CN113960220B - 血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法及其应用，该方法包括如下步骤：选取同一份血液样品中存在相关性的血液中多环芳烃及其衍生物作为目标检测物，进行同步提取、检测、分析，其包括如下步骤：S1：建立PAHs与SPAHs关系分析数学模型，筛选与PAHs具有较强相关性的SPAHs，并将筛选出的SPAHs、PAHs作为目标检测物；S2：目标检测物的提取；S3：样品的净化与分离；S4：样品的浓缩与检测：上机分析，得到检测目标物PAHs和SPAHs的多种组分的含量数据。该方法的应用，是将检测得到的血液样本中的PAHs和SPAHs含量数据与关系一起应用于评估环境中普遍存在的两类污染物在人群或个体中的暴露特征，提高了检测效果及特异性并扩展了检测数据的应用范围。

Description

血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法及应用
技术领域
本发明属于有机污染物检测及人体暴露风险评估技术领域，具体涉及一种血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法及应用。
背景技术
多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs)是一类普遍存在于环境的有机污染物，其来源主要分为自然源和人为源。人为源包括由煤炭、石油、木材等有机物质的不完全燃烧；自然源主要包括森林等引起的火灾、火山活动的喷发物等。有研究证明，PAHs对人体有“三致”作用（致癌、致畸、致突变）。多环芳烃在环境中能长时间稳定，具有长距离迁移能力，且可通过呼吸道、皮肤、消化道等等多种途径进入人体中，危害人体健康。多环芳烃衍生物(Substituted polycyclic aromatic hydrocarbons，SPAHs)是一类通过硝基、甲基等取代的多环芳烃的衍生物，不少多环芳烃衍生物潜在诱变和致癌的环境风险。大气中的多环芳烃，在有高浓度的光化学氧化剂与二氧化氮、硝酸并存时，会发生硝化反应而生成NPAHs、OPAHs等物质。SPAHs能随着呼吸、皮肤接触、进食等方式进入人体肺部和血液中，对人体造成相当大的危害。
现有技术中，对PAHs、SPAHs的暴露水平通常采用两种方式加以评估：1）测定环境中PAHs和SPAHs浓度；2）测定PAHs和SPAHs在人体血液中的浓度。目前，针对PAHs、SPAHs等环境化学污染物的人体暴露，主要通过分析其在空气、水、土壤等环境样品的浓度，结合暴露模型间接加以评估。该方法采样简单，易于开展，技术较为成熟。然而，由于人体暴露PAHs和SPAHs的途径复杂多样，同时又受个体差异的影响，依据环境PAHs、SPAHs浓度，借助暴露模型进行评估，无法外推到人体内实际暴露剂量，难以准确反映人体的内暴露负荷水平，而直接检测血液中PAHs和SPAHs浓度，可以避免个体差异、暴露途径等影响，直接反映人体的内暴露情况。
目前，多环芳烃、多环芳烃衍生物如硝基多环芳烃的检测方法，多为单独检测多环芳烃、硝基多环芳烃，并且大多以在空气、水、土壤等介质中的样品为检测物，如中国发明专利文献CN 111007192A，公开了一种土壤中硝基多环芳烃及多环芳烃的检测方法，其采用高效液相色谱-荧光检测器联用，同时测定3种多环芳烃和1种硝基多环芳烃，但是其必须对样品进行净化与衍生处理，而且未就多环芳烃和硝基多环芳烃的关系进行研究；中国发明专利文献CN106885852A，公开了一种用于硝基多环芳烃的双功能整体柱的制备及高效液相色谱联用方法，在其采用管内整体柱还原-管内固相微萃取-高效液相色谱分离-激光诱导荧光检测方法中，也必须对待测样品进行还原，然后再使用激光诱导荧光检测器对分离后的还原产物样品进行检测。显然，上述两种方法，均存在着样品处理、检测及分析步骤操作繁琐、用时长、消耗溶剂多等不足，同时其样品基质中的杂质较少，也无法将其应用于血液等杂质多且复杂的样品处理。
由于多环芳烃与多环芳烃衍生物属于极性差别较大的两类物质，且多环芳烃衍生物在环境中存在的浓度较低，同时对多环芳烃与多环芳烃衍生物进行处理，存在一定的技术难点，目前还未发现能够实现对同一血液样品中PAHs及其衍生物SPAHs同步检测的报道，以及对于同一血液样品中两类污染物进行分析的报道。但是，获取并分析同一血液样品中的PAHs和SPAHs的浓度数据，才能准确的评估其对人体真实的健康暴露风险情况，进而为制定保护暴露人群的策略提供准确的数据支持。
因此，针对现有技术处理过程用时长、溶剂消耗多、处理成本和分析时间多、无法解决同步获取并分析同一血液样品中的PAHs和SPAHs的浓度数据等不足和缺点，本发明将PAHs和SPAHs作为污染物暴露标志物进行同步检测和分析，不仅有效解决了预处理过程繁琐、复杂的过程，更重要的同时检测多种暴露污染物种类，降低了独立检测形成的系统误差，得到更加精准的结果，从而更准确的判断和评估人体暴露水平，为暴露人员采取精准的健康防护措施提供更精准的数据支撑。
发明内容
本发明提供一种血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法及应用，针对现有技术存在的不足和缺点，结合PAHs、SPAHs在血液中的存续和代谢特点，优化样品处理、检测及分析的步骤，无需对样品进行衍生或还原，将PAHs和SPAHs作为污染物暴露标志物进行同步检测，然后分析和揭示同一样品（同一批次样品）中的PAHs和SPAHs的关系，一方面可有效解决现有技术预处理过程繁琐、复杂的过程，大幅提升了可同步处理、检测与分析的暴露污染物的种类，降低了独立检测形成的系统误差，得到更加精准的结果；另一方面通过属性建模，提高对人体健康暴露风险水平判断和评估的准确性，为暴露人员采取精准的健康防护措施提供更精准的数据支撑。
本发明为实现上述目的，而提供的技术方案为：
一种血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法，其特征在于，选取同一份血液样品中存在相关性的血液中多环芳烃及其衍生物作为目标检测物，进行同步提取、检测、分析，其包括如下步骤：
S1：建立数学模型，在从迄今已发现的200多种多环芳烃及众多多环芳烃衍生物中，选择对人体危害大，相互之间具有相关性的组分作为目标检测物：
建立PAHs与SPAHs关系分析模型：y=ax+b（公式1），其中，x为PAHs的浓度，y为SPAHs的浓度，a为系数、-1≤a≤1，b为常数，系数a和常数b在使用SPSS进行回归分析时通过计算获得；自动生成（该系数a、b会代入数据的变化而自动进行调整），选取《优先控制化学品名录》中记录的人体危害大的多环芳烃PAHs作为筛选目标范围，使用公式1及回归分析的方法，分析PAHs和SPAHs中各具体组分的相关性，得到线性相关系数R2，然后将其中R2≥0.3、与PAHs具有较强相关性的SPAHs组分作为目标检测物；
S2：目标检测物的提取：取血液样品中的1 mL血清加入50 mL特氟龙管中；加入内标，然后向其中加入1.5 mL乙醇和0.5 mL甲酸，混匀并静置15 min，然后加入5 mL 的正己烷与二氯甲烷的混合液，二者的体积比为1:1；在1800 rpm下、涡旋混匀2 min；超声萃取10min，萃取结束后，于离心机中3500 rpm离心10 min，取上清液于15 mL玻璃离心管，按上述步骤重复萃取3次，依次萃取容量为5 mL 、5 mL 、3 mL，合并上清液；
S3：样品的净化与分离：将上述合并后的上清液，在缓慢氮气流中吹干，加入1 mL正己烷与二氯甲烷的混合液复溶，二者的体积比为5:1；依次采用6 mL丙酮和6 mL正己烷活化硅胶SPE小柱；然后将复溶的样品加载至小柱上，依次采用正己烷、二氯甲烷和丙酮洗脱；
S4：样品的浓缩与检测：将上述含PAHs和SPAHs的洗脱液氮吹至近干，加入回收率指示物，并用异辛烷定溶至200μL，PAHs和SPAHs分别采用GC-MS/MS和GC-MS上机分析，得到检测目标物PAHs和SPAHs的多种组分的含量数据。
一种前述血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法的应用，其特征在于，将检测得到的多个血液样本中的两类目标检测物PAHs和SPAHs的含量数据，验证相互之间的关系，对血液中PAHs、SPAHs进行同步检测，将该数据与关系一起应用于评估环境中普遍存在的两类污染物在人群中的暴露特征，其具体包括如下步骤：
（1）采样对象信息收集：收集采样对象的基础信息，包括收集20名职业工人的暴露影响因素，包括年龄、性别、岗位、作业时间（入职时间）等基本信息；
（2）数据分类：把年龄、性别、岗位、作业时间分为连续变量和分类变量，其中性别、岗位属于分类变量，年龄、作业时间属于连续变量，将岗位（分类变量）分为暴露组和对照组，将PAHs、SPAHs的数据则作为因变量，并相应归类；
（3）差异性分析：采用SPSS分析软件，把暴露组与对照组PAHs、SPAHs检测数据进行差异性分析，得出两种目标检测物之间的差异性，得到P值；
（4）结果判定：当P＜0.05时，表示暴露特征差异显著，存在显著性；当P＞0.05时，无显著性，表示暴露特征无统计学差异。
本发明提供的血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法及应用，与现有技术相比，其有益效果为：
1、本发明提供的血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法及应用，是结合PAHs、SPAHs在血液中的存续和代谢特点，优化样品处理、检测及分析的步骤，无需对样品进行衍生或还原，将存在相关性PAHs和SPAHs作为污染物暴露标志物进行同步检测，然后分析和揭示同一样品（同一批次样品）中的PAHs和SPAHs具体组分之间的关系，一方面可有效解决现有技术预处理过程繁琐、复杂的过程，大幅提升了可同步处理、检测与分析的暴露污染物的种类，降低了独立检测形成的系统误差，得到更加精准的结果；另一方面通过数学建模、筛选目标检测物，减少目标检测物的数量，减少了数据整理与分析的工作量，提高对人体健康暴露风险水平判断和评估的准确性，缩短了检测和分析时间，提高了工作效率，并为暴露人员采取精准的健康防护措施提供更精准的数据支撑。
2、本发明提供的血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法及应用，通过分析和揭示同一血液样品（及同一批次血液样品）中的PAHs和SPAHs具体组分之间的关系，对PAHs、SPAHs相互关系进行了数学建模；通过该分析模型，可以大幅减少目标检测物的组分数量，并且能够实现根据其中一类目标检测物的检测数据，准确地计算、获得另一类目标检测物的数据，从而为健康风险暴露分析提供完整的数据，并为进一步简化目标检测物的数量，提高检测和分析效率、准确性，提供了新的途径。
3、本发明提供的血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法及应用，克服了现有检测技术的诸多不足，特别是针对采用现有的检测方法做了针对性的改进，所采用的样品预处理、检测仪器及检测方法、分析方法均不存在相同，方便、快捷、节省溶剂，并能够同步提取、检测和分析同一（批次）血液样品中多环芳烃、多环芳烃衍生物，而无需对样品进行还原或衍生化处理。现有技术中，必须先对多环芳烃衍生物进行衍生化，此方法处理后的样品组分发生了一定的变化，容易对实验数据形成干扰，而本发明则不需要此步骤。
4、本发明在样品的目标物净化、分离步骤中的固相萃取柱，采用硅胶SPE小柱（1g,6 mL），在节省溶剂的同时，还有效去除了血液中的基质干扰，使得所有目标化合物最终回收率介于60~120%之间，大大提高了定量分析的准确性。
5、本发明所提供的萃取方法，可大幅节省溶剂，采用正己烷:二氯甲烷（1:1, v/v）超声重复萃取3次，可实现对PAHs、SPAHs多种组分的同步提取，省时、便捷、回收率高，而且可以有效排除血液中杂质的干扰，检测准确性提升显著。
6、本发明通过对多个步骤和方法的改进，采用常规的检测设备（无需另外采用荧光检测器），即可大幅提升可同步检测目标物组分的种类，并使所有目标检测物的方法准确度和精度均可保持一致。本发明能够一次性同步提取血液中20种及以上多环芳烃（PAHs）组分、16种及以上多环芳烃衍生物（SPAHs）组分，可以避免分别提取的繁琐过程，有效简化了实验步骤，大幅提高了样品前处理及检测、分析的效率。
7、本发明是基于血液中PAHs及其代谢物SPAHs的特点，同时将其作为损伤标志物，将血液中存在关联关系的PAHs及其代谢物SPAHs的多种组分同时纳入检测范围，进行同步分析、检测，所得到的数据，对于全面评估环境中普遍存在的两类污染物在人群中的暴露特征及其对人体健康产生的影响具有重要意义。
8、本发明通过对血液样品中的PAHs及其代谢物SPAHs中的检测数据及相关性分析模型（差异性、相关性），可以将其应用于对群体及单个个体的职业病临床筛查、流行病学调查等，并可以进一步应用于流行性或职业疾病的诱发因素分析，对因污染物诱发的特定疾病（特别是职业病）的人群及个体诱发影响因素等进行流行病学分析，因此具有广阔的医学应用前景，扩展了该检测数据及健康暴露风险评估结果的应用范围。
附图说明
图1是本发明实施例的血液样品前处理的流程图。
图2是本发明实施例的GC-MS/MS分析PAHs色谱图。
图3是本发明实施例的GC-MS分析SPAHs的色谱图。
图4是本发明实施例血液基质低浓度（LL）和高浓度（HL）加标样品中目标化合物的内标回收率柱状图。
下面结合附图和实施例，对本发明进行详细说明。
具体实施方式
实施例1：
请参见附图1-4，本实施例提供的血液中多环芳烃PAHs及其衍生物SPAHs的同步检测方法及应用，具体以某炼焦企业年龄介于20至50岁之间的20名职业工人（10名办公室人员、10名车间工人）的静脉血样品为例，对本发明血液中PAHs和SPAHs同步检测及在群体分析的应用进行具体描述。
本实施例提供的血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法，是选取同一份血液样品中存在相关性的血液中多环芳烃及其衍生物作为目标检测物，进行同步提取、检测、分析，其包括如下步骤：
S1：建立数学模型，在从迄今已发现的200多种多环芳烃及众多多环芳烃衍生物中，选择对人体危害大，相互之间具有相关性的组分作为目标检测物：
建立PAHs与SPAHs关系分析模型：y=ax+b（公式1），其中，x为PAHs的浓度，y为SPAHs的浓度，a为系数、-1≤a≤1，b为常数，系数a和常数b在使用SPSS进行回归分析时通过计算获得；自动生成（该系数a、b会代入数据的变化而自动进行调整），选取《优先控制化学品名录》中记录的人体危害大的多环芳烃PAHs作为筛选目标范围，使用公式1及回归分析的方法，分析PAHs和SPAHs中各具体组分的相关性，得到线性相关系数R2，然后将其中R2≥0.3、与PAHs具有较强相关性的SPAHs组分作为目标检测物；
本实施例经过步骤S1的筛选，所确定的目标检测物的具体组分为：
PAHs为：萘、联苯、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘（嵌二萘 ）、苯并[a]蒽、屈(稠二萘)、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[e]芘、苯并[a]芘、苝、9,10-二苯基蒽、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝；
SPAHs为：1,4-萘醌、1-苊酮、9-芴酮、2-硝基芴、9-硝基蒽、9-硝基菲、2-硝基二苯并噻吩、3-硝基荧蒽、1-硝基芘、2-硝基芘、1,4-屈醌、6-硝基䓛、3-硝基苯并蒽酮、1,3-二硝基芘、1,6-二硝基芘、1,8-二硝基芘。
具体是根据《优先化学物质名录》的记载，筛选萘、联苯、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘（嵌二萘 ）、苯并[a]蒽、屈(稠二萘)、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[e]芘、苯并[a]芘、苝、9,10-二苯基蒽、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝等20种多环芳烃作为待筛选的目标检测物。同时，依据y=ax+b，其中，x为PAHs的浓度，y为SPAHs的浓度，a为系数、-1≤a≤1，b为常数，分析PAHs与SPAHs组分的关系，得出R2，当R2＞0.3时，两者之间具有较强关系，作为目标检测物。根据计算得到的R2值，本实施例将1,4-萘醌、1-苊酮、9-芴酮、2-硝基芴、9-硝基蒽、9-硝基菲、2-硝基二苯并噻吩、3-硝基荧蒽、1-硝基芘、2-硝基芘、1,4-屈醌、6-硝基䓛、3-硝基苯并蒽酮、1,3-二硝基芘、1,6-二硝基芘、1,8-二硝基芘等组分作为目标检测物。
表1 SPAHs检测指标纳入情况
Figure 860348DEST_PATH_IMAGE001
S2：目标检测物的提取：取血液样品中的1 mL血清加入50 mL特氟龙管中；加入内标指示物，然后向其中加入1.5 mL乙醇和0.5 mL甲酸，混匀并静置15 min，然后加入5 mL体积比为1:1的正己烷与二氯甲烷,1800 rpm 涡旋混匀2 min；在超声萃取10 min、萃取结束后，于离心机中3500 rpm离心10 min，取上清液于10 mL玻璃离心管，按上述步骤重复萃取3次、每次容量分别为5 mL 、5 mL 、3 mL，合并上清液，在缓慢氮气流中吹干，用1 mL体积比为5:1的正己烷与二氯甲烷复溶；
所加入的内标指示物包括：d8-萘，d10-苊，d10-菲，d12-䓛，d12-苝，2-硝基芴-d9，3-硝基荧蒽-d9；
S3：样品的净化与分离：将上述合并后的上清液，在缓慢氮气流中吹干，加入1 mL正己烷与二氯甲烷的混合液复溶，二者的体积比为5:1；依次采用6 mL丙酮和6 mL正己烷活化固相萃取柱（硅胶SPE小柱）；然后将复溶的样品加载至该固相萃取柱上，依次采用正己烷、二氯甲烷和丙酮洗脱；其中的固相萃取柱采用的是硅胶SPE柱小柱，规格为1 g、6 mL；在去除血液中的基质干扰组分同时对所述各目标检测物均有较好的保留，相比于固相萃取自填柱减少了溶剂使用；
S4：样品的浓缩与检测：将上述含PAHs和SPAHs的洗脱液氮吹至近干，加入回收率指示物，并用异辛烷定溶至200μL，PAHs和SPAHs分别采用GC-MS/MS和GC-MS上机分析，得到检测目标物PAHs和SPAHs的多种组分的含量数据；其中的回收率指示物为：d14-对联三苯或6-硝基屈-d11；
S5：重复步骤S2- S4，分别完成同批次多个个体血液样品中PAHs和SPAHs的检测，得到该批次多个血液样品的检测数据，然后汇总、分类，进行群体PAHs和SPAHs的健康暴露特征分析：以暴露与非暴露作为自变量，以PAHs、SPAHs含量数据则作为因变量，采用SPSS分析软件，把自变量与PAHs、SPAHs检测数据进行差异性分析，得出两种目标检测物各组分之间的相关性。
其详细操作的步骤如下：
1. 材料与仪器
1.1 仪器与材料：Agilent 7890B气相色谱仪，GC-MS/MS（7890B-7000D）、GC-MS（7890B-5977A），DB-5MS（30 m x 0.25 mm，0.25 μm，Agilent J&W）及DB-5HT（15ｍx 0.25mm，0.25 μm，Agilent J&W）毛细管色谱柱，水浴锅（智诚分析仪器制造，上海），氮吹仪（柏林河西路，美国)，Milli-Q 超纯水系统（默克，德国），涡旋振荡器（特朗纳，美国），50 mL 特氟龙离心管，15 mL玻璃旋盖离心管（目盛付，日本），短型玻璃巴斯德吸管（上海安谱实验科技，中国），CNW硅胶固相萃取小柱 (1 g, 6 mL)（上海安谱实验科技，中国），称量纸（上海伯奥生物科技，中国）。
1.2 试剂与标准品：色谱纯乙醇、甲酸、正己烷、丙酮（上海安谱实验科技，中国），色谱级二氯甲烷（默克，德国），20种PAHs标准品：萘，联苯，苊烯，苊，芴，菲，蒽，荧蒽，芘（嵌二萘），苯并[a]蒽，屈(稠二萘)，苯并[b]荧蒽，苯并[k]荧蒽，苯并[e]芘，苯并[a]芘，苝，9,10-二苯基蒽，茚并[1,2,3-cd]芘，二苯并[a,h]蒽，苯并[g,h,i]苝（Supelco Bellefonte,PA,USA）及其6种同位素标记物：萘-d8，苊-d10，菲-d10，屈-d12，苝-d12 （SupelcoBellefonte, PA, USA）；对联三苯-d14 (Cambridge Isotope Laboratories, Andover,MA, USA); 16种SPAHs标准品：1,4-萘醌，1-苊酮，9-芴酮，2-硝基芴，9-硝基蒽，9-硝基菲，2-硝基二苯并噻吩，3-硝基荧蒽，1-硝基芘，2-硝基芘，1,4-屈醌，6-硝基䓛，3-硝基苯并蒽酮，1,3-二硝基芘，1,6-二硝基芘，1,8-二硝基芘 (Accustandard Inc., New Haven,USA);以及3种同位素标记物标准品：2-硝基芴-d9，3-硝基荧蒽-d9，6-硝基屈-d11(Accustandard Inc., New Haven, USA); 同位素标准品萘-d8，苊-d10，菲-d10，䓛-d12，苝-d12用作PAHs定量内标，同位素标准品2-硝基芴-d9，3-硝基荧蒽-d9用作SPAHs定量内标。同位素标准品对联三苯-d14用作PAHs回标，6-硝基屈-d11用作SPAHs回标。各目标分析物的基本信息及仪器分析参数详见表2与表3。
表2. 20种PAHs及其同位素标记物的特征离子及保留时间
Figure 856117DEST_PATH_IMAGE002
表3. 16种SPAHs及其同位素标记物的特征离子及保留时间
Figure 104696DEST_PATH_IMAGE003
2. 分析方法
2.1 采集样品及信息
招募某炼焦企业年龄介于20至50岁之间的20名职业工人（10名办公室人员、10名车间工人）为自愿者进行样品采集，所收集血液样本均为静脉血。
2.2 样品的前处理流程
（1）目标物的提取：将采集的血液样品，取1 mL血清加入50 mL特氟龙管中，并向其中加入已知量（萘-d8，苊-d10，菲-d10，屈-d12，苝-d12各40 ng，2-硝基芴-d9，3-硝基荧蒽-d9各20 ng）的内标指示物，然后向其中加入1.5 mL乙醇和0.5 mL甲酸，混匀并静置15 min，然后加入5 mL 正己烷:二氯甲烷（1:1, v/v）,1800 rpm 涡旋混匀2 min。超声萃取10 min，萃取结束后，于离心机中3500 rpm离心10 min，取上清液于15 mL玻璃离心管，按上述步骤重复萃取3次（5+5+3 mL），合并上清液；
（2）样品的净化与分离：将上述合并后的上清液在缓慢氮气流中吹干，1 mL正己烷:二氯甲烷（5:1，v/v）复溶。依次采用6 mL丙酮和6 mL正己烷活化硅胶SPE柱（1g, 6 mL），然后将复溶的样品加载至小柱上，依次采用正己烷、二氯甲烷和丙酮洗脱；
（3）样品的浓缩与检测：将上述含PAHs和SPAHs的洗脱液氮吹至近干，加入回收率指示物（d14-对联三苯，6-硝基屈-d11各20 ng），并用异辛烷定溶至200 μL，PAHs和SPAHs分别采用GC-MS/MS和GCMS上机检测，分析目标物的含量。完整前处理流程详见图1。
2.3 GC-MS/MS及GC-MS仪器分析方法
PAHs采用气相色谱-三重串联四级杆质谱联用仪（GC-MS/MS）进行分析，采用DB-5MS（30 m x 0.25 mm，0.25 μm，Agilent J&W）毛细管色谱柱实现PAHs的色谱分离，载气为氦气，流速为1.3 mL·min-1，脉冲25 psi, 不分流进样，进样量1 μL；升温程序为：柱温80℃，保持1min，以2℃·min-1升至215℃，保持0 min；以10℃·min-1升至245℃，保持0 min；以8℃·min-1升至300℃，保持4 min。辅助加热区温度280℃，离子源温度230℃，前进样口温度280℃，溶剂延迟2 min，使用MRM采集方式。质谱离子源为EI源。20种PAHs及其6种同位素标记物的总离子流如图2所示。
SPAHs采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）进行分析。采用DB-5HT（15ｍx 0.25 mm，0.25 μm，Agilent J&W）毛细管色谱柱分离SPAHs，载气为氦气，流速为１ml·min-1，脉冲25psi，不分流进样，进样量1μL，甲烷气为反应气。升温程序为：柱温60℃，保持0.5 min，以8℃·min-1升至220℃，保持0 min；以20℃·min-1升至300℃，保持15 min。辅助加热区温度280℃，离子源温度230℃，前进样口温度280℃，溶剂延迟2 min，SIM采集模式。16种SPAHs及其3种同位素标记物的总离子流如图3所示。
2.4 结果与结论
2.4.1 方法验证
本发明通过购买的胎牛血清进行基质加标实验和空白实验验证了该方法的适用性。将血清分成9个等分（每等分取1 mL）；其中3个以低浓度（LL，2 ng）的目标化合物加标，3个以高浓度（HL，10 ng）加标；其余3个重复样品用作非加标对照。另设置三个程序空白样品，以检测实验室背景污染；程序空白和非加标尿液样品中目标化合物的平均浓度用于对加标样品分析结果的校正。通过校准曲线的线性，目标化合物检出限（Limits ofdetection，LODs）、定量限（Limits of quantification，LOQs）以及每个分析物的准确度和精密度，以评估所开发方法的可靠性和适用性，详述如下：
（1）线性分析
根据所分析的目标化合物种类，制备了两条校准曲线：20种PAHs标准混合物（萘，联苯，苊烯，苊，芴，菲，蒽，荧蒽，芘（嵌二萘 ），苯并[a]蒽，屈(稠二萘)，苯并[b]荧蒽，苯并[k]荧蒽，苯并[e]芘，苯并[a]芘，苝，9,10-二苯基蒽，茚并[1,2,3-cd]芘，二苯并[a,h]蒽，苯并[g,h,i]苝）；16种SPAHs标准混合物（1,4-萘醌，1-苊酮，9-芴酮，2-硝基芴，9-硝基蒽，9-硝基菲，2-硝基二苯并噻吩，3-硝基荧蒽，1-硝基芘，2-硝基芘，1,4-屈醌，6-硝基䓛，3-硝基苯并蒽酮，1,3-二硝基芘，1,6-二硝基芘，1,8-二硝基芘）。校准曲线的浓度范围根据尿液样品中的预期浓度分别设置8个数据点。校准曲线均采取线性模型，通过线性相关系数（R2）的值并加以评估。本发明实施例中，筛选出的所有目标检测物之间均具有良好的相关性，R2≥ 0.996。详见表4。
表4. 建立的血清分析方法的验证结果
Figure 827801DEST_PATH_IMAGE004
Figure 720802DEST_PATH_IMAGE005
Figure 12106DEST_PATH_IMAGE006
Figure 607035DEST_PATH_IMAGE007
Figure 881634DEST_PATH_IMAGE008
Figure 878409DEST_PATH_IMAGE009
（2）定量限（LOD）和检出限（LOQ）
LOD根据最低浓度标准曲线点相应化合物的3倍信噪比（S/N=3）进行计算。LOQ设置为程序空白中检测到的目标化合物的平均值加上三倍标准偏差。对于在程序空白中未检出的目标化合物，LOQ设置为最低浓度标准曲线点目标化合物的10信噪比（S/N=10）。本发明实施例中PAHs、SPAHs的LOQ分别为0.754~2.572 ng/mL, 0.162~4.460 ng/mL详见表4。
（3）准确度和精密度
准确度通过血清基质加标样品中各目标化合物的回收率加以评估，即加标样品中各分析物的检测值（通过程序和基质空白样品中的含量进行校正）与实际加标量的百分比。分析方法的精密度（也称为方法的重复性）为可重复条件下三个重复样品的相对标准偏差（RSD）。
总体而言，本发明的验证结果表明，LL和HL组中的分析物均具有良好的准确度和精密度。PAHs及SPAHs的平均准确度范围，低浓度加标（LL）样品中PAHs及SPAHs的准确度分别为70~121％（RSD <15％），71~114％（RSD <10％）；高浓度加标（HL）样品中相应的准确度分别为65~119％（RSD <14％），79~111％（RSD <10％）（见表4）。PAHs及SPAHs的基质加标样品中各自的内标（IS）回收率分别为68 ± 8%至104 ± 5%，65 ± 10%至95 ± 6%，见图4。
本实施例通过对20名职业工人的血液样品的同步检测数据进行整理、汇总、分类，以车间工人为暴露组，以办公室工人为对照组，采用SPSS分析软件，对PAHs、SPAHs的差异性、相关性进行逐项分析，得出P值，见表5和表6。
表5 PAHs暴露情况分析表
Figure 75035DEST_PATH_IMAGE010
表6 SPAHs暴露情况分析表
Figure 907993DEST_PATH_IMAGE011
本发明实施例提供的前述血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法的应用，是将同步检测得到的多个血液样本中的两类目标检测物PAHs和SPAHs的各具体组分的含量数据，验证相互之间的关系，并将该数据与关系一起应用于评估环境中普遍存在的两类污染物在人群（群体）中的暴露特征，其具体包括如下步骤：
（1）采样对象信息收集：收集采样对象的基础信息，包括收集20名职业工人的暴露影响因素，包括年龄、性别、岗位、作业时间（入职时间）等基本信息；
（2）数据分类：把年龄、性别、岗位、作业时间分为连续变量和分类变量，其中性别、岗位属于分类变量，年龄、作业时间属于连续变量，将分类变量（如岗位等）分为暴露组和对照组，将PAHs、SPAHs的数据则作为因变量，并相应归类；
（3）差异性分析：采用SPSS分析软件，把暴露组与对照组PAHs、SPAHs检测数据进行差异性分析，得出两种目标检测物之间的差异性，得到P值；
（4）结果判定：当P＜0.05时，表示暴露特征差异显著，存在显著性；当P＞0.05时，无显著性，表示暴露特征无统计学差异。
具体的暴露特征判断结果：依据条件“p＜0.05时，显著，当P＞0.05时，无差异”对暴露情况进行判断，从表5可知，暴露组（车间工人）的萘、联苯、苊烯、苊、芴、屈(稠二萘)、苯并[k]荧蒽、苯并[e]芘、苝、茚并[1,2,3-cd]芘等PAHs的P值小于0.05，暴露组与非暴露组存在差异显著，即车间工人血液中的萘、联苯、苊烯、苊、芴、屈(稠二萘)、苯并[k]荧蒽、苯并[e]芘、苝、茚并[1,2,3-cd]芘比办公室工人高，表明车间工人存在PAHs暴露，比办公室工人存在更高的健康风险。
同理，根据表6可判断，车间工人（群体）血液中的9-硝基蒽、3-硝基荧蒽、1-硝基芘、2-硝基芘、1,4-屈醌、6-硝基䓛、1,8-二硝基芘比办公室人员高，表明车间工人存在SPAHs暴露，比办公室工人（群体）存在更高的健康风险。
实施例2：
本施例提供的前述血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法及应用，与实施例1基本上相同，其不同之处在于，对血液中PAHs、SPAHs进行同步检测，将该群体数据与关系一起应用于评估环境中普遍存在的两类污染物在个体中的暴露特征。
本实施例血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法，其在S1-S5的基础上，还包括步骤S6：当实验条件受限、仅能进行PAHs或SPAHs之一的组分含量进行检测时，将已知的目标检测物检测数据代入所述的公式1中，计算出未知的目标检测物的浓度，补全PAHs、SPAHs的数据，以进行所涉及的区域或岗位的监控风险暴露分析；即将步骤S5得到的一类目标检测物的检测数据，代入PAHs与SPAHs关系分析模型y=ax+b（公式1），从而得到两类目标检测物的数据，简化应用于人体PAHs、SPAHs的健康暴露风险分析的检测过程。
所述的同步检测方法的应用，将检测得到的血液样本中的目标物PAHs、SPAHs的含量数据及相互之间的关系，一起应用于对个体人员的个体暴露影响水平进行分析，其具体包括如下步骤：
（5）数据整理：把同一个体的萘、联苯、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘（嵌二萘 ）、苯并[a]蒽、屈(稠二萘)、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[e]芘、苯并[a]芘、苝、9,10-二苯基蒽、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝等数据求和，得出个体的PAHs总量，同理，把1,4-萘醌、9-芴酮、2-硝基芴、9-硝基蒽、9-硝基菲、2-硝基二苯并噻吩、3-硝基荧蒽、1-硝基芘、2-硝基芘、1,4-屈醌、6-硝基䓛、3-硝基苯并蒽酮、1,8-二硝基芘、1-苊酮、1,3-二硝基芘、1,6-二硝基芘求和，得出个体SPAHs总量；本实施例的数据整理结果见表7；根据SPSS软件进行回归分析，经过计算而获得系数a=0.13，常数b=3.59。
（6）模型的验证：把a和b代入关系模型，y=ax+b（公式1），其中，a为系数、-1≤a≤1，b为常数，得到y = 0.13x +3.59；本实施例中，根据检测的实验数据，根据表7的数据，例如，样本3血液PAHs浓度为26.26，根据公式y=0.13x+3.59可得出SPAHs=0.13×26.26+3.59=7.00，与实测值6.95接近。
（7）健康暴露影响分析：对y = 0.13x +3.59，R2=0.52进行分析，R2=0.52，表明该区域的PAHs、SPAHs存在较强相关性，即PAHs浓度升高时，SPAHs的浓度也会对应升高，作业人员同时暴露在PAHs、SPAHs的风险也越高。
在其他实施例中，如因实验条件受限，仅能对PAHs或SPAHs中的一类组分进行检测时，可运用前述的数学模型（公式1）计算出另外一种未被检测的SPAHs或PAHs的浓度、补全数据，为全面分析PAHs、SPAHs的暴露情况，并进一步为该区域或岗位群体及个体的防护提供精准对策。
表7 20个样本中PAHs、SPAHs浓度一览表
Figure 972901DEST_PATH_IMAGE012
本发明基于多环芳烃衍生物SPAHs是一类通过硝基、甲基取代的多环芳烃的衍生物，大气中的多环芳烃，在有高浓度的光化学氧化剂与二氧化氮、硝酸并存时，会发生硝化反应而生成SPAHs的原理，通过多种方法的同步改进，实现同步检测批量样品中的PAHs、SPAHs，不仅可以直接掌握PAHs、SPAHs的内暴露情况，同时通过建立的PAHs与SPAHs关系模型，找出群体样本中的PAHs和SPAHs的相关性的规律，再应用于个体分析，拓展了检测数据的应用范围。
本发明通过优化整体的技术方案，采用常规检测仪器，即可实现对多种目标检测物组分的同步检测和分析；通过筛选目标检测物，在保证分析结果准确性的基础上减少了需要检测的目标检测物数量，从而简化了检测步骤、降低了检测成本，提高了检测效率及准确性，并进一步扩展了所获得的检测数据在健康暴露风险评估中的应用范围。
需要说明的是，在本发明其他实施例中，在本发明记载的步骤、组分、配比、仪器、工艺参数和条件的范围内，进行具体选择所得到的其他不同方案，均可以达到本发明所记载的技术效果，故本发明不再将其一一列出。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。凡是依据本发明之组分、配比及工艺所作的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法，其特征在于，选取同一份血液样品中存在相关性的血液中多环芳烃及其衍生物作为目标检测物，进行同步提取、检测、分析，其包括如下步骤：
S1：建立数学模型，在从迄今已发现的200多种多环芳烃及众多多环芳烃衍生物中，选择对人体危害大，相互之间具有相关性的组分作为目标检测物：
建立PAHs与SPAHs关系分析模型：y=ax+b 公式1，其中，x为PAHs中一种具体组分的浓度，y为该种PAHs组分所对应的一种SPAHs具体组分的浓度，a为系数、-1≤a≤1，b为常数，系数a和常数b在使用SPSS进行回归分析时通过计算获得；选取《优先控制化学品名录》中记录的人体危害大的多环芳烃PAHs作为筛选目标范围，使用公式1及回归分析的方法，分析PAHs和SPAHs中各具体组分的相关性，得到线性相关系数R2，然后将其中R2≥0.3、与PAHs具有较强相关性的SPAHs组分作为目标检测物；
经筛选、确定的目标检测物组分为：
PAHs为：萘、联苯、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、屈、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[e]芘、苯并[a]芘、苝、9,10-二苯基蒽、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝；
SPAHs为：1,4-萘醌、1-苊酮、9-芴酮、2-硝基芴、9-硝基蒽、9-硝基菲、2-硝基二苯并噻吩、3-硝基荧蒽、1-硝基芘、2-硝基芘、1,4-屈醌、6-硝基䓛、3-硝基苯并蒽酮、1,3-二硝基芘、1,6-二硝基芘、1,8-二硝基芘；
S2：目标检测物的提取：取血液样品中的1 mL血清加入50 mL特氟龙管中；加入内标指示物，然后向其中加入1.5 mL乙醇和0.5 mL甲酸，混匀并静置15 min，然后加入5 mL 的正己烷与二氯甲烷的混合液，二者的体积比为1:1；在1800 rpm下、涡旋混匀2 min；超声萃取10 min，萃取结束后，于离心机中3500 rpm离心10 min，取上清液于15 mL玻璃离心管，按上述步骤重复萃取3次，依次的萃取溶剂体积分别为5 mL 、5 mL 、3 mL，合并上清液；
S3：样品的净化与分离：将上述合并后的上清液，在缓慢氮气流中吹干，加入1 mL正己烷与二氯甲烷的混合液复溶，二者的体积比为5:1；依次采用6 mL丙酮和6 mL正己烷活化固相萃取柱；然后将复溶的样品加载至该固相萃取柱上，依次采用正己烷、二氯甲烷和丙酮洗脱；
S4：样品的浓缩与检测：将上述含PAHs和SPAHs的洗脱液氮吹至近干，加入回收率指示物，并用异辛烷定溶至200μL，PAHs和SPAHs分别采用GC-MS/MS和GC-MS上机分析，得到检测目标物PAHs和SPAHs的多种组分的含量数据。
2.根据权利要求1所述血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法，其特征在于，其还包括如下步骤：
S5：重复步骤S2- S4，分别完成同批次多个个体血液样品中PAHs和SPAHs的检测，得到该批次多个血液样品的检测数据，然后汇总、分类，进行群体PAHs和SPAHs的健康暴露特征分析：以PAHs为自变量，SPAHs含量数据作为因变量，采用SPSS分析软件，对PAHs、SPAHs检测数据进行相关性分析，得到公式1中的a值和b值。
3.根据权利要求2所述血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法，其特征在于，其还包括如下步骤：
S6：当实验条件受限、仅能进行PAHs或SPAHs之一的组分含量进行检测时，将已知的目标检测物检测数据代入所述的公式1中，计算出未知的目标检测物的浓度，补全PAHs、SPAHs的数据，以进行所涉及的区域或岗位的监控风险暴露分析；即将步骤S5得到的一类目标检测物的检测数据，代入PAHs与SPAHs关系分析模型y=ax+b 公式1，从而得到两类目标检测物的数据，简化应用于人体PAHs、SPAHs的健康暴露风险分析的检测过程。
4.根据权利要求1所述血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法，其特征在于，
所述步骤S2中所述内标指示物包括：d8-萘，d10-苊，d10-菲，d12-䓛，d12-苝，2-硝基芴-d9，3-硝基荧蒽-d9；
所述步骤S2中的1.5 mL乙醇和0.5 mL甲酸，混匀并静置15 min，然后加入5 mL体积比为1:1的正己烷与二氯甲烷,1800 rpm 涡旋混匀2 min；在超声萃取10 min、萃取结束后，于离心机中3500 rpm离心10 min，取上清液于10 mL玻璃离心管，按上述步骤重复萃取3次、每次萃取使用的溶剂体积分别为5 mL 、5 mL 、3 mL，合并上清液，在缓慢氮气流中吹干，用1mL体积比为5:1的正己烷与二氯甲烷复溶。
5.根据权利要求1所述血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法，其特征在于，
所述步骤S3中的固相萃取柱，是采用硅胶SPE柱小柱，规格为1 g、6 mL；在去除血液中的基质干扰组分同时对所述各目标检测物均有较好的保留，相比于固相萃取自填柱可减少溶剂的使用。
6.根据权利要求1所述血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法，其特征在于，所述步骤S4中的回收率指示物为：d14-对联三苯或6-硝基屈-d11。
7.一种权利要求1~6之一所述血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法的应用，其特征在于，将同步检测得到的多个血液样本中的两类目标检测物PAHs和SPAHs的含量数据，将该数据与关系一起应用于评估环境中普遍存在的两类污染物在人群中的暴露特征，其具体包括如下步骤：
（1）采样对象信息收集：收集采样对象的基础信息，包括收集20名职业工人的暴露影响因素，包括年龄、性别、岗位、作业时间或入职时间的基本信息；
（2）数据分类：把年龄、性别、岗位、作业时间分为连续变量和分类变量，其中性别、岗位属于分类变量，年龄、作业时间属于连续变量，将分类变量分为暴露组和对照组，将PAHs、SPAHs的数据则作为因变量，并相应归类；
（3）差异性分析：采用SPSS分析软件，把暴露组与对照组PAHs、SPAHs检测数据进行差异性分析，得出两种目标检测物之间的差异性，得到P值；
（4）结果判定：当P＜0.05时，表示暴露特征差异显著，存在显著性；当P＞0.05时，无显著性，表示暴露特征无统计学差异。
8.根据权利要求7所述的同步检测方法的应用，其特征在于，将同步检测得到的血液样本中的目标物PAHs、SPAHs的含量数据及相互之间的关系，一起应用于对个体人员的个体暴露影响水平进行分析，其具体包括如下步骤：
（5）数据整理：把同一个体的萘、联苯、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、屈、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[e]芘、苯并[a]芘、苝、9,10-二苯基蒽、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝等数据求和，得出个体的PAHs总量，同理，把1,4-萘醌、9-芴酮、2-硝基芴、9-硝基蒽、9-硝基菲、2-硝基二苯并噻吩、3-硝基荧蒽、1-硝基芘、2-硝基芘、1,4-屈醌、6-硝基䓛、3-硝基苯并蒽酮、1,8-二硝基芘、1-苊酮、1,3-二硝基芘、1,6-二硝基芘求和，得出个体SPAHs总量；
（6）模型的验证：将检测得到的实验数据代入、验证PAHs与SPAHs关系模型，使用回归分析的方法，分析PAHs和SPAHs的相关性，计算得出R2的值，R2处于0~1之间；R2越接近1，表示两者的相关性越强，同时验证两者的关系模型，y=ax+b 公式1，其中，a为系数、-1≤a≤1，b为常数；
（7）健康暴露影响分析：分析计算得到的R2值，当R2＞0.3时，表明该岗位的PAHs、SPAHs存在较强的相关性，R2越大，相关性越强，即PAHs浓度升高时，SPAHs的浓度也会对应升高，作业人员同时暴露在PAHs、SPAHs的风险也越高。
9.根据权利要求8所述的同步检测方法的应用，其特征在于，其还包括步骤（8）：在实验条件受限，仅能对PAHs或SPAHs之一进行浓度检测时，将所检测得到数据，代入所述的模型y=ax+b 公式1中，补全未检测的SPAHs或PAHs的浓度，得出PAHs、SPAHs的暴露情况，为该岗位的防护提供精准对策。
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