CN114354790A

CN114354790A - 一种检测水产品中7种卤代咔唑类化合物的方法

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Publication number: CN114354790A
Application number: CN202111630866.7A
Authority: CN
Inventors: 蒋玲波; 高卓瑶; 王萍亚; 唐雷鸣; 刘婷; 戴意飞; 陈翔; 倪鲁波
Original assignee: Zhoushan Institute For Food And Drug Control
Current assignee: Zhoushan Institute For Food And Drug Control
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2022-04-15

Abstract

本发明公开了一种检测水产品中7种卤代咔唑类化合物的方法，将标准品或待测样品通过色谱柱分离保留进入质谱，进行准确质量数的采集，优化质谱电压，扫描采集参数，旨在有效分离7种卤代咔唑类化合物，并对其进行准确定性、定量；通过上述优化建立水产品中卤代咔唑类化合物快速、高效、灵敏的检测方法。本发明方法利用气相色谱‑三重四极杆串联质谱定性定量功能，对水产品中卤代咔唑类化合物进行检测，具有操作简便快速、能有效地减少基质成分的干扰、高灵敏度、高分辨率等优点。

Description

一种检测水产品中7种卤代咔唑类化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种检测水产品中7种卤代咔唑类化合物的方法，属于水产品检测技术领域。

背景技术

咔唑(9H-Carbazole，CZ，分子式C12H9N)及其衍生物是一类含氮的杂环芳烃化合物，被广泛用于光电材料、染料、医药和超分子识别等诸多领域中。多卤代咔唑(polyhalogenated 9H-carbazoles，PHCZs)是指咔唑环上的氢原子被卤素原子(Cl、Br或I)所取代的一类化合物。PHCZs是一类与多氯二苯并呋喃结构相类似的新型有机污染物。近年来，已被欧盟委员会定义为具有潜在持久性、生物积累性的有毒物质(PBT)。毒理学研究表明，接触咔唑和卤代咔唑对人类健康有不利影响。由于PHCZs与多卤代二苯并呋喃的结构相似，并且能与Ah-受体结合，因此具有致癌和致突变的类二噁英毒理效应，能够诱导啮齿动物、水生动物和人类致癌、致畸和致突变。

环境中的PHCZs来源较为复杂，包括人为源和自然源。对于海洋生态系统而言，水体中出现卤代咔唑，绝大部分归因于人为源。例如，27-BCZ、36-BCZ和36-ICZ等光电材料聚合物合成的中间体，发生泄露或降解进入到环境；染料卤代靛蓝的生产过程中伴随着一些副反应，产生咔唑和卤化苯胺，经过一系列反应生成PHCZs。使用大量的灭草隆和绿谷隆等对氯苯胺类农药，降解后会产生对氯苯胺，进而转化为氯代咔唑进入到土壤中。自然源有火山爆发、森林火灾、生物酶催化反应、光降解等。PHCZs在自然环境中性质稳定，能长时间残留于水体、土壤、沉积物、空气中。由于其具有潜在持久性和生物积累性，在各种水生物种和海洋物种中也检测到了PHCZs的存在，包括鱼类、贝类、海豹等。

随着对卤代咔唑的不断研究探索，至今已在环境中检测到20多种卤代咔唑类物质，但是作为一类新型污染物质，卤代咔唑的许多性质还不为人知。迄今为止，关于卤代咔唑的毒理学性质及其环境行为方面的知识仍旧非常有限，对其污染的研究也主要集中于水体和土壤中，在水产品中的研究相对较少。目前国内外尚未见系统的水产品中卤代咔唑的检测报道。

本发明采用气相色谱质谱联用技术，建立水产品中多种卤代咔唑的高通量检测技术，实现对水产品中以3-氯咔唑、3-溴咔唑、3,6-二氯咔唑、3,6-二溴咔唑、2,7-二溴咔唑、1,3,6,8-四溴咔唑为代表的多种卤代咔唑的快速分离和准确测定。该方法灵敏度、准确性，定性能力强，且前处理简单，能实现在线自动化检测的要求，从而实现用气相色谱-三重四极杆串联质谱联用方法对未知样品快速进行定量分析的目的，达到更绿色、高效、快速的、高通量检测水产品中卤代咔唑类化合物。本方法操作简单，可达到满意的回收率，有效的去除杂质干扰，其灵敏度高，检测限低，适用于水产品中卤代咔唑类化合物含量的检测工作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种检测水产品中7种卤代咔唑类化合物的方法，本发明方法利用气相色谱-三重四极杆串联质谱定性定量功能，对水产品中卤代咔唑类化合物进行检测，具有操作简便快速、能有效地减少基质成分的干扰、高灵敏度、高分辨率等优点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测水产品中7种卤代咔唑类化合物的方法，包括以下步骤：

(1)配置标准品：

移取7种卤代咔唑类化合物混合标准溶液于容量瓶中用丙酮定容后得到混合标准储备液，然后利用丙酮逐级稀释混合标准储备液，得到浓度逐级变化的混合标准溶液系列；

(2)样品提取和净化：

将待测的水产品样品和硅藻土混匀，将均匀试样依次进行加速溶剂萃取仪萃取、凝胶渗透色谱仪净化、有机滤膜过滤后得到净化液，待上机检测；

(3)测定分析混合标准溶液系列：

将步骤(1)中得到的混合标准储备液进行色谱分离、质谱测定分析，得到各种卤代咔唑类化合物的保留时间和特征离子，以及总离子流质量色谱图和各卤代咔唑类化合物的离子碎片质量色谱图；将步骤(1)中的到的浓度逐级变化的混合标准溶液系列也进行色谱分离、质谱测定分析，每个浓度测定3次，以特征离子的峰面积Y对其质量浓度X进行线性回归绘制标准曲线；

(4)定性定量水产品样品中7种卤代咔唑类化合物：

将步骤(2)中的到水产品样品的净化液按照步骤(3)中的条件进行色谱分离、质谱测定分析，得到水产品样品的色谱图和峰面积，与步骤(3)中的质量色谱图进行匹配分析且带入标准曲线进行计算，通过外标法能够定性、定量分析测定出水产品样品中的7种卤代咔唑类化合物。

上述技术方案中，步骤(1)中，所述的7种卤代咔唑类化合物，为咔唑、3-氯咔唑、3-溴咔唑、3，6-二氯咔唑、3，6-二溴咔唑、2，7-二溴咔唑、1，3，6，8-四溴咔唑。

上述技术方案中，步骤(1)中，所述的7种卤代咔唑类化合物混合标准溶液，质量浓度为1000mg/L，每种卤代咔唑类化合物称取相同的质量后用丙酮溶解制备而成。

上述技术方案中，步骤(1)中，准确移取7种卤代咔唑类化合物混合标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用丙酮定容至100ml，制备成10ng/L的混合标准储备液，于-20℃下储存备用。

上述技术方案中，步骤(1)中，所述的混合标准溶液系列，逐级变化的浓度为0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。

上述技术方案中，步骤(2)中，所述的水产品样品与硅藻土的质量比为1:3，精准称取2.00g水产品样品与6.00g硅藻土混匀，得到均匀试样。

上述技术方案中，步骤(2)中，所述的均匀试样利用加速溶剂萃取仪(acceleratedsolvent extractor，ASE)进行萃取是，将其将置于萃取池中，萃取用的溶剂为二氯甲烷、用量为45mL，将萃取温度设定为100℃、萃取压力设定为1500psi；在溶剂作用下静态循环萃取2次，每次静态萃取的时间设定为5min，萃取完成后，将萃取液氮吹浓缩至10ml得到提取液，再对提取液进行净化。

上述技术方案中，步骤(2)中，利用凝胶渗透色谱仪(gel permeationchromatograph，GPC)进行净化时，凝胶渗透色谱仪的净化条件为：Bio－beads S－X3玻璃凝胶色谱柱(470mm×40mm，271～327mm(200～

400目)；流动相为乙酸乙酯－环己烷，体积比1∶1，流速5.0mL/min；流出液收集时间4～12min；净化完成后将提取液氮吹浓缩至近干，再用丙酮定容到1ml后进行过滤。

上述技术方案中，步骤(2)中，利用有机膜进行过滤是，所述的有机滤膜规格为0.22μm。

上述技术方案中，步骤(3)中，色谱条件为：色谱柱：Agilgent HP-5MS，规格为30m×250μm×0.25μm；升温程序：起始温度为50℃，并保持3min，再以10℃/min的速度升温至300℃，并保持10min；载气为氦气，其流速1.1mL/min；恒压，压力：8.4679psi；进样口温度：280℃，进样量1μL；进样模式为不分流进样。

上述技术方案中，步骤(3)中，质谱条件为：电子轰击(EI)离子源，电子能量为70eV；碰撞气体为氮气；数据采集模式为多反应监测模式(MRM)；离子源温度为280℃；四极杆温度：280℃；溶剂延迟时间：5min。

本发明中，将标准品或待测样品通过色谱柱分离保留进入质谱，进行准确质量数的采集，优化质谱电压，扫描采集参数，旨在有效分离7种卤代咔唑类化合物，并对其进行准确定性、定量。通过上述优化建立水产品中卤代咔唑类化合物快速、高效、灵敏的检测方法。

现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的检测方法操作简便快速，自动化程度高，灵敏度高，水产品基质下其检出限可达ppb以下，其回收率及重复性能满足日常检测的要求，采用气相色谱-三重四极杆串联质谱的方法实现了在线富集净化分离分析的功能。而且，本方法具有高通量、高灵敏度、高分辨率，高质量精确度及可行的线性范围，利用气相色谱-三重四极杆串联质谱定性定量的功能，对水产品中卤代咔唑类化合物进行检测，大大地减少了假阳性等误判事件，促进水产品行业持续健康发展有巨大的现实意义，也可为食品行业监管部门和检测机构提供有利的技术储备，应用前景广泛。

附图说明

图1为7种卤代咔唑类化合物总离子流质量色谱图(+TIC MRM(**->**)STD6.D(STD6))；

图2a、2b和2c为咔唑离子碎片质量色谱图(2a为+MRM(167.1->139.1)STD6.D；2b为167.1->139.1，167.1->115.1＝19.0(100.3％)；2c为+MRM(19.943-20.154min)(167.1->**)STD6.D)；

图3a、3b和3c为三氯咔唑离子碎片质量色谱图(3a为+MRM(201.0->166.1)STD6.D；3b为201.0->166.1，201.0->140.1＝40.3(100.5％)；3c为+MRM(22.611-22.808min)(201.0->**)STD6.D)；

图4a、4b和4c为三溴咔唑离子碎片质量色谱图(4a为+MRM 244.9->166.1)STD6.D；4b为244.9->166.1，244.9->139.1＝46.3(100.5％)；4c为+MRM(23.740-23.941min)(244.9->**)STD6.D)；

图5a、5b和5c为3,6二氯咔唑离子碎片质量色谱图(5a为+MRM 234.9->200.1)STD6.D；5b为234.9->200.1，234.9->164.1＝23.8(101.9％)；5c为+MRM(25.090-25.297min)(234.9->**)STD6.D)；

图6a、6b和6c为3,6二溴咔唑离子碎片质量色谱图(6a为+MRM 324.9->165.1)STD6.D；6b为324.9->165.1，324.9->246.0＝25.3(73.4％)；6c为+MRM(27.070-27.195min)(324.9-->**)STD6.D)；

图7a、7b和7c为2,7二溴咔唑离子碎片质量色谱图(7a为+MRM 324.9->165.1)STD6.D；7b为324.9->165.1，324.9->244.0＝40.1(100％)；7c为+MRM(27.195-27.362min)(324.9-->**)STD6.D)；

图8a、8b和8c为1,3,6,8四溴咔唑离子碎片质量色谱图(8a为+MRM 482.7->322.9)STD6.D；8b为482.7->322.9，482.7->402.0＝84.3(101.3％)；8c为+MRM(29.412-29.602min)(482.7-->**)STD6.D)。

具体实施方式

以下对本发明技术方案的具体实施方式详细描述，但本发明并不限于以下描述内容：

本发明的实施例中，仪器及试剂如下所示：

1、主要仪器

气相色谱-三重四极杆串联质谱仪，7890B-7000D，美国安捷伦科技有限公司

加速溶剂萃取仪，350，美国戴安公司

凝胶渗透色谱仪，Freestyle SPE EVA，德国LCTech公司

氮吹浓缩仪：N-2110，日本EYELA公司

超纯水仪：Milli-Q型，美国Milli-pore公司。

2、试剂

丙酮：色谱纯，德国Merck公司；

标准品：咔唑、3-氯咔唑、3-溴咔唑、3，6-二氯咔唑、3，6-二溴咔唑、2，7-二溴咔唑、1，3，6，8-四溴咔唑，由杭州唯开科器贸易有限公司提供。

3、色谱条件

色谱柱：Agilgent HP-5MS，规格为30m×250μm×0.25μm；升温程序：起始温度为50℃，并保持3min，再以10℃/min的速度升温至300℃，并保持10min；载气为氦气，其流速1.1mL/min；恒压，压力：8.4679psi；进样口温度：280℃，进样量1μL；进样模式为不分流进样；

4、质谱条件

电子轰击(EI)离子源，电子能量为70eV；碰撞气体为氮气；数据采集模式为多反应监测模式(MRM)；离子源温度为280℃；四极杆温度：280℃；溶剂延迟时间：5min。

下面结合具体的实施例对本发明方法进行阐述：

实施例1：

(1)配置标准品：

准确移取7种卤代咔唑类化合物混合标准溶液(质量浓度为1000mg/L)1.0ml于100ml容量瓶中，用丙酮定容至100ml，制备成10ng/L的标准中间液，于-20℃下储存；将标准储备液分别用丙酮稀释至浓度为0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml，得到标准系列工作液，置于-20℃冰箱内避光保存、待测。

(2)样品提取和净化：

精准称取2.00g水产品样品与6.00g硅藻土混匀，将均匀试样置于加速溶剂萃取仪(accelerated solvent extractor，ASE)的萃取池中，在溶剂(45ml二氯甲烷)作用下静态循环萃取2次，将萃取温度设定为100℃、萃取压力设定为1500psi，每次静态萃取的时间设定为5min，萃取完成后，将萃取液氮吹浓缩至10ml得到提取液；

利用凝胶渗透色谱仪(gel permeation chromatograph，GPC)对提取液进行净化，净化条件为：Bio－beads S－X3玻璃凝胶色谱柱(470mm×40mm，271～327mm(200～400目)；流动相为乙酸乙酯－环己烷，体积比1∶1，流速5.0mL/min；流出液收集时间4～12min；净化完成后将提取液氮吹浓缩至近干，再用丙酮定容到1mL，过0.22μm有机滤膜后得到净化液，待上机检测；

(3)测定分析混合标准溶液系列：

本发明中，将标准品通过色谱柱分离保留进入质谱，进行准确质量数的采集，优化质谱电压，扫描采集参数，旨在有效分离7种卤代咔唑类化合物，并对其进行准确定性、定量。

将步骤(1)中得到的混合标准储备液按照上述优化的条件进行色谱分离、质谱测定分析，得到得到各卤代咔唑类化合物的保留时间和特征离子如表1所示；还得到了气相色谱-质谱总离子流图如图1所示，各卤代咔唑类化合物的离子碎片图如图2-图8所示；

表1为7种卤代咔唑类化合物的质谱参数

*标注的为定量离子对。

将步骤(1)中的到的浓度逐级变化的混合标准溶液系列进行GC-MS/MS测定分析，每个质量浓度测定3次，利用特征离子峰面积绘制标准曲线，以目标物的峰面积(Y)对其质量浓度(X，ng/ml)进行线性回归，得到7种卤代咔唑类化合物的线性范围、线性回归方程、相关系数、检出限、定量限，如表2：

表2为7种卤代咔唑类化合物的线性范围、线性回归方程、相关系数

由表2可知，本发明的气相色谱-串联质谱联用技术检测水产品中7种卤代咔唑类化合物的方法重现性好，线性范围广，相关系数达0.9949以上，其灵敏度高，检测限低，达到ppb级，能满足日常检测的要求。

(4)定性定量水产品样品中7种卤代咔唑类化合物：

本发明通过优化后的色谱条件、质谱条件，采用气相色谱-串联质谱联用技术进行检测，建立一个准确的检测方法；结合建立的方法对可疑样品，采用ASE萃取、GPC净化、色谱柱分离、质谱测定，检测分析水产品中的加标回收率；得到水产品样品的色谱图和峰面积后，与步骤(3)中的质量色谱图进行匹配分析且带入标准曲线进行计算，通过外标法能够定性、定量分析测定出水产品样品中的7种卤代咔唑类化合物。

(5)确证

对原始数据进行处理并结合数据库进行匹配，采用质谱进行分析，然后自动生成确证结果，对阳性制备样品保留时间结合离子源进一步确证。

通过上述优化建立水产品中卤代咔唑类化合物快速、高效、灵敏的检测方法。现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的检测方法操作简便快速，自动化程度高，灵敏度高，水产品基质下其检出限可达ppb以下，其回收率及重复性能满足日常检测的要求，采用气相色谱-三重四极杆串联质谱的方法实现了在线富集净化分离分析的功能。而且，本方法具有高通量、高灵敏度、高分辨率，高质量精确度及可行的线性范围，利用气相色谱-三重四极杆串联质谱定性定量的功能，对水产品中卤代咔唑类化合物进行检测，大大地减少了假阳性等误判事件，促进水产品行业持续健康发展有巨大的现实意义，也可为食品行业监管部门和检测机构提供有利的技术储备，应用前景广泛。

实施例2：

(1)配置标准品：

准确移取7种卤代咔唑混合标准溶液(质量浓度为1000mg/L)1.0ml于100ml容量瓶中，用丙酮定容至100ml，制备成10ng/L的标准中间液，于-20℃下储存。将标准储备液分别用丙酮稀释至浓度为0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的标准系列工作液，置于-20℃冰箱内避光保存、待测。

(2)样品提取和净化：

(3)测定分析混合标准溶液系列：

通过优化后的色谱条件、质谱条件，采用气相色谱-串联质谱联用技术进行检测，建立一个准确的检测方法。结合建立的方法对可疑样品，采用ASE萃取，GPC净化，色谱柱分离，质谱测定这些与实施例1相同，在此不再细述。

(4)确证

检测分析水产品中的加标回收率：选用阴性水产品样品，按步骤(2)进行前处理，取1mL待测液，并分别加入10μl 2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml 3个浓度水平的混合标准工作溶液，进行加标回收试验，每个浓度水平取6个平行样，使用GC-MS/MS进行分析检测(色谱和质谱条件同上)，结果见表3。

表3为水产品中7种卤代咔唑类化合物的回收率及相对标准偏差(n＝6)

本发明的气相色谱-串联质谱联用技术检测水产品中7种卤代咔唑类化合物的方法操作简便快速，灵敏度高，其回收率及重复性能满足日常检测的要求。该方法具有高通量、高灵敏度、高分辨率、高质量精确度及可行的线性范围，可利用质谱定性的功能，对卤代咔唑类化合物进行检测，大大地减少了假阳性等误判事件，极大地提升了检测机构对水产品风险的监测能力。结果表明，7种卤代咔唑类化合物在0.2～100ng/mL范围内线性关系良好，R²≥0.9949，相对标准偏差(RSD)为0.05％～4.60％(n＝6)。该方法简单、灵敏度高、分析时间短，适用于水产品中7种卤代咔唑类化合物的实际检测分析。

上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测水产品中7种卤代咔唑类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配置标准品：

(2)样品提取和净化：

(3)测定分析混合标准溶液系列：

将步骤(1)中得到的混合标准储备液进行色谱分离、质谱测定分析，得到各种卤代咔唑类化合物的保留时间和特征离子，以及总离子流质量色谱图和各卤代咔唑类化合物的离子碎片质量色谱图；将步骤(1)中的到的浓度逐级变化的混合标准溶液系列也进行色谱分离、质谱测定分析，每个浓度测定3次，进行线性回归绘制标准曲线；

(4)定性定量水产品样品中7种卤代咔唑类化合物：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的7种卤代咔唑类化合物，为咔唑、3-氯咔唑、3-溴咔唑、3，6-二氯咔唑、3，6-二溴咔唑、2，7-二溴咔唑、1，3，6，8-四溴咔唑。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的7种卤代咔唑类化合物混合标准溶液，质量浓度为1000mg/L，每种卤代咔唑类化合物称取相同的质量后用丙酮溶解制备而成。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，准确移取7种卤代咔唑类化合物混合标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用丙酮定容至100ml，制备成10ng/L的混合标准储备液，于-20℃下储存备用；所述的混合标准溶液系列，逐级变化的浓度为0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的水产品样品与硅藻土的质量比为1:3，精准称取2.00g水产品样品与6.00g硅藻土混匀，得到均匀试样。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的均匀试样利用加速溶剂萃取仪进行萃取是，将其将置于萃取池中，萃取用的溶剂为二氯甲烷、用量为45mL，将萃取温度设定为100℃、萃取压力设定为1500psi；在溶剂作用下静态循环萃取2次，每次静态萃取的时间设定为5min，萃取完成后，将萃取液氮吹浓缩至10ml得到提取液，再对提取液进行净化。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，利用凝胶渗透色谱仪进行净化时，凝胶渗透色谱仪的净化条件为：Bio－beads S－X3玻璃凝胶色谱柱(470mm×40mm，271～327mm(200～400目)；流动相为乙酸乙酯－环己烷，体积比1∶1，流速5.0mL/min；流出液收集时间4～12min；净化完成后将提取液氮吹浓缩至近干，再用丙酮定容到1ml后进行过滤。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，利用有机膜进行过滤是，所述的有机滤膜规格为0.22μm。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，色谱条件为：色谱柱：AgilgentHP-5MS，规格为30m×250μm×0.25μm；升温程序：起始温度为50℃，并保持3min，再以10℃/min的速度升温至300℃，并保持10min；载气为氦气，其流速1.1mL/min；恒压，压力：8.4679psi；进样口温度：280℃，进样量1μL；进样模式为不分流进样。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，质谱条件为：电子轰击(EI)离子源，电子能量为70eV；碰撞气体为氮气；数据采集模式为多反应监测模式(MRM)；离子源温度为280℃；四极杆温度：280℃；溶剂延迟时间：5min。