CN103344718A

CN103344718A - 快速筛查尿中羟基多环芳烃的方法

Info

Publication number: CN103344718A
Application number: CN2013102629780A
Authority: CN
Inventors: 李雪; 李银萍
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2013-10-09

Abstract

本发明涉及一种快速筛查尿中羟基多环芳烃的方法，操作步骤是：（1）配制OH-PAHs单体母液；（2）配制OH-PAHs混标；（3）配制加标水解尿样；（4）PEEK固相萃取前处理尿样；（5）高效液相色谱-荧光检测分析样品；（6）数据分析。本发明以PEEK开管柱为SPE萃取柱提取尿中OH-PAHs，改善了现有固相萃取柱前处理技术中填充型固相萃取柱耗时长，前处理成本高，有机溶剂用量大的不足。该方法具有灵敏、简便、快速、装置易于获取、可重复利用且成本低等特点，适用于快速筛查职业和非职业暴露人群尿中OH-PAHs，对PAHs暴露人群健康风险评价研究意义重大。

Description

快速筛查尿中羟基多环芳烃的方法

技术领域

本发明涉及一种尿中羟基多环芳烃（Hydroxylated polycyclic aromatic hydrocarbons，OH-PAHs）的快速筛查方法，特别涉及一种聚醚醚酮（Polyetheretherketone，PEEK）材质开管柱为固相萃取柱快速提取尿中羟基多环芳烃（OH-PAHs），并采用高效液相色谱-荧光检测分析洗脱液的尿中OH-PAHs的快速筛查方法。

背景技术

尿中OH-PAHs是致癌性环境有机污染物PAHs的重要生物标志物，在人体对PAHs暴露及健康风险评价研究（如PAHs分子流行病学）中意义重大。

尿中OH-PAHs的检测流程主要包括样品前处理和仪器分析两部分，其中，样品前处理过程能够直接影响整个分析方法的灵敏度/检测限、重现性和分析速度。目前，文献报道尿中OH-PAHs的前处理技术主要包括：固相萃取（Solid phase extraction，SPE）、固相微萃取（Solid-phase microextraction，SPME）、液液萃取（Liquid-liquid extraction，LLE）、液液液微萃取（Liquid-liquid-liquid microextraction，LLLME）、免疫亲和萃取（Immunosorbent extraction）等。在上述前处理技术中，SPE因在萃取效果稳定性、萃取效率、商业产品成熟度等方面优势显著，而成为最常使用的前处理技术。

但是，目前SPE技术前处理尿中OH-PAHs常用的商业化固相萃取柱主要是不同材质的填充柱，需要通过抽真空等方法使样品和洗脱液等通过小柱，萃取过程耗时久，降低了尿中OH-PAHs分析方法的分析效率，无法满足PAHs暴露及其健康风险评价研究中高通量样品的分析需求。此外，现有SPE小柱多为一次性使用，分析大量样品时（几百个到几千个），分析成本较高。

发明内容

本发明的目的在于避免现有商业SPE萃取柱前处理尿中OH-PAHs过程繁冗且成本高的缺陷，提供一种以PEEK材质开管柱为SPE萃取柱前处理尿中OH-PAHs的快速筛查方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速筛查尿中羟基多环芳烃的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：

（1）准确称取羟基多环芳烃各单体溶于甲醇配浓度为95～105 mg L^–1的OH-PAHs各单体初级母液；再制成浓度为9.5～10.5 mg L^–1的各单体次级母液； 4± 0.2 ^oC密封避光保存；

（2）将步骤(1)所得各单体次级母液，用甲醇稀释为浓度0.95～1.05 mg L^–1的各单体混标母液，4 ± 0.2 ^oC密封避光保存；

（3）将0.1 M盐酸、0.5 M pH = 5的醋酸钠-醋酸、尿液和葡萄糖醛酸酶按50: 150: 400: 1的体积比混合均匀，避光条件下，37 ^oC恒温振荡水解反应12小时；取出水解后的尿样，离心分离10 min，取上清液即得水解尿样；

（4）将步骤(2)所得混标母液用步骤(3)所得水解尿样逐级稀释，得到羟基多环芳烃单体浓度为0.5–100 mg L^–1的暴露人群模拟尿样；

（5）首先用甲醇清洗PEEK开管柱，再用超纯水活化开管柱，然后用活化后的PEEK开管柱处理步骤(4)所得暴露人群模拟尿样和水解尿样，再用0.25–3倍样品体积的超纯水清洗开管柱，最后用0.25–3倍样品体积的甲醇洗脱开管柱，并将洗脱液氮吹浓缩，得到；

（6）分别在步骤(2)所得混标母液、步骤(5)所得的前处理后的样品和水解尿样中加入咔唑KZ内标；再用HPLC-FD法分别进行分析；每个PAHs暴露人群模拟尿样重复分析 ≥ 3次；其中高效液相色谱HPLC的参数设置为：流速0.8 mL min^–1；柱温30–40 ^oC；进样量20 mL；HPLC水-甲醇流动相（体积比）梯度洗脱程序：0–20 min，60 %甲醇；20–26 min，60 %–95 %甲醇；26–33 min，95 %甲醇；33–34 min，95 %–60 %甲醇；34–44 min，60 %甲醇，其他参数自动优化得到；荧光检测器FD的参数设置为：激发波长/发射波长（Ex/Em）时间切换程序：0–9 min，Ex/Em =227/355 nm；9–15 min，Ex/Em =275/330 nm；15–19 min，Ex/Em =250/360 nm；19–21 min，Ex/Em =252/386 nm；21–26.5 min，Ex/Em =265/351 nm；26.5–28 min，Ex/Em =242/396 nm；28–29 min，Ex/Em =262/375 nm，其他参数自动优化得到；

上述的羟基多环芳烃各单体为：2-羟基萘2-OHNap、2-羟基芴2-OHFlu、2-羟基菲2-OHPhe、3-羟基菲3-OHPhe、4-羟基菲4-OHPhe、9-羟基菲9-OHPhe、1-羟基芘1-OHPyr、6-羟基屈6-OHChr和3-羟基苯并a芘3-OHBaP。

配制水解尿样的原因是为下一步配制PAHs暴露人群模拟尿样提供基质；水解尿样取自非PAHs暴露人体，因此其中的OH-PAHs的浓度可忽略不计，不会影响前处理和检测结果。

采用水解尿样的原因是，尿中排出的OH-PAHs主要是以结合态的形式存在，如OH-PAHs的葡糖苷酸结合物，因此现有尿中OH-PAHs分析方法中，都是先将尿样水解，得到游离态的OH-PAHs，然后再进行前处理（萃取净化）和仪器检测。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著进步：本发明采用了PEEK固相萃取-高效液相色谱-荧光检测方法，快速筛查尿中OH-PAHs，其中前处理过程采用PEEK开管柱作为SPE萃取柱，在前处理条件未经优化、上样量仅为20 mL的条件下，尿中3-OHBaP和1-OHPyr定量限浓度可低至0.6 mg L^–1，低中环（2~3环）OH-PAHs定量限浓度可低至2.0 mg L^–1；其次，PEEK材质易于吸附中高环OH-PAHs（如3-OHBaP、1-OHPyr），因此尤适于评价人体对强致癌性中高环PAHs（如3-OHBaP）暴露的健康风险；第三，PEEK管通透性好、材料易于获取，且可重复利用，分析成本远低于现有商业SPE萃取柱产品；最后，尿样前处理过程简单、快速（< 2.5 min），易于操作，有机溶剂用量少，降低了分析成本，同时更为绿色环保。

本发明以PEEK开管柱为前处理SPE萃取柱提取尿中OH-PAHs，提高了分析效率，减少了现有SPE萃取柱前处理技术中所需有机溶剂用量与样品体积，改善了SPE柱一次性使用导致分析成本高的不足。该方法具有灵敏、简便、装置易于获取等特点，可快速筛查职业和非职业暴露人群尿中OH-PAHs，尤其是尿中具有强致癌性的中高环OH-PAHs（如3-OHBaP），对PAHs暴露人群健康风险评价研究意义重大。本发明可快速筛查尿中OH-PAHs，有望满足PAHs暴露及其健康风险评价研究中高通量样品的分析需求。

附图说明

图1为本发明OH-PAHs混标中OH-PAHs单体的色谱图。

图2为本发明OH-PAHs暴露人群模拟尿样的洗脱液中OH-PAHs单体色谱图。

图3为本发明水解尿样的洗脱液色谱图。

图4 为本发明3-OHBaP单体内标法标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的优选实施例作详细说明，本发明不仅局限于以下实施例，实施例中实验条件仅作为典型情况的说明，并非对本发明的限定。

本发明所述的实施例使用的PEEK材质开管柱为美国Agilent公司的PEEK管商品，液相色谱仪和荧光检测器均为美国Waters公司的2695高效液相色谱仪与2475荧光检测器。具体操作步骤如下：

（1）配制OH-PAHs单体初级和次级母液：准确称取10.0 ± 0.5 mg OH-PAHs各单体，包括2-羟基萘（2-OHNap），2-羟基芴（2-OHFlu），2-羟基菲（2-OHPhe），3-羟基菲（3-OHPhe），4-羟基菲（4-OHPhe），9-羟基菲（9-OHPhe），1-羟基芘（1-OHPyr），6-羟基屈（6-OHChr）和3-羟基苯并a芘（3-OHBaP），置入大瓶中，加入甲醇溶解，得到浓度为100 ± 5 mg L^–1的OH-PAHs各单体初级母液；移取一定体积OH-PAHs各单体初级母液，用甲醇稀释为浓度10 ± 0.5 mg L^–1的OH-PAHs各单体标液；将OH-PAHs初级和次级母液转移至棕色小瓶中，4± 0.2 ^oC密封避光保存。

（2）配制OH-PAHs混标母液：移取一定体积OH-PAHs各单体次级母液，用甲醇稀释为浓度1± 0.05 mg L^–1的OH-PAHs母液混标液，并将标液转移至棕色小瓶中，4 ± 0.2 ^oC密封避光保存。

（3）配制水解尿样：取0.5 mL 0.1 M盐酸、1.5 mL 0.5 M醋酸钠-醋酸缓冲溶液（pH = 5）、4 mL尿液和10 mL葡萄糖醛酸酶于玻璃离心管中。避光条件下，37 ^oC恒温振荡水浴12小时。取出水解后的尿样，12000 rcf离心10 min，取上清液即得水解尿样。

（4）配制PAHs暴露人群模拟尿样：取一定体积 OH-PAHs混标母液（浓度为1 ± 0.05 mg L^–1），用2 mL水解空白尿样稀释，得到OH-PAHs浓度为0.5–50 mg L^–1的PAHs暴露人群模拟尿样。

（5）PEEK管预处理尿样：首先用0.5 mL甲醇清洗PEEK管，再用0.5 mL超纯水（电阻率18.2 MW·cm）活化PEEK管，然后用活化后的PEEK管处理体积为2.0 mL的PAHs暴露人群模拟尿样（OH-PAHs浓度为0.5–50 mg L^–1）和水解空白尿样，再用0.5 mL超纯水清洗PEEK管，最后用1 mL甲醇洗脱PEEK管，并将洗脱液氮吹浓缩到200 mL。

（6）高效液相色谱（HPLC）参数设置：流速0.8 mL min^–1；柱温40 ^oC；进样量20 mL；HPLC水-甲醇流动相（体积比）梯度洗脱程序：0–20 min，60 %甲醇；20–26 min，60 %–95 %甲醇；26–33 min，95 %甲醇；33–34 min，95 %–60 %甲醇；34–44 min，60 %甲醇。其他参数自动优化得到。

（7）荧光检测器（FD）参数设置：激发波长/发射波长（Ex/Em）时间切换程序：0–9 min，Ex/Em =227/355 nm；9–15 min，Ex/Em =275/330 nm；15–19 min，Ex/Em =250/360 nm；19–21 min，Ex/Em =252/386 nm；21–26.5 min，Ex/Em =265/351 nm；26.5–28 min，Ex/Em =242/396 nm；28–29 min，Ex/Em =262/375 nm，其他参数自动优化得到。

（8）样品检测：分别向OH-PAHs混标和前处理后的样品中，加入相同质量的咔唑（KZ）内标，用于内标法定量样品中OH-PAHs单体。HPLC-FD分析OH-PAHs混标标液、PAHs暴露人群模拟尿样和水解空白尿样。每个PAHs暴露人群模拟尿样重复分析 3次。

（9）定性定量分析：以OH-PAHs混标谱图中OH-PAHs单体保留时间为参照（图1），对比OH-PAHs暴露人群模拟尿样（图2）和空白水解尿（图3）的色谱图中OH-PAHs保留时间处的信噪比（S/N）值确认模拟尿中除2-OHNap外，其他8种单体可均被检出且定量，尤其是高环化合物（1-OHPyr，6-OHChr和3-OHBaP）的定量限浓度可低至0.6 mg L^–1。采用内标法定量OH-PAHs单体。首先，以OH-PAHs单体和内标KZ的峰面积的比值为纵坐标（Y），以各单体与内标KZ质量的比值为横坐标（X），对OH-PAHs梯度混标实验数据进行线性回归分析，绘制各单体标准曲线。如图4所示，3-OHBaP单体标准曲线回归方程Y = 1.9551X–0.0517（R ² =0.9994），暴露人群模拟尿样中3-OHBaP单体与内标KZ的色谱峰面积比为3.958（图2），由标准曲线定量求出检出3-OHBaP单体质量为13.73 g，再除以样品体积2 mL，即检出样品中3-OHBaP单体浓度为6.86 mg L^–1，日内重复检测3次结果的相对标准偏差为15.5 %。

Claims

1.一种快速筛查尿中羟基多环芳烃的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：

（3）将0.1 M盐酸、0.5 M pH = 5的醋酸钠-醋酸、尿液和葡萄糖醛酸酶按50: 150: 400: 1 的体积比混合均匀，避光条件下，37 ^oC恒温振荡水解反应12小时；取出水解后的尿样，离心分离10 min，取上清液即得水解尿样；

（5）首先用甲醇清洗PEEK开管柱，再用超纯水活化开管柱，然后用活化后的PEEK开管柱处理步骤(4)所得暴露人群模拟尿样和水解尿样，再用0.25–3倍样品体积的超纯水清洗开管柱，最后用0.25–3倍样品体积的甲醇洗脱开管柱，并将洗脱液氮吹浓缩；

（6）分别在步骤(2)所得混标母液、步骤（5）所得的前处理后的样品和水解尿样中加入咔唑KZ内标；再用HPLC-FD法分别进行分析；每个PAHs暴露人群模拟尿样重复分析 ≥ 3次；其中高效液相色谱HPLC的参数设置为：流速0.8 mL min^–1；柱温30–40 ^oC；进样量20 mL；HPLC水-甲醇流动相（体积比）梯度洗脱程序：0–20 min，60 %甲醇；20–26 min，60 %–95 %甲醇；26–33 min，95 %甲醇；33–34 min，95 %–60 %甲醇；34–44 min，60 %甲醇，其他参数自动优化得到；荧光检测器FD的参数设置为：激发波长/发射波长Ex/Em时间切换程序：0–9 min，Ex/Em =227/355 nm；9–15 min，Ex/Em =275/330 nm；15–19 min，Ex/Em =250/360 nm；19–21 min，Ex/Em =252/386 nm；21–26.5 min，Ex/Em =265/351 nm；26.5–28 min，Ex/Em =242/396 nm；28–29 min，Ex/Em =262/375 nm，其他参数自动优化得到。

2.根据权利要求1所述的快速筛查尿中羟基多环芳烃的方法，其特征在于所述的羟基多环芳烃各单体为：2-羟基萘2-OHNap、2-羟基芴2-OHFlu、2-羟基菲2-OHPhe、3-羟基菲3-OHPhe、4-羟基菲4-OHPhe、9-羟基菲9-OHPhe、1-羟基芘1-OHPyr、6-羟基屈6-OHChr和3-羟基苯并a芘3-OHBaP。