CN113433252A - 一种同步测定血液中多种多环芳烃的方法及应用 - Google Patents

一种同步测定血液中多种多环芳烃的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同步测定血液中多种多环芳烃的方法及应用，该方法包括如下步骤：S1.样品采集；S2.超声提取和冷冻离心；S3.SPE萃取；S4.浓缩、复溶；S5.上机，将浓缩液用气相色谱‑串联质谱法检测，或采用气相色谱质谱联用仪检测，分析检测结果，计算得到血液样品中多种多环芳烃的各具体成分的浓度。本发明还公开了该方法在用于构建动物试验模型及特定人群内暴露的健康风险评估的应用。本发明采用小体积血液样本，通过冷冻离心消除液液萃取中乳化现象，并通过SPE净化，对样本进行提取、纯化和浓缩，测定全血样品中PAHs的含量，对开展多种多环芳烃在生物体内的代谢、转运、合成和损伤研究具有重要意义。

Description

一种同步测定血液中多种多环芳烃的方法及应用
技术领域
本发明涉及复杂基质生物样品中有机污染物检测技术领域，具体涉及一种同步测定血液中多种多环芳烃的方法及应用。
背景技术
多环芳烃PAHs是一类由两个或两个以上苯环或环戊二烯稠合而成的高分子有机物，是一类由有机物质的不完全燃烧或高热分解产生的具有多种生物学毒性的有机污染物，广泛存在于空气、水、食物和土壤中。由于其具有高生物活性、持久性、脂溶性等特点，且物理化学性质稳定，在自然环境中难以降解，是持久性有机污染物。多环芳烃可通过食物、呼吸、甚至皮肤接触进入人体内，对人类的健康造成危害，研究表明PAHs具有较强的致畸、致癌和致突变性，与早产、胎儿生长受限等不良妊娠结局有关。在内暴露研究中，多以PAH-DNA加合物、尿中1一羟基芘作为暴露指标，以血液中的 PAHs作为暴露指标的研究较少，主要是因为直接采集人体血液难度较大，且血液基质复杂，含有大量的蛋白、糖类、脂类和水分，尤其是全血中含有红细胞、白细胞、血小板等物质，背景干扰严重，而污染物浓度多为微量和痕量水平，这些都是样品前处理及直接检测的巨大挑战。
目前血液样品的前处理方法主要有液液萃取法和固相萃取法，液液萃取法就是用有机溶剂直接提取，该法操作简单，但多用于血清或者血浆中，不适合基质更为复杂的全血；固相萃取技术（SPE）是血液样品应用比较广泛的方法，由于PAHs是半挥发性有机物，在样品前处理及检测过程中容易散失，导致上述方法的样本剂量均较大，多为2-10ml，增大了获取难度，特别是对于大鼠等小型试验动物而言，不利于开展各种动物试验。
例如，现有技术中，为了解决血液中多环芳烃等成分的检测问题，中国发明专利申请号CN202011171172 .7公开了一种血液中半挥发性有机物的检测方法，该方法是先进行多级萃取；然后进行固相净化；接着再进行气相色谱质谱联用仪分析；最后计算各个待测目标半挥发性有机物的浓度。该发明通过对方法整体工艺流程设计进行改进，先对待测样品采用特定的前处理，再对前处理后的样品采用气相色谱质谱联用仪多反应监测模式进行检测，对血液中具有代表性的邻苯二甲酸酯、多环芳烃、多溴二苯醚、多氯联苯和农药等多种半挥发性有机物进行检测。
但是，该发明提供的检测方法所采用的多级萃取过程复杂、使用的样品剂量和溶剂多，且其检测对象为血清或血浆样品而不是全血，在处理过程中会损失部分多环芳烃的含量；在其超声、振动萃取、离心等处理过程中，样品的温度会快速升高、造成多环芳烃等检测目标成分的挥发，影响检测结果的准确性；同时，由于全血中包括各种血细胞、基质复杂，其在前处理过程中容易堵塞萃取柱，且在洗脱液中会残留血液中的水分，不利于后续氮吹。
因此，现有的多环芳烃的检测方法，均不能适用于将全血直接作为检测样品；在样品处理过程中容易造成多环芳烃的挥发，导致检测结果不准确。
发明内容
为克服现有技术所存在的上述不足之处，本发明的目的在于，提供一种同步测定血液中多种多环芳烃的方法，采用小体积样本，通过冷冻离心和减少SPE萃取前处理步骤，对样本进行提取、纯化和浓缩，避免多环芳烃的损失，以准确测定血样品中PAHs的含量。
本发明还提供了将该方法用于构建动物试验模型及进行内暴露健康风险评估的应用。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种同步测定血液中多种多环芳烃的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1. 样品采集
用装有抗凝剂的采血管采集新鲜血液后充分摇匀，取不少于500ul于聚四氟离心试管中，制得血样样品；
S2.超声提取和冷冻离心
S2.1按血样样品：溶剂体积比设定的比例，向样品中加入正己烷，充分振摇后，冰浴下超声提取；
S2.2将提取液放于冰箱中至基质层冷冻到-18℃--20℃，再放于离心机上离心，分离出上清液，得到第一次提取液；
S2.3 将S2.2的上清液移至新试管中，再向血样中加入3.0mL正己烷，重复上述S2.2的离心操作，将上清液取出、得到第二次提取液，与第一次提取液合并；
S3.SPE萃取
S3.1 SPE活化
依次用甲醇和超纯水活化SPE小柱，保持小柱湿润；
S3.2 上样
将合并后的正己烷萃取液缓缓倒入SPE小柱上，并确保萃取液中组分与SPE小柱充分键合；待萃取液流净后，增加压力，继续抽提；
S3.3 洗脱
用V/V=1：1的正己烷和二氯甲烷的混合溶剂，洗脱SPE小柱，收集洗脱液；
S4. 浓缩、复溶
将洗脱液氮吹至干燥，再用100ul溶剂复溶，制得浓缩液：其中，气相色谱用含内标的正己烷作为溶剂复溶，液相色谱用乙腈作为溶剂复溶；
S5. 上机
将浓缩液用气相色谱-串联质谱法检测，或采用气相色谱质谱联用仪检测，分析检测结果，计算得到样品中多种多环芳烃的各具体成分的浓度。
所述步骤S1中的样品采集步骤，采集新鲜血液的对象为大鼠等小型试验动物或人体；其采集量不少于500ul。
所述S2.1超声提取和冷冻离心的步骤，具体为：
S2.1按血样样品：溶剂体积比=1:6的比例，向样品中加入正己烷，充分振摇后，冰浴下超声提取40min；
S2.2将提取液放于冰箱中至基质层冷冻到-18℃--20℃，再放于离心机上4500rpm离心10min，分离出上清液，得到第一次提取液；
S2.3 将S2.2的上清液移至新试管中，再向血样中加入3.0mL正己烷，重复上述S2.2的离心操作，将上清液取出、得到第二次提取液，与第一次提取液合并；
所述S3.SPE萃取的步骤，具体为：
S3.1 SPE活化
依次用1.0ml甲醇和1.0ml超纯水活化SPE小柱，保持小柱湿润；
S3.2 上样
将合并后的正己烷萃取液缓缓倒入SPE小柱上，为确保萃取液中组分与SPE小柱充分键合，控制压力开关和限流阀，使流速保持在2ml/min；待萃取液流净后，增加压力，继续抽提2min；
S3.3 洗脱
用V/V=1：1正己烷和二氯甲烷的混合溶剂6.0mL，洗脱SPE小柱，收集洗脱液。
所述S1还包括如下步骤：
S1.1 预先选定的同步测定的血液中多种多环芳烃成分为18种，其分别为：1：萘；2 ：苊烯；3 ：苊；4 ：芴；5 ：菲；6 ：蒽；7 ：芘；8 ：荧蒽；9 ：䓛；10 ：苯并［a］蒽；11 ：苯并［j］荧蒽；12 ：苯并［b］荧蒽；13 ：苯并［k］荧蒽；14 ：苯并［a］芘；15 ：苯并［e］芘；16 ：二苯并［a，h］蒽；17 ：茚并［1，2，3-cd］芘；18 ：苯并［g，h，i］苝；
S1.2 根据预先选定的多环芳烃成分，向血样样品中加入萘-d8，苊-d10，菲-d10，䓛-d12，苝-d12，5种内标储备液200mg/L或以上浓度，持证标准溶液；色谱纯正的己烷、二氯甲烷；对所述的步骤S2-S5进行全程序质控，使得到5种氘代内标的回收率处于72%-112%之间。
所述的步骤S1-S5还包括进行全过程安全防护的步骤，具体包括：在专用实验场所开展实验，并使用专用器皿；实验者在操作过程中做好个人防护措施，在通风橱中进行操作；废弃溶剂、试剂、玻璃器皿、实验耗材等按实验室安全相关规定妥善处理。
一种所述的同步测定血液中多种多环芳烃的方法的应用，其特征在于，将其应用于构建动物试验模型，将多次、定时采集样品并检测得到的全血样品中PAHs 质量浓度的检测数据，用于分析、确定大鼠等小型试验动物PAHs 负荷水平及变化规律。
将其得到的全血样品中PAHs 质量浓度的检测数据，进一步用于为研究PAHs 暴露造成的危害提供试验数据，分析影响实验动物PAHs 暴露的危险因素。
一种所述的同步测定血液中多种多环芳烃的方法的应用，其特征在于，将其全血样品中PAHs 质量浓度的检测数据，用于分析、确定待测人群PAHs 负荷水平及变化规律，进行内暴露的健康风险评估。
将其全血样品中PAHs 质量浓度的检测数据，进一步用于研究影响待测人群PAHs暴露的危险因素，为预防PAHs 暴露对待测人群造成的潜在危害提供数据支持。
相比现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明提供的同步测定血液中多种多环芳烃的方法，采用特定的处理和检测方法，可以实现将全血直接作为检测样品，样品量仅需500ul全血即可实现18种多环芳烃的组分分析，样本采集易于实现，特别是对于大鼠等血液量较少的小型试验动物而言，便于构建各种动物试验模型。
2、本发明提供的同步测定血液中多种多环芳烃的方法，采用小体积全血样本，通过冷冻离心和SPE萃取前处理，对样本进行提取、纯化和浓缩，以准确测定大鼠血液中PAHs的含量，这对构建动物模型、开展多环芳烃在生物体内的代谢、转运、合成和损伤研究具有重要意义。
3、本发明提供的同步测定血液中多种多环芳烃的方法，在SPE萃取前，先进行超声液液萃取，消除了大多数基质干扰，并提高SPE萃取效率；
4、本发明提供的同步测定血液中多种多环芳烃的方法，采用冰浴超声避免超声高温带来的组分损失；采用冷冻离心解决了超声过程中形成凝胶体系、难以分离出的PAHs的问题，提高了体系的萃取效率。
5、本发明提供的同步测定血液中多种多环芳烃的方法，其采用的氮吹浓缩将样本浓度提高了5倍，提高了方法的灵敏度。
6、本发明提供的同步测定血液中多种多环芳烃的方法，采用正己烷先对全血中的多环芳烃进行液液萃取，通过冷冻离心，分离出有机相，再将有机相在SPE萃取柱上进行净化，经溶液洗脱后氮吹至干，再用200ul溶剂复溶，上机待测。其中的正己烷-二氯甲烷体系沸点较低，易于氮吹，可最大化保护样本免于损失；前处理过程中有机溶剂的使用量大幅减少，降低检测成本。
7、发明提供的同步测定血液中多种多环芳烃的方法，除可用于测定大鼠全血中多环芳烃外，还可用于测定其他实验动物或者人体的血液、血清和血浆中的多环芳烃类有机物。
8、发明提供的同步测定血液中多种多环芳烃的方法的应用，将全血直接作为检测样品，样品量仅需500ul全血即可实现18种多环芳烃的组分分析，特别适合小型试验动物检测样本体积小，需要多次、少量、长期取血检验的需求，利用多次、定时采集样品并检测得到的全血样品中PAHs 质量浓度的检测数据，分析、确定大鼠等小型试验动物PAHs 负荷水平及变化规律，为进一步为研究PAHs 暴露造成的危害提供试验数据，分析影响实验动物PAHs暴露的危险因素提供了新的技术思路。
9、本发明提供的同步测定血液中多种多环芳烃的方法的应用，将其全血样品中PAHs 质量浓度的检测数据，用于确定待测人群PAHs 负荷水平及变化规律，进行内暴露的健康风险评估；并可以进一步用于研究影响待测人群PAHs 暴露的危险因素，为预防PAHs暴露对待测人群造成的潜在危害提供了新的思路。
附图说明
图1为本发明实施例1测定的18种PAHs总离子流示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1：
请参见图1，本发明实施例提供的同步测定血液中多种多环芳烃的方法，是以大鼠全血作为样品进行检测，其包括如下步骤：
S1. 样品采集
根据设定的时间，采集大鼠的血液，用装有抗凝剂的采血管采集新鲜血液后充分摇匀，取不少于500ul于聚四氟离心试管中，制得血样样品4份；
S1.1 预先选定的同步测定的血液中多种多环芳烃成分为18种，其分别为：1：萘；2 ：苊烯；3 ：苊；4 ：芴；5 ：菲；6 ：蒽；7 ：芘；8 ：荧蒽；9 ：䓛；10 ：苯并［a］蒽；11 ：苯并［j］荧蒽；12 ：苯并［b］荧蒽；13 ：苯并［k］荧蒽；14 ：苯并［a］芘；15 ：苯并［e］芘；16 ：二苯并［a，h］蒽；17 ：茚并［1，2，3-cd］芘；18 ：苯并［g，h，i］苝，该待测定的18种多环芳烃标准溶液的总离子流示意图见图1。
S1.2 根据预先选定的多环芳烃成分，向血样样品中加入萘-d8，苊-d10，菲-d10，䓛-d12，苝-d12，5种内标储备液200mg/L或以上浓度，持证标准溶液；色谱纯正的己烷、二氯甲烷；对所述的步骤S2-S5进行全程序质控，使得到5种氘代内标的回收率处于72%-112%之间；
S2.超声提取和冷冻离心
S2.1按血样样品：溶剂体积比=1:6的比例，向样品中加入正己烷，充分振摇后，冰浴下超声提取40min；
S2.2将提取液放于冰箱中至基质层冷冻到-18℃--20℃，再放于离心机上4500rpm离心10min，分离出上清液，得到第一次提取液；
S2.3 将S2.2的上清液移至新试管中，再向血样中加入3.0mL正己烷，重复上述S2.2的离心操作，将上清液取出、得到第二次提取液，与第一次提取液合并；
S3.SPE萃取
S3.1 SPE活化
依次用1.0ml甲醇和1.0ml超纯水活化SPE小柱，保持小柱湿润；
S3.2 上样
将合并后的正己烷萃取液缓缓倒入SPE小柱上，为确保萃取液中组分与SPE小柱充分键合，控制压力开关和限流阀，使流速保持在2ml/min；待萃取液流净后，增加压力，继续抽提2min；
S3.3 洗脱
用V/V=1：1正己烷和二氯甲烷的混合溶剂6.0mL，洗脱SPE小柱，收集洗脱液。
S4. 浓缩、复溶
将洗脱液氮吹至干燥，再用100ul溶剂复溶，制得浓缩液：其中，气相色谱用含内标的正己烷作为溶剂复溶，液相色谱用乙腈作为溶剂复溶；
S5. 上机
将浓缩液用气相色谱-串联质谱法检测，或采用气相色谱质谱联用仪检测，分析检测结果，计算得到样品中多种多环芳烃的各具体成分的浓度；共检测样品4份，检测结果如表1所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表1 大鼠血液测定结果（ng/mL）
本实施例的同步测定血液中多种多环芳烃的方法的应用，将其应用于构建PAHs诱发致癌性试验的动物试验模型，将多次、定时采集样品并检测得到的全血样品中PAHs 质量浓度的检测数据，用于分析、确定大鼠等小型实验动物PAHs 负荷水平及与诱发致癌相关的变化规律。
本实施例具体的操作，包括如下步骤：
一、专利的仪器试剂说明和实验条件优化
1仪器、试剂和材料准备
EDAA-2700T型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BY-400C型低速离心机（北京白洋医疗器械有限公司）；氮吹仪（美国Organomation公司）；固相萃取装置；500mgLC-18 小柱， 6mL；18种多环芳烃混标和5种内标（萘-d8，苊-d10，菲-d10，䓛-d12，苝-d12）储备液（美国o2si公司）：200mg/L或以上浓度，持证标准溶液；色谱纯正己烷、二氯甲烷（德国Merck公司）。
2实验条件优化
2.1在SPE萃取前增加萃取步骤
现有研究多是将血液样品直接上样到SPE萃取柱上进行净化，血液基质复杂，容易堵塞萃取柱，且在洗脱液中会残留血液中的水分，不利于后续氮吹。本专利在SPE净化前，先用正己烷对血样进行液液萃取，再将萃取液过SPE萃取柱净化。增加的这一步骤将多环芳烃萃取至有机相中，即消除了水份对后续氮吹的影响，又消除了大部分杂质干扰。
2.2 萃取体积的选择
根据文献报道，按照样本：溶剂1:6的体积加入溶剂进行萃取，为确保萃取效率，采取两次等量萃取的方式，分别向500ul全血样本中加入3mL正己烷萃取。
2.3超声提取
将加入萃取液的样本放入超声提取器中超声40min，为避免超声温度过高造成组分挥发，加入冰袋降温。
2.4 冷冻离心的选择
超声结束后，如发现部分样本出现乳化现象，则将样本至于冰箱中冷冻后，在离心机上4500rpm离心10min，使上清液与基质实现良好的分离。
二、检测操作步骤
1. 样品采集
以动物模型实验中的大鼠为采血对象，用装有抗凝剂的采血管采集新鲜血液后充分摇匀，取500ul于聚四氟离心管中。
2.超声提取和冷冻离心
按样本：溶剂体积比1:6的比例，加入3.0mL正己烷，充分振摇后，冰浴下超声提取40min，放于冰箱中至基质层冷冻，再放于离心机上4500rpm离心10min，分离上清液至新试管中，再向血样中加入3.0mL正己烷，重复上述操作，将上清液取出，与第一次提取液合并。
3.SPE萃取
3.1 SPE活化
依次用1.0ml甲醇和1.0ml超纯水活化SPE小柱，注意保持小柱的湿润，不能让水分流干。
3.2 上样
将合并后的正己烷萃取液缓缓倒入SPE小柱上，为确保萃取液中组分与SPE小柱充分键合，控制压力开关和限流阀，使流速保持在2ml/min。待萃取液流净后，增加压力，继续抽提2min。
3.3 洗脱
用6.0mL正己烷和二氯甲烷（V/V=1：1）的混合溶剂洗脱SPE小柱，收集洗脱液。
4 浓缩
将洗脱液氮吹至干，注意氮气流速不宜过高。用100ul溶剂复溶（气相色谱用含内标的正己烷为溶剂，液相色谱用乙腈为溶剂），待测。
5.质量控制和安全防护
5.1在整个样品前处理过程中加入内标物，进行全程序质控，得到5种氘代内标的回收率在72%-112%之间，准确度满足方法学的要求
5.2多环芳烃属于高风险化合物需要在专用实验场所开展实验，并使用专用器皿；实验者在操作过程中做好个人防护措施：佩戴口罩，帽子，手套，通风橱中进行操作；废弃溶剂、试剂、玻璃器皿、实验耗材等按实验室安全相关规定妥善处理。
实施例2：
本发明实施例提供的同步测定血液中多种多环芳烃的方法及其应用，其与实施例1基本上相同，其不同之处在于：
其是采用与实施例相同的步骤和方法，以处于特定环境区域内、存在健康暴露风险的待测人群的人体（如厨师、孕妇、儿童等）作为研究对象，将其全血做为样品进行检测。
所述的同步测定血液中多种多环芳烃的方法的应用，将人体全血样品中PAHs 质量浓度的检测数据，用于分析、确定待测人群（厨师、孕妇、儿童等）PAHs 负荷水平及变化规律，进行内暴露的健康风险评估。
同时，还可将其全血样品中PAHs 质量浓度的检测数据，进一步用于研究影响待测人群PAHs 暴露的危险因素，为预防PAHs 暴露对待测人群造成的潜在危害提供数据支持。
所述的步骤S1-S5还包括进行全过程安全防护的步骤，具体包括：在专用实验场所开展实验，并使用专用器皿；实验者在操作过程中做好个人防护措施，在通风橱中进行操作；废弃溶剂、试剂、玻璃器皿、实验耗材等按实验室安全相关规定妥善处理。
在其他实施例中，本发明的检测方法及应用，除用于测定大鼠全血中多环芳烃外，还可用于测定大鼠及人体的血清和血浆中的多环芳烃类有机物。
所述的小体积实验动物还可以为家兔（含幼兔）、鱼类（淡水或海水鱼）、禽类（含幼禽）、鸟类等；待测人群的人体，可以根据年龄、性别、职业、工作场所等选择，均可以达到本发明记载的技术效果。
在其他实施例中，采用本发明提供的检测方法，还可以将其得到的全血样品中PAHs 质量浓度的检测数据，进一步为研究人体、试验动物等因PAHs 暴露造成的危害提供试验数据，发现其生理、病理发展过程，用来分析影响实验动物PAHs 暴露的危险因素。
具体的采血方式为，使用采血针在小鼠、大鼠尾静脉，家兔耳缘静脉、耳廓中央动脉、后肢胫部皮下静脉取血。
在本发明记载的范围内，根据需要选择其他的对象、样品、组分、条件、参数而得到的其他技术方案，均可以实现本发明的技术效果，在此不再一一列出。
以上所述仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种同步测定血液中多种多环芳烃的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1. 样品采集
用装有抗凝剂的采血管采集新鲜血液后充分摇匀，取不少于500ul于聚四氟离心试管中，制得血样样品；
S2.超声提取和冷冻离心
S2.1按血样样品：溶剂体积比设定的比例，向样品中加入正己烷，充分振摇后，冰浴下超声提取；
S2.2将提取液放于冰箱中至基质层冷冻到-18℃--20℃，再放于离心机上离心，分离出上清液，得到第一次提取液；
S2.3 将S2.2的上清液移至新试管中，再向血样中加入3.0mL正己烷，重复上述S2.2的离心操作，将上清液取出、得到第二次提取液，与第一次提取液合并；
S3.SPE萃取
S3.1 SPE活化
依次用甲醇和超纯水活化SPE小柱，保持小柱湿润；
S3.2 上样
将合并后的正己烷萃取液缓缓倒入SPE小柱上，并确保萃取液中组分与SPE小柱充分键合；待萃取液流净后，增加压力，继续抽提；
S3.3 洗脱
用V/V=1：1的正己烷和二氯甲烷的混合溶剂，洗脱SPE小柱，收集洗脱液；
S4. 浓缩、复溶
将洗脱液氮吹至干燥，再用100ul溶剂复溶，制得浓缩液：其中，气相色谱用含内标的正己烷作为溶剂复溶，液相色谱用乙腈作为溶剂复溶；
S5. 上机
将浓缩液用气相色谱-串联质谱法检测，或采用气相色谱质谱联用仪检测，分析检测结果，计算得到样品中多种多环芳烃的各具体成分的浓度。
2.根据权利要求1所述的同步测定血液中多种多环芳烃的方法，其特征在于，
所述步骤S1中的样品采集步骤，采集新鲜血液的对象为小型试验动物或人体；其采集量不少于500ul。
3.根据权利要求1所述的同步测定血液中多种多环芳烃的方法，其特征在于，
所述S2超声提取和冷冻离心的步骤，具体为：
S2.1按血样样品：溶剂体积比=1:6的比例，向样品中加入正己烷，充分振摇后，冰浴下超声提取40min；
S2.2将提取液放于冰箱中至基质层冷冻到-18℃--20℃，再放于离心机上4500rpm离心10min，分离出上清液，得到第一次提取液；
S2.3 将S2.2的上清液移至新试管中，再向血样中加入3.0mL正己烷，重复上述S2.2的离心操作，将上清液取出、得到第二次提取液，与第一次提取液合并。
4.根据权利要求1所述的同步测定血液中多种多环芳烃的方法，其特征在于，
所述S3.SPE萃取的步骤，具体为：
S3.1 SPE活化
依次用1.0ml甲醇和1.0ml超纯水活化SPE小柱，保持小柱湿润；
S3.2 上样
将合并后的正己烷萃取液缓缓倒入SPE小柱上，为确保萃取液中组分与SPE小柱充分键合，控制压力开关和限流阀，使流速保持在2ml/min；待萃取液流净后，增加压力，继续抽提2min；
S3.3 洗脱
用V/V=1：1正己烷和二氯甲烷的混合溶剂6.0mL，洗脱SPE小柱，收集洗脱液。
5.根据权利要求1-4之一所述的同步测定血液中多种多环芳烃的方法，其特征在于，
所述S1还包括如下步骤：
S1.1 预先选定的同步测定的血液中多种多环芳烃成分为18种，其分别为：1：萘；2 ：苊烯；3 ：苊；4 ：芴；5 ：菲；6 ：蒽；7 ：芘；8 ：荧蒽；9 ：䓛；10 ：苯并［a］蒽；11 ：苯并［j］荧蒽；12 ：苯并［b］荧蒽；13 ：苯并［k］荧蒽；14 ：苯并［a］芘；15 ：苯并［e］芘；16 ：二苯并［a，h］蒽；17 ：茚并［1，2，3-cd］芘；18 ：苯并［g，h，i］苝；
S1.2 根据预先选定的多环芳烃成分，向血样样品中加入萘-d8，苊-d10，菲-d10，䓛-d12，苝-d12，5种内标储备液200mg/L或以上浓度，持证标准溶液；色谱纯正的己烷、二氯甲烷；对所述的步骤S2-S5进行全程序质控，使得到5种氘代内标的回收率处于72%-112%之间。
6.根据权利要求1所述的同步测定血液中多种多环芳烃的方法，其特征在于，
所述的步骤S1-S5还包括进行全过程安全防护的步骤，具体包括：在专用实验场所开展实验，并使用专用器皿；实验者在操作过程中做好个人防护措施，在通风橱中进行操作；废弃溶剂、试剂、玻璃器皿、实验耗材按实验室安全相关规定妥善处理。
7.一种根据权利要求1-6之一所述的同步测定血液中多种多环芳烃的方法的应用，其特征在于，将其应用于构建动物试验模型，将多次、周期性采集样品并检测得到的全血样品中PAHs 质量浓度的检测数据，用于分析、确定试验动物PAHs 负荷水平及变化规律。
8.根据权利要求7所述的同步测定血液中多种多环芳烃的方法的应用，其特征在于，将其得到的全血样品中PAHs 质量浓度的检测数据，进一步用于研究PAHs 暴露造成的危害，分析影响实验动物PAHs 暴露的危险因素。
9. 一种根据权利要求1-6之一所述的同步测定血液中多种多环芳烃的方法的应用，其特征在于，将其全血样品中PAHs 质量浓度的检测数据，用于分析、确定待测人群PAHs 负荷水平及变化规律，进行内暴露的健康风险评估。
10.根据权利要求9所述的同步测定血液中多种多环芳烃的方法的应用，其特征在于，将其全血样品中PAHs 质量浓度的检测数据，进一步用于研究影响待测人群PAHs 暴露的危险因素，为预防PAHs 暴露对待测人群造成的潜在危害提供数据支持。
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