CN113970609B - 沉积物有机磷酸酯及代谢产物lc-ms/ms分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种沉积物有机磷酸酯及代谢产物LC‑MS/MS分析方法，包括：配制不同浓度梯度的有机磷酸酯及代谢产物的标准混合溶液，加入内标化合物，进行LC‑MS/MS测定，绘制各个有机磷酸酯及代谢产物的内标校正曲线；海洋沉积物样品中加入内标化合物，进行处理，复溶，进行LC‑MS/MS测定，定性分析、定量分析。本发明能够同时完成海洋沉积物中OPEs及其主要代谢产物的准确定性和定量分析，有效降低分析成本、提高分析效率。

Description

沉积物有机磷酸酯及代谢产物LC-MS/MS分析方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域。更具体地说，本发明涉及一种沉积物有机磷酸酯及代谢产物LC-MS/MS分析方法。

背景技术

有机磷酸酯(organophosphate esters,OPEs)是一类人工合成的磷酸衍生物，因具有良好的阻燃作用，同时兼具增塑和润滑效果，近年来被作为溴系阻燃剂的替代品广泛应用于建筑材料、电子产品、塑料制品、家装饰品和纺织品中。根据取代基不同，OPEs可以分为烷基取代、含卤原子的烷基取代以及芳香基取代OPEs。不同类型的OPEs，其应用领域也有所不同。其中，芳香基取代的OPEs(如三苯基磷酸酯(TPHP)、磷酸-2-乙基己酯二苯酯(EHDPP)、磷酸三甲苯酯(TMPP)等)主要作为阻燃增塑剂应用于PVC材料、纤维素聚合物、热塑性塑料以及合成橡胶中；含氯原子的烷基取代的OPEs(如磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)、磷酸三(2-氯丙基)酯(TCIPP)、磷酸三(1,3-二氯异丙基)酯(TDCIPP)等)常常作为阻燃剂添加到硬质和软质的聚氨酯泡沫材料中；不含氯原子的烷基取代的OPEs(磷酸三乙酯(TEP)、磷酸三丙酯(TPRP)、磷酸三正丁酯(TNBP)、磷酸三(丁氧基乙基)酯(TBOEP)、磷酸三异丁酯(TIBP)等)主要作为增塑剂应用于不饱和聚酯树脂、醋酸纤维素、聚氯乙烯以及合成橡胶等材料中。实际工业生产中常根据功能需求，同时添加一类或几类OPEs。

OPEs主要通过物理添加的方式加入产品中，容易在生产、使用和处置过程中泄露到环境中，且在污水处理厂中的去除效率有限，近年来已在全球多种环境介质和生物体中频繁检出。研究表明，OPEs具有致癌性、生育毒性及神经发育毒性，进入环境后严重威胁生态系统和人类健康，是国际公认的一类新型有机污染物。此外，多种OPEs在生物体内较容易通过磷酸酯氧脱烷基、氧化羟基化、氧化羧基化、氧化脱卤(氯代OPEs)代谢转化生成I相代谢产物，部分OPEs的I相羟基化代谢产物(HO-OPFRs)还可能较快的与葡萄糖醛酸等结合生成II相代谢产物，且部分代谢产物具有比母体更强的毒性。据文献报道，TBOEP是水生生物体内普遍检出且含量较高的一种OPEs，作为TBOEP的2种主要代谢产物，双(2-丁氧乙基)-3-羟基(2-丁氧乙基)磷酸酯(3-HO-TBOEP)和2-羟基乙基-双(2-丁氧乙基)磷酸酯(BBOEHP)在水环境中的污染现状亟待研究。

综上所述，开展海洋环境中OPEs及其主要代谢产物的分析技术研究和残留监测，对保护海洋生态系统和人类健康具有重要意义。然而，目前海洋环境基质中有机磷酸酯类污染物分析主要存在如下问题：(1)前处理方法上。目前沉积物中OPEs的前处理方法主要为索氏提取法、加速溶剂萃取法、超声提取法等。其中，索氏提取法最大的缺点在于提取时间较长(通常16～48h)，有机试剂消耗量大(约100～200mL)。加速溶剂萃取法虽然节省试剂且提取快速，但购买设备昂贵，一般小型公司或单位不具备条件。超声提取仪价格低廉，提取过程简单，试剂消耗量小，适合作为固体样品中有机污染物的提取方法。然而，不同于传统有机污染物，有机磷酸酯及其代谢产物结构组成各异，理化性质差异较大，极性宽泛，给同时监测分析带了很大困扰，现有方法至少需要分别建立两套样品前处理，才能满足沉积物中有机磷酸酯及其代谢产物的提取，耗时耗力。(2)检测方法上。目前沉积物中OPEs分析最常采用气相色谱质谱(GC-EI-MS)法，该方法主要存在两个缺点：一是对于部分化合物(尤其是烷基取代基磷酸酯)，除磷酸质子化的基峰(m/z＝99)外，EI-MS无法提供其他碎片离子进行定量分析，且低质量端的离子受基质干扰严重。二是不适用于挥发性较差的OPEs代谢物的分析，或分析时需要提前衍生化，步骤繁琐且容易引入误差。相比于GC-MS，液相色谱-质谱法(LC-MS)具有更高的选择性和灵敏度，适用于极性较强、难挥发的OPEs和代谢产物的分析。该方法主要有三个不足：一是可以同时分析的有机磷酸酯的种类较少；二是样品的分析时间过长，长达30分钟；三是OPEs与OPEs代谢产物通常分为两个方法分析。因此，关于OPEs及其主要代谢产物的样品前处理和检测方法仍需不断地改进。

基于LC-MS技术，通过优化样品提取、富集、净化以及色谱和质谱分析条件，研发同时分析沉积物中多种OPEs及其主要代谢产物的样品前处理和检测方法，可以有效缩短分析时间、降低分析成本，用于目标污染物的快速跟踪监测，为当前海洋环境中有机磷阻燃剂代谢产物的残留分析提供技术支撑，为水环境中有机磷阻燃剂的生态风险评价提供基础数据。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种沉积物有机磷酸酯及代谢产物LC-MS/MS分析方法，其能够同时分析海洋沉积物中OPEs及其主要代谢产物，有效降低分析成本、提高分析效率。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种沉积物有机磷酸酯及代谢产物LC-MS/MS分析方法，包括：

配制不同浓度梯度的有机磷酸酯及代谢产物的标准混合溶液，加入内标化合物，进行LC-MS/MS测定，以各个有机磷酸酯及代谢产物与内标化合物的浓度比为横坐标、峰面积比为纵坐标，绘制各个有机磷酸酯及代谢产物的内标校正曲线；

将海洋沉积物样品进行除杂、冻干、研磨前处理，得测量样品，加入内标化合物，用溶剂溶解、超声提取、固相萃取、洗脱、浓缩，得浓缩物样品，复溶，进行LC-MS/MS测定，根据标准混合溶液中各个有机磷酸酯及代谢产物的保留时间、母离子及特征碎片离子信息定性分析各个有机磷酸酯及代谢产物，将样品中测得的各个有机磷酸酯及代谢产物与内标化合物的峰面积比带入内标校正曲线，定量分析各个有机磷酸酯及代谢产物；

所述有机磷酸酯及代谢产物包括磷酸三乙酯，磷酸三丙酯，磷酸三正丁酯，磷酸三辛酯，磷酸三苯基酯，磷酸-2-乙基己酯二苯酯，磷酸三(2-氯乙基)酯，磷酸三(2-氯丙基)酯，磷酸三(1，3-二氯异丙基)酯，磷酸三(丁氧基乙基)酯，磷酸三甲苯酯，磷酸三异丁酯，双(2-丁氧乙基)-3-羟基(2-丁氧乙基)磷酸酯，2-羟基乙基-双(2-丁氧乙基)磷酸酯；

液相色谱条件为：以ZOBARX C₁₈色谱柱作为分离柱，长度100mm，内径2.1mm，填料粒径1.8μm；进样量5μL，柱温40℃；以含有5mmol/L乙酸铵和体积浓度为0.1％的甲酸的水溶液作为水相，以甲醇作为有机相；

质谱条件为：离子源温度340℃；毛细管温度350℃；鞘气温度350℃；鞘气流速11L/min；辅助气流量9L/min；电喷雾电压为4kV。

优选的是，内标化合物为TNBP-d27，TPHP-d15，TCIPP-d18或BBOEHEP-d4。

优选的是，绘制内标校正曲线时，用移液枪准确吸取0.5μL、1μL、2μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL的1mg/L的标准混合工作液，得到十种体积的标准混合工作液，每个体积的标准混合工作液中均加入100μL的1mg/L的内标化合物混合溶液，各自用甲醇稀释到1mL，振荡混匀得到十种不同浓度的标准混合工作液：0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL。

优选的是，将海洋沉积物样品进行除杂、冻干、研磨过80目筛前处理，得测量样品。

优选的是，将2g测量样品加入内标化合物，采用10mL溶剂，于室温超声提取、离心，收集上清液，重复2-3次，合并得提取液，氮气流缓慢吹至1mL，加入40mL超纯水，采用C₁₈固相萃取柱进行富集和净化，用淋洗液淋洗并收集洗脱液，氮气流缓慢吹至近干燥状态后，得浓缩物样品，用200μL甲醇复溶，进行LC-MS/MS测定。

优选的是，溶剂为乙腈。

优选的是，淋洗液为乙腈。

优选的是，洗脱为梯度洗脱，梯度洗脱设置为0-7min、7-16min、16-20min、20-20.1min、20.1-24min、24min以后，水相与有机相的体积比分别为40％:60％、20％:80％、3％:97％、3％:97％、40％:60％、40％:60％。

优选的是，母离子及特征碎片离子信息的获得方式为：

分别配制浓度为5μg/mL的各个有机磷酸酯及代谢产物的标准溶液，采用高效液相色谱三重四级杆质谱仪器配备的自动进样系统直接进样，在电喷雾正离子模式下采用全扫描模式进行分析检测，确定各个有机磷酸酯及代谢产物的母离子；

对各个有机磷酸酯及代谢产物施加不同碰撞能量，得到各个有机磷酸酯及代谢产物的二级碎片离子，各自选择两个响应强度较高的碎片离子作为特征碎片离子。

本发明至少包括以下有益效果：

第一、本发明通过对色谱质谱条件、样品提取和净化条件等多参数优化，建立一次性前处理、一针进样，同时分析沉积物中OPEs及其主要代谢产物的方法，将有效降低分析成本、提高分析效率；

第二、本发明基于LC-MS/MS技术，建立一套适用于沉积物中OPEs及其主要代谢产物同时分析的方法，可以有效避免GC-MS法分析OPEs过程中定量离子单一和背景离子干扰严重的问题，减少实际样品分析中假阳性的问题，使定性分析更为准确；

第三、本发明对分析方法的线性范围、回收率、检测低限、基质效应以及精密度等的考察验证，并应用于不同海域实际沉积物样品的监测，建立的分析方法准确性高、灵敏度高，可适用海洋沉积物样品的监测，为当前海洋环境中OPEs及其代谢产物的污染残留分析提供技术支撑和基础数据。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明的OPEs及其代谢产物的离子提取色谱图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

<实例1>

1仪器与试剂

Agilent 1290Ⅱ高效液相色谱系统(美国安捷伦公司)，Agilent 6470三重四级杆质谱(美国安捷伦公司)，超纯水仪(美国Millipore公司)，CHRIST Alpha 1-4 LSCbasic冷冻干燥机(德国Osterode公司)，Retsch MM400冷冻研磨机(德国莱驰公司)，色谱级甲醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷均购置自美国Merk公司，乙酸铵和甲酸购自美国Sigma公司，C₁₈固相萃取小柱购自上海安普公司。

12种有机磷酸酯，包括：磷酸三乙酯(TEP)，磷酸三丙酯(TPRP)，磷酸三正丁酯(TNBP)，磷酸三辛酯(TEHP)，磷酸三苯基酯(TPHP)，磷酸-2-乙基己酯二苯酯(EHDPP)，磷酸三甲苯酯(TMPP)，磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)，磷酸三(2-氯丙基)酯(TCIPP)，磷酸三(1，3-二氯异丙基)酯(TDCIPP)，磷酸三(丁氧基乙基)酯(TBOEP)，磷酸三异丁酯(TIBP)，标准品购自德国Dr.E公司、美国AccuStandard公司和加拿大TRC公司。

2种有机磷酸酯代谢物，包括：双(2-丁氧乙基)-3-羟基(2-丁氧乙基)磷酸酯(3-HO-TBOEP)，2-羟基乙基-双(2-丁氧乙基)磷酸酯(BBOEHP)，标准品购自德国Dr.E公司、美国AccuStandard公司和加拿大TRC公司。

4种内标化合物TNBP-d27，TPHP-d15，TCIPP-d18和BBOEHEP-d4购自加拿大TRC公司。

所有化合物均用乙腈配制浓度为100mg/L的标准贮备液备用。

2实验方法

2.1质谱条件：

所有化合物在电喷雾正离子模式(ESI+)下分析，具体参数设置为：离子源温度：340℃；毛细管温度：350℃；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；辅助气流量：9L/min；电喷雾电压为4kV。

2.2色谱条件：

以ZOBARX C₁₈色谱柱作为分离柱，长度100mm，内径2.1mm，填料粒径1.8μm；进样量5μL，柱温40℃；以5mmol/L乙酸铵(含0.1％甲酸)作为水相，以甲醇作为有机相进行色谱分离分析。流动相梯度设置如表1示出：

表1

2.3前处理方法：

沉积物样品去除贝壳、树枝等杂质，冷冻干燥后，研磨过80目筛混匀，备用。

称取2g上述沉积物于具塞玻璃瓶中，加入一定量内标化合物，采用10mL乙腈溶液，于室温下超声提取15min，将以3500rpm离心10min，收集上清液，重复上述过程2次，合并提取液，氮气流缓慢吹约至1mL；加入40mL超纯水，采用C₁₈(500mg,6mL)固相萃取柱进行富集和净化；用乙腈淋洗并收集洗脱液，缓慢氮吹至近干燥状态后，用200μL甲醇复溶，供LC-MS/MS分析。

2.4定性定量分析方法

内标校正曲线制备：制备十个浓度梯度的OPEs及代谢物混合标准溶液，这些标准溶液中每种目标物的浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL。其中，不同梯度浓度的目标物标准溶液中，内标化合物浓度始终保持在100ng/mL。在与步骤相同的色谱条件下进行LC-MS/MS测定；分别以各个有机磷酸酯及代谢产物与对应内标化合物的浓度比为横坐标、峰面积比为纵坐标，绘制内标校正曲线；

样品分析时，在同上步骤2.1、2.2的色谱质谱条件下，对待测样品中的目标物含量进行LC-MS/MS测定。

定性分析：根据每种化合物的保留时间、母离子及两个子离子信息，定性分析目标物；

采用内标法进行定量分析：实际沉积物样品组成复杂，同种目标物在不同样品中的回收效率、基质干扰可能会有所不同，本方法在样品提取前加入内标化合物，将样品中测得的目标物与对应内标化合物的峰面积比带入内标校正曲线，定量分析各目标物含量，可以有效抵消提取步骤及基质本身对结果的影响，使结果更为准确。

3结果讨论

3.1质谱条件优化

分别配制浓度为5μg/mL的待测化合物单个标准溶液，采用高效液相色谱三重四级杆质谱仪器配备的自动进样系统直接进样，在电喷雾正离子模式下采用全扫描模式(FullScan)进行分析检测，确定相应待测化合物的母离子；

在电喷雾正离子模式下采用子离子扫描模式(Product Ion)进行分析，对每种待测目标物施加不同碰撞能量，得到每种化合物的二级碎片离子，选择两个响应强度较高的碎片离子作为特征碎片离子。

3.2色谱条件优化

分别配制浓度为100μg/L的待测化合物混合标准溶液，在数据采集软件中输入优化得到的化合物母离子质量数、两个碎片离子质量数以及最佳碰撞能量，在多通道反应监测模式(MRM)下进行色谱条件的优化，包括色谱柱类型、流动相组成和流动相洗脱梯度。

分别比较了Agilent ZORBAX C₁₈柱(长度100mm，内径2.1mm，填料粒径1.8μm)和Agilent Poroshell C₁₈柱(长度100mm，内径2.1mm，填料粒径2.7μm)两种C₁₈柱作为分离柱时对目标化合物的分离情况，结果表明：以Agilent ZORBAX C₁₈柱作为分离柱时，所有化合物色谱峰型更为尖锐，响应值更高，同等洗脱梯度下对TIBP和TNBP同分异构体的分离更完全。因此，选择Agilent ZORBAX C18柱作为色谱柱，进行后续的条件优化实验。

本发明共涉及14种目标化合物，包括目标有机磷酸酯化合物12种，其主要代谢产物2种。上述14种化合物结构组成不同，挥发性、水溶解度等理化性质差异较大，且包含一对同分异构体化合物，给样品的同时分离带来一定困难。

为实现目标化合物最佳分离和响应，对流动相和梯度洗脱程序进行了优化。比较了甲醇、甲醇:乙腈(1:1，v/v)和乙腈分别作为有机相时对各物质的色谱行为和离子化程度的影响，结果表明：绝大多数目标化合物在甲醇作为流动相时可以同时获得较好的色谱分离和离子响应强度。以乙腈和甲醇:乙腈(1:1，v/v)作为有机相时，尽管对于部分OPEs来说，响应值较高于甲醇，然而TNBP和TIBP两种同分异构体难以完全分离，且TBOEP的两种代谢物色谱峰型较宽，响应值明显低于以甲醇为有机相的结果。为保证对所有化合物的完全分离，同时满足绝大多数的高灵敏度，因此选择甲醇作为有机相。

水相组成以及pH条件的变动，对化合物的色谱分离和质谱响应可能会产生明显影响。本发明分别比较了纯水、在纯水中添加0.1％甲酸，以及在纯水中同时添加0.1％甲酸和5mmol乙酸铵(NH₄Ac)三种不同水溶液作为水相时，目标化合物的色谱分离和离子响应情况。结果表明，水相中加入0.1％甲酸和5mmol乙酸铵后，绝大多数化合物的离子响应增强。OPEs及其代谢产物的高效液相色谱三重四级杆质谱信息如表2所示。

表2

样品提取和富集净化条件优化：

本发明涉及的14种OPEs及其主要代谢物，正辛醇水分配系数在0.8-9.5之间，跨度非常大，给样品的提取和富集净化带来了较大的挑战。

提取溶液优化：提取溶剂的选择既要保证对目标化合物的充分提取，又要尽可能避免提取过多的杂质。本发明采用超声辅助提取方式，根据化合物的亲脂性差异，并结合沉积物样品的基质特点，分别以甲醇、乙腈、二氯甲烷，以及等体积比例混合的乙腈:二氯甲烷(1:1，v:v)四种溶液作为提取溶液，进行回收率实验考察。结果表明，采用乙腈提取时获得绝大多数化合物的回收率最高；其次为甲醇和乙腈：二氯甲烷(1:1，v:v)，甲醇更适合正辛醇水分配系数较小的目标物的提取，乙腈：二氯甲烷(1:1，v:v)则相反。因此，本发明最终确立以乙腈作为提取溶液，优点是满足较好提取效果的同时，价格便宜，且毒性较小。

净化小柱优化：沉积物样品基质复杂，含有的色素、腐殖质等杂质严重干扰对目标化合物的离子响应，本发明采用较为简单且高效的样品净化方式——固相萃取，对提取溶液进行净化以达到去除干扰性杂质的效果。然而，基质和化合物理化性质不同时，固相小柱的选择也往往不同。实验分别采用Florisil、C₁₈、HLB作为净化小柱，进行空白沉积物加标回收率考察。结果表明，C₁₈柱对样品的净化效果最好，其次为Florisil柱，而HLB柱除了对BBOEHEP和3-OH-TBOEP两种代谢物的回收率相对较高外，其他化合物回收率普遍较低。因此，本发明最终确立以C₁₈柱作为净化柱。且相比于HLB柱，C₁₈柱的另一个优点是价格更便宜。

淋洗液优化：在确立的提取溶液和净化小柱条件下，分别比较了乙腈、甲醇和乙腈:二氯甲烷(3:1，v/v)作为淋洗液时，对C₁₈小柱上富集的目标化合物的洗脱效果，发现乙腈作为淋洗液时目标化合物洗脱效率最高。

3.3基质效应

沉积物基质组成复杂，样品溶液中存在基质干扰时可能导致假阳性或假阴性结果的出现。本发明对于所有OPEs及3-OH-TBOEP和BBOEHEP化合物，在优化的方法条件下进行空白沉积物样品提取，并用该提取液配制基质标准溶液上机分析，计算基质标准溶液与溶剂标准溶液中获得的目标物色谱峰面积比值来考察基质效应。结果表明，所有目标化合物的基质效应值在80％左右，表明存在轻微基质抑制效应，可以通过内标定量的方式予以消除。目标化合物的基质效应具体值如表3所示。

3.4目标化合物的线性范围、检出限、定量限

内标校正曲线制备：制备十个浓度梯度的OPEs及代谢物混合标准溶液，这些标准溶液中每种目标物的浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL。在优化的色谱质谱条件下进行测定，获得目标化合物的线性范围、检出限及定量限结果见表3。目标化合物的线性回归系数均大于0.999，表明方法的线性关系良好，可以进行精确定量。分别以3倍和10倍信噪比计算目标化合物的检出限和定量限，结果如表3所示。与已有报道相比，本发明建立的分析方法可实现的绝大多数OPEs更低的定量限。

表3

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3.5回收率和精密度

参照美国EPA标准，分别对空白沉积物进行5ng，20ng和50ng三个不同浓度的加标回收实验，每个加标水平下设进行6个平行，回收率及相对标准偏差(RSD)结果如表4所示。

表4

4实际样品检测

将建立的LC-MS/MS方法用于9份实际海洋沉积物样品中OPEs及其代谢物的检测，结果如表5所示。

表5

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5本发明与已有方法的区别和优势

本发明海洋沉积物中有机磷酸酯及其主要代谢产物的化学风险物质的检测方法与现有技术不同之处在于：

(1)本发明基于LC-MS/MS技术，建立一套适用于沉积物中OPEs及其主要代谢产物同时分析的方法，可以有效避免GC-MS法分析OPEs过程中定量离子单一和背景离子干扰严重的问题，减少实际样品分析中假阳性的问题，使定性分析更为准确。

(2)本发明共涉及12种OPEs和2种OPEs主要代谢产物的同时分析，通过优化液相条件与质谱条件解决了传统方法分析时间较长的问题，14种目标物在21min之内便可全部出峰，该方法色谱分离速度快、选择性和灵敏度好，在有效提高分析效率的同时，有助于减少仪器对气体和流动相的消耗，降低成本。

(3)与已有报道相比，本发明建立的分析方法可实现绝大多数OPEs更低的定量限，有利于环境中痕量OPEs及其代谢产物的准确定量。

(4)现有关于固体样品中OPEs及代谢物的检测方法至少需要分别建立两套样品前处理和仪器分析方法，两次提取，两次进样，才能完成沉积物中OPEs及其主要代谢产物的定性定量分析的问题，本发明通过对色谱质谱条件、样品提取和净化条件等多参数优化，建立一次性前处理、一针进样，同时分析沉积物中OPEs及其主要代谢产物的方法。运用该方法可实现目标有机磷酸酯及其代谢产物的快速定量测定，将极大减小人力、物力，降低分析成本、提高分析效率。

(5)OPEs因生产量大、使用广泛，且其本身及代谢产物毒性较大，对环境生态甚至人类健康构成威胁，已成为全球关注的新污染物之一。海洋环境中OPEs的污染研究起步较晚，而OPEs代谢产物的污染现状尚未见报道。本发明沉积物中OPEs及其主要代谢产物的分析方法，通过对本发明方法线性范围、回收率、检测低限、基质效应以及精密度等的考察验证，并应用于不同海域实际沉积物样品的监测，本发明建立的分析方法准确性高、灵敏度高，可适用海洋沉积物样品的监测，为当前海洋环境中OPEs及其代谢产物的污染残留分析提供技术支撑和基础数据。

(6)本发明涉及烷基取代、含卤原子的烷基取代和芳香基取代等三个不同类型的OPEs及其两个羟基化代谢产物，目标物结构组成和理化性质差异较大，如果仅以单个或少数内标化合物对所有目标物进行定量校正可能导致结果存在一定偏差。本发明在上述各类型化合物中选择一个同位素内标(即TNBP-d27，TCIPP-d18，TPHP-d15和BBOEHEP-d4)作为内标化合物进行校正分析，尽可能满足定量结果全面覆盖所有化合物的实际情况。

(7)实际沉积物样品基质复杂，粒径组成、有机质含量不同的沉积物对目标物的吸附能力和基质干扰能力各异，传统方法多通过在样品提取后、上机分析前加入内标化合物进行定量分析，此种方式仅能对基质效应起到一定的校正作用，而并不能校正操作过程对化合物的影响。本发明在样品前处理前加入内标化合物，随目标物一起完成整个前处理和仪器分析流程，使对目标化合物的定量分析更可靠。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.沉积物有机磷酸酯及代谢产物LC-MS/MS分析方法，其特征在于，包括：

配制不同浓度梯度的有机磷酸酯及代谢产物的标准混合溶液，加入内标化合物，进行LC-MS/MS测定，以各个有机磷酸酯及代谢产物与内标化合物的浓度比为横坐标、峰面积比为纵坐标，绘制各个有机磷酸酯及代谢产物的内标校正曲线；

将海洋沉积物样品进行除杂、冻干、研磨前处理，得测量样品，加入内标化合物，用溶剂溶解、超声提取、固相萃取、洗脱、浓缩，得浓缩物样品，复溶，进行LC-MS/MS测定，根据标准混合溶液中各个有机磷酸酯及代谢产物的保留时间、母离子及特征碎片离子信息定性分析各个有机磷酸酯及代谢产物，将样品中测得的各个有机磷酸酯及代谢产物与内标化合物的峰面积比带入内标校正曲线，定量分析各个有机磷酸酯及代谢产物；

所述有机磷酸酯及代谢产物包括磷酸三乙酯，磷酸三丙酯，磷酸三正丁酯，磷酸三辛酯，磷酸三苯基酯，磷酸-2-乙基己酯二苯酯，磷酸三(2-氯乙基)酯，磷酸三(2-氯丙基)酯，磷酸三(1，3-二氯异丙基)酯，磷酸三(丁氧基乙基)酯，磷酸三甲苯酯，磷酸三异丁酯，双(2-丁氧乙基)-3-羟基(2-丁氧乙基)磷酸酯，2-羟基乙基-双(2-丁氧乙基)磷酸酯；

液相色谱条件为：以ZOBARX C₁₈色谱柱作为分离柱，长度100mm，内径2.1mm，填料粒径1.8μm；进样量5μL，柱温40℃；以含有5mmol/L乙酸铵和体积浓度为0.1％的甲酸的水溶液作为水相，以甲醇作为有机相；

质谱条件为：离子源温度340℃；毛细管温度350℃；鞘气温度350℃；鞘气流速11L/min；辅助气流量9L/min；电喷雾电压为4kV。

2.如权利要求1所述的沉积物有机磷酸酯及代谢产物LC-MS/MS分析方法，其特征在于，内标化合物为TNBP-d27，TPHP-d15，TCIPP-d18或BBOEHEP-d4。

3.如权利要求2所述的沉积物有机磷酸酯及代谢产物LC-MS/MS分析方法，其特征在于，绘制内标校正曲线时，用移液枪准确吸取0.5μL、1μL、2μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL的1mg/L的标准混合工作液，得到十种体积的标准混合工作液，每个体积的标准混合工作液中均加入100μL的1mg/L的内标化合物混合溶液，各自用甲醇稀释到1mL，振荡混匀得到十种不同浓度的标准混合工作液：0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL。

4.如权利要求1所述的沉积物有机磷酸酯及代谢产物LC-MS/MS分析方法，其特征在于，将海洋沉积物样品进行除杂、冻干、研磨过80目筛前处理，得测量样品。

5.如权利要求4所述的沉积物有机磷酸酯及代谢产物LC-MS/MS分析方法，其特征在于，将2g测量样品加入内标化合物，采用10mL溶剂，于室温超声提取、离心，收集上清液，重复2-3次，合并得提取液，氮气流缓慢吹至1mL，加入40mL超纯水，采用C₁₈固相萃取柱进行富集和净化，用淋洗液淋洗并收集洗脱液，氮气流缓慢吹至近干燥状态后，得浓缩物样品，用200μL甲醇复溶，进行LC-MS/MS测定。

6.如权利要求5所述的沉积物有机磷酸酯及代谢产物LC-MS/MS分析方法，其特征在于，溶剂为乙腈。

7.如权利要求5所述的沉积物有机磷酸酯及代谢产物LC-MS/MS分析方法，其特征在于，淋洗液为乙腈。

8.如权利要求1所述的沉积物有机磷酸酯及代谢产物LC-MS/MS分析方法，其特征在于，洗脱为梯度洗脱，梯度洗脱设置为0-7min、7-16min、16-20min、20-20.1min、20.1-24min、24min以后，水相与有机相的体积比分别为40％:60％、20％:80％、3％:97％、3％:97％、40％:60％、40％:60％。

9.如权利要求1所述的沉积物有机磷酸酯及代谢产物LC-MS/MS分析方法，其特征在于，母离子及特征碎片离子信息的获得方式为：

分别配制浓度为5μg/mL的各个有机磷酸酯及代谢产物的标准溶液，采用高效液相色谱三重四级杆质谱仪器配备的自动进样系统直接进样，在电喷雾正离子模式下采用全扫描模式进行分析检测，确定各个有机磷酸酯及代谢产物的母离子；

对各个有机磷酸酯及代谢产物施加不同碰撞能量，得到各个有机磷酸酯及代谢产物的二级碎片离子，各自选择两个响应强度较高的碎片离子作为特征碎片离子。

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