KR101321034B1 - 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법 - Google Patents

생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101321034B1
KR101321034B1 KR1020120018879A KR20120018879A KR101321034B1 KR 101321034 B1 KR101321034 B1 KR 101321034B1 KR 1020120018879 A KR1020120018879 A KR 1020120018879A KR 20120018879 A KR20120018879 A KR 20120018879A KR 101321034 B1 KR101321034 B1 KR 101321034B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
polycyclic aromatic
aromatic hydrocarbon
biological sample
metabolites
naphthol
Prior art date
Application number
KR1020120018879A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130097315A (ko
Inventor
이정애
표희수
정봉철
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to KR1020120018879A priority Critical patent/KR101321034B1/ko
Publication of KR20130097315A publication Critical patent/KR20130097315A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101321034B1 publication Critical patent/KR101321034B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/493—Physical analysis of biological material of liquid biological material urine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/025—Gas chromatography

Abstract

본 발명은 생체 시료를 효소 가수 분해하는 단계; 가수 분해된 생체 시료를 85 내지 99%의 메탄올로 용출하는 단계; 및 용출한 생체 시료를 기체크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)으로 분석하는 단계를 포함하는 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법을 개시한다.

Description

생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법{Method for Determination of metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons in biological material}
본 발명은 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체를 분석하는 방법에 관한 것이다.
다환 방향족 탄화수소(Polycyclic aromatic hydrocarbone: PAH)는 여러 개의 벤젠 고리를 포함하는 방향족 탄화수소로서, 미량으로도 암을 유발시킬 수 있는 발암 물질 또는 돌연변이원성 물질이며, 유기물이 불완전 연소할 때 생성된다. 이는 경유 또는 휘발유 등 화석 연료를 사용하는 자동차의 배출 가스에서 많이 생성되고, 경유 자동차의 미세 먼지(Particle Materials, PM) 등에 흡착된 상태 또는 가스상으로 존재하며, 주로 공기 역학적 직경이 2.5㎛ 미만의 입자상 물질로 공기 중에 방출된다.
생명체가 PAH에 노출되면 암이 유발되거나 돌연변이가 일어날 수 있다. 생명체에 PAH가 유입되면, 먼저 지용성 성분인 PAH는 산화되어 수산화 PAH로 되고, 이후 글루크로나이드, 글루타치온 등과 결합하여 수용성 물질로 되어 대사체의 형태로서 뇨를 통해 배출된다. 이러한 대사 과정을 거쳐 뇨로 배출된 PAH 대사체들의 농도를 측정하면, 생명체가 PAH에 얼마나 노출되었는지를 평가할 수 있으며, 나아가 PAH 노출 유해 정도를 평가할 수 있을 것이다.
종전에는 하나의 방법으로 여러 PAH의 대사체를 동시에 측정할 수 없고, 일부의 PAH 대사체만을 측정할 수 있었을 뿐만 아니라, 측정에 오랜 시간이 소요되었고, 그 검출 한계 및 정량 한계도 그리 높지 않았다.
랄프 프레우스 등, Journal of Chromatography B, 801 (2004) 307-316
본 발명은 우수한 감도 및 정확성을 가지고 간편하고 효율적으로 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체를 분석하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면은 생체 시료를 효소 가수 분해하는 단계; 가수 분해된 생체 시료를 85 내지 99%의 메탄올로 용출하는 단계; 및 용출한 생체 시료를 기체크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)으로 분석하는 단계를 포함하는 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면은 상기 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법으로 분석된 다환 방향족 탄화수소 대사체를 포함하는 대상의 다환 방향족 탄화수소 노출 정도 진단용 바이오 마커를 제공한다.
본 발명에 따른 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법은 우수한 감도 및 정확성을 가지고 간편하고 효율적으로 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체를 분석할 수 있으며, 하나의 방법으로 여러 다환 방향족 탄화수소 대사체를 동시에 분석할 수도 있다.
도 1은 다환 방향족 탄화수소 대사체에 대한 총 이온 크로마토그램(TIC)이다(1: 1-나프톨-d8, 2: 1-나프톨, 3: 2-나프톨, 4: 1-하이드록시피렌).
본 발명의 일측면은 생체 시료를 효소 가수 분해하는 단계; 가수 분해된 생체 시료를 85 내지 99%의 메탄올로 용출하는 단계; 및 용출한 생체 시료를 기체크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)으로 분석하는 단계를 포함하는 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법을 제공한다.
본 명세서에서,"생체 시료"는 생물 기원의 시료를 모두 포괄하는 개념이며, 구체적으로 뇨, 혈액 또는 피부 조직을 포함한다.
본 발명의 일측면에서, "다환 방향족 탄화수소"는 두 개 이상의 환(環)이 각각 두 개 이상의 원자를 공유한 형으로 일체화된 방향족 탄화수소 화합물을 의미한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 다환 방향족 탄화수소는 나프탈렌(naphthalene), 나프타센(naphthacene), 안트라센(anthracene), 피렌(pyrene) 또는 벤조피렌(benzopyrene)을 포함한다. 본 발명의 일측면에서, "다환 방향족 탄화수소의 대사체"는 다환 방향족 탄화수소가 생체 대사 과정을 통해 대사된 물질을 의미한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 다환 방향족 탄화수소의 대사체는 나프탈렌, 나프타센, 안트라센, 피렌 또는 벤조피렌의 대사체, 구체적으로 1-나프톨(1-naphthol, 1-NA), 2-나프톨(2-naphthol, 2-NA) 및 1-하이드록시피렌(1-hydroxypyrene, 1-OHP) 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 1-나프톨, 2-나프톨 및 1-하이드록시피렌의 화학식은 각각 아래의 화학식 1 내지 3과 같다.
Figure 112012015146857-pat00001
Figure 112012015146857-pat00002
Figure 112012015146857-pat00003
본 발명의 일측면에서, 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체의 농도가 0.5 내지 100 ng/ml, 구체적으로 1 내지 75 ng/ml, 더 구체적으로 3 내지 60 ng/ml일 때, 더욱 뛰어난 감도로 분석될 수 있다.
생체 시료 중 다환 방향족 탄화수소는 미량으로 존재하며, 효소가 컨쥬게이션(conjugation)된 형태로 존재한다. 따라서 생체 시료 중 다환 방향족 탄화수소를 분석하기 위해서는 먼저 이를 가수 분해하는 것이 필요하다. 이에, 본 발명의 일측면에 따른 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법은 생체 시료를 효소 가수 분해하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 효소는 β-글루쿠로니다아제 및 아릴설파타아제 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 가수 분해 단계는 25 내지 40℃에서 10 내지 30시간, 구체적으로 30 내지 40℃에서 10 내지 20시간 동안 진행될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법은 가수 분해하는 단계 이전에, 생체 시료에 0.1 내지 0.5%, 구체적으로 0.2 내지 0.3%의 아스코르브산을 가하여 생체 시료의 산화를 저지하는 단계를 더 포함할 수 있다. 생체 시료의 산화를 저지함으로써 생체 시료의 변성을 방지하여 보다 정확하게 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체를 분석할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법은 생체 시료에 아스코르브산을 가하는 단계 이후에, 생체 시료의 pH를 4.5 내지 6, 구체적으로 5 내지 5.5로 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, pH 조절은 산 버퍼, 구체적으로 아세테이트 버퍼를 사용하여 행할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법은 가수 분해된 생체 시료를 85 내지 99%의 메탄올로 용출(elution)하는 단계를 포함한다. 종전에는 80% 메탄올을 사용하여 생체 시료를 용출하기도 하였으나, 본 발명의 일측면에 따른 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법은 85 내지 99%의 메탄올을 사용함으로써, 높은 용출 효율로 대사체를 분석할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에 따른 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법은 88 내지 95%의 메탄올, 구체적으로 88 내지 93%의 메탄올을 사용하여 생체 시료를 용출할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법은 생체 시료를 메탄올로 용출하는 단계 이전에, 생체 시료를 물로 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 세척 과정을 통해 분석하고자 하는 다환 방향족 탄화수소를 제외한 다른 방해 물질을 제거하여 분석 효율을 높일 수 있으며, 나아가 적은 양의 생체 시료로도 다환 방향족 탄화수소 대사체에 대해 정확도 및 정밀도 높은 분석이 가능하다. 본 발명의 다른 일측면에서, 물은 증류수 또는 정제수를 포함한다.
본 발명의 일측면에 따른 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법은 메탄올로 용출하는 단계 이후에, N-메틸-N-(트리메틸실일) 트리플루오로아세타미드(MSTFA), 트리메틸아이오도실란(TMSI) 및 트리-메틸클로로실란(TMCS)의 혼합 용액으로 유도체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 혼합 용액은 N-메틸-N-(트리메틸실일) 트리플루오로아세타미드(MSTFA), 트리메틸아이오도실란(TMSI) 및 트리-메틸클로로실란(TMCS)을 90~110 : 2~8 : 1~3(v/v/v)의 비율로 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 유도체화하는 단계는 50 내지 70℃에서 1분 내지 30분, 구체적으로 55 내지 65℃에서 5분 내지 20분 동안 진행될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법은 메탄올로 용출하는 단계 이후에, 용출한 생체 시료를 기체크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)으로 분석하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 기체크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)으로 분석하는 단계는 10분 내지 30분, 구체적으로 15분 내지 20분의 짧은 시간 안에 완료될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법은 정량 분석을 위하여 내부 표준법을 사용할 수 있다. 내부 표준법은, 분석하려는 시료에 들어있지 않은 내부 표준 물질 일정량을 표준 용액과 시료에 가하여 검정 곡선을 얻은 다음, 분석 목적 물질의 양을 상대적으로 계산하는 방법이다. 본 발명의 일측면에서, 내부 표준 물질로 1-나프톨-d8(1-NA-d8)을 사용할 수 있으며, 이의 화학식은 아래와 같다.
Figure 112012015146857-pat00004
본 발명의 일측면에 따른 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법은 3종 이상의 다환 방향족 탄화수소 대사체, 구체적으로 1-나프톨(1-naphthol, 1-NA), 2-나프톨(2-naphthol, 2-NA) 및 1-하이드록시피렌(1-hydroxypyrene, 1-OHP)을 포함하는 다환 방향족 탄화수소 대사체를 동시에 분석할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에 따른 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법은 검출 한계(LOD)가 0.1 내지 0.5 ng/ml이고, 정량 한계(LOQ)가 0.1 내지 1 ng/ml로 매우 우수하다. 또한 80 내지 110%의 정확도 및 1 내지 35%의 정밀도라는 뛰어난 결과를 나타낼 수 있다. 이러한 우수한 결과를 바탕으로, 본 발명의 일측면에 따른 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법은 우수한 감도 및 정확성을 가지고 간편하고 효율적으로 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체를 분석할 수 있다. 나아가 얻은 분석 결과를 기초로 인간 또는 동물을 포함하는 생명체가 다환 방향족 탄화수소에 얼마나 노출되었는지를 평가할 수 있고 더불어 다환 방향족 탄화수소가 생명체에 미친 영향을 평가할 수 있을 것이다. 이에, 본 발명의 일측면은 생명체의 다환 방향족 탄화수소 노출 정도 평가를 위한 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면은 상기 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법을 행하기 위한 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석부를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 키트는 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법이 기재된 설명서를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일측면은 상기 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법에 의해 분석된 다환 방향족 탄화수소 대사체를 포함하는 대상의 다환 방향족 탄화수소 노출 정도 진단용 바이오 마커를 제공한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 대상은 인간 또는 동물을 예로 들 수 있는 생명체를 포함한다.
이하, 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실험예]
1. 시료의 준비
다환 방향족 탄화수소(PAH) 대사체 표준 물질인 3종의 분석 물질, 1-나프톨(1-NA), 2-나프톨(2-NA) 및 1-하이드록시피렌(1-OHP)(모두 Sigma-Aldrich사, 슈타인하임, 독일에서 입수)과 내부 표준 물질인 1-나프톨-d8(1-NA-d8)(C/D/N Isotope사, Quebec, Canada에서 입수)에 대해 각각 10㎎씩 무게를 재고 HPLC용 메탄올 10mL에 녹여, 농도가 1000㎍/mL인 스톡 솔루션(stock solution)을 제조하였다. 그 후 이를 10배 희석 시킨 10㎍/mL을 만들어 실험 전까지 -20℃ 냉동고에 보관하였다. 1㎍/mL, 100ng/mL 및 10ng/mL의 시료 또한 위와 실질적으로 동일한 방법으로 제조한 후, 실험 전까지 4℃ 냉장고에서 보관하였다.
2. 생체 시료 전처리
뇨 시료 5 mL에 0.2% 아스코르브산(Sigma-Aldrich사에서 입수) 200 ㎕를 넣어 산화되는 것을 방지하고, 0.2 M의 아세테이트 버퍼(Sigma-Aldrich사에서 입수) 1 mL를 첨가시켜 pH 5.2로 유지시켰다. 이후 β-글루쿠로니다아제/아릴설파타아제(Roche사, 인디아나폴리스, 독일에서 입수) 50 ㎕를 가한 다음 37℃에서 16시간 동안 가수 분해시켰다. 상온에서 방치한 후 내부 표준 물질인 1-나프톨-d8(1-NA-d8)(C/D/N Isotope사, 퀘벡, 캐나다에서 입수)을 2 ng/mL 농도로 첨가하고 메탄올(Berdick & Jackson사, 미시간, 미국에서 입수) 3 mL와 증류수 3 mL를 충분히 활성화된 HLB 카트리지 (Hydrophilic Lipophilic Balance catridge)(Waters사, 매사추세츠, 미국에서 입수)에 흘려주었다. 시료를 주입하고, 증류수 3 mL로 씻어 준 다음, 90% 메탄올 1 mL로 4번 용출(elution)시키고, N2 농축기(Turbo Vap)를 이용하여 건조시켜 고체상 추출을 행하였다. 시료에 MSTFA/TMCS/TMSI 100 : 5 : 2(v/v/v) 혼합 용액(Sigma-Aldrich사에서 입수) 40 ㎕을 가하고 60℃에서 15분간 반응시킨 다음 그 2 ㎕을 GC-MS에 주입하였다.
3. 크레아티닌의 측정
뇨 시료 정량 분석에 있어 각 분석 대상 개체의 내재적 차이를 보정하기 위해 크레아티닌 농도를 함께 측정하였다. 크레아티닌은 요소 질소나 요산과 같이 체내에서 에너지로 사용된 단백질의 노폐물이다. 크레아티닌은 근육에서 에너지로 사용된 후 크레아티닌이나 크레아틴 인산을 형성하고 혈중으로 유출되어 뇨로 배설된다. 이에, 크레아티닌 농도를 측정하여 신장 기능의 정상 여부를 판단하는 지표로 사용할 수 있으며, 개인 간에 나타나는 차이를 보정할 수 있다. 구체적인 측정 방법은 아래와 같다.
먼저 뇨 시료 200 ㎕에 증류수 4.5 mL을 첨가한 후 10% 텅스텐산 나트륨(Na2WO4) 100 ㎕와 0.6N H2SO4 200 ㎕를(Sigma-Aldrich사에서 입수) 첨가하였다. 진탕기로 균등하게 섞어 준 후 원심 분리기를 이용하여 분리시켜 그 상층액 2 mL를 취하였다. 취한 상층액에 0.036 M 피크르산(picric acid)(Allied chemical사, 인도에서 입수) 1 mL와 0.75 N NaOH 1 mL를 가하고 20분간 방치시킨 다음, UV 분광 광도계(spectrophotometer, Beckman, 캘리포니아, 미국)를 이용하여 λMAX 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4. GC-MS 분석
GC-MS 분석은 HP6890 시리즈 가스 크로마토그래프(휴렛-팩커드, 캘리포니아, 미국)에 다이렉트 인터페이스(direct interface)로 연결된 HP5973 질량-선택적 탐지기를 사용하였다. 또한, 모든 시료는 HP6890 시리즈 주입기를 사용하여 GC에 주입하였다.
구체적으로, 분리관은 Ultra-2(95% 디메틸-5% 디페닐 폴리실록산, 길이 25m, 내경 0.25㎜ I.D., 필름 두께 0.33 ㎛)를 사용하였으며, 온도 프로그래밍의 초기 온도 160℃에서 2분간 머무른 후, 8℃/분으로 185℃까지 상승시키고, 다시 15℃/분으로 320℃까지 상승시킨 후 2 분간 유지시켰다. 주입량은 2 ㎕이고 순도 99.99%인 헬륨 가스를 0.9mL/분의 흐름 속도로 흘려주었으며, 스플릿 모드(split mode)(ratio 5 : 1)로 설정하였다. 이온화에 사용한 전자 에너지는 70eV이었고, 질량 스펙트럼상의 특성 이온만을 선택하여 검출하는 방법(selected ion monitoring, SIM)을 이용하여 전 처리된 시료를 분석하였다. GC-MS 작동 조건은 아래 표 1과 같다.
파라미터 조건
컬럼 Ultra 2
(95% 디메틸-5% 디페닐 폴리실록산, 25m×0.25㎜I.D.×0.33㎛ 필름 두께)
운반 기체 헬륨(0.9 mL/분의 속도로 유지)
입구 모드 스플릿 모드(ratio 5 : 1)
주입 부피 2 uL
획득 모드 SIM for GC-MSD
이온화 EI at 70 eV
용매 지연 시간 4 분
총 시간 16.5 분
온도 프로그래밍 초기 160 ℃
# 속도(℃/분) 온도(℃) 시간(분)
1 0 160 2
2 8 185 0
3 15 320 2.37
5. PAH 대사체 분석을 위한 특성 이온의 선정
PAH 대사체 표준 혼합 용액을 이용하여 GC-MS의 기기 조건을 확립하였다. 각 시료의 머무름 시간들을 비교하고, 내부 표준 물질에 대한 PAH 대사체의 베이스 이온(base ion)들의 높이 비를 대조해봄으로써 피크를 동정하였다. GC-MS의 SIM 모드로 분석하기 위한 질량 스펙트럼 상에서의 특성 이온들은 아래 표 2와 같다.
시료 머무름 시간 선택 이온
1-NA-d8 5.039 223, 208, 191
1-NA 5.073 216, 201, 185
2-NA 5.339 216, 201, 185
1-OHP 12.433 290, 275, 291
3종의 PAH 대사체에 대한 총 이온 크로마토그램(total ion chromatogram, TIC) 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 1은 1-나프톨-d8, 2는 1-나프톨, 3은 2-나프톨, 그리고 4는 1-하이드록시피렌을 의미한다. 내부 표준 물질은 도 1에서 볼 수 있듯이, 크로마토그램상 분리되지 않은 분석 물질들은 각각 다른 m/z 값을 나타내므로 SIM 모드에서 충분히 구별되었다.
6. 분석 방법의 검증
3종의 PAH 대사체 표준 물질의 검정 곡선 농도 범위는 0.1, 0.2, 1, 2, 10, 20 및 100 ng/mL의 농도를 선택하여 측정하였고, 정도 관리의 농도는 0.5, 5 및 50 ng/mL의 농도를 선택하여 측정하였다. 검출 한계 측정은 신호 대 잡음비(S/N; Signal to noise) 방법을 이용하였으며, 신호 대 잡음비가 10 이상으로 나타나는 농도를 정량 한계(LOQ)로 나타내었다. 그 결과 모든 표준 검정 곡선은 정량 범위 내에서 직선성(r2 > 0.996)을 나타내었다. 각 시료의 검정 곡선 범위 및 직선성 상관 계수는 아래 표 3과 같다.
시료 범위(ng/mL) 기울기 절편 R2 검출 한계 (ng/mL) 정량 한계 (ng/mL)
1-NA 0.1-100 0.009 0 1 0.1 0.1
2-NA 0.2-100 0.011 0 0.999 0.2 0.5
1-OHP 0.5-100 0.053 -0.009 1 0.5 1
3종 PAH 대사체의 유효성 결과는 동일한 농도의 시료를 3회 반복 처리한 결과와 3일간 동일한 농도의 시료를 처리한 결과를 기초로 정확도(accuracy, %)와 정밀도(precision, %)로서 아래 표 4에 나타내었다. 정확도(Accuracy)란, 측정 값의 참값에 가까운 정도이고, 정밀도(precision)란, 측정 값의 흩어짐이 작은 정도를 의미한다.
농도
(ng/mL)		 3회 반복 처리 3일간 반복 처리
평균±SD 정밀도(%) 정확도(%) 평균±SD 정밀도(%) 정확도(%)
1-NA 0.5 0.8±0.5 24.9 110.5 0.6±0.1 63.2 151.5
5 5.0±0.5 3.6 98.4 4.9±0.2 11.6 100.1
50 54.1±2.6 3.0 98.7 49.3±1.5 4.7 108.1
2-NA 0.5 0.6±0.2 17.9 109.0 0.5±0.1 30.6 127.9
5 5.1±0.3 10.9 103.0 5.1±0.6 5.6 101.7
50 51.01±2.6 6.2 101.0 50.5±3.1 5.2 102.0
1-OHP 0.5 0.8±0.1 34.3 115.6 0.6±0.2 11.1 152.2
5 4.5±0.3 3.4 103.4 5.2±0.2 7.1 90.7
50 42.1±13.0 10.3 92.2 46.1±4.8 30.9 84.2
상기 결과에서 볼 수 있듯이, 5 ng/ml와 50 ng/ml의 농도에서 84.2 ~ 108.1%의 정확도 및 3.0 ~ 30.9 %의 정밀도 값을 얻을 수 있었다. 즉, 본 발명의 일측면에 따른 분석 방법의 결과 유효성을 검증할 수 있었다.

Claims (8)

  1. 생체 시료를 효소 가수 분해하는 단계;
    가수 분해된 생체 시료를 85 내지 99%의 메탄올로 용출하는 단계; 및
    용출한 생체 시료를 기체크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)으로 분석하는 단계를 포함하는 생체 시료 내 3종 다환 방향족 탄화수소 대사체의 동시 분석 방법으로,
    상기 3종 다환 방향족 탄화수소 대사체는 1-나프톨, 2-나프톨 및 1-하이드록시피렌인, 분석 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    생체 시료는 뇨를 포함하는 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    효소 가수 분해하는 단계의 효소는 β-글루쿠로니다아제 및 아릴설파타아제 중 하나 이상을 포함하는 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    메탄올로 용출하는 단계 이전에, 생체 시료를 물로 세척하는 단계를 더 포함하는 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
KR1020120018879A 2012-02-24 2012-02-24 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법 KR101321034B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120018879A KR101321034B1 (ko) 2012-02-24 2012-02-24 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120018879A KR101321034B1 (ko) 2012-02-24 2012-02-24 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130097315A KR20130097315A (ko) 2013-09-03
KR101321034B1 true KR101321034B1 (ko) 2013-10-23

Family

ID=49449723

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120018879A KR101321034B1 (ko) 2012-02-24 2012-02-24 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101321034B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110441427A (zh) * 2019-08-19 2019-11-12 生态环境部华南环境科学研究所 基于低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法
KR20210050217A (ko) 2019-10-28 2021-05-07 강원대학교산학협력단 가공육 내 다환방향족탄화수소류 동시분석방법

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104101660B (zh) * 2014-06-27 2016-06-01 缪荣明 尿中1-溴-2丙醇的气相色谱检测方法
CN104165952A (zh) * 2014-08-15 2014-11-26 广州衡创测试技术服务有限公司 一种油墨、涂层、油漆中禁用偶氮染料的检测方法
WO2021187714A1 (ko) * 2020-03-19 2021-09-23 숙명여자대학교산학협력단 미세먼지 노출 여부 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005062109A (ja) 2003-08-19 2005-03-10 Kanazawa Univ Tlo Inc 多環芳香族炭化水素類の人体曝露評価方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005062109A (ja) 2003-08-19 2005-03-10 Kanazawa Univ Tlo Inc 多環芳香族炭化水素類の人体曝露評価方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
논문1-CANCER EPIDEMIOLOGY BIOMARKERS PREVENTION 2004;12(12) *
논문1-CANCER EPIDEMIOLOGY BIOMARKERS PREVENTION 2004;12(12)*
논문2-JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B 2006 *
논문2-JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B 2006*
논문3-MARINE ENVIRONMENTAL RESEARCH 2008 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110441427A (zh) * 2019-08-19 2019-11-12 生态环境部华南环境科学研究所 基于低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法
CN110441427B (zh) * 2019-08-19 2022-02-08 生态环境部华南环境科学研究所 基于低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法
KR20210050217A (ko) 2019-10-28 2021-05-07 강원대학교산학협력단 가공육 내 다환방향족탄화수소류 동시분석방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130097315A (ko) 2013-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Determination of urinary malondialdehyde by isotope dilution LC-MS/MS with automated solid-phase extraction: A cautionary note on derivatization optimization
Lin et al. A high-throughput and sensitive methodology for the quantification of urinary 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine: measurement with gas chromatography-mass spectrometry after single solid-phase extraction
Beach et al. Selective quantitation of the neurotoxin BMAA by use of hydrophilic-interaction liquid chromatography–differential mobility spectrometry–tandem mass spectrometry (HILIC–DMS–MS/MS)
KR101321034B1 (ko) 생체 시료 내 다환 방향족 탄화수소 대사체 분석 방법
McCoy et al. Analysis of aflatoxin B1‐lysine adduct in serum using isotope‐dilution liquid chromatography/tandem mass spectrometry
JP6092890B2 (ja) 質量分析による逆トリヨードサイロニンの検出法
Karlonas et al. Mixed‐mode SPE for a multi‐residue analysis of benzodiazepines in whole blood using rapid GC with negative‐ion chemical ionization MS
Gunnar et al. Fast gas chromatography–negative‐ion chemical ionization mass spectrometry with microscale volume sample preparation for the determination of benzodiazepines and α‐hydroxy metabolites, zaleplon and zopiclone in whole blood
Zhang et al. Determination of marker residue of Olaquindox in fish tissue by ultra performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry
Yuan et al. A simple, fast, and sensitive method for the measurement of serum nicotine, cotinine, and nornicotine by LC–MS/MS
CN112326819B (zh) 一种同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法
Tang et al. Recent developments in DNA adduct analysis using liquid chromatography coupled with mass spectrometry
Chen et al. Simultaneous determination of toxins in algae and water samples by high‐performance liquid chromatography with triple quadrupole mass spectrometry
WO2007090081A2 (en) Analysis of mycophenolic acid in saliva using liquid chromatography tandem mass spectrometry
Yuan et al. Simultaneous determination of paraquat and diquat in human plasma by HPLC‐DAD: Its application in acute poisoning patients induced by these two herbicides
Valente et al. Validation and clinical application of an UHPLC method for simultaneous analysis of total homocysteine and cysteine in human plasma
Sabatini et al. A method for routine quantitation of urinary 8‐hydroxy‐2′‐deoxyguanosine based on solid‐phase extraction and micro‐high‐performance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry
Song et al. Quantitative determination of clonazepam in plasma by gas chromatography-negative ion chemical ionization mass spectrometry
Jaikwang et al. A dilute-and-shoot LC–MS/MS method for urinary glyphosate and AMPA
Papoutsis et al. Development and validation of a gas chromatography‐mass spectrometric method for the determination of sildenafil and desmethyl‐sildenafil in whole blood
Guo et al. A rapid, sensitive, and widely applicable method for quantitative analysis of underivatized amino acids in different biological matrices by UHPLC‐MS/MS
Ballotari et al. Development of a new ultra‐high‐performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for the determination of digoxin and digitoxin in plasma: Comparison with a clinical immunoassay
KR101028042B1 (ko) 생체 뇨 시료 내 휘발성 유기 화합물(ｖｏｃ) 대사체 분석 방법
Maestri et al. Determination of urinary S‐phenylmercapturic acid, a specific metabolite of benzene, by liquid chromatography/single quadrupole mass spectrometry
Crow et al. A simple and cost effective method for the quantification of 8‐hydroxy‐2′‐deoxyguanosine from urine using liquid chromatography tandem mass spectrometry

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161004

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170928

Year of fee payment: 5