JP2005062109A - 多環芳香族炭化水素類の人体曝露評価方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】人体に取り込まれたPAHSが代謝されて尿中に水酸化物のグルクロン酸抱合体又は硫酸抱合体になっていることに着目し、環境汚染物質である多環芳香族炭化水素(polycyclic aromatic hydrocarbon : PAH)が人の体内に取り込まれ生成した解毒代謝物を酵素を用いてヒドロキシ体に加水分解して定量分析することにより生体指標とした。
【選択図】 図1
Description
PAHSは多種多様な発生源を有し、環境中に広く分布することから、ヒトの曝露量は比較的高く、同時に曝露量の推定が困難な化合物である。
PAHは、その排出源として自動車、特に粉じん排出量の多いディーゼル車の寄与が大きいことが推定されている。
さらにPAHは喫煙によってもその曝露量は増加するなど、ヒトに対する曝露量が極めて高いにもかかわらず、そのリスク評価は十分に行われていない。
最近、PAHの中に内分泌撹乱作用を呈するものがあることが報告され、ベンゾ[a]ピレン(BaP)を含む数種類のPAHについて抗エストロゲン作用などの内分泌撹乱作用の一部が明らかにされつつある。
US Environmental Protection Agency (EPA)では、環境汚染物質として測定すべき項目の中に16種のPAH(16 US EPA PAHS)(図3)をあげ、それらを測定する方法として HPLC(高速液体クロマトグラフィー)または GC/FID(水素炎イオン化検出−ガスクロマトグラフィー)を推奨している。
また多環芳香族炭化水素の種類が多く、人に対する曝露は定性的に把握できても、定量的に評価できる生体指標がこれまでになかった。
特に、4環以上の多環芳香族炭化水素に至っては、濃度も薄く、定性分析でさえ困難であった。
PAHの水酸化体が強い蛍光を有するからである。
薬物の解毒に大きく関与している酵素チトクロムP450により、インビトロ(in vitro)で各種PAHを代謝させたところPAHヒドロキシ体が生成することが明らかになった。
次に、本発明に係る生体指標の有用性を確認する目的で喫煙者と非喫煙者の2群に分けPAH代謝物濃度を分析比較した結果を図2(表2)に示す(具体的な分析方法は後述する)。
なお、濃度の単位は尿中のクレアチニン値で補正したμ mol/molクレアチニンである。
表中、日本人とは日本在住の日本人を意味し、タイ人とはタイ国に在住のタイ人を意味する。地域差も検討項目にいれたものである。
また、表中、(mean)は平均値を(SD)は標準偏差値を示し、(range)は最小値を示した人の値と最大値を示した人の値を示し、*はt−検定の結果を示し、下記の意味である。
*:統計学的に非喫煙者に対して喫煙者が5%の棄却率で有意である。
**:統計学的に非喫煙者に対して喫煙者が1%の棄却率で有意である。
***:統計学的に非喫煙者に対して喫煙者が0.1%の棄却率で有意である。
その結果、喫煙者群と非喫煙者群の尿中1−OHPyr(1−ヒドロキシピレン)濃度及び2−OHFle(2−ヒドロキシフルオレン)濃度を比較したところ、喫煙者群で有意に高く、尿中PAH代謝物が喫煙によるPAHS摂取の指標として有用であることが明らかとなった。
また、在住地による地域差があることも認められた。
1−OHPyrを除く4環以上のPAHヒドロキシ体は2,3環の化合物と比べて2桁以上濃度が低いことも明らかになった。
今回、喫煙者と非喫煙者との比較を例に、本発明が、PAHS摂取の生体指標(バイオマーカー)として有用であることを確認したように、道路沿いや工場地帯等の環境汚染の違い、飲食等の傾向と各種病気との因果関係等多くの分野での生体指標となることが期待される。
(1)ヒト尿試料(10mL)をサンプリングし、1.0M塩酸を加え、pH5.0に調節した後、酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)を20mL加える。
(2)これにβ−グルクロニダーゼ/アリルスルファターゼ溶液(type H−2:Helix pomatia 由来:β−グルクロニダーゼ活性,100,000 units/mL, スルファターゼ活性,5000 units/mL)(Sigma社製)15μL を加え、恒温水浴中で37℃、2時間インキュベートする。
グルクロン酸抱合体あるいは硫酸抱合体を酵素にて加水分解するためである。
(3)メタノール5mL及び水10mLを通液し前処理をした逆相系固相抽出カートリッジ(Sep-Pack PlusC18,Waters)に酵素処理した上記尿試料を通液する。
(4)20%メタノール水溶液10mLでカートリッジを洗浄し、通気して乾燥させる。
(5)あらかじめn-ヘキサン100mLで洗浄しておいた順相系固相抽出カートリッジ(Sep-Pack Plus Silica,Waters)をC18カートリッジの下に接続し、n-ヘキサン/酢酸エチル(9/1,v/v)20mLで溶出する。
(6)この溶出液を減圧乾固し、最終的にメタノール(200μL)に溶解して検液とする。
(7)定量のための蛍光検出−高速液体クロマトグラフィー装置は、島津社製HPLCポンプ2台、デガッサー1台、カラムオーブン1台、蛍光検出器1台、システムコントローラー1台、インテグレーター1台から構成され、カラムはDiscovery RP-Amide C16(250×4.6mmi.d.,5 μm Supelco)を用いる。
移動相としてA液:アセトニトリル及びB液:10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用意し、あらかじめB液45%、流速1.0mL/min、カラム温度40℃で1時間流し、カラム平衡化しておく。分析の際のグラジェントプログラムは、0−20分までB液45%、20分から37分までにB液60%まで直線的にBの割合を増加させ、その後60分までB液60%一定とする。
また波長切り替えプログラムは、0−15分(励起波長Ex.277nm、蛍光波長Em.355nm)、15−20分(Ex.270,Em.327)、20−40分(Ex.256,Em.370)、40−60分(Ex.240,Em.387)とする。
(8)このシステムに上記手順に従って処理した検液(20μL)を導入し、得られたクロマトグラフの例を図1(チャート)に示す。
分かりやすくするために、検液(Urine)のクロマトグラフに標準試料(Standard)のクロマトグラフを重ね合わせてある。
なお、縦軸は蛍光強度(Fluorescence intensity)である。
Claims (4)
- 環境汚染物質である多環芳香族炭化水素(polycyclic aromatic hydrocarbon : PAH)が人の体内に取り込まれ生成した解毒代謝物を酵素を用いてヒドロキシ体に分解して定量分析することにより生体指標としたことを特徴とする多環芳香族炭化水素類(PAHS)の人体曝露評価方法。
- 人の体内に取り込まれた解毒代謝物が尿中PAH代謝物であることを特徴とする請求項1記載のPAHS人体曝露評価方法。
- 定量分析法が蛍光検出−高速液体クロマトグラフィーであることを特徴とする請求項1又は請求項2記載のPAHS人体曝露評価方法。
- 尿中PAH代謝物を酵素を用いて加水分解してモノヒドロキシ体にし、このモノヒドロキシ−PAHを固相抽出濃縮した後に溶出した検液を用いて蛍光検出−高速液体クロマトグラフィー(HPLC/FL)にて定量分析することを特徴とするPAHS人体曝露評価方法。
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KR101321034B1 (ko) | 2012-02-24 | 2013-10-23 | 한국과학기술연구원 | 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법 |
CN113960220A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-01-21 | 生态环境部华南环境科学研究所 | 血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法及应用 |
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