KR101265679B1 - 발암성 돌연변이원 검색용 마커 유전자 및 이를 이용한발암성 돌연변이원 후보 물질 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 발암성을 지닌 돌연변이원(carcinogenic mutagens)에 대한 발암성 돌연변이원 검색용 마커 유전자 및 이를 이용한 발암성 돌연변이원 후보 물질을 검색하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 발암성 돌연변이원에 노출시 발현되는 유전자 변화를 마이크로어레이로 측정하여 선별된 발암성 돌연변이원에 반응하는 유전자 마커 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것이다. 본 발명의 마커 유전자는 새로운 발암 위험성을 지닌 돌연변이원 후보 물질을 판정 및 발암성 돌연변이원 검색용 키트로 이용될 수 있다.
돌연변이원, 발암 위험성 진단용 마커, 키트
Description
도 1은 본 발명의 5종 돌연변이원(4-NQO, AF2, MMS, MNU 및 2-NF)에 의한 인간 정상 간세포주에서의 세포독성을 MTT 분석으로 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 5종 돌연변이원에 의한 인간 정상 간세포주에서의 유전자 발현 양상을 19k 올리고 마이크로어레이를 이용하여 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 5종 돌연변이원에 의한 올리고 마이크로어레이 분석결과 1.5배 이상 고발현 및 저발현되는 유전자들의 개수를 나타내는 그림이다.
도 4는 본 발명의 5종 돌연변이원에 의해 공통적으로 발현 변화를 나타내는 유전자들의 개수를 도식화한 밴다이어그램이다.
본 발명은 발암성을 지닌 돌연변이원(carcinogenic mutagens)에 대한 발암성 마커 유전자 및 이를 이용한 발암성 돌연변이원 후보 물질을 검색하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 발암성 돌연변이원에 노출시 발현되는 유전자 변화를 마이크로어레이로 측정한 후 선별된 발암성 돌연변이원에 반응하는 유전자 마커를 이용하여 새로운 발암 위험성을 지닌 돌연변이원 후보물질의 모니터링 및 검색 방법에 관한 것이다.
돌연변이원(carcinogenic mutagens)은 유전자에 돌연변이를 일으킬 수 있는 물질로서, 돌연변이가 일어나면 대부분의 세포는 세포기관에 문제가 생겨서 죽게 되지만 일부는 정상세포를 암세포로 만들어서 인체의 통제를 벗어나게 됨으로써 암을 유발시키게 된다(Radman, M., et al., Mutat. Res., 98, 249-264, 1982; 및 Meselson and Russel, 1977). 대부분의 암이 DNA 돌연변이에 의해 발생하는 것은 아니지만, 많은 경우에 있어서 DNA 돌연변이가 암 발생률을 높이는 것으로 알려져 있고, 또한 동물 실험에서 발암물질로 알려진 대부분이 이러한 발암성 돌연변이를 일으킬 수 있는 것으로 알려졌다(McCann et al ., 1975). 특히, 돌연변이를 일으켜 발암물질 여부를 확인하는 방법은 동물실험으로 발암물질을 찾아내는 것보다 훨씬 쉽고 경제적이기 때문에 우선적으로 많이 이용되고 있다.
현재 돌연변이 검사로서 가장 많이 사용하는 것은 부르스 에임즈 박사가 발견한 Ames 테스트로 이 검사는 Salmonella typhimurium 이라는 박테리아를 이용하는 방법이며(Ames et al., 1973, 1975; Maron and Ames, 1983), 또한 대장균을 이용하는 방법도 있다. 이러한 방법들은 그 사용법이 간단하지만, 박테리아를 이용 하기 때문에 포유동물 세포에서 일어날 수 있는 돌연변이를 모두 검사하는데 한계가 있다. 이로 인해, 세포와 유전자를 활용한 신속하고 정확한 돌연변이원 평가 기 방법이 국제적으로 조합되고 있다. 일례로, OECD에서는 포유동물 세포를 이용하여 돌연변이원을 검색하는 방법들을 제시하고 있으며, 일반적으로 사용되는 시험법들로는 형질전환 돌연변이법(Transgenic mutagenesis assay, Kohler et al., 1991; Ryu et al., 1998c,d, 1999b, 2000, 2002), 싸이미딘 키나아제 유전자 ㅇ아앞쪽 돌연변이법(thymidine kinase gene forward mutation assay, Clive et al., 1983; Sawyer et al., 1985; Ryu et al., 1999a), 단일세포 겔 전기영동법(single cell gel electrophoresis assay, Singh et al., 1994; Ryu et al., 1997, 2001a,d; Tice et al., 2000) 및 DNA 결합/첨가법(DNA binding/adduct assay) 등이 있으며, 더 나아가 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 톡시코게노믹스(Toxicogenomics) 연구 등을 접목하여 고속탐색(high throughput)법으로 환경 유해 물질, 신농약, 의약 후보물질은 물론 모든 화학물질의 돌연변이 유발 유무를 보다 신속하고 정확하게 평가하기 위한 노력들이 이루어지고 있다(Aederma and McGregor, 2002; Hamadeh and Afsari, 2004; 및 Newton et al., 200O).
돌연변이 유발과 관련한 유전자는 별로 보고되고 있지 않으나, 최근 분자적 및 생물학적 분석에 의하여 DNA repair, 세포주기 조절(cell cycle control), 세포사멸 및 산화적 스트레스 반응 등에 관련된 유전자들이 이러한 돌연변이 유발에 관여한다고 보고되었으며, 인간 림프구 세포주인 TK6 세포에서 MMS와 다른 돌연변이 원들을 처리한 후 마이크로어레이를 이용하여 GADD45와 p53 관련 유전자들, p21CIP1 , WAF1 및 SID1, PLAB, TNFSF9, BTG2, BUB1 및 MYC과 같은 유전자들이 DNA 손상에 의하여 발현이 변화한다는 사실이 보고된 바 있다(Islaih, et al., Environ. Molecul. Mutagen. 44, 401-419, 2004, Islaih, et al., Mutation Res. 578, 100-116, 2005). 또한, 싸이미딘 키나아제 유전자 앞쪽 돌연변이 분석(thymidine kinase gene forward mutation assay)에서 주로 사용되는 L5178Y 마우스 림프구 세포주에서 유전자독성 돌연변이원(genotoxic carcinogens), 유전자독성 비돌연변이원(genotoxic noncarcinogens), 비유전자독성 돌연변이원(nongenotoxic carcinogens) 및 비유전자독성 비돌연변이원(nongenotoxic noncarcinogens)을 처리하여 유전자 발현양상을 살펴본 연구도 있다(Kim et al., Environ. Mol. Mutagen., 45, 80-89, 2005). 그러나, 이러한 유전자만으로는 돌연변이원을 검색하고 평가하기에는 아직 불충분하다.
이에, 본 발명자들은 인간 유전자 1만 9천개가 집적되어 있는 올리고 마이크로어레이를 이용하여 직접적인 활성(direct acting) 돌연변이원들의 유전자 발현 양상을 인간 정상 간세포에서 조사함으로써 돌연변이원에 대한 고발현 또는 저발현 되는 유전자를 탐색하고 실시간(real-time) RT-PCR 방법으로 이들 유전자들을 확인함으로써 새로운 직접적인 활성(direct acting) 돌연변이원 마커 유전자들을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 직접적인 활성을 지닌 돌연변이원에 의해 공통적으로 과발현 또는 저발현되는 마커 유전자 및 이들을 이용한 발암성 돌연변이원 후보 물질을 검색하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 정상 간세포주에 돌연변이원 을 처리했을 때 발현변화를 나타내는 것을 특징으로 하는 발암성 돌연변이원 검색용 마커 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커 유전자를 이용한 발암성 돌연변이원 검색 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 마커 유전자를 포함하는 발암성 돌연변이원 검색용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 인간 정상 간세포주에 돌연변이원을 처리했을 때 발현변화를 나타내는 것을 특징으로 하는 발암성 돌연변이원 검색용 마커 유전자를 제공한다.
본 발명에서는 인간 정상 간세포주(THLE-3)에 처리하는 직접적인 활성을 지닌 돌연변이원으로서 4-니트로퀴놀린-N-산화물(4-nitroquinoline-N-oxide, 4-NQO), 퓨릴퓨라마이드(furylfuramide, AF-2), 메틸메탄설포네이트(methylmethanesulfonate, MMS), N-니트로소-N-메틸우레아(N-nitroso-N-methylurea, MNU) 및 2-니트로플루오렌(2-nitrofluorene, 2NF)로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명자들은 상기 5종의 돌연변이원과 대조군으로 사용한 용매를 각각 인간 정상 간세포주에 3시간 동안 처리하여 mRNA를 분리한 후, 분리된 RNA를 대조군은 Cy3(녹색)으로, 돌연변이원을 처리한 처리군은 Cy5(빨간색)으로 각각 표지한 다음 cDNA를 합성하기 위하여 역전사 반응을 수행하였다. 이어, 합성된 cDNA를 혼성화 카세트(Hybridization cassette)인 가톨릭 의대에서 제작한 16,377개의 유전자가 집적된 올리고 마이크로 어레이 칩에 넣고, 표적 DNA와 혼성화한 후, 스캐닝하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2 참조).
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 16,377개의 유전자 중에서 Cy5/Cy3의 비율이 0.5배 이상 발현이 증가한 유전자를 찾았으며, 구체적으로 4-NQO의 경우는 3.4%(16,377개의 유전자 중 559개)이고, AF-2는 6.8%(16,377개의 유전자 중 1,026개)이며, MMS는 3.05%(16,377개의 유전자 중 500개)이고, MNU는 6.8%(16,377개의 유전자 중 1,120개)이며, 2NF의 경우는 2.7%(16,377개의 유전자 중 446개)임을 확인하였다(도 3 참조). 이와 달리, Cy5/Cy3의 비율이 0.5배 이하로 발현이 감소한 유전자로 4-NQO의 경우는 3.15%(16,377개의 유전자 중 516개)이고, AF-2는 6.35%(16,377개의 유전자 중 1,041개)이며, MMS는 1.98%(16,377개의 유전자 중 325개)이고, MNU는 5.32%(16,377개의 유전자 중 872개)이며, 2NF의 경우는 2.5% (16,377개의 유전자 중 408개)임을 확인하였다(도 3 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 결과로부터 5종의 돌연변이원들에 의해 공통적으로 1.5배 이상 과발현되거나 저발현되는 유전자를 분류하였고, 그 결과 과발현된 유전자의 수는 51개이고, 저발현된 유전자의 수는 45개임을 확인하였다(도 4, 표 3 및 표 4 참조). 이때, 이들 유전자들을 기능별로 분류하면 세포사멸, 세포주기 조절, 전사 및 전달에 관련된 유전자로 구성되어 있음을 알 수 있었다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 돌연변이원 검색용 마커 유전자는 하기의 번호를 갖는 유전자들로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과발현된 유전자를 특징으로 한다: 유전자 등록번호(Genebank) NM_003722[tumor protein p73-like(TP73L)], 유전자 등록번호 NM_001951[E2F transcription factor 5, p130-binding(E2F5)], 유전자 등록번호 NM_006940[SRY(sex determining region Y)-box 5(SOX5), transcript variant 1], 유전자 등록번호 NM_005461[v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B(avian), MAFB], 유전자 등록번호 AF211977(Special AT-rich sequence binding protein 1), 유전자 등록번호 NM_001337[chemokine(C-X3-C motif) receptor 1, CX3CR1], 유전자 등록번호 NM_001643[apolipoprotein A-II (APOA2)], 유전자 등록번호 NM_002309[leukemia inhibitory factor(cholinergic differentiation factor), LIF)], 유전자 등록번호 AJ001348(Lymphocyte antigen 6 complex, locus K), 유전자 등록번호 NM_004310[ras homolog gene family, member H(RHOH)], 유전자 등록번호 AK027024[Transcription elongation factor A(SII), 3], 유전자 등록번호 M26147(deoxynucleotidyltransferase, DNTT), 유전자 등록번호 AF205437(G-protein-coupled receptor induced protein GIG2, GIG2), 유전자 등록번호 NM_017753[plasticity related gene 3(PRG-3), transcript variant 2], 유전자 등록번호 NM_001974[egf-like module containing, mucin-like, hormone receptor-like 1(EMR1)], 유전자 등록번호 NM_018659(cytokine-like 1, CYTL1), 유전자 등록번호 NM_004519[potassium voltage-gated channel, KQT-like subfamily, member 3(KCNQ3)], 유전자 등록번호 NM_001171[ATP-binding cassette, sub-family C(CFTR/MRP), member 6(ABCC6)], 유전자 등록번호 NM_000339[solute carrier family 12(sodium/chloride transporters), member 3(SLC12A3)], 유전자 등록번호L32786[Solute carrier family 25(mitochondrial carrier; adenine nucleotide translocator), member 5], 유전자 등록번호 NM_001647(apolipoprotein D, APOD), 유전자 등록번호 AF134401(putative espin mRNA), 유전자 등록번호 NM_007267 (Epidermodysplasia verruciformis 1), 유전자 등록번호 NM_001936[dipeptidyl-peptidase 6(DPP6), transcript variant 2], 유전자 등록번호 NM_012190[aldehyde dehydrogenase 1 family, member L1(ALDH1L1)], 유전자 등록번호 AK024433 (Mitochondrial ribosomal protein S25), 유전자 등록번호 NM_018199(exonuclease 3'-5' domain-like 2, EXDL2), 유전자 등록번호 NM_005510[dom-3 homolog Z(C. elegans),DOM3Z], 유전자 등록번호 AF110322[MSTP016(MST016)], 유전자 등록번호 NM_006495(ecotropic viral integration site 2B, EVI2B), 유전자 등록번호 Y11162 (U68 small nucleolar RNA), 유전자 등록번호 NM_001711[biglycan(BGN)], 유전자 등록번호 AK024448(mRNA for FLJ00038 protein), 유전자 등록번호 AB020695(mRNA for KIAA0888 protein), 유전자 등록번호 AK024464(mRNA for FLJ00057 protein), ESTs로서 유전자 등록번호 BE887356, 유전자 등록번호 AK022120, 유전자 등록번호 AL049434, 유전자 등록번호 AL389981, 유전자 등록번호 AK025673, 유전자 등록번호 AK024522, 유전자 등록번호 AF086548, 유전자 등록번호 AK000881, 유전자 등록번호 AK024365, 유전자 등록번호 AK023312, 유전자 등록번호 AK021573, 유전자 등록번호AF007132, 유전자 등록번호 AK024759, 유전자 등록번호 AK021863, 유전자 등록번호AF085917 및 유전자 등록번호 S50185.
또한, 본 발명의 돌연변이원 검색용 마커 유전자는 하기의 번호를 갖는 유전자들로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 저발현된 유전자를 특징으로 한다: 유전자 등록번호 NM_001141[arachidonate 15-lipoxygenase, type B (ALOX15B), transcript variant d], 유전자 등록번호 S72620(Friend leukemia virus integration 1), 유전자 등록번호 NM_006399[basic leucine zipper transcription factor, ATF-like(BATF)], 유전자 등록번호 NM_001244[tumor necrosis factor(ligand) superfamily, member 8(TNFSF8)], 유전자 등록번호AF118072(Protein phosphatase methylesterase-1), 유전자 등록번호 NM_003641 [interferon induced transmembrane protein 1(9-27), IFITM1], 유전자 등록번호M26747(Thyroid hormone receptor, beta), 유전자 등록번호 X99631(HOXC12 protein, exon 2), 유전자 등록번호 X52339(Zinc finger protein 708, KOX8), 유전자 등록번호 NM_000356[Treacher Collins-Franceschetti syndrome 1 (TCOF1), transcript variant 2], 유전자 등록번호 J03048(hemopexin mRNA), 유전자 등록번호 M81768[Solute carrier family 9(sodium/hydrogen exchanger), member 1], 유전자 등록번호 NM_001683[ATPase, Ca++ transporting, plasma membrane 2(ATP2B2)], 유전자 등록번호 NM_016356(doublecortin domain containing 2, DCDC2), 유전자 등록번호 NM_003371(vav 2 oncogene, VAV2), 유전자 등록번호 NM_001783[CD79A antigen(immunoglobulin-associated alpha), CD79A], 유전자 등록번호 NM_003394 [wingless-type MMTV integration site family, member 10B(WNT10B)], 유전자 등록번호 AF000562(uroplakin II mRNA), 유전자 등록번호 Z36807(Mastermind-like 3, Drosophila), 유전자 등록번호 NM_015950(Mitochondrial ribosomal protein L2), 유전자 등록번호 NM_015900(phospholipase A1 member A, PLA1A), 유전자 등록번호AB014541(Apoptosis-associated tyrosine kinase), 유전자 등록번호 AJ008151 (Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 14), 유전자 등록번호 NM_000715(complement component 4-binding protein, alpha, C4BPA), 유전자 등록번호 NM_014509(Serine hydrolase-like 2), 유전자 등록번호 S49432(type VI collagen alpha 3 chain), 유전자 등록번호 AF210651[NAG18 (NAG18)], 유전자 등록번호 AF251187(periodontal ligament cell specific protein 2 mRNA), 유전자 등록번호 U28131(HMGI-C chimeric transcript), 유전자 등록번호 NM_016301(ATP binding domain 1 family, member C), 유전자 등록번호 NM_014081(PRO0297 protein), 유전자 등록번호 NM_014151(HSPC053 protein) 및 EST로서 유전자 등록번호 L10374, 유전자 등록번호 AK026099, 유전자 등록번호 AL353948, 유전자 등록번호 AF088021, 유전자 등록번호 AK000107, 유전자 등록번호 AL359568, 유전자 등록번호 AF086183, 유전자 등록번호 AK023571, 유전자 등록번호 AF070586, 유전자 등록번호 AK024528, 유전자 등록번호 AK023515, 유전자 등록번호 AF090098 및 유전자 등록번호 NM_019060.
이어, 본 발명자들은 상기 유전자들을 동정한 다음, 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR)을 수행하여 상기 유전자들의 발현변화 정도를 정량적으로 분석하였다. 이러한 실시간 RT-PCR은 상기 cDNA 마이크로어레이 결과의 정확성을 높이는데 사용되었으며, 그 결과 상기 유전자들은 마이크로어레이 결과와 실시간 RT-PCR의 결과와 높은 상관관계가 있음을 확인하였다(표 6 참조).
또한, 본 발명은 상기 마커 유전자를 이용한 발암성 돌연변이원 검색 방법을 제공한다.
본 발명에서는, 하기 1) 내지 6) 단계를 포함하는 발암성 돌연변이원 검색 방법을 제공한다:
1) 인간 정상 간세포주에 돌연변이원을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 돌연변이원을 처리한 실험군 세포와 돌연변이원을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군 및 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 7항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 제 1항의 마커 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 발암성 돌연변이원 검색 방법.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 정상 간세포주는 THLE-2(ATCC CRL-10149, MA)와 THLE-3(ATCC CRL-11233, MA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 검색 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용가능하다.
또한, 상기 검색 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 19k 올리고 마이크로어레이를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 공통적으로 과발현 또는 저발현되는 마커 유전자(표 3 및 표 4 참조)를 집적한 마이크로어레이 칩을 제작하여 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 단계 5)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon사, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용해도 무방하다.
또한, 본 발명에서는 하기 1) 내지 4) 단계를 포함하는 발암성 돌연변이원 검색 방법을 제공한다:
1) 인간 정상 간세포주에 돌연변이원을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 돌연변이원을 처리한 실험군 세포와 돌연변이원을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
3) 제 1항의 마커 유전자에 상보적이며 마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 발암성 돌연변이원 검색 방법.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 정상 간세포주는 THLE-2와 THLE-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 돌연변이원 후보 물질은 거의 모든 장기에 직접, 간접적인 영향을 미쳐 대사 작용의 변화 및 기질적인 변화를 일으키나, 일차적으로 간에서 돌연변이원성을 지니지 않는 형태로 대사될 수도 그렇지 않을 수도 있으므로 대사체에 의한 돌연변이원성 여부도 동시에 검사할 수 있는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명자들은 인간의 정상 간세포주에 돌연변이원 후보 물질을 처리한 시료에서 mRNA를 분리한 후, 이를 실시간 RT-PCR을 수행하여 cDNA를 합성한 후, 상기에서 언급된 유전자 마커들의 프라이머를 제작하여 합성된 cDNA와 혼성화한다. 이어, 유전자 발현의 증가 혹은 감소 양상을 확인함으로써 시료의 돌 연변이원으로서 가능한지를 판단할 수 있다. 이때, 상기 프라이머는 본 발명에서 선별된 마커 유전자와 상보적이고, 마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머라면 모두 사용가능하다. 따라서, 본 발명에서는 서열번호 1 내지 20으로 기재되는 정방형 및 역방향 프라이머 10쌍을 제시하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 본 발명은 상기 마커 유전자를 포함하는 돌연변이원 검색용 키트를 제공한다.
이때, 상기 검색용 키트는 하기와 같이 구성되는 것을 특징으로 한다: 1) 인간 정상 간세포주; 2) DNA 마이크로어레이 칩; 3) 형광물질; 4) DNA 마이크로어레이 분석 소프트웨어; 및 5) 반응 시약.
상기 검색용 키트의 인간 정상 간세포주는 THLE-3인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 정상 간세포주에서 유래한 세포주라면 모두 사용가능하다.
상기 검색용 키트의 DNA 마이크로어레이 칩은 19k 올리고 마이크로어레이를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 공통적으로 과발현 또는 저발현되는 마커 유전자(표 3 및 표 4 참조)를 집적한 마이크로어레이 칩을 제작하여 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기에서 탐색된 마커 유전자의 탐침 DNA 분자를 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위하여 파이조일렉트릭(piezoelectric)방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로 어레이 칩 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다. 상기 검색용 키트의 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인산화효소 접합물질(strepavidin-alkaline phosphatase conjugate), 화학형광물질(chemifluorescent) 및 화학발광물질(chemiiluminescent)로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다. 또한, 상기 검색용 키트의 DNA 마이크로어레이 분석 소프트웨어로는 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon사, USA)를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 소프트웨어를 사용해도 무방하다. 아울러, 상기 검색용 키트의 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, cNTPs 및 rNTPs(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도체와 같은 표식시약(post synthesis labeling agent), 혼성화 및 세척 완충용액 등과 같은 완충용액 등으로 구성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
또한, 상기 검색용 키트는 하기와 같이 구성되는 것을 특징으로 한다: 1) 상기 마커 유전자에 상보적이고, 이를 증폭할 수 있는 프라이머; 2) 실시간 RT-PCR 기기; 및 2) 반응 시약.
상기 검색용 키트의 프라이머는 서열번호 1 내지 20으로 기재되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 마커 유전자에 상보적이며, 이 유전자를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머쌍은 모두 사용가능하다. 또한, 상기 검색용 키트의 실시간 RT-PCR 기기는 My IQ Real-Time PCR(Bio-Rad, USA)를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 기존의 실시간 RT-PCR 기기는 모두 사용 가능하다. 상기 검색용 키트의 반응 시약은 당업자에게 알려진 실시간 RT-PCR에 사용되는 시약은 모두 포함될 수 있으며, 반응 완충 용액, 올리고 dT, 역전사 효소, 염색 시약 및 대조군 프라이머(예를 들면, GAPDH) 등이 포함될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 세포주 배양 및
돌연변이원
처리
<1-1> 인간 정상
간세포주
배양
인간 정상 간세포주인 THLE-3 세포(ATCC CRL-11233, MA, USA)는 10% FBS와 70ng/ml의 포스포에타놀아민(phosphoehanolamine, Sigma, CA)이 첨가된 BEGM 배지에서 약 5일동안 플레이트에 80% 정도 채워질 때까지 배양하였다. 또한, 본 발명에서 사용한 돌연변이원은 기존의 연구와 보고를 통해 이미 직접적인 활성을 지닌 발암성 돌연변이원인 퓨릴퓨라마이드(furylfuramide, AF-2), N-니트로소-N-메틸우레아(N-nitroso-N-methylurea, MNU), 메틸메탄설포네이트(methylmethanesulfonate, MMS), 4-니트로퀴놀린-N-산화물(4-nitroquinoline-N-oxide, 4-NQO) 및 2-니트로플루오렌(2-nitrofluorene, 2NF) 등의 5종을 선정하였고, 메틸메탄설포네이트(MMS)는 증류수에 용해시키고, 나머지 4종의 돌연변이원들은 DMSO에 용해시켰다. 비히클 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하로 하였다.
<1-2>
돌연변이원
처리에 의한 세포독성실험
Mossman, et al.(1995)에 의한 방법을 약간 변형하여 인간 정상 간세포주인 THLE-3 세포에 대한 세포독성실험(MTT)을 수행하였다. 우선, 24-웰 플레이트의 웰 당 3×104 개의 세포를 BEGM 배지에 현탁한 후 24 시간 동안 배양하였다. 이어, 각각의 용해된 5종의 돌연변이원들을 처리한 후, 3시간 동안 배양한 다음 5 mg/ml의 3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide, MTT)을 첨가하여 반응을 중지시켰고, 상기 플레이트는 37℃에서 3시간 동안 추가 배양하였다. 이어, 상기 배지를 제거한 다음 세포내에서 형성된 포르마젠 크리스탈(formazan crystal)을 500ul의 DMSO로 용해하였고, 최종적으로 96-웰 플레이트로 옮긴 후 540 nm에서 O.D 값을 측정하였다.
그 결과, 각 돌연변이원들에 대한 THLE-3 세포의 세포독성 비율은 각각 4-NQO에서는 0.83 uM, AF2에서는 243.12 uM, MMS에서는 510.37 uM, MNU에서는 2,093.97 uM 및 2-NF에서는 80.78 uM에서 20%의 생존율을 보였으며(도 6), 이 농도를 본 발명의 마이크로어레이 실험에 사용하였다.
<
실시예
2> 표적
RNA
분리
이어, 본 발명자들은 100mm 플레이트에 THLE-3 세포(1×106개/ml)를 분주하여 24시간 동안 배양한 다음 상기 <실시예 2>에서 결정된 각각의 돌연변이원을 상기 농도로 세포에 처리한 후 3시간 동안 배양하였다. 이어, 제조사의 지시방법에 따라 상기 세포를 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies)으로 처리한 다음 RNA를 분리하였고, 이를 RNeasy mini kit(Qiagen, CA)로 정제하였다. 또한, 게놈 DNA는 RNA를 정제하는 동안 RNase-free DNase set(Qiagen)을 사용하여 제거하였다. 상기로부터 수득한 각각의 RNA양은 스펙트로포토미터로 측정하였고, 그 순도는 Agilent 2100 Bioanalyzer와 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다.
<
실시예
3>
마이크로어레이
(
Microarray
) 실험
이어, 본 발명자들은 상기로부터 분리 및 정제된 RNA를 이용한 마이크로어레이 실험을 수행하였다. 이때, 사용된 마이크로어레이 분석은 통상적인 마이크로어레이 칩 분석방법으로서, 서로 다른 두 군(대조군 및 실험군)의 환경에서 자란 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로 하여 역전사효소에 의해 역전사 시킬 때, 각각 다른 색의 형광물질을 띤 Cy3(빨간색) 및 Cy5(녹색)을 첨가하여 cDNA를 합성한 후, 이 합성된 두 군의 cDNA를 같은 양으로 혼합하여 마이크로어레이 칩에 결합시키는 방법이다. 이와 달리, 본 발명에서는 스트라타진(Stratagene)사에서 판매하는 10 종의 인간 세포주로부터 분리된 RNA로부터 구성된 인간 참조 RNA(reference RNA)를 대조군으로 하여, 상기 실험군에서 수득한 cDNA와 반응시켜 19k 올리고 마이크로어레이 칩(가톨릭 의대에서 제작)에 결합시키는 방법을 사용하였다.
<3-1> 형광물질로
표지된
cDNA
제조
본 발명자들은 올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 <실시예 2>에서 수득한 돌연변이원 처리군의 RNA로부터 cDNA를 제조하였다. 표지화(labeling)는 일반적으로 많이 사용되는 직접 표지 방법을 이용하였다. 구체적으로, 상기에서 준비된 30 ㎍의 RNA를 2 ㎍ (1 ㎍/㎕)의 올리고(dT) 프라이머 와 혼합한 뒤 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 반응을 중화(annealing)시켰다. 이어, 중화된 RNA를 이용하여 역전사(RT) 반응을 수행하기 위하여 하기 표 2와 같이 반응 시약을 혼합하였다.
참조 RNA(Reference RNA)는 Cy3-dUTP으로 표지화하였고, 돌연변이원을 각각 처리한 THLE-3 세포로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(NEN)로 표지화하였다. 이때, 두 샘플은 마이크론(Microcon) YM-30 컬럼(Millipore, MA)을 이용하여 혼합 및 정제하였다.
<3-2>
혼성화
반응(
Hybridization
)
이어, 혼성화(hybridization) 및 세척은 가톨릭 의대의 Moui system을 이용하여 수행하였다. 구체적으로, 혼성화 버퍼인 DIG(2x hybridization buffer), Herring Sperm DNA(10㎍/㎕) 및 샘플과 증류수를 포함한 혼성화는 1시간 동안 42℃ 물수조(water bath)에서 수행하였고, 이어 2×SSC/0.1% SDS에서 2분간 두 번 반복하여 세척한 후, 다시 1×SSC/0.1% SDS에서 2분, 0.2×SSC에서 3분, 0.05×SSC에서 2분, 증류수에서 2분간 세척한 후 상기 슬라이드는 600rpm에서 6분간 원심분리하여 건조시켰다.
<3-3> 형광 이미지 획득
이어, 본 발명자들는 상기 <실시예 3-2>로부터 수득한 슬라이드의 혼성화 이미지를 얻기 위하여, Genepix 4000B(Axon Instruments, CA)로 스캔하였다. 구체적으로, 혼성화 반응을 통하여 결합이 안 된 유전자를 씻어낸 칩은 레이저 형광 스캐너(laser fluorescence scanner)에 의해서 읽혀지는데, 이때 녹색은 대조군에서 발현되며, 빨간색은 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성도를 나타내게 되며, 노란색은 녹색과 빨간색의 보색으로 두 군에서 큰 차이가 없음을 의미한다. 이와 같이, 스캔한 이미지들로부터 유전자의 발현 비율을 얻기 위하여, GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, CA)를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 각각의 돌연변이원에 대한 발암성 마커 유전자를 선별하였다(도 2 및 도 3). 특히, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 16,377개의 유전자 중에서 Cy5/Cy3의 비율이 0.5배 이상으로 유전자 발현이 증가한 유전자는 4-NQO의 경우, 약 3.4%(16,377개의 유전자 중 559개)이고, AF-2는 약 6.8%(16,377개의 유전자 중 1,026개)이며, MMS는 약3.05%(16,377개의 유전자 중 500개)이고, MNU는 약 6.8%(16,377개의 유전자 중 1,120개)이며, 2NF는 약 2.7%(16,377개의 유전자 중 446개)임을 관찰하였다. 이와 달리, Cy5/Cy3의 비율이 0.5배 이하로 유전자 발현이 감소한 유전자는 4-NQO의 경우, 약 3.15%(16,377개의 유전자 중 516개)이고, AF-2는 약 6.35%(16,377개의 유전자 중 1,041개)이며, MMS는 약 1.98%(16,377개의 유전자 중 325개)이고, MNU는 약 5.32%(16,377개의 유전자 중 872개)이며, 2NF는 약 2.5%(16,377개의 유전자 중 408개)임을 관찰하였다(도 3).
이때, 5종의 돌연변이원들에 대해 공통적으로 1.5배 이상 과발현되거나 저발현되는 유전자들만을 분류하면, 51개의 유전자가 발현이 증가하였고, 45개의 유전자는 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한, 이들 유전자들을 기능별로 분류하면, 세포사멸(apoptosis) 관련, 세포주기(cell cycle) 조절, 전사 (transcription) 및 전달(transport)에 관련된 유전자임을 알 수 있었다(도 4, 표 3 및 표 4).
<
실시예
4> 정량적 실시간
RT
-
PCR
이어, 본 발명자들은 돌연변이원에 의해 유도된 상기 <실시예 3>의 유전자들 중 발현변화 정도가 큰 10개의 유전자를 선별하여 이를 정량하기 위하여, My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR, Bio-rad, USA)를 이용한 정량적 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 구체적으로, 올리고 dT 프라이머와 슈퍼스크립트 키트(Superscipt™ kit, Qiagen사)를 이용한 역전사 반응으로 cDNA를 합성하였다. 이어, 상기로부터 수득한 PCR 산물을 정량하기 위하여, 사이버그린 I(SYBR Green I, Bio-rad, USA)으로 염색하였다. 이때 사용한 SYBR Green I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광 강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 우선, PCR에 사용한 표적 유전자와 내재성 대조군(GAPDH)에 대한 프라이머를 SYBR Green 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 최적화(primer optimization)를 수행하였다. 이어, 합성된 cDNA 시료와 상기로부터 최적화된 농도의 각 프라이머(표 5)를 혼합하고, SYBR Green 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행한 다음 정량적 소프트웨어로 분석하였다(표 6).
그 결과, 과발현 유전자들 중에서는 LIF 및 저발현 유전자들 중에서는 FLI1을 제외한 나머지 유전자들은 5종의 돌연변이원들에 대한 유전자 발현 양상이 올리고 마이크로어레이 결과와 매우 유사하게 나타남을 확인하였다(표 6).
|
등록번호
유전자명
실시간
RT
-
PCR
프라이머
서열
(5' -> 3') |
|||
| NM_003722 | tumor protein p73-like (TP73L) | 센스 | cactctccatgccatccac |
| 안티센스 | gcccaacctcgctaagaaa | ||
| NM_001951 | E2F transcription factor 5, p130-binding (E2F5) | 센스 | gcagcagacatcagctacaga |
| 안티센스 | gacattaactcatcaatgatatctcca | ||
| NM_006940 | SRY (sex determining region Y)-box 5 (SOX5) | 센스 | cggcagtacttcaatgttgg |
| 안티센스 | gctccagggtacacaacacc | ||
| AF211977 | Special AT-rich sequence binding protein 1 | 센스 | cccacattatccatgttcca |
| 안티센스 | tctgtggctgctgctgtg | ||
| NM_001643 | apolipoprotein A-II (APOA2) | 센스 | aggtcaagagcccagagctt |
| 안티센스 | ccttcttgatcaggggtgtc | ||
| NM_002309 | leukemia inhibitory factor (cholinergic differentiation factor) (LIF) | 센스 | tgccaatgccctctttattc |
| 안티센스 | gtccaggttgttggggaac | ||
| NM_001141 | arachidonate 15-lipoxygenase, type B (ALOX15B) | 센스 | tgatgagtctgtccaagatgaca |
| 안티센스 | cgggtctccagtgaggaag | ||
| S72620 | Friend leukemia virus integration 1 | 센스 | aacgatcagtaagaatacagagcaac |
| 안티센스 | gctaggcgactgctggtc | ||
| NM_006399 | basic leucine zipper transcription factor, ATF-like (BATF) | 센스 | tattgccgcccagaagag |
| 안티센스 | ccaggtcttcgctctcca | ||
| NM_001244 | tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 8 (TNFSF8) | 센스 | ccgcagctatttctatttgacc |
| 안티센스 | ggtgagttgggaatggagtc | ||
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 돌연변이원에 대해 특이적으로 발현이 변화하는 유전자 마커를 이용한 검색 방법은 새로운 돌연변이원 후보 물질을 손쉽게 검색할 수 있을 뿐 아니라 기존에 보고되지 않은 돌연변이원과 관련된 유전자 검색, 돌연변이 유발과 발암 위험성 유전자 규명 및 돌연변이원에 노출된 정도를 모니터링하는데 유용하게 이용할 수 있다.
<110> KIST
<120> Marker genes and screening method for carcinogenic mutagens using
thereof
<130> 6P-06-37
<160> 20
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> TP73L sense primer
<400> 1
cactctccat gccatccac 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> TP73L antisense primer
<400> 2
gcccaacctc gctaagaaa 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> E2F5 sense primer
<400> 3
gcagcagaca tcagctacag a 21
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> E2F5 antisense primer
<400> 4
gacattaact catcaatgat atctcca 27
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> SOX5 sense primer
<400> 5
cggcagtact tcaatgttgg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> SOX5 antisense primer
<400> 6
gctccagggt acacaacacc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Special AT-rich sequence binding protein 1 sense primer
<400> 7
cccacattat ccatgttcca 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Special AT-rich sequence binding protein 1 antisense primer
<400> 8
tctgtggctg ctgctgtg 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> APOA2 sense primer
<400> 9
aggtcaagag cccagagctt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> APOA2 antisense primer
<400> 10
ccttcttgat caggggtgtc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> LIF sense primer
<400> 11
tgccaatgcc ctctttattc 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> LIF antisense primer
<400> 12
gtccaggttg ttggggaac 19
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> ALOX15B sense primer
<400> 13
tgatgagtct gtccaagatg aca 23
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> ALOX15B antisense primer
<400> 14
cgggtctcca gtgaggaag 19
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> Friend leukemia virus integration 1 sense primer
<400> 15
aacgatcagt aagaatacag agcaac 26
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Friend leukemia virus integration 1 antisense primer
<400> 16
gctaggcgac tgctggtc 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> BATF sense primer
<400> 17
tattgccgcc cagaagag 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> BATF antisense primer
<400> 18
ccaggtcttc gctctcca 18
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> TNFSF8 sense primer
<400> 19
ccgcagctat ttctatttga cc 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> TNFSF8 antisense primer
<400> 20
ggtgagttgg gaatggagtc 20
Claims (14)
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- 하기의 모든 유전자 또는 그의 상보가닥 분자가 모두 집적된 발암성 돌연변이원 검색용 DNA 마이크로어레이 칩:유전자 등록번호(Genebank) NM_003722[tumor protein p73-like(TP73L)], 유전자 등록번호 NM_001951[E2F transcription factor 5, p130-binding(E2F5)], 유전자 등록번호 NM_006940[SRY(sex determining region Y)-box 5(SOX5), transcript variant 1], 유전자 등록번호 NM_005461[v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B(avian), MAFB], 유전자 등록번호 AF211977(Special AT-rich sequence binding protein 1), 유전자 등록번호 NM_001337[chemokine(C-X3-C motif) receptor 1, CX3CR1], 유전자 등록번호 NM_001643[apolipoprotein A-II (APOA2)], 유전자 등록번호 NM_002309[leukemia inhibitory factor(cholinergic differentiation factor), LIF)], 유전자 등록번호 AJ001348(Lymphocyte antigen 6 complex, locus K), 유전자 등록번호 NM_004310[ras homolog gene family, member H(RHOH)], 유전자 등록번호 AK027024[Transcription elongation factor A(SII), 3], 유전자 등록번호 M26147(deoxynucleotidyltransferase, DNTT), 유전자 등록번호 AF205437(G-protein-coupled receptor induced protein GIG2, GIG2), 유전자 등록번호 NM_017753[plasticity related gene 3(PRG-3), transcript variant 2], 유전자 등록번호 NM_001974[egf-like module containing, mucin-like, hormone receptor-like 1(EMR1)], 유전자 등록번호 NM_018659(cytokine-like 1, CYTL1), 유전자 등록번호 NM_004519[potassium voltage-gated channel, KQT-like subfamily, member 3(KCNQ3)], 유전자 등록번호 NM_001171[ATP-binding cassette, sub-family C(CFTR/MRP), member 6(ABCC6)], 유전자 등록번호 NM_000339[solute carrier family 12(sodium/chloride transporters), member 3(SLC12A3)], 유전자 등록번호L32786[Solute carrier family 25(mitochondrial carrier; adenine nucleotide translocator), member 5], 유전자 등록번호 NM_001647(apolipoprotein D, APOD), 유전자 등록번호 AF134401(putative espin mRNA), 유전자 등록번호 NM_007267 (Epidermodysplasia verruciformis 1), 유전자 등록번호 NM_001936[dipeptidyl-peptidase 6(DPP6), transcript variant 2], 유전자 등록번호 NM_012190[aldehyde dehydrogenase 1 family, member L1(ALDH1L1)], 유전자 등록번호 AK024433 (Mitochondrial ribosomal protein S25), 유전자 등록번호 NM_018199(exonuclease 3'-5' domain-like 2, EXDL2), 유전자 등록번호 NM_005510[dom-3 homolog Z(C. elegans),DOM3Z], 유전자 등록번호 AF110322[MSTP016(MST016)], 유전자 등록번호 NM_006495(ecotropic viral integration site 2B, EVI2B), 유전자 등록번호 Y11162 (U68 small nucleolar RNA), 유전자 등록번호 NM_001711[biglycan(BGN)], 유전자 등록번호 AK024448(mRNA for FLJ00038 protein), 유전자 등록번호 AB020695(mRNA for KIAA0888 protein), 유전자 등록번호 AK024464(mRNA for FLJ00057 protein), ESTs로서 유전자 등록번호 BE887356, 유전자 등록번호 AK022120, 유전자 등록번호 AL049434, 유전자 등록번호 AL389981, 유전자 등록번호 AK025673, 유전자 등록번호 AK024522, 유전자 등록번호 AF086548, 유전자 등록번호 AK000881, 유전자 등록번호 AK024365, 유전자 등록번호 AK023312, 유전자 등록번호 AK021573, 유전자 등록번호AF007132, 유전자 등록번호 AK024759, 유전자 등록번호 AK021863, 유전자 등록번호AF085917, 유전자 등록번호 S50185, 유전자 등록번호 NM_001141[arachidonate 15-lipoxygenase, type B (ALOX15B), transcript variant d], 유전자 등록번호 S72620(Friend leukemia virus integration 1), 유전자 등록번호 NM_006399[basic leucine zipper transcription factor, ATF-like(BATF)], 유전자 등록번호 NM_001244[tumor necrosis factor(ligand) superfamily, member 8(TNFSF8)], 유전자 등록번호AF118072(Protein phosphatase methylesterase-1), 유전자 등록번호 NM_003641 [interferon induced transmembrane protein 1(9-27), IFITM1], 유전자 등록번호M26747(Thyroid hormone receptor, beta), 유전자 등록번호 X99631(HOXC12 protein, exon 2), 유전자 등록번호 X52339(Zinc finger protein 708, KOX8), 유전자 등록번호 NM_000356[Treacher Collins-Franceschetti syndrome 1 (TCOF1), transcript variant 2], 유전자 등록번호 J03048(hemopexin mRNA), 유전자 등록번호 M81768[Solute carrier family 9(sodium/hydrogen exchanger), member 1], 유전자 등록번호 NM_001683[ATPase, Ca++ transporting, plasma membrane 2(ATP2B2)], 유전자 등록번호 NM_016356(doublecortin domain containing 2, DCDC2), 유전자 등록번호 NM_003371(vav 2 oncogene, VAV2), 유전자 등록번호 NM_001783[CD79A antigen(immunoglobulin-associated alpha), CD79A], 유전자 등록번호 NM_003394 [wingless-type MMTV integration site family, member 10B(WNT10B)], 유전자 등록번호 AF000562(uroplakin II mRNA), 유전자 등록번호 Z36807(Mastermind-like 3, Drosophila), 유전자 등록번호 NM_015950(Mitochondrial ribosomal protein L2), 유전자 등록번호 NM_015900(phospholipase A1 member A, PLA1A), 유전자 등록번호AB014541(Apoptosis-associated tyrosine kinase), 유전자 등록번호 AJ008151 (Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 14), 유전자 등록번호 NM_000715(complement component 4-binding protein, alpha, C4BPA), 유전자 등록번호 NM_014509(Serine hydrolase-like 2), 유전자 등록번호 S49432(type VI collagen alpha 3 chain), 유전자 등록번호 AF210651[NAG18 (NAG18)], 유전자 등록번호 AF251187(periodontal ligament cell specific protein 2 mRNA), 유전자 등록번호 U28131(HMGI-C chimeric transcript), 유전자 등록번호 NM_016301(ATP binding domain 1 family, member C), 유전자 등록번호 NM_014081(PRO0297 protein), 유전자 등록번호 NM_014151(HSPC053 protein) 및 EST로서 유전자 등록번호 L10374, 유전자 등록번호 AK026099, 유전자 등록번호 AL353948, 유전자 등록번호 AF088021, 유전자 등록번호 AK000107, 유전자 등록번호 AL359568, 유전자 등록번호 AF086183, 유전자 등록번호 AK023571, 유전자 등록번호 AF070586, 유전자 등록번호 AK024528, 유전자 등록번호 AK023515, 유전자 등록번호 AF090098 및 유전자 등록번호 NM_019060.
- 1) 인간 정상 간세포주에 돌연변이원을 처리하는 단계;2) 단계 1)의 돌연변이원을 처리한 실험군 세포와 돌연변이원을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군 및 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 5항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 제 5항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 발암성 돌연변이원 검색 방법.
- 제 6항에 있어서, 단계 1)의 인간 정상 간세포주는 THLE-2와 THLE-3 세포로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 발암성 돌연변이원 검색 방법.
- 제 6항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 발암성 돌연변이원 검색 방법.
- 1) 인간 정상 간세포주에 돌연변이원을 처리하는 단계;2) 단계 1)의 돌연변이원을 처리한 실험군 세포와 돌연변이원을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;3) 제 5항의 유전자 각각에 상보적이며 상기 각각의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 모두를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하는 단계; 및4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 발암성 돌연변이원 검색 방법.
- 제 9항에 있어서, 단계 1)의 인간 정상 간세포주는 THLE-2와 THLE-3 세포로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 발암성 돌연변이원 검색 방법.
- 제 5항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 발암성 돌연변이원 검색용 키트.
- 제 11항에 있어서, 상기 키트는 THLE-2와 THLE-3 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 정상 간세포주를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 발암성 돌연변이원 검색용 키트.
- 제 5항의 각각의 유전자에 상보적이고 상기 각각의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 모두를 포함하는 발암성 돌연변이원 검색용 키트.
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Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020060055313A KR101265679B1 (ko) | 2006-06-20 | 2006-06-20 | 발암성 돌연변이원 검색용 마커 유전자 및 이를 이용한발암성 돌연변이원 후보 물질 스크리닝 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020060055313A KR101265679B1 (ko) | 2006-06-20 | 2006-06-20 | 발암성 돌연변이원 검색용 마커 유전자 및 이를 이용한발암성 돌연변이원 후보 물질 스크리닝 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20070120713A KR20070120713A (ko) | 2007-12-26 |
| KR101265679B1 true KR101265679B1 (ko) | 2013-05-22 |
Family
ID=39138362
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020060055313A KR101265679B1 (ko) | 2006-06-20 | 2006-06-20 | 발암성 돌연변이원 검색용 마커 유전자 및 이를 이용한발암성 돌연변이원 후보 물질 스크리닝 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101265679B1 (ko) |
-
2006
- 2006-06-20 KR KR1020060055313A patent/KR101265679B1/ko not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Environ. Mol. Mutagen., Vol. 44, No. 5, pp. 401-419 (2004) |
| Mutat. Res., Vol. 549, pp. 5-27 (2004) |
| NCBI, GenBank Accession No. NM_001141.1 (1999.04.01.) |
| NCBI, GenBank Accession No. NM_001951.1 (1999.03.19.) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20070120713A (ko) | 2007-12-26 |
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