KR101008385B1 - 다환 방향족 탄화수소류 노출 여부 확인용 바이오마커 및이를 이용한 확인 방법 - Google Patents

다환 방향족 탄화수소류 노출 여부 확인용 바이오마커 및이를 이용한 확인 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다환 방향족 탄화수소류(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs)에 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 구체적으로 다환 방향족 탄화수소류에 의해 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이며, 본 발명의 바이오마커는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 환경 시료에서 다환 방향족 탄화수소류의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 다환 방향족 탄화수소류에 의해 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
다환 방향족 탄화수소류, 다환 방향족 탄화수소, 바이오마커, 마이크로어레이

Description

다환 방향족 탄화수소류 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법{Biomarker for identification of exposure to Polycyclic Aromatic Hydrocarbons and the method of identification using thereof}
본 발명은 다환 방향족 탄화수소류(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs)에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것이다.
다환 방향족 탄화수소류는 여러 개의 벤젠고리를 지닌 방향족 탄화수소로서 유기물이 불완전 연소 시 발생하며, 미량으로도 암을 유발시킬 수 있는 발암물질 또는 돌연변이원성을 가진 물질이다. 경유, 휘발유 등 화석연료를 사용하는 자동차의 배출가스에서도 자주 발생하고, 경유자동차의 PM등에 흡착되거나 가스상으로도 존재하며, 공기역학적 직경이 2.5 ㎛미만의 입자상 물질로서 공기 중에 방출된다(Keith LH & Walker MM, EPA's Clean Air Act Air Toxics Database Vol.Ⅱ-Air Toxics Chemical and Physical Properties, Lewis Pub., 1993a). 대기 중의 다환 방향족 탄화수소류는 오존에 의해 변화되어 분해반응이 일어나며, 나프탈렌과 페난 트렌의 대기 중에서 반감기는 각각 12시간, 8시간 정도인 것으로 조사되었다(정용 외 1997; //home.sunchon.ac.kr/~bioenvlab/data2/ham6/6-1.htm). 다환 방향족 탄화수소류는 물에 대한 용해도가 낮고 유기용매에 대한 용해도가 매우 큰 물질로 증기압이 비교적 낮아 입자상 물질에 흡착되어 인체에 흡입되며, 1.0 ㎛ 이하의 크기는 쉽게 인체로 흡수된다. 일반적으로 환경발암 물질에 장기간 만성적으로 노출되는 것이 단기간의 급성노출보다도 훨씬 더 중요하고(Daisey 등, 1976; //home.sunchon.ac.kr/~bioenvlab/data2/ham6/6-1.htm) 환경노출의 정상조건하에서, 고농도의 다환 방향족 탄화수소류를 포함하는 토양, 기름, 콜타르 등에 접촉시 피부를 통해 몸으로 흡수된다. 뿐만 아니라 지방분을 포함하는 모든 신체조직에 유입되어 신장, 간 등에 축적되며 대부분의 다환 방향족 탄화수소류는 분비물을 통해 체외로 빠져나간다. 대표적인 다환 방향족 탄화수소류의 하나인 벤조에이파이렌(Benzo[a]pyrene)은 거의 모든 동물 종에서 발암성을 나타내는 물질이다.
다환방향족 탄화수소류의 발암성 정도와 유전자 발현 변화에 대한 연구는 일부 보고되고 있지만, 대표적인 다환방향족 탄화수로류로 알려진 벤조에이파이렌에 대한 연구에 거의 국한되어 있다. 이처럼 다환 방향족 탄화수소류의 인간에 대한 발암 가능성에도 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 더욱 빠르고 간편한 스크리 닝(screening) 방법, 예를 들면 프라이머(primer)를 이용하는 실시간 PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 다환 방향족 탄화수소류의 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.
포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena M et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996).
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K et. al., J. Am. Acad. Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer K et al., J. Am. Acad. Dermatol. 51:681-692, 2004).
유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며 cDNA로 전환한다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두 개의 다른 형광(예: Cye3 및 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram K et al., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).
최근 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯한 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 확인할 수 있게 될 것이다.
이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 4천 개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 다환 방향족 탄화수소류의 유전자 발현 프로파일을 인간 간암 세포인 HepG2 세포주에서 관찰 및 분석함으로써 9종의 다환 방향족 탄화수소류에 의해 공통으로 과발현 또는 저발현 되는 유전자를 발굴하고, 실시간(real-time) RT-PCR 방법에 의해 상기 유전자들의 발현 양상을 확인함으로써 다환 방향족 탄화수소류 노출을 검출할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 노출 여부를 확인하는 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 다환 방향족 탄화수소류(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs)의 노출에 의해 과발현 또는 저발현되는 바이오마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커를 이용한 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다환 방향족 탄화수소류(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs)의 노출에 의해 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 올리고뉴클레오티드가 집적된 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 상기 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 검색 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 다환 방향족 탄화수소류(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs)의 노출에 의해 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.
상기 다환 방향족 탄화수소류에는 벤조에이파이렌(Benzo[a]pyrene), 다이벤조에이에이취안트라센(Dibenzo[a,h]anthrancene), 크라이센(Chrysene), 페난트렌(Phenanthrene), 나프탈렌(Naphthalene), 3-메틸콜란트렌(3-Methylchloanthrene), 벤조에이안트라센(Benzo[a]anthracene), 벤조케이플루오란텐(Benzo[k]fluoranthene) 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌(Indeno[1,2,3,c,d]pyrene) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 바이오마커는 상기 다환 방향족 탄화수소류 노출에 의해 1.5배 이상 발현이 증가 또는 감소한 유전자로써, 세포사멸(apoptosis), 세포 주기(cell cycle), 신호전달(signal transduction), 전사(transcription), 면역 반응(immune response), 수송(transport), 유사분열 주기(mitotic cell cycle), 유사분열의 조절(regulation of mitosis), DNA 복구(DNA repair) 및 전사 조절(transcription regulation) 등에 관련된 유전자로 구성되어 있다.
본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택돼는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 제공한다:
유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003900(SQSTM1,sequestosome 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002305(LGALS1,lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003897(IER3, immediate early response 3), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003311(PHLDA2,pleckstrin homology-like domain, family A, member 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_147780(CTSB,cathepsin B), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001007271(DUSP13,dual specificity phosphatase 13), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014624(S100A6,S100 calcium binding protein A6), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004073(PLK3,polo-like kinase 3 (Drosophila)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001924(GADD45A,growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002754(MAPK13,mitogen-activated protein kinase 13), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014059(C13orf15,chromosome 13 open reading frame 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_025106(SPSB1,splA/ryanodine receptor domain and SOCS box containing 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004864(GDF15,growth differentiation factor 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_005620(S100A11,S100 calcium binding protein A11), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_175744(RHOC,ras homolog gene family, member C), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003330(TXNRD1,thioredoxin reductase 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003900(SQSTM1,sequestosome 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001012631(IL32,interleukin 32), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001421(ELF4, E74-like factor 4 (ets domain transcription factor)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004925(AQP3,aquaporin 3 (Gill blood group)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_198447(GOLT1A,golgi transport 1 homolog A (S. cerevisiae)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004695(SLC16A5,solute carrier family 16, member 5 (monocarboxylic acid transporter 6)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000499(CYP1A1,cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_022346(NCAPG,non-SMC condensin I complex, subunit G), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_018492(PBK,PDZ binding kinase), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_020242(KIF15,kinesin family member 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004701(CCNB2,cyclin B2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_080668(CDCA5,cell division cycle associated 5), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_006101(NDC80,NDC80 homolog, kinetochore complex component (S. cerevisiae)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_138555(KIF23,kinesin family member 23), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004523(KIF11,kinesin family member 11), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_181803(UBE2C,ubiquitin-conjugating enzyme E2C), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003318(TTK,TTK protein kinase), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_016343(CENPF,centromere protein F, 350/400ka (mitosin)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014750(DLG7,discs, large homolog 7 (Drosophila)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001790(CDC25C,cell division cycle 25 homolog C (S. pombe)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002358(MAD2L1,MAD2 mitotic arrest deficient-like 1 (yeast)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002128(HMGB1,high-mobility group box 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_148957(TNFRSF19,tumor necrosis factor receptor superfamily, member 19), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001067(TOP2A,topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002129(HMGB2,high-mobility group box 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_013277(RACGAP1,Rac GTPase activating protein 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_024087(ASB9,ankyrin repeat and SOCS box-containing 9), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_023110(FGFR1,fibroblast growth factor receptor 1 (fms-related tyrosine kinase 2, Pfeiffer syndrome)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_005271(GLUD1,glutamate dehydrogenase 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000251(MSH2,mutS homolog 2, colon cancer, nonpolyposis type 1 (E. coli)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002128(HMGB1,high-mobility group box 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002129(HMGB2,high-mobility group box 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002729(HHEX,hematopoietically expressed homeobox), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_013282(UHRF1,ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) AK025758(Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000204(CFI,complement factor I) 및 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000715(C4BPA,complement component 4 binding protein, alpha).
1) 상기 바이오마커 중에서 다환 방향족 탄화수소류의 노출에 의해 발현이 증가하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다:
유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003900(SQSTM1,sequestosome 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002305(LGALS1,lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003897(IER3, immediate early response 3), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003311(PHLDA2,pleckstrin homology-like domain, family A, member 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_147780(CTSB,cathepsin B), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001007271(DUSP13,dual specificity phosphatase 13), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014624(S100A6,S100 calcium binding protein A6), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004073(PLK3,polo-like kinase 3 (Drosophila)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001924(GADD45A,growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002754(MAPK13,mitogen-activated protein kinase 13), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014059(C13orf15,chromosome 13 open reading frame 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_025106(SPSB1,splA/ryanodine receptor domain and SOCS box containing 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004864(GDF15,growth differentiation factor 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_005620(S100A11,S100 calcium binding protein A11), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_175744(RHOC,ras homolog gene family, member C), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003330(TXNRD1,thioredoxin reductase 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003900(SQSTM1,sequestosome 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001012631(IL32,interleukin 32), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001421(ELF4, E74-like factor 4 (ets domain transcription factor)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004925(AQP3,aquaporin 3 (Gill blood group)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_198447(GOLT1A,golgi transport 1 homolog A (S. cerevisiae)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004695(SLC16A5,solute carrier family 16, member 5 (monocarboxylic acid transporter 6)) 및 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000499(CYP1A1,cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1).
2) 상기 바이오마커 중에서, 다환 방향족 탄화수소류의 노출에 의해 발현이 감소하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다:
유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_022346(NCAPG,non-SMC condensin I complex, subunit G), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_018492(PBK,PDZ binding kinase), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_020242(KIF15,kinesin family member 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004701(CCNB2,cyclin B2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_080668(CDCA5,cell division cycle associated 5), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_006101(NDC80,NDC80 homolog, kinetochore complex component (S. cerevisiae)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_138555(KIF23,kinesin family member 23), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004523(KIF11,kinesin family member 11), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_181803(UBE2C,ubiquitin-conjugating enzyme E2C), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003318(TTK,TTK protein kinase), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_016343(CENPF,centromere protein F, 350/400ka (mitosin)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014750(DLG7,discs, large homolog 7 (Drosophila)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001790(CDC25C,cell division cycle 25 homolog C (S. pombe)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002358(MAD2L1,MAD2 mitotic arrest deficient-like 1 (yeast)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002128(HMGB1,high-mobility group box 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_148957(TNFRSF19,tumor necrosis factor receptor superfamily, member 19), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001067(TOP2A,topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002129(HMGB2,high-mobility group box 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_013277(RACGAP1,Rac GTPase activating protein 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_024087(ASB9,ankyrin repeat and SOCS box-containing 9), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_023110(FGFR1,fibroblast growth factor receptor 1 (fms-related tyrosine kinase 2, Pfeiffer syndrome)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_005271(GLUD1,glutamate dehydrogenase 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000251(MSH2,mutS homolog 2, colon cancer, nonpolyposis type 1 (E. coli)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002128(HMGB1,high-mobility group box 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002129(HMGB2,high-mobility group box 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002729(HHEX,hematopoietically expressed homeobox), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_013282(UHRF1,ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) AK025758(Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000204(CFI,complement factor I) 및 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000715(C4BPA,complement component 4 binding protein, alpha).
본 발명자들은 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 9종의 다환 방향족 탄화수소류를 인간 간암 세포주(HepG2)에 각각 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 다환 방향족 탄화수소류는 인간 간암 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 80%의 세포생존율(IC20)을 보이는 9종의 다환 방향족 탄화수소류의 농도를 각각 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 다환 방향족 탄화수소류를 인간 간암 세포주에 처리하고, 상기 물질을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 형광물질(Cy5)로 표지하였으며, 약물을 처리하지 않은 대조군의 경우 Cy3로 표지하였다. 상기 형광표지된 cDNA를 44 k 올리고마이크로어레이 칩 Human whole genome microarray(Agilent, USA)와 혼성화 하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2 참조). 분석시 Cy5/Cy3 비율이 1.5배 이상인 경우 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.667배 이하인 경우 발현 감소된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 발현 증가된 유전자는 1) 벤조에이파이렌의 경우 0.81%(44,000개의 유전자 중 355개), 2) 다이벤조에이에이취안트라센은 0.39%(44,000개의 유전자 중 170개), 3) 크라이센은 0.73%(44,000개의 유전자 중 323개), 4) 페난트렌은 0.69%(44,000개의 유전자 중 302개), 5) 나프탈렌은 0.86%(44,000개의 유전자 중 377개), 6) 3-메틸콜란트렌은 0.25% (44,000개의 유전자 중 112개), 7) 벤조에이안트라센은 0.87%(44,000개의 유전자 중 379개), 8) 벤조케이플루오란텐은 9.54%(44,000개의 유전자 중 4199개), 9) 인데노(1,2,3-c,d)파이렌은 1.04%(44,000개의 유전자 중 458개)임을 확인하였다. 또한, 발현이 감소된 유전자는 1)벤조에이파이렌의 경우 0.76%(44,000개의 유전자 중 335개), 2) 다이벤조에이에이취안트라센은 0.77%(44000개의 유전자 중 338개), 3) 크라이센은 0.82%(44,000개의 유전자 중 361개), 4) 페난트렌은 0.55%(44,000개의 유전자 중 244개), 5) 나프탈렌은 0.71%(44,000개의 유전자 중 313개), 6) 3-메틸콜란트렌은 0.57%(44,000개의 유전자 중 252개), 7) 벤조에이안트라센은 1.2%(44,000개의 유전자 중 529개), 8) 벤조케이플루오란텐은 7.18%(44,000개의 유전자 중 3160개), 9) 인데노(1,2,3-c,d)파이렌은 1.11%(44,000개의 유전자 중 490개)임을 확인하였다. 이때, 9종의 다환 방향족 탄화수소류에 의해 공통으로 1.5배 이상 과발현 또는 0.667배 이하 저발현 되는 유전자들을 분류한 기능별로 분류하면, 세포사멸(apoptosis), 세포 주기(cell cycle), 신호전달(signal transduction), 전사(transcription), 면역 반응(immune response), 수송(transport), 유사분열 주기(mitotic cell cycle), 유사분열의 조절(regulation of mitosis), DNA 복구(DNA repair), 전사 조절(transcription regulation) 등에 관련된 유전자들이었다(표 2 및 표 3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 다환 방향족 탄화수소류를 처리했을 때, 인간 간암 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
본 발명자들은 상기 유전자 중 과발현된 유전자 5종과 저발현된 유전자 2종을 분리하여, 실시간 RT-PCR(real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 방법으로 발현 양상을 조사하였다. 그 결과, 5종의 과발현 유전자들과 2종의 저발현 유전자의 발현 양상이 올리고마이크로어레이 칩 결과와 유사하게 나타남을 확인하였다(표 5 참조). 이들 유전자들은 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014624(S100A6,S100 calcium binding protein A6), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004073(PLK3,polo-like kinase 3 (Drosophila)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001924(GADD45A,growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002754(MAPK13,mitogen-activated protein kinase 13), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014059(C13orf15,chromosome 13 open reading frame 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_018492(PBK,PDZ binding kinase) 및 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004701(CCNB2,cyclin B2) 등이다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보 가닥 분자가 집적된 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
상기 다환 방향족 탄화수소류에는 벤조에이파이렌, 다이벤조에이에이취안트라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 올리고뉴클레오티드는 상기 바이오마커 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함한다.
본 발명의 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로파이펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L- 라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 상기 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 상기 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다:
1) 실험군인 피검체 유래 인간 체세포와 대조군 체세포에서 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질을 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 본 발명의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화 시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 본 발명의 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.
상기 다환 방향족 탄화수소류에는 벤조에이파이렌, 다이벤조에이에이취안트 라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 바이오마커를 검출하는 방법에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간의 간 또는 간암의 세포 및 조직에서 유래한 세포를 사용하는 것이 바람직하며, 인간 간암 세포주(HepG2)를 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 상기 피검체는 다환 방향족 탄화수소류에 노출된 것이 의심되는 개체이고, 대조군은 건강한 인간 개체일 것이다.
상기 바이오마커를 검출하는 방법에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 바이오마커를 검출하는 방법에 있어서, 단계 4)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, USA) 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 과발현 또는 저발현 유전자(표 2 및 표 3 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 4)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
또한, 본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 상기 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다:
1) 실험군인 피검체 유래 인간 체세포와 대조군 체세포에서 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를 대상으로, 본 발명의 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계.
상기 다환 방향족 탄화수소류에는 벤조에이파이렌, 다이벤조에이에이취안트라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 바이오마커를 검출하는 방법에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간의 간 또는 간암의 세포 및 조직에서 유래한 세포를 사용하는 것이 바람직하며, 인간 간암 세포주(HepG2)를 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 상기 피검체는 다환 방향족 탄화수소류에 노출된 것이 의심되는 개체이고, 대조군은 건강한 인간 개체일 것이다.
상기 바이오마커를 검출하는 방법에 있어서, 단계 2)의 프라이머쌍은 본 발 명에서 탐색된 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머라면 모두 사용가능하다. 본 발명에서는 단계 2)의 프라이머쌍은 하기 프라이머쌍 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 이용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다:
프라이머쌍 1 - 서열번호 1로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 2로 기재된 안티센스 프라이머;
프라이머쌍 2 - 서열번호 3으로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 4로 기재된 안티센스 프라이머;
프라이머쌍 3 - 서열번호 5로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 6으로 기재된 안티센스 프라이머;
프라이머쌍 4 - 서열번호 7로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 8으로 기재된 안티센스 프라이머;
프라이머쌍 5 - 서열번호 9로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 10으로 기재된 안티센스 프라이머;
프라이머쌍 6 - 서열번호 11로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 12로 기재된 안티센스 프라이머; 및,
프라이머쌍 7 - 서열번호 13으로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 14로 기재된 안티센스 프라이머.
또한, 본 발명은 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 다환 방향족 탄화수소류에는 벤조에이파이렌, 다이벤조에이에이취안트라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 확인용 키트에 추가적으로 인간 간세포를 포함하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다. 상기 인간 간세포는 HepG2를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 간 또는 간암의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포 함시킬 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자에 상보적이고, 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 확인용 키트의 프라이머쌍은 하기 프라이머쌍 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머쌍을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있으며 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 센스 및 안티센스 프라이머쌍은 모두 사용 가능하다:
프라이머쌍 1 - 서열번호 1로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 2로 기재된 안티센스 프라이머;
프라이머쌍 2 - 서열번호 3으로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 4로 기재된 안티센스 프라이머;
프라이머쌍 3 - 서열번호 5로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 6으로 기재된 안티센스 프라이머;
프라이머쌍 4 - 서열번호 7로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 8으로 기재된 안티센스 프라이머;
프라이머쌍 5 - 서열번호 9로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 10으로 기재된 안티센스 프라이머;
프라이머쌍 6 - 서열번호 11로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 12로 기재 된 안티센스 프라이머; 및,
프라이머쌍 7 - 서열번호 13으로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 14로 기재된 안티센스 프라이머.
본 발명은 다환 방향족 탄화수소류에 노출되었을 때에 특이적으로 발현이 증가 또는 감소되는 DNA 단편을 다환 방향족 탄화수소류에 노출 여부 확인용 바이오마커로 이용하여 다환 방향족 탄화수소류의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하며, 다환 방향족 탄화수소류에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리
<1-1> 세포배양
인간 간암 세포주인 HepG2 세포(한국 세포주 은행)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)를 이용하여 100 ㎜ 디쉬(dish)에서 80% 정도 자랄 때까지 배 양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 다환 방향족 탄화수소류에서 발암성이 있다고 보고된 벤조에이파이렌(Benzo[a]pyrene), 다이벤조에이에이취안트라센(Dibenzo[a,h]anthrancene), 크라이센(Chrysene), 페난트렌(Phenanthrene), 나프탈렌(Naphthalene), 3-메틸콜란트렌(3-Methylchloanthrene), 벤조에이안트라센(Benzo[a]anthracene), 벤조케이플루오란텐(Benzo[k]fluoranthene) 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌(Indeno[1,2,3,c,d]pyrene) 등의 9종(Sigma-Aldrich, USA)을 선정하였으며, DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.
<1-2> 세포 독성 실험(MTT assay) 및 화학 물질 처리
Mossman 등(J. Immunol. Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 HepG2 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트에 4× 105/웰 세포수로 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)에서 24 시간 동안 처리하여 부착시켰다. DMSO에 용해된 9종의 다환 방향족 탄화수소류인 벤조에이파이렌, 다이벤조에이에이취안트라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌을 각각 처리하고 48시간 후에 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 ㎚에서 O.D.값을 측정하였다.
HepG2 세포주에서 다환 방향족 탄화수소류의 세포독성을 살펴본 결과, 벤조에이파이렌의 경우 8.35 ㎍/㎖, 다이벤조에이에이치안트라센은 3.79 ㎍/㎖, 크라이센은 34.97 ㎍/㎖, 페난트렌은 500 ㎍/㎖(페난트렌은 500 ㎍/㎖ 이상의 농도로 녹을 수 없어서 상기 농도로 정함), 3-메틸콜란트렌은 2.14 ㎍/㎖, 나프탈렌은 1772.23 ㎍/㎖, 벤조에이안트라센은 36.09 ㎍/㎖, 벤조케이플루오란텐은 22.56 ㎍/㎖ 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌의 경우는 227.66 ㎍/㎖이었으며(도 1), 상기 농도들로 결정하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
<실시예 2> 마이크로어레이 실험
<2-1> 표적 RNA의 분리 및 형광 물질 표지
6 × 106 cell/㎖ 농도로 100 ㎜ 디쉬에 HepG2 세포를 분주한 후, 24 시간 후 실시예 1-2에서 결정된 9종의 다환 방향족 탄화수소류의 각각의 농도를 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 농도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)와 아가로스 젤 전기영동으로 확인하였다.
<2-2> 표지된 cDNA 제조
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시예 2-1에서 수득한 다환 방향족 탄화수소류 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 표 1과 같이 시약을 혼합하였다.
구성 부피(㎕)
5X first strand buffer 6
dNTPs 0.6
0.1 M DDT 3
SuperScript II enzyme 3
Cy-3 or Cy-5 dUTP 2
대조군인 HepG2 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)로 표지화 하였고, 9종의 다환 방향족 탄화수소류를 각각 처리한 HepG2 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)로 표지화하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제되었다.
<2-3> 혼성화 반응
혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로는 44 k Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, USA)를 이용하였다. 세척(2분간 2× SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1× SSC, 2분간 0.2× SSC에 세척) 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.
<2-4> 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon Instruments, USA)로 스캔하였다. 결합하지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)로 분석하였다. 이렇게 하여 얻어진 데이터로부터 다환 방향족 탄화수소류에 대한 마커 유전자를 선별하였다(도 2).
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 4천 개의 유전자 중에서 다환 방향족 탄화수소류에 의해 Cy5/Cy3의 비율이 1.5배 이상으로 유전자 발현 증가를 보이는 유전자는 1) 벤조에이파이렌의 경우 0.81%(44,000개의 유전자 중 355개), 2) 다이벤조에이에이취안트라센은 0.39%(44,000개의 유전자 중 170개), 3) 크라이센은 0.73%(44,000개의 유전자 중 323개), 4) 페난트렌은 0.69%(44,000개의 유전자 중 302개), 5) 나프탈렌은 0.86%(44,000개의 유전자 중 377개), 6) 3-메틸콜란트렌은 0.25% (44,000개의 유전자 중 112개), 7) 벤조에이안트라센은 0.87%(44,000개의 유전자 중 379개), 8) 벤조케이플루오란텐은 9.54%(44,000개의 유전자 중 4199개), 9) 인데노(1,2,3-c,d)파이렌은 1.04%(44,000개의 유전자 중 458개)임을 확인하였다. 또한, 발현이 감소된 유전자는 1)벤조에이파이렌의 경우 0.76%(44,000개의 유전자 중 335개), 2) 다이벤조에이에이취안트라센은 0.77%(44000개의 유전자 중 338개), 3) 크라이센은 0.82%(44,000개의 유전자 중 361개), 4) 페난트렌은 0.55%(44,000개의 유전자 중 244개), 5) 나프탈렌은 0.71%(44,000개의 유전자 중 313개), 6) 3-메틸콜란트렌은 0.57%(44,000개의 유전자 중 252개), 7) 벤조에이안트라센은 1.2%(44,000개의 유전자 중 529개), 8) 벤조케이플루오란텐은 7.18%(44,000개의 유전자 중 3160개), 9) 인데노(1,2,3-c,d)파이렌은 1.11%(44,000개의 유전자 중 490개)임을 확인하였다.
이때, 9종의 다환 방향족 탄화수소류에 의해 공통으로 1.5배 이상 과발현되거나 저발현 되는 유전자들을 확인한 결과, 45개의 유전자가 공통으로 유전자 발현이 증가하였고, 55개의 유전자가 공통으로 유전자 발현이 감소하였다(도 3 참조). 이들 100개의 유전자 중 기능별로 분류가능한 유전자를 분류한 결과, 세포사멸(apoptosis), 세포 주기(cell cycle), 신호전달(signal transduction), 전사(transcription), 면역 반응(immune response), 수송(transport), 유사분열 주기(mitotic cell cycle), 유사분열의 조절(regulation of mitosis), DNA 복구(DNA repair), 전사 조절(transcription regulation)에 관련된 유전자들이었다(표 2 및 표 3 참조).
다환 방향족 탄화수소류에 의해 발현이 증가하는 유전자
등록번호 유전자약어 유전자명 중간값(Mean Intensity)
(Cy5/Cy3)
3MC BaA BaP BkF IND Chry DBA NP Phen
세포사멸(apoptosis)
NM_003900 SQSTM1 sequestosome 1 2.04 1.69 4.97 3.60 6.76 2.12 2.54 4.08 6.27
NM_002305 LGALS1 lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1) 1.52 2.67 5.27 8.30 8.37 2.69 2.68 1.85 4.22
NM_003897 IER3 immediate early response 3 1.96 4.00 7.35 5.36 5.06 3.28 2.85 4.67 4.93
NM_003311 PHLDA2 pleckstrin homology-like domain, family A, member 2 1.58 2.93 3.95 16.64 8.55 3.62 2.76 5.94 4.25
NM_147780 CTSB cathepsin B 1.98 2.30 4.56 2.60 1.70 3.68 1.60 2.00 4.76
세포 주기( cell cycle )
NM_001007271 DUSP13 dual specificity phosphatase 13 1.72 2.74 5.01 8.38 11.03 7.03 2.87 2.17 3.14
NM_014624 S100A6 S100 calcium binding protein A6 3.56 1.73 7.63 3.09 2.78 5.93 4.17 1.84 4.46
NM_004073 PLK3 polo-like kinase 3 (Drosophila) 2.28 2.76 6.58 5.24 3.86 5.34 3.07 2.51 6.21
NM_001924 GADD45A growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha 1.92 1.63 2.75 2.70 1.74 2.78 2.25 1.64 1.59
NM_002754 MAPK13 mitogen-activated protein kinase 13 1.86 1.87 3.48 1.52 2.20 2.13 2.25 2.40 2.85
NM_014059 C13orf15 chromosome 13 open reading frame 15 1.92 4.71 4.40 25.66 9.32 3.35 2.48 2.00 2.43
신호 전달( signal transduction )
NM_025106 SPSB1 splA/ryanodine receptor domain and SOCS box containing 1 1.58 1.97 2.32 7.12 4.13 1.77 2.17 2.57 1.71
NM_004864 GDF15 growth differentiation factor 15 5.17 5.08 5.82 13.77 8.01 6.64 10.98 4.74 8.02
NM_005620 S100A11 S100 calcium binding protein A11 1.90 2.90 9.07 7.97 6.18 5.64 3.05 2.42 5.78
NM_175744 RHOC ras homolog gene family, member C 2.22 1.82 3.98 2.17 2.54 2.83 2.27 1.85 2.37
NM_003330 TXNRD1 thioredoxin reductase 1 1.83 1.80 1.50 2.83 5.83 2.30 2.37 3.74 2.00

전사( transcription )
NM_003900 SQSTM1 sequestosome 1 2.04 1.69 4.97 3.60 6.76 2.12 2.54 4.08 6.27
면역반응( Immune response )
NM_001012631 IL32 interleukin 32 1.97 2.03 5.00 1.79 1.95 3.08 2.52 1.53 3.19
NM_001421 ELF4 E74-like factor 4 (ets domain transcription factor) 2.04 1.72 5.52 2.43 4.16 3.43 1.97 2.46 3.47
수송( Transport )
NM_004925 AQP3 aquaporin 3 (Gill blood group) 2.87 5.23 17.68 22.33 8.17 8.41 5.69 2.89 6.38
NM_198447 GOLT1A golgi transport 1 homolog A (S. cerevisiae) 1.85 2.05 3.77 2.83 2.79 2.28 1.67 1.56 2.34
NM_004695 SLC16A5 solute carrier family 16, member 5 (monocarboxylic acid transporter 6) 1.54 1.80 3.02 3.01 2.73 2.56 2.12 2.45 3.29
NM_000499 CYP1A1 cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1 12.2 89.77 70.77 81.72 137.0 85.39 28.28 1.66 7.63
* 3MC : 3-메틸콜란트렌
BaA : 벤조에이안트라센
BaP : 벤조에이파이렌
BkF : 벤조케이플루오란텐
IND : 인데노(1,2,3-c,d)파이렌
Chry : 크라이센
DBA : 다이벤조에이에이취안트라센
NP : 나프탈렌
Phen : 페난트렌
다환 방향족 탄화수소류에 의해 발현이 감소하는 유전자
등록번호 유전자약어 유전자명 중간값(Mean Intensity)
(Cy5/Cy3)
3MC BaA BaP BkF IND Chry DBA NP Phen
유사분열 주기(mitotic cell cycle)
NM_022346 NCAPG non-SMC condensin I complex, subunit G 0.34 0.45 0.07 0.30 0.25 0.44 0.23 0.46 0.32
NM_018492 PBK PDZ binding kinase 0.16 0.43 0.05 0.22 0.19 0.28 0.08 0.47 0.25
NM_020242 KIF15 kinesin family member 15 0.40 0.39 0.05 0.28 0.12 0.28 0.42 0.61 0.31
NM_004701 CCNB2 cyclin B2 0.36 0.62 0.10 0.24 0.32 0.43 0.34 0.55 0.27
NM_080668 CDCA5 cell division cycle associated 5 0.29 0.43 0.12 0.27 0.34 0.31 0.20 0.61 0.36
NM_006101 NDC80 NDC80 homolog, kinetochore complex component (S. cerevisiae) 0.26 0.51 0.04 0.23 0.19 0.28 0.18 0.41 0.17
NM_138555 KIF23 kinesin family member 23 0.48 0.52 0.18 0.34 0.30 0.45 0.56 0.56 0.34
NM_004523 KIF11 kinesin family member 11 0.41 0.57 0.37 0.28 0.30 0.44 0.40 0.65 0.56
NM_181803 UBE2C ubiquitin-conjugating enzyme E2C 0.37 0.63 0.13 0.39 0.34 0.46 0.25 0.65 0.27
유사분열의 조절( regulation of mitosis )
NM_003318 TTK TTK protein kinase 0.27 0.55 0.07 0.34 0.17 0.30 0.20 0.49 0.22
NM_016343 CENPF centromere protein F, 350/400ka (mitosin) 0.30 0.57 0.08 0.23 0.14 0.40 0.15 0.54 0.28
NM_014750 DLG7 discs, large homolog 7 (Drosophila) 0.28 0.52 0.08 0.33 0.22 0.58 0.20 0.52 0.24
NM_001790 CDC25C cell division cycle 25 homolog C (S. pombe) 0.36 0.59 0.09 0.28 0.40 0.46 0.41 0.64 0.29
NM_002358 MAD2L1 MAD2 mitotic arrest deficient-like 1 (yeast) 0.22 0.51 0.08 0.29 0.21 0.34 0.17 0.50 0.29
신호전달( signal transduction )
NM_002128 HMGB1 high-mobility group box 1 0.43 0.66 0.30 0.60 0.41 0.60 0.46 0.50 0.47
NM_148957 TNFRSF19 tumor necrosis factor receptor superfamily, member 19 0.47 0.46 0.30 0.16 0.16 0.45 0.48 0.42 0.29
NM_001067 TOP2A topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa 0.29 0.49 0.08 0.21 0.14 0.45 0.22 0.56 0.22
NM_002129 HMGB2 high-mobility group box 2 0.22 0.46 0.14 0.26 0.24 0.29 0.14 0.34 0.40
NM_013277 RACGAP1 Rac GTPase activating protein 1 0.28 0.66 0.17 0.63 0.54 0.55 0.23 0.47 0.32
NM_024087 ASB9 ankyrin repeat and SOCS box-containing 9 0.47 0.44 0.33 0.33 0.25 0.42 0.36 0.46 0.26
NM_023110 FGFR1 fibroblast growth factor receptor 1 (fms-related tyrosine kinase 2, Pfeiffer syndrome) 0.35 0.61 0.44 0.50 0.59 0.39 0.44 0.43 0.58
NM_005271 GLUD1 glutamate dehydrogenase 1 0.44 0.53 0.24 0.26 0.40 0.29 0.36 0.64 0.41
DNA 복구( DNA repair )
NM_000251 MSH2 mutS homolog 2, colon cancer, nonpolyposis type 1 (E. coli) 0.63 0.54 0.52 0.51 0.28 0.58 0.53 0.64 0.59
전사 조절( transcription regulation )
NM_002128 HMGB1 high-mobility group box 1 0.43 0.66 0.30 0.60 0.41 0.60 0.46 0.50 0.47
NM_002129 HMGB2 high-mobility group box 2 0.22 0.46 0.14 0.26 0.24 0.29 0.14 0.34 0.40
NM_002729 HHEX hematopoietically expressed homeobox 0.61 0.65 0.37 0.53 0.55 0.60 0.56 0.42 0.51
NM_013282 UHRF1 ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1 0.18 0.31 0.14 0.18 0.24 0.17 0.13 0.31 0.57
AK025758 　 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 2 0.47 0.44 0.35 0.20 0.28 0.45 0.20 0.28 0.60
면역반응( Immune response )
NM_000204 CFI complement factor I 0.62 0.48 0.30 0.19 0.29 0.44 0.50 0.61 0.32
NM_000715 C4BPA complement component 4 binding protein, alpha 0.35 0.40 0.29 0.20 0.25 0.44 0.23 0.55 0.61
* 3MC : 3-메틸콜란트렌
BaA : 벤조에이안트라센
BaP : 벤조에이파이렌
BkF : 벤조케이플루오란텐
IND : 인데노(1,2,3-c,d)파이렌
Chry : 크라이센
DBA : 다이벤조에이에이취안트라센
NP : 나프탈렌
Phen : 페난트렌
<실시예 3> 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction) 정량
다환 방향족 탄화수소류에 노출에 의해 발현 유도된 상기 실시예 2의 공통으로 과발현되는 유전자 5종과 공통으로 저발현 되는 유전자 2종을 선별하였다. 이들 유전자들은 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014624(S100A6,S100 calcium binding protein A6), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004073(PLK3,polo-like kinase 3 (Drosophila)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001924(GADD45A,growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002754(MAPK13,mitogen-activated protein kinase 13), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014059(C13orf15,chromosome 13 open reading frame 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_018492(PBK,PDZ binding kinase) 및 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004701(CCNB2,cyclin B2) 등이다.
상기 유전자들의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 상기 유전자들의 mRNA를 특이적으로 발현할 수 있는 프라이머를 제작하여(표 4), My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR)(Bio-rad, USA)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다.
구체적으로, 올리고 dT 프라이머와 Superscript kit(Omniscipt™ kit, Qiagen, Co., USA)를 이용하여 역전사반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. PCR 산물을 정량하기 위하여 사이버그린(SYBR Green) I 염색(Bio-rad, USA)으로 염색하였다. 사이버그린 I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저 PCR에 이용한 표적 유전자와 내재성(endogenous) 대조군(GAPDH)에 대한 프라이머를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 각각의 프라이머(표 4)를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다.
등록번호 유전자명 PCR 프라이머 서열
(5'->3')
NM_014624 S100A6, S100 calcium binding protein A6 센스 TGATCCAGAAGGAGCTCACCATTG
(서열번호 1)
안티센스 TGTTCCGGTCCAAGTCTTCCATCA
(서열번호 2)
NM_004073 PLK3, polo-like kinase 3 (Drosophila) 센스 GACTACTCCAATAAGTTCGGCTTTG
(서열번호 3)
안티센스 CATATGTGTGCCATCGTTGAAGA
(서열번호 4)
NM_001924 GADD45A, growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha 센스 TCAGCGCACGATCACTGTC
(서열번호 5)
안티센스 CCAGCAGGCACAACACCAC
(서열번호 6)
NM_002754 MAPK13, mitogen-activated protein kinase 13 센스 AGACACTGCCCAAGGACCAGTATT
(서열번호 7)
안티센스 AGGCCCATTTCCCACATAAGGAGA
(서열번호 8)
NM_014059 C13orf15, chromosome 13 open reading frame 15 센스 TCAGAAAGTTCCGAGGACCTGCTA
(서열번호 9)
안티센스 ATTGCCCAGAAATGGGATCAAGGG
(서열번호 10)
NM_018492 PBK, PDZ binding kinase 센스 TCTGGACTGAGAGTGGCTTTCACA
(서열번호 11)
안티센스 AGCCAAGCTTCTGCATAAACGGAG
(서열번호 12)
NM_004701 CCNB2, cyclin B2 센스 AGACTCTGTACATGTGCGTTGGCA
(서열번호 13)
안티센스 TTGGAAGCCAAGAGCAGAGCAGTA
(서열번호 14)
실시간 정량 PCR 결과
등록번호 유전자명 실시간 PCR cDNA 마이크로어레이
(상대적 배율) (Cy3/Cy5 비율)
NM_014624 S100A6, S100 calcium binding protein A6 3MC 9.39 3MC 3.56
BaA 4.08 BaA 1.729
BaP 1.99 BaP 7.625
BkF 2.18 BkF 3.086
IND 0.51 IND 2.779
Chry 4.16 Chry 5.933
DBA 5.44 DBA 4.169
NP 14.59 NP 1.835
Phen 6.06 Phen 4.455
NM_004073 PLK3, polo-like kinase 3 (Drosophila) 3MC 3.51 3MC 2.28
BaA 3.13 BaA 2.762
BaP 2.00 BaP 6.576
BkF 3.36 BkF 5.24
IND 1.3 IND 3.861
Chry 9.23 Chry 5.343
DBA 2.36 DBA 3.065
NP 3.26 NP 2.508
Phen 6.68 Phen 6.214
NM_001924 GADD45A, growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha 3MC 2.31 3MC 1.92
BaA 41.21 BaA 1.632
BaP 4.99 BaP 2.752
BkF 1.10 BkF 2.698
IND 0.66 IND 1.739
Chry 4.52 Chry 2.784
DBA 1.81 DBA 2.25
NP 1.70 NP 1.639
Phen 1.91 Phen 1.591
NM_002754 MAPK13, mitogen-activated protein kinase 13 3MC 2.27 3MC 1.855
BaA 4.37 BaA 1.873
BaP 7.87 BaP 3.484
BkF 3.88 BkF 1.515
IND 3.02 IND 2.196
Chry 4.79 Chry 2.127
DBA 2.43 DBA 2.247
NP 2.45 NP 2.397
Phen 3.51 Phen 2.853
NM_014059 C13orf15, chromosome 13 open reading frame 15 3MC 3.78 3MC 1.916
BaA 2.70 BaA 4.713
BaP 23.32 BaP 4.399
BkF 39.90 BkF 25.66
IND 6.22 IND 9.318
Chry 3.39 Chry 3.353
DBA 7.80 DBA 2.484
NP 4.88 NP 1.999
Phen 4.48 Phen 2.426
NM_018492 PBK, PDZ binding kinase 3MC 0.10 3MC 0.161
BaA 0.69 BaA 0.434
BaP 0.04 BaP 0.0492
BkF 0.16 BkF 0.218
IND 0.13 IND 0.187
Chry 0.21 Chry 0.283
DBA 0.10 DBA 0.0796
NP 0.59 NP 0.465
Phen 0.23 Phen 0.25
NM_004701 CCNB2, cyclin B2 3MC 0.15 3MC 0.358
BaA 0.74 BaA 0.623
BaP 0.42 BaP 0.104
BkF 0.09 BkF 0.241
IND 0.05 IND 0.317
Chry 0.19 Chry 0.432
DBA 0.06 DBA 0.338
NP 0.04 NP 0.548
Phen 0.14 Phen 0.272
그 결과, 표 5에서 나타난 바와 같이 5종의 공통으로 과발현 유전자들 및 2종의 공통으로 저발현 유전자의 유전자 발현 양상은 다환 방향족 탄화수소류에 의한 유전자 발현을 조사한 올리고 마이크로어레이 결과와 매우 유사하게 나타남을 확인하였다.
도 1은 9종의 다환 방향족 탄화수소류[벤조에이파이렌, 다이벤조에이에이취안트라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐, 인데노(1,2,3-c,d)파이렌]의 인간 간암 세포인 HepG2 세포주에서의 세포 독성을 조사한 그래프이다.
도 2는 마이크로어레이 칩을 이용한 다환 방향족 탄화수소류를 처리한 인간 간암 세포주의 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 9종의 다환 방향족 탄화수소류에 의해 공통적으로 발현 변화하는 유전자의 개수를 도식화한 도면이다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Biomarker for identification of exoposure to Polycyclic Aromatic Hydrocarbo and the method of identification using thereof <130> 8P-07-29 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A6 sense primer <400> 1 tgatccagaa ggagctcacc attg 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A6 antisense primer <400> 2 tgttccggtc caagtcttcc atca 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLK3 sense primer <400> 3 gactactcca ataagttcgg ctttg 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLK3 antisense primer <400> 4 catatgtgtg ccatcgttga aga 23 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GADD45A sense primer <400> 5 tcagcgcacg atcactgtc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GADD45A antisense primer <400> 6 ccagcaggca caacaccac 19 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAPK13 sense primer <400> 7 agacactgcc caaggaccag tatt 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAPK13 antisense primer <400> 8 aggcccattt cccacataag gaga 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C13orf15 sense primer <400> 9 tcagaaagtt ccgaggacct gcta 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C13orf15 antisense primer <400> 10 attgcccaga aatgggatca aggg 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PBK sense primer <400> 11 tctggactga gagtggcttt caca 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PBK antisense primer <400> 12 agccaagctt ctgcataaac ggag 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCNB2 sense primer <400> 13 agactctgta catgtgcgtt ggca 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCNB2 antisense primer <400> 14 ttggaagcca agagcagagc agta 24

Claims (22)

  1. 하기의 모든 유전자의 핵산서열의 전부 또는 그의 상보가닥 분자로 구성되는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩:
    유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003900(SQSTM1,sequestosome 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002305(LGALS1,lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003897(IER3, immediate early response 3), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003311(PHLDA2,pleckstrin homology-like domain, family A, member 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_147780(CTSB,cathepsin B), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001007271(DUSP13,dual specificity phosphatase 13), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014624(S100A6,S100 calcium binding protein A6), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004073(PLK3,polo-like kinase 3 (Drosophila)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001924(GADD45A,growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002754(MAPK13,mitogen-activated protein kinase 13), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014059(C13orf15,chromosome 13 open reading frame 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_025106(SPSB1,splA/ryanodine receptor domain and SOCS box containing 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004864(GDF15,growth differentiation factor 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_005620(S100A11,S100 calcium binding protein A11), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_175744(RHOC,ras homolog gene family, member C), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003330(TXNRD1,thioredoxin reductase 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003900(SQSTM1,sequestosome 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001012631(IL32,interleukin 32), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001421(ELF4, E74-like factor 4 (ets domain transcription factor)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004925(AQP3,aquaporin 3 (Gill blood group)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_198447(GOLT1A,golgi transport 1 homolog A (S. cerevisiae)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004695(SLC16A5,solute carrier family 16, member 5 (monocarboxylic acid transporter 6)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000499(CYP1A1,cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_022346(NCAPG,non-SMC condensin I complex, subunit G), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_018492(PBK,PDZ binding kinase), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_020242(KIF15,kinesin family member 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004701(CCNB2,cyclin B2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_080668(CDCA5,cell division cycle associated 5), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_006101(NDC80,NDC80 homolog, kinetochore complex component (S. cerevisiae)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_138555(KIF23,kinesin family member 23), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004523(KIF11,kinesin family member 11), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_181803(UBE2C,ubiquitin-conjugating enzyme E2C), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003318(TTK,TTK protein kinase), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_016343(CENPF,centromere protein F, 350/400ka (mitosin)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014750(DLG7,discs, large homolog 7 (Drosophila)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001790(CDC25C,cell division cycle 25 homolog C (S. pombe)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002358(MAD2L1,MAD2 mitotic arrest deficient-like 1 (yeast)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002128(HMGB1,high-mobility group box 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_148957(TNFRSF19,tumor necrosis factor receptor superfamily, member 19), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001067(TOP2A,topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002129(HMGB2,high-mobility group box 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_013277(RACGAP1,Rac GTPase activating protein 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_024087(ASB9,ankyrin repeat and SOCS box-containing 9), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_023110(FGFR1,fibroblast growth factor receptor 1 (fms-related tyrosine kinase 2, Pfeiffer syndrome)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_005271(GLUD1,glutamate dehydrogenase 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000251(MSH2,mutS homolog 2, colon cancer, nonpolyposis type 1 (E. coli)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002128(HMGB1,high-mobility group box 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002129(HMGB2,high-mobility group box 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002729(HHEX,hematopoietically expressed homeobox), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_013282(UHRF1,ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) AK025758(Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000204(CFI,complement factor I) 및 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000715(C4BPA,complement component 4 binding protein, alpha).
  2. 제 1항에 있어서, 하기 유전자가 다환 방향족 탄화수소류의 노출에 의해 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 DNA 마이크로어레이 칩:
    유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003900(SQSTM1,sequestosome 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002305(LGALS1,lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003897(IER3, immediate early response 3), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003311(PHLDA2,pleckstrin homology-like domain, family A, member 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_147780(CTSB,cathepsin B), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001007271(DUSP13,dual specificity phosphatase 13), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014624(S100A6,S100 calcium binding protein A6), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004073(PLK3,polo-like kinase 3 (Drosophila)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001924(GADD45A,growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002754(MAPK13,mitogen-activated protein kinase 13), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014059(C13orf15,chromosome 13 open reading frame 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_025106(SPSB1,splA/ryanodine receptor domain and SOCS box containing 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004864(GDF15,growth differentiation factor 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_005620(S100A11,S100 calcium binding protein A11), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_175744(RHOC,ras homolog gene family, member C), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003330(TXNRD1,thioredoxin reductase 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003900(SQSTM1,sequestosome 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001012631(IL32,interleukin 32), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001421(ELF4, E74-like factor 4 (ets domain transcription factor)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004925(AQP3,aquaporin 3 (Gill blood group)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_198447(GOLT1A,golgi transport 1 homolog A (S. cerevisiae)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004695(SLC16A5,solute carrier family 16, member 5 (monocarboxylic acid transporter 6)) 및 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000499(CYP1A1,cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1).
  3. 제 1항에 있어서, 하기 유전자가 다환 방향족 탄화수소류의 노출에 의해 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 DNA 마이크로어레이 칩:
    유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_022346(NCAPG,non-SMC condensin I complex, subunit G), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_018492(PBK,PDZ binding kinase), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_020242(KIF15,kinesin family member 15), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004701(CCNB2,cyclin B2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_080668(CDCA5,cell division cycle associated 5), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_006101(NDC80,NDC80 homolog, kinetochore complex component (S. cerevisiae)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_138555(KIF23,kinesin family member 23), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_004523(KIF11,kinesin family member 11), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_181803(UBE2C,ubiquitin-conjugating enzyme E2C), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_003318(TTK,TTK protein kinase), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_016343(CENPF,centromere protein F, 350/400ka (mitosin)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_014750(DLG7,discs, large homolog 7 (Drosophila)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001790(CDC25C,cell division cycle 25 homolog C (S. pombe)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002358(MAD2L1,MAD2 mitotic arrest deficient-like 1 (yeast)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002128(HMGB1,high-mobility group box 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_148957(TNFRSF19,tumor necrosis factor receptor superfamily, member 19), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_001067(TOP2A,topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002129(HMGB2,high-mobility group box 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_013277(RACGAP1,Rac GTPase activating protein 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_024087(ASB9,ankyrin repeat and SOCS box-containing 9), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_023110(FGFR1,fibroblast growth factor receptor 1 (fms-related tyrosine kinase 2, Pfeiffer syndrome)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_005271(GLUD1,glutamate dehydrogenase 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000251(MSH2,mutS homolog 2, colon cancer, nonpolyposis type 1 (E. coli)), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002128(HMGB1,high-mobility group box 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002129(HMGB2,high-mobility group box 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_002729(HHEX,hematopoietically expressed homeobox), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_013282(UHRF1,ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) AK025758(Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 2), 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000204(CFI,complement factor I) 및 유전자 등록번호(Genebank Accession no.) NM_000715(C4BPA,complement component 4 binding protein, alpha).
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 다환 방향족 탄화수소류는 벤조에이파이렌, 다이벤조에이에이취안트라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 마이크로어레이 칩.
  7. 1) 실험군인 피검체 유래 인간 체세포와 대조군 체세포에서 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
    3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화 시키는 단계;
    4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
    5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 구성하는 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 구성하는 유전자를 검출하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 다환 방향족 탄화수소류는 벤조에이파이렌, 다이벤조에이에이취안트라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 구성하는 유전자를 검출하는 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간의 간 또는 간암의 세포 및 조직에서 유래한 세포인 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 구성하는 유전자를 검출하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 인간 간암 세포는 HepG2인 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 구성하는 유전자를 검출하는 방법.
  11. 제 7항에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 구성하는 유전자를 검출하는 방법.
  12. 1) 실험군인 피검체 유래 인간 체세포와 대조군 체세포에서 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 RNA를 대상으로, 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 구성하는 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 구성하는 유전자를 검출하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 다환 방향족 탄화수소류는 벤조에이파이렌, 다이벤조에이에이취안트라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 구성하는 유전자를 검출하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 단계 1)의 인간 체세포는 간 또는 간암의 세포 및 조직에서 유래한 세포인 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 구성하는 유전자를 검출하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 인간 간암 세포는 HepG2인 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 구성하는 유전자를 검출하는 방법.
  16. 제 12항에 있어서, 단계 2)의 프라이머쌍은 하기 프라이머쌍 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부를 확인하기 위해 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 구성하는 유전자를 검출하는 방법:
    프라이머쌍 1 - 서열번호 1로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 2로 기재된 안티센스 프라이머;
    프라이머쌍 2 - 서열번호 3으로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 4로 기재된 안티센스 프라이머;
    프라이머쌍 3 - 서열번호 5로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 6으로 기재된 안티센스 프라이머;
    프라이머쌍 4 - 서열번호 7로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 8으로 기재된 안티센스 프라이머;
    프라이머쌍 5 - 서열번호 9로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 10으로 기재된 안티센스 프라이머;
    프라이머쌍 6 - 서열번호 11로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 12로 기재된 안티센스 프라이머; 및,
    프라이머쌍 7 - 서열번호 13으로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 14로 기재된 안티센스 프라이머.
  17. 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 키트.
  18. 제 17항에 있어서, 다환 방향족 탄화수소류는 벤조에이파이렌, 다이벤조에이에이취안트라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 키트.
  19. 제 17항에 있어서, 인간 간 세포 또는 간암 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 키트.
  20. 제 1항의 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 구성하는 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 키트.
  21. 제 20항에 있어서, 다환 방향족 탄화수소류는 벤조에이파이렌, 다이벤조에이에이취안트라센, 크라이센, 페난트렌, 나프탈렌, 3-메틸콜란트렌, 벤조에이안트라센, 벤조케이플루오란텐 및 인데노(1,2,3-c,d)파이렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 키 트.
  22. 제 20항에 있어서, 프라이머쌍은 하기 프라이머쌍 1 내지 7로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소류에 대한 노출 여부 확인용 키트:
    프라이머쌍 1 - 서열번호 1로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 2로 기재된 안티센스 프라이머;
    프라이머쌍 2 - 서열번호 3으로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 4로 기재된 안티센스 프라이머;
    프라이머쌍 3 - 서열번호 5로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 6으로 기재된 안티센스 프라이머;
    프라이머쌍 4 - 서열번호 7로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 8으로 기재된 안티센스 프라이머;
    프라이머쌍 5 - 서열번호 9로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 10으로 기재된 안티센스 프라이머;
    프라이머쌍 6 - 서열번호 11로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 12로 기재된 안티센스 프라이머; 및,
    프라이머쌍 7 - 서열번호 13으로 기재된 센스 프라이머 및 서열번호 14로 기재된 안티센스 프라이머.
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