix GeneChip Operating System, GCOS)을 이용하고, 모든 절차는 어피매트릭스사의 프로토콜에 따라 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 통계학적 분석은 진플렉스 소프트웨어 버전 2.3(GenPlex software version 2.3)을 이용하여 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.

상기 노출 여부 확인방법에 있어서, 탈요오드화효소의 활성 저해 화학물질은 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은,

1) 탈요오드화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출이 의심되는 실험군인 피검체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상 개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 하기 유전자에 상보적이고 하기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계:

유전자 등록번호 NM_016569(T-box 3) 및 NM_002213(integrin, beta 5); 및

3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 탈요오드화효소의 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인방법을 제공한다.

상기 노출 여부 확인방법에 있어서, 상기 단계 2)의 프라이머 쌍은 단계 2)의 유전자를 증폭할 수 있는, 18 내지 30머 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍인 것이 바람직하고, 하기 프라이머 쌍 1 내지 2로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다:

프라이머 쌍 1: 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머, 및

프라이머 쌍 2: 서열번호 11로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 12로 기재되는 역방향 프라이머.

상기 노출 여부 확인방법에 있어서, 탈요오드화효소의 활성 저해 화학물질은 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 마이크로어레이 칩을 포함하는 탈요오드화효소의 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

상기 키트에 있어서, 추가적으로 인간 체세포를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 인간 체세포는 SH-SY5Y인 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 인간 신경 유래 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 키트에 추가로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인산화효소 접합물질(streptavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemifluorescent agent) 및 화학발광물질(chemiluminescent agent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3 및 Cy5를 사용하였다.

상기 키트에 추가로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표시 시약 및 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.

하기 각각의 유전자에 상보적이고 하기 각각의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 탈요오드화효소의 활성을 저해시키는 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다:

유전자 등록번호 NM_016569(T-box 3) 및 NM_002213(integrin, beta 5).

상기 확인용 키트의 프라이머 쌍은 하기 프라이머 쌍 1 내지 2로 구성된 군으로부터 선택하여 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 상기 바이오마커 유전자의 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 15 내지 50머 길이, 바람직하게는 15 내지 30머 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 25머 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 모두 사용가능하다:

프라이머 쌍 1: 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머, 및

프라이머 쌍 2: 서열번호 11로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 12로 기재되는 역방향 프라이머.

상기 키트에 있어서, 탈요오드화효소의 활성 저해 화학물질은 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 탈요오드화효소 ( Deiodinase ) 넉다운 ( knockdown ) 인간 신경세포 유래 세포주주 구축

<1-1> 세포배양

인간 신경세포 유래 세포주인 SH-SY5Y 세포주를 2% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)과 10% FBS (Gibco, USA)가 첨가된 MEM 배지 (50%의 F-12 Nutrient Mixture 포함, Gibco)에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

<1-2> siRNA를 이용한 3종의 탈요오드화효소 넉다운 SH-SY5Y 세포주 구축

배양 배지는 10% CD-FBS를 포함하는 MEM 배지를 사용하였다. siRNA 실험에서 표적 유전자의 넉다운 효율을 비교하기 위한 음성대조군 siRNA로서 NC siRNA(Bioneer)를 표적 siRNA 실험과 동일한 조건에서 진행하였다.

구체적으로, SH-SY5Y 세포를 6 웰-플레이드(well-plate)에 50 × 10⁴ cells/㎖로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간 배양한 뒤 DharmaFECT1(Dharmacon, Thermo Fisher)의 최종농도가 0.4 μM이 되도록 하고, DIO1(type 1 deiodinase) siRNA(siRNA No. 1041596; Bioneer, 한국) 50 nM 처리하고 24시간 후, DIO2(type 2 deiodinase) siRNA(siRNA No. 1041606; Bioneer, 한국) 100 nM을 처리하고 24시간 경과 뒤에 트리졸(trizol; Invitrogen life technologies, 미국)을 이용한 전체 RNA 분리를 수행하였다. 상기 처리된 세포로부터 트리졸 시약을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하였고, 알앤이지 미니 키트(RNeasy mini kit, Qiagen, 미국)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 알앤에이즈-프리 디앤에이즈 세트(RNase-free DNase set, Qiagen, 미국)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 농도는 엑스페리온(Experion, Automated Electrophoresis station, Bio-Rad, 미국)으로 확인하였다.

상기 탈요오드화효소 3종 유전자들의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR, Bio-rad, USA)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다.

구체적으로, 올리고 dT 프라이머와 수퍼스크립트 키트(Superscript kit, Omniscipt™ kit, Qiagen, Co., USA)를 이용하여 역전사반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. PCR 산물을 정량하기 위하여 사이버그린(SYBR Green) I 염색(Bio-rad, USA)으로 염색하였다. 사이버그린 I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성되는 양이 증가할수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저 PCR에 이용한 표적 유전자와 내재성(endogenous) 대조군(RPLPO)에 대한 프라이머를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하기 위해 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 각각의 프라이머(표 2)를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 siRNA를 처리한 DIO1 및 DIO2뿐만 아니라, siRNA를 처리하지 않은 DIO3(type 3 deiodinase)의 유전자 발현도 감소하였음을 실시간 RT-PCR로 확인하였다(도 1).

DIO1 , DIO2 , DIO3 프라이머 서열

유전자명	PCR 프라이머 서열(5'→3')		서열번호
DIO1	F	AAGCAACACTTGAGCTGTTCAGCC	1
	R	TGCAGGGAATGTGGTCTCCAAAGT	2
DIO2	F	ATTAGGGACGAGTACGCCAGCTTT	3
	R	CATTCAATTCGGAGCTGCTGCCTT	4
DIO3	F	GAGGGTGTAAACATCCAACGGACA	5
	R	TCCCAAGCGTGACTTGGTTTGA	6
RPLPO	F	TGCAGCTGATCAAGACTGGAGACA	7
	R	TCCAGGAAGCGAGAATGCAGAGTT	8

< 실시예 2> 탈요오드화효소 넉다운에 의한 갑상선 호르몬( T3 ) 생합성 저해정 도 측정

탈요오드화효소가 넉다운 된 DKD 세포주에서 갑상선 호르몬(T3) 생합성의 저해정도를 발광면역측정법(luminescence immunoassay)을 이용하여 T3 발현수준을 측정하였다.

구체적으로, 세포주의 세포 파쇄물(cell lysate)과 세포 배양액(cell supernatant)에서 총 T3를 측정할 수 있는 발광면역측정 키트(Cat No. 175-300; Monobind Inc., Lake Forest, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 상기 실시예 <1-2>의 방법으로 확보된 세포를 PBS로 세척한 후, 단백질 분해효소 억제제(Roche applied science, Mannheim, Germany)를 첨가한 용균용액[lysis buffer, 20 mM Tris(pH 8.0), 137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10%(v/v) NP-40]을 넣고, 4℃에서 20분간 반응시켜 세포 파쇄물을 수득하였으며, 상기 수득된 세포 파쇄물을 4℃, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액만 모아 발광면역측정에 사용하였다. 추출한 상층액의 단백질량은 BCA 분석 키트(pierce, USA)를 이용하여 정량하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 탈요오드화효소가 넉다운 된 DKD 세포주에서 갑상선 호르몬(T3) 수치의 감소를 확인하였다(도 2).

< 실시예 3> 마이크로어레이 실험

<3-1> 표지된 cDNA 제조

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <1-2>의 방법으로 수득한 탈요오드화효소 넉다운 세포주의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다.

구체적으로, 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍을 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 표 3과 같이 시약을 혼합하였다.

역전사 반응을 위한 시약 조성

구성	부피(㎕)
5x first strand buffer	6
dNTPs	0.6
0.1 M DDT	3
SuperScript II enzyme	3
Cy-3 또는 Cy-5 dUTP	2

대조군인 SH-SY5Y 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)로 표지화하였고, 탈요오드화효소 넉다운 SH-SY5Y 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)로 각각 표지화하였다. 이때 두 시료는 마이크로콘 YM-30(Microcon YM-30) 컬럼(Millipore, 미국)을 사용하여 혼합, 정제되었다.

<3-2> 혼성화 ( hybridzation ) 반응

혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)(한국)의 지시방법에 따라 수행하였다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이로는 44 k 인간 유전체 전체(Human whole genome) 올리고마이크로어레이(Agilent, 미국)를 이용하였다. 세척 과정(2분간 2× SSC/0.1% SDS, 3분간 1× SSC 및 2분간 0.2× SSC에 세척)을 거친 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.

<3-3> 형광 이미지 획득

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 진픽스 4000B(Genepix 4000B, Axon Instruments, 미국)로 스캔하였고, 결합하지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이적으로 발현되는 유전자의 활성수준을 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 진픽스 4.1(GenePix 4.1) 소프트웨어(Axon Instruments, 미국)로 분석하였다. 상기 방법에 의해 수득한 데이터로부터 탈요오드화효소 넉다운 인간 신경세포 유래 세포주에 대한 마커 유전자를 선별하였다(표 4).

그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 올리고 칩 상에 존재하는 대략 6만 2천 개의 유전자 중에서 탈요오드화효소 넉다운 인간 신경세포 유래 세포주 특이적으로 Cy5/Cy3의 비율이 1.5배 이상 증가한 유전자는 1.858%(62,000개의 유전자 중 1,152개), 발현이 감소한 유전자는 1.845%(62,000개의 유전자 중 1,144개)임을 확인하였다. 이들 유전자 중 탈요오드화효소 넉다운 특이적으로 발현하는로 유전자를 확인하였다(표 4).

탈요오드화효소 활성 저해 화학물질에 의해 발현이 변화하는 유전자

유전자 등록번호	유전자 약어	유전자 명	올리고마이크로어레이 값
			정상 SH-SY5Y 세포주	탈요오드화효소 녹다운 SH-SY5Y 세포주
NW_016569	TBX3	T-box 3	1.00	3.20
NW_002213	ITGB5	integrin, beta 5	1.00	0.32

< 실시예 4> 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 처리

<4-1> 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질

본 발명자들은 기존의 연구를 통해 탈요오드화효소의 활성을 저해시키는 화학물질로 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin), 프로필티오우라실(propylthiouracil), 베타에스트라디올(β-estradiol), 3-메틸콜란트렌(3-methylcholanthrene), 아미오다론(amiodarone), 아로클러 1254(arochlor 1254), 카드뮴 클로라이드(cadmium chloride), 디메토에이트(dimethoate), 펜발레레이트(fenvalerate), 이오파노익산(iopanoic acid), 메톡시클로르(methoxychlor) 및 4-메틸벤질리덴 캠포르(4-methylbenzylidene-camphor)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 사용하였으며, 이를 DMSO에 용해시켜, 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하로 사용하였다.

<4-2> 탈요오드화효소 활성 저해 화학 물질의 농도 결정

상기 실시예 <1-1>의 방법으로 배양한 SH-SY5Y 세포주를 이용하여, Mossman 등 (J. Immunol. Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 MTT 실험을 수행하였다.

구체적으로, 세포는 24-웰 플레이트에 25 × 10⁴ 세포수/웰(cells/well)로 MEM 배지(Gibro-BRL, 미국)에서 DMSO에 용해된 상기 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르, 4-메틸벤질리덴 캠포르를 처리하고 48시간 후에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하여, 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.

SH-SY5Y 세포주에서 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르, 4-메틸벤질리덴 캠포르의 세포독성을 살펴본 결과, 세포독성을 보이지 않는 농도를 관찰할 수 있었으며(표 5), 상기 농도들로 결정하여 본 발명의 유전자 등록번호 NM_016569(T-box 3) 및 NM_002213(integrin, beta 5) 2종의 유전자에 대한 실시간 RT-PCR 실험을 수행하였다.

화학물질	농도(uM)
프로필티오우라실	40
요오드아세트산(idoacetic acid)	1
메틸머큐리(methylmecury)	1
메티마졸(methimazole)	400
2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신	0.01
베타에스트라디올	10
3-메틸콜란트렌	25
아미노트리아졸(aminotriazole)	500
아미오다론	10
아로클러 1254	100
카드뮴 클로라이드	25
디메토에이트	25
펜발레레이트	40
옥틸메톡시신나메이트(Octylmethoxycinnamate)	50
이오파노익산	90
메톡시클로르	50
4-메틸벤질리덴 캠포르	60

<4-3> 실시간 RT -PCR( Real - time reverse transcriptase polymerase chain reaction ) 정량

실시예 <3-3>에 의해 결정된 상기 탈요오드화효소 활성 저해와 관련된 2종의 유전자[유전자 등록번호 NM_016569(T-box 3) 및 NM_002213(integrin, beta 5)]에 대해 상기 실시예 <1-2>에 기재된 방법과 동일하게 실시간 RT-PCR을 수행하였고, 상기 2종의 유전자에 대한 프라이머는 표 6과 같다.

프라이머 서열

유전자 등록번호	유전자 명	PCR 프라이머 서열(5'→3')		서열번호
NM_016569	T-box 3	센스	TCAGAAACGTCGGTTGCATTGAGC	9
		안티센스	AATCCGCACTGAGGGAGATGTCTT	10
NM_002213	integrin, beta 5	센스	TGTGAGTGCGACAACTTCTCCTGT	11
		안티센스	TAACCTGCATGGCACTTGCATTCC	12

그 결과, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이 1.5배 기준으로 유전자 등록번호 NM_016569(T-box 3)는 유전자 발현이 증가하고, 유전자 등록번호 NM_002213(integrin, beta 5)는 유전자 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4).

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> The biomarkers for identification of exposure to deiodinase inhibiting disruptors and the identification method of deiodinase inhibiting disruptors exposure using the same biomarkers <130> 12P-11-21 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DIO1_F <400> 1 aagcaacact tgagctgttc agcc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DIO1_R <400> 2 tgcagggaat gtggtctcca aagt 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DIO2_F <400> 3 attagggacg agtacgccag cttt 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DIO2_R <400> 4 cattcaattc ggagctgctg cctt 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DIO3_F <400> 5 gagggtgtaa acatccaacg gaca 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DIO3_R <400> 6 tcccaagcgt gacttggttt ga 22 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPLPO_F <400> 7 tgcagctgat caagactgga gaca 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPLPO_R <400> 8 tccaggaagc gagaatgcag agtt 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-box 3_sense <400> 9 tcagaaacgt cggttgcatt gagc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-box 3_antisense <400> 10 aatccgcact gagggagatg tctt 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin, beta 5_sense <400> 11 tgtgagtgcg acaacttctc ctgt 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin, beta 5_antisense <400> 12 taacctgcat ggcacttgca ttcc 24

Claims (16)

1. 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산 서열 또는 그 상보 가닥 분자가 집적된 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin), 프로필티오우라실(propylthiouracil), 베타에스트라디올(β-estradiol), 3-메틸콜란트렌(3-methylcholanthrene), 아미오다론(amiodarone), 아로클러 1254(arochlor 1254), 카드뮴 클로라이드(cadmium chloride), 디메토에이트(dimethoate), 펜발레레이트(fenvalerate), 이오파노익산(iopanoic acid), 메톡시클로르(methoxychlor) 및 4-메틸벤질리덴 캠포르(4-methylbenzylidene-camphor)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질 특이적 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩:
   유전자 등록번호(Genebank) NM_016569(T-box 3) 및 NM_002213(integrin, beta 5).
   
2. 삭제
3. 1) 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 노출이 의심되는 실험군인 피검체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상 개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;
   2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
   3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
   4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및,
   5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는,
   2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인방법.
   
4. 제 3항에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간 신경세포 또는 조직으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인방법.
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 인간 신경세포는 SH-SY5Y인 것을 특징으로 하는 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인방법.
   
6. 제 3항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인방법.
   
7. 삭제
8. 1) 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 노출이 의심되는 실험군인 피검체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상 개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;
   2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 하기 유전자에 상보적이고 하기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계:
   유전자 등록번호 NM_016569(T-box 3) 및 NM_002213(integrin, beta 5); 및
   3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는,
   2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인방법.
   
9. 제 8항에 있어서, 상기 단계 2)의 프라이머 쌍은 단계 2)의 유전자를 증폭할 수 있는, 18 내지 30머 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인방법.
   
10. 제 8항에 있어서, 단계 2)의 프라이머 쌍은 하기 프라이머 쌍 1 내지 2로 이루어지는 것을 특징으로 하는 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 탈요오드화효소 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인방법.:
    프라이머 쌍 1: 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머, 및
    프라이머 쌍 2: 서열번호 11로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 12로 기재되는 역방향 프라이머.
    
11. 삭제
12. 제 1항의 마이크로어레이 칩을 포함하는 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 탈요오드화효소의 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 키트.
    
13. 하기 각각의 유전자에 상보적이고 하기 각각의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 탈요오드화효소의 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 키트.:
    유전자 등록번호 NM_016569(T-box 3) 및 NM_002213(integrin, beta 5).
    
14. 제 13항에 있어서, 프라이머 쌍은 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 18 내지 30머 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 탈요오드화효소의 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 키트.
    
15. 제 13항에 있어서, 프라이머 쌍은 하기 프라이머 쌍 1 내지 2로 이루어지는 것을 특징으로 하는 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조다이옥신, 프로필티오우라실, 베타에스트라디올, 3-메틸콜란트렌, 아미오다론, 아로클러 1254, 카드뮴 클로라이드, 디메토에이트, 펜발레레이트, 이오파노익산, 메톡시클로르 및 4-메틸벤질리덴 캠포르로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 탈요오드화효소의 활성 저해 화학물질에 대한 노출 여부 확인용 키트.:
    프라이머 쌍 1: 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머, 및
    프라이머 쌍 2: 서열번호 11로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 12로 기재되는 역방향 프라이머.
16. 삭제

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