KR100901127B1 - 독소루비신 처리에 따른, 심장독성 유발 약물 검색용마커유전자 및 이를 이용한 심장독성 유발 약물 검색 방법 - Google Patents

독소루비신 처리에 따른, 심장독성 유발 약물 검색용마커유전자 및 이를 이용한 심장독성 유발 약물 검색 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 심장독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 구체적으로 심장독성 유발 약물인 독소루비신에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 마커유전자 및 이를 이용한 심장독성 유발 약물 검색 방법에 관한 것이다. 본 발명의 마커유전자는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 마커유전자로 이용하여 새로운 심장독성의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 심장독성을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
독소루비신, 마커유전자, 마이크로어레이, 심장독성

Description

독소루비신 처리에 따른, 심장독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 심장독성 유발 약물 검색 방법{Marker genes based on doxorubicin treatment for screening of drug inducing cardiotoxicity and screening method using thereof}
도 1은 독소루비신에 의한 인간 제대 혈관 내피 세포주에서의 세포 독성을 조사한 그래프이다.
도 2와 도 3은 마이크로어레이 칩을 이용한 독소루비신을 처리한 인간 제대 혈관 내피 세포주의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명은 심장독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 심장독성 유발 약물인 독소루비신에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 마커유전자 및 이를 이용한 심장독성 유발 약물 검색 방법에 관한 것이다.
독소루비신은 육종, 다수의 골수종, 악성 임파종, 급성 임파성 백혈병, 고환암, 난소암, 유방암, 위암, 방광암 및 식도암 등의 치료제로서 사용된다. 광범위한 항 종양제로서 사용되는 독소루비신은 1960년 초반에 Streptomyces peucetius로부터 추출되어 상용화되었다. 독소루비신을 처방받으면 초기에 일시적인 부정맥이 발생하고 약 41%의 환자에게서 심장독성이 유발되며 이것의 대표적인 예로 방실 차단되는 현상이 나타난다. 또한 광선과민증, 국부 괴사, 구역질, 구토가 발생되면 종종 과민성 쇼크를 유발하는 것으로 보고되었다. 종양의 증식을 억제하기 위한 세포독성 화학요법에 의해, 세포 용해 작용이 활발하게 일어나 고요산혈증이 유발되기도 한다.
독소루비신의 작용기전으로는 DNA 내에 삽입되어 DNA 및 RNA의 합성을 억제함으로써, 활성 산소종을 생성하여 DNA 손상과 지질의 과산화 반응 유발하는 경우, DNA와 결합하여 알킬화시키는 반응을 유발하는 경우, topoisomerase Ⅱ의 작용을 억제하여 DNA 손상 유발과 이로 인해 아폽토시스(apoptosis)를 유발하는 경우 등이 보고되었다.
독소루비신은 특히 내피세포와 심장근육세포에 작용하여 세포 죽음을 유발하는 것으로 알려져 있다. In vitro 상에서 독소루비신이 심장근육세포에 아폽토시스(apoptosis)를 일으키는 것으로 보고되어 있다. 독소루비신은 종양의 세포 증식 억제제로서 일반적으로 사용되는 것과는 반대로 심장근육세포나 내피세포에는 과산화수소(활성 산소종)를 생성하여 아폽토시스를 일으키는 것으로 보고되었다. 이는 세포내에 산소종 형성으로 인해 p53의 발현이 증가하게 되고 이 유전자는 직접적으 로 p53 결합 부분이 있으며, 세포의 아폽토시스를 촉발시키는 기능을 갖는 Bax 유전자의 활성을 유도한다. p53 외에도 산화적 스트레스로 인해 ASK1이 활성화되어 c-Jun NH2-terminal kinase (JNK)와 p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase) 경로를 거쳐 아폽토시스를 유발하는 것도 보고되어 있다.
더불어, 심장과 관련된 특이적인 유전자들의 발현이 독소루비신에 의해 감소하는 것으로 보고되었다. 발현이 감소하는 유전자에는 심장 근육과 관련된 α-actinin, myosin light and heavy chains, troponin 1, desmin 그리고 미토콘드리아와 관련된 iron-sulfur protein, ADP/ATP translocase, phosphofructokinase, mitochondrial creatine kinase 이 외에 creatine kinase, phospholamban, calsequestrin, phospholipase A2, brain natriuretic peptide 등이 보고되었다 (Takemura G., et al ., Prog. Cardiovasc. Dis. 49:330-352, 2007). HSP27 (heat shock protein 27)은 산화적 스트레스에 대한 저항성을 나타내어 독소루비신에 대한 심장 부작용을 나타내는 유전자로 보고된 바 있다 (Liu L., et al ., Eur. J. Heart Fail. 2007). 또한 독소루비신은 유전자 p21의 발현 증가로 세포주기의 G2/M기를 정지시키는 것으로 보고되었다 (Lee SM., et al ., Mol. Cells., 20:331-338, 2005.)
포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션 (genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 즉, 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이 (microarray) 분석을 수행한다 (Schena, M., et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:10614-10619, 1996).
마이크로어레이는 cDNA (complementary DNA)나 20-25 염기쌍 (base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화하거나 잉크젯 (ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다 (Sellheyer, K and Belbin, T.J., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서는 사진 식각 공정 (photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성 방법에 의해 만들고 있으며, Agillent사 등에서는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다 (Sellheyer, K. and Belbin, T.J., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).
유전자 발현의 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며, cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cye3과 Cye5)으로 대조군과 실험군의 RNA를 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다 (Somasundaram, K., et al ., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).
최근 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인, 독성 유전체학 (Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량 (high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이고, 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질을 검색 및 진단할 수 있게 될 것이다.
이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 1천 개가 집적된 올리고 마이크로어레이를 이용하여 항암제로서 심장독성을 유발하는 대표적 약물인 독소루비신 처리에 의한 유전자 발현 프로파일을 인간 제대 혈관 내피 세포인 HUVEC 세포주에서 관찰 및 분석함으로써 독소루비신에 의해 과발현 또는 저발현 되는 유전자를 발굴함으로써 심장독성 유발 약물을 검출할 수 있는 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 심장독성 유발 약물에 의해 과발현 또는 저발현되는 마커 유전자 및 상기 마커유전자를 이용한 심장독성 유발 약물 검색 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 심장독성 유발 약물인 독소루비신에 의해 자극받은 인간 제대 혈관 내피 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 심장독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 심장독성 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자를 이용한 심장독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 심장독성 유발 약물 검색 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 심장독성 유발 약물인 독소루비신에 의해 자극받은 인간 제대 혈관 내피 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 심장독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 제공한다.
상기 마커유전자는 지질 대사 (lipid metabolism), 발달 (development), 아 폽토시스 (apoptosis), 면역 반응 (immune response), 세포 주기 (cell cycle), 세포 주기 점검점 (cell cycle checkpoint), 세포 부착 (cell adhesion), 세포 유착 분자 [cell adhesion molecules(CAMs)], 전사 (transcription), 유비퀴틴 회로 (ubiquitin cycle)에 관련된 유전자로 구성되어 있다.
본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 마커유전자를 제공한다: 유전자 등록번호 (Genebank) AB033073[(Sulfatase 2)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001024807[Amyloid beta (A4) precursor-like protein 1], 유전자 등록번호 (Genebank) BC042143(Hypothetical protein FLJ32009), 유전자 등록번호 (Genebank) AB209032(Activating transcription factor 3), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_005245[FAT tumor suppressor homolog 1 (Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) BC021008(Cytoplasmic FMR1 interacting protein 2), 유전자 등록번호 (Genebank) BC034763(Ferredoxin reductase), 유전자 등록번호 (Genebank) AK122903(EPS8-like 2), 유전자 등록번호 (Genebank) BC034227[DNA segment on chromosome 4 (unique) 234 expressed sequence], 유전자 등록번호 (Genebank) CR623038(Inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 (Genebank) BC012091[Hairy and enhancer of split 2 (Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) CR622352(Brain specific protein), 유전자 등록번호 (Genebank) AK055797(Acyl-CoA thioesterase 4), 유전자 등록번호 (Genebank) BC017338(Fucosidase, alpha-L- 1, tissue), 유전자 등록번호 (Genebank) 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arrest deficient-like 1 (yeast)), 유전자 등록번호 (Genebank) BC032677(Ubiquitin-conjugating enzyme E2C), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_006101(Kinetochore associated 2), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_018492(PDZ binding kinase), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_007280(Opa interacting protein 5), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001773(CD34 antigen), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_173808(Neuronal growth regulator 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_003005[Selectin P (granule membrane protein 140kDa, antigen CD62)], 유전자 등록번호 (Genebank) M30640[Selectin E (endothelial adhesion molecule 1)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_000841(Glutamate receptor, metabotropic 4), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_000513[Opsin 1 (cone pigments), medium-wave-sensitive (color blindness, deutan)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001295[Chemokine (C-C motif) receptor 1], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_006988(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_002834[Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11 (Noonan syndrome 1)], 유전자 등록번호 (Genebank) AF045459(BMX non-receptor tyrosine kinase), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014588[Visual system homeobox 1 homolog, CHX10-like (zebrafish)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001620[AHNAK nucleoprotein (desmoyokin)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_012278[Integrin beta 1 binding protein (melusin) 2]), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_000185[Serpin peptidase inhibitor, clade D (heparin cofactor), member 1], 유전자 등록번호 (Genebank) AF071592(Kinesin family member 4A), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_015895(Geminin, DNA replication inhibitor), 유전자 등록번호 (Genebank) BC020744[Aldo-keto reductase family 1, member C4 (chlordecone reductase; 3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type I; dihydrodiol dehydrogenase 4)], 유전자 등록번호 (Genebank) AB209179[Polo-like kinase 1 (Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_003629[Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3 (p55, gamma)], 유전 자 등록번호 (Genebank) NM_006653 (Fibroblast growth factor receptor substrate 3), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_031966(Cyclin B1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014750[Discs, large homolog 7 (Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_003981(Protein regulator of cytokinesis 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_018685[Anillin, actin binding protein (scraps homolog, Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014783(Rho GTPase activating protein 11A), 유전자 등록번호 (Genebank) AK090447(Rho GTPase activating protein 19), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_018154[ASF1 anti-silencing function 1 homolog B (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_006716[DBF4 homolog (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 (Genebank) CD049340(Aurora kinase B), 유전자 등록번호 (Genebank) BX107768(Transcribed locus), 유전자 등록번호 (Genebank) AB091343(Centrosomal protein 55kDa), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_152446(Chromosome 14 open reading frame 145), 유전자 등록번호 (Genebank) BC006173(Chromosome 14 open reading frame 151), 유전자 등록번호 (Genebank) AK126548(Chromosome 20 open reading frame 144), 유전자 등록번호 (Genebank) BX640641(Chromosome 6 open reading frame 107), 유전자 등록번호 (Genebank) AL832235(Chromosome 6 open reading frame 173), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001012507(Chromosome 6 open reading frame 173), 유전자 등록번호 (Genebank) CR604810(Cyclin A2), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_152562(Cell division cycle associated 2), 유전자 등록번호 (Genebank) CR621398(Cell division cycle associated 3), 유전자 등록번호 (Genebank) BQ056337[Cyclin-dependent kinase inhibitor 3 (CDK2-associated dual specificity phosphatase)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_018204(Cytoskeleton associated protein 2), 유전자 등록번호 (Genebank) BQ278454(CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_015426(WD repeat domain 51A), 유전자 등록번호 (Genebank) XM_291222(Integrator complex subunit 1), 유전자 등록번호 (Genebank) XM_497443(DNM1DN3.2 duplicon), 유전자 등록번호 (Genebank) W60781(Fatty acid binding protein 4, adipocyte), 유전자 등록번호 (Genebank) BC071990(Family with sequence similarity 7, member A2), 유전자 등록번호 (Genebank) BC043576[Fer3-like (Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) BX640701[Zwilch, kinetochore associated, homolog (Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) AL833626(Zinc finger, DHHC-type containing 20), 유전자 등록번호 (Genebank) AL832036(Hypothetical protein FLJ40629), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_018063(Helicase, lymphoid-specific), 유전자 등록번호 (Genebank) BX102654(Histone 1, H4b), 유전자 등록번호 (Genebank) BC004387(Clone BSYN39 immunoglobulin variable region VH mu domain), 유전자 등록번호 (Genebank) BM471410[Heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin)], 유전자 등록번호 (Genebank) AY251274(Junctophilin 3), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014736(KIAA0101), 유전자 등록번호 (Genebank) BC052951(Lamin B1), 유전자 등록번호 (Genebank) XM_067448(similar to MEST), 유전자 등록번호 (Genebank) BC010526(Hypothetical LOC401127), 유전자 등록번호 (Genebank) AK125737(LOC440570), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_203411(Transmembrane protein 88), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_138703(Melanoma antigen family E, 2), 유전자 등록번호 (Genebank) AL136840[MCM10 minichromosome maintenance deficient 10 (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 (Genebank) AF516710(MLF1 interacting protein), 유전자 등록번호 (Genebank) AK000318(Leucine zipper protein 5), 유전자 등록번호 (Genebank) AK222819(Nucleolar and spindle associated protein 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_032882(Paraneoplastic antigen like 6A), 유전자 등록번호 (Genebank) BU675073(Pituitary tumor-transforming 1), 유전자 등록번호 (Genebank) CN484301[Transcribed locus, moderately similar to XP_227769.2 PREDICTED: similar to Ac1147 (Rattus norvegicus)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_013277(Rac GTPase activating protein 1), 유전자 등록번호 (Genebank) AY195859(Reticulocalbin 3, EF-hand calcium binding domain), 유전자 등록번호 (Genebank) NR_000041(RNA, U12 small nuclear), 유전자 등록번호 (Genebank) BQ216858(Ribosomal protein L39-like), 유전자 등록번호 (Genebank) AB007829(Scavenger receptor class A, member 3), 유전자 등록번호 (Genebank) CR617127[SIL1 homolog, endoplasmic reticulum chaperone (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_182513[Spindle pole body component 24 homolog (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_012449(Six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1), 유전자 등 록번호 (Genebank) NM_015180(Spectrin repeat containing, nuclear envelope 2), 유전자 등록번호 (Genebank) AJ243997(Transforming, acidic coiled-coil containing protein 3), 유전자 등록번호 (Genebank) BF032596[Translocase of inner mitochondrial membrane 10 homolog (yeast)], 유전자 등록번호 (Genebank) AB209297(Thymopoietin), 유전자 등록번호 (Genebank) AK097009(phospholipid transfer protein), 유전자 등록번호 (TIGR) THC2429167, 유전자 등록번호 (TIGR) THC2309312, 유전자 등록번호 (TIGR) THC2295607, 유전자 등록번호 (TIGR) THC2374943, 유전자 등록번호 (TIGR) THC2308133, 유전자 등록번호 (TIGR) THC2310788, 유전자 등록번호 (TIGR) THC2405066, 유전자 등록번호 (EnsEMBL) ENST00000354861, 유전자 등록번호 (TIGR) THC2282717.
1) 상기 마커유전자 중에서 심장독성 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 증가하는 마커유전자는 하기와 같다: 유전자 등록번호 (Genebank) AB033073[(Sulfatase 2)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001024807[Amyloid beta (A4) precursor-like protein 1], 유전자 등록번호 (Genebank) BC042143(Hypothetical protein FLJ32009), 유전자 등록번호 (Genebank) AB209032(Activating transcription factor 3), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_005245[FAT tumor suppressor homolog 1 (Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) BC021008(Cytoplasmic FMR1 interacting protein 2), 유전자 등록번호 (Genebank) BC034763(Ferredoxin reductase), 유전자 등록번호 (Genebank) AK122903(EPS8-like 2), 유전자 등록번호 (Genebank) BC034227[DNA segment on chromosome 4 (unique) 234 expressed sequence], 유전자 등록번호 (Genebank) CR623038(Inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 (Genebank) BC012091[Hairy and enhancer of split 2 (Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) CR622352(Brain specific protein), 유전자 등록번호 (Genebank) AK055797(Acyl-CoA thioesterase 4), 유전자 등록번호 (Genebank) BC017338(Fucosidase, alpha-L- 1, tissue), 유전자 등록번호 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similar to NP_001604.1 alpha 2 actin; alpha-cardiac actin (Homo sapiens)], 유전자 등록번호 (Genebank) AK128234(unnamed protein product; Homo sapiens cDNA FLJ46368 fis, clone TESTI4051504.), 유전자 등록번호 (Genebank) AI795990(Chromosome 1 open reading frame 133), 유전자 등록번호 (Genebank) AK128234(unnamed protein product; Homo sapiens cDNA FLJ46368 fis, clone TESTI4051504.), 유전자 등록번호 (Genebank) AK024399(CDNA FLJ14337 fis, clone PLACE4000494), 유전자 등록번호 (Genebank) BI520836[Transcribed locus, weakly similar to XP_209041.2 PREDICTED: similar to KIAA1503 protein (Homo sapiens)], 유전자 등록번호 (Genebank) AI292270[Transcribed locus, weakly similar to XP_510761.1 PREDICTED: similar to host cell factor C1 regulator 1 (XPO1 dependant) isoform 1; HCF-1 beta-propeller interacting protein (Pan troglodytes)], 유전자 등록번호 (Genebank) BX445423[Transcribed locus, weakly similar to XP_515285.1 PREDICTED: similar to inhibitor of DNA binding 2; inhibitor of differentiation 2; DNA-binding protein inhibitor ID2; helix-loop-helix protein ID2 (Pan troglodytes)], 유전자 등록번호 (Genebank) AK097009(phospholipid transfer protein), 유전자 등록번호 (TIGR) THC2429167, 유전자 등록번호 (TIGR) THC2309312, 유전자 등록번호 (TIGR) THC2295607, 유전자 등록번호 (TIGR) THC2374943, 유전자 등록번호 (TIGR) THC2308133, 유전자 등록번호 (TIGR) THC2310788.
2) 상기 마커유전자 중에서 심장독성 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 감소하는 마커유전자는 하기와 같다: 유전자 등록번호 (Genebank) BX648814(Angiopoietin 1), 유전자 등록번호 (Genebank) AL713654[pantothenate kinase 2 (Hallervorden-Spatz syndrome)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_170589(Cancer susceptibility candidate 5), 유전자 등록번호 (Genebank) AB209019(Regulator of G-protein signalling 4), 유전자 등록번호 (Genebank) AF041210[Midline 1 (Opitz/BBB syndrome)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014786[Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 17], 유전자 등록번호 (Genebank) AY750055[Diaphanous homolog 3 (Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) AB209505[Myosin VA (heavy polypeptide 12, myoxin)], 유전자 등록번호 (Genebank) AF117756(Thyroid hormone receptor associated protein 3), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_002957(Retinoid X receptor, alpha), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_004237(Thyroid hormone receptor interactor 13), 유전자 등록번호 (Genebank) AB210026(Myosin, heavy polypeptide 10, non-muscle), 유전자 등록번 호 (Genebank) NM_002156[Heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin)], 유전자 등록번호 (Genebank) BC065544(Chromosome 14 open reading frame 106), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_003115(UDP-N-acteylglucosamine pyrophosphorylase 1), 유전자 등록번호 (Genebank) AL833741[Enolase 1, (alpha)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_000189(Hexokinase 2), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_021116[Adenylate cyclase 1 (brain)], 유전자 등록번호 (Genebank) U20938 (Dihydropyrimidine dehydrogenase), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_003258(Thymidine kinase 1, soluble), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_003504[CDC45 cell division cycle 45-like (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001254[CDC6 cell division cycle 6 homolog (S. cerevisiae), 유전자 등록번호 (Genebank) AK123010(Ribonucleotide reductase M2 polypeptide), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_004111(Flap structure-specific endonuclease 1), 유전자 등록번호 (Genebank) U81234[Chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_022111[Claspin homolog (Xenopus laevis)], 유전자 등록번호 (Genebank) AY032677[Polymerase (DNA directed), theta], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001067[Topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa, 유전자 등록번호 (Genebank) NM_012415[RAD54 homolog B (S. cerevisiae), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_005934[Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila); translocated to, 1], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_202002(Forkhead box M1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_030919(Chromosome 20 open reading frame 129), 유전자 등록번호 (Genebank) AK091802(KIAA2002 protein), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014791(Maternal embryonic leucine zipper kinase), 유전자 등록번호 (Genebank) AK172841(Testis-specific serine kinase 6), 유전자 등록번호 (Genebank) AK055221(F-box protein 5), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014176[Ubiquitin-conjugating enzyme E2T (putative), 유전자 등록번호 (Genebank) AB209172[Solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, taurine), member 6, 유전자 등록번호 (Genebank) NM_003486[Solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system), member 5, 유전자 등록번호 (Genebank) NM_005063[Stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014762(24-dehydrocholesterol reductase), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_016343[Centromere protein F, 350/400ka (mitosin)], 유전자 등록번호 (Genebank) L08238[Suppressor of variegation 3-9 homolog 1 (Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) BC043166(Potassium voltage-gated channel, shaker-related subfamily, beta member 1), 유전자 등록번호 (Genebank) AK091926[Solute carrier family 13 (sodium-dependent dicarboxylate transporter), member 2], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_000722(Calcium channel, voltage-dependent, alpha 2/delta subunit 1), 유전자 등록번호 (Genebank) AB208912(Guanylate binding protein 1, interferon-inducible, 67kDa), 유전자 등록번호 (Genebank) AF373846(Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 13C), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_002758(Mitogen-activated protein kinase kinase 6), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_016426(G-2 and S-phase expressed 1), 유전자 등록번호 (Genebank) BC004352(Kinesin family member 22), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001005414(ZW10 interactor antisense), 유전자 등록번호 (Genebank) AY367065[Asp (abnormal spindle)-like, microcephaly associated (Drosophila)), 유전자 등록번호 (Genebank) BC011000(Cell division cycle associated 5), 유전자 등록번호 (Genebank) U65410[MAD2 mitotic arrest deficient-like 1 (yeast)), 유전자 등록번호 (Genebank) BC032677(Ubiquitin-conjugating enzyme E2C), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_006101(Kinetochore associated 2), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_018492(PDZ binding kinase), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_007280(Opa interacting protein 5), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001773(CD34 antigen), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_173808(Neuronal growth regulator 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_003005[Selectin P (granule membrane protein 140kDa, antigen CD62)], 유전자 등록번호 (Genebank) M30640[Selectin E (endothelial adhesion molecule 1)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_000841(Glutamate receptor, metabotropic 4), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_000513[Opsin 1 (cone pigments), medium-wave-sensitive (color blindness, deutan)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001295[Chemokine (C-C motif) receptor 1], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_006988(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_002834[Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11 (Noonan syndrome 1)], 유전자 등록번호 (Genebank) AF045459(BMX non-receptor tyrosine kinase), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014588[Visual system homeobox 1 homolog, CHX10-like (zebrafish)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001620[AHNAK nucleoprotein (desmoyokin)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_012278[Integrin beta 1 binding protein (melusin) 2]), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_000185[Serpin peptidase inhibitor, clade D (heparin cofactor), member 1], 유전자 등록번호 (Genebank) AF071592(Kinesin family member 4A), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_015895(Geminin, DNA replication inhibitor), 유전자 등록번호 (Genebank) BC020744[Aldo-keto reductase family 1, member C4 (chlordecone reductase; 3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type I; dihydrodiol dehydrogenase 4)], 유전자 등록번호 (Genebank) AB209179[Polo-like kinase 1 (Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_003629[Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3 (p55, gamma)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_006653 (Fibroblast growth factor receptor substrate 3), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_031966(Cyclin B1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014750[Discs, large homolog 7 (Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_003981(Protein regulator of cytokinesis 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_018685[Anillin, actin binding protein (scraps homolog, Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014783(Rho GTPase activating protein 11A), 유전자 등록번호 (Genebank) AK090447(Rho GTPase activating protein 19), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_018154[ASF1 anti-silencing function 1 homolog B (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_006716[DBF4 homolog (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 (Genebank) CD049340(Aurora kinase B), 유전자 등록번호 (Genebank) BX107768(Transcribed locus), 유전자 등록번호 (Genebank) AB091343(Centrosomal protein 55kDa), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_152446(Chromosome 14 open reading frame 145), 유전자 등록번호 (Genebank) BC006173(Chromosome 14 open reading frame 151), 유전자 등록번호 (Genebank) AK126548(Chromosome 20 open reading frame 144), 유전자 등록번호 (Genebank) BX640641(Chromosome 6 open reading frame 107), 유전자 등록번호 (Genebank) AL832235(Chromosome 6 open reading frame 173), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_001012507(Chromosome 6 open reading frame 173), 유전자 등록번호 (Genebank) CR604810(Cyclin A2), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_152562(Cell division cycle associated 2), 유전자 등록번호 (Genebank) CR621398(Cell division cycle associated 3), 유전자 등록번호 (Genebank) BQ056337[Cyclin-dependent kinase inhibitor 3 (CDK2-associated dual specificity phosphatase)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_018204(Cytoskeleton associated protein 2), 유전자 등록번호 (Genebank) BQ278454(CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_015426(WD repeat domain 51A), 유전자 등록번호 (Genebank) XM_291222(Integrator complex subunit 1), 유전자 등록번호 (Genebank) XM_497443(DNM1DN3.2 duplicon), 유전자 등록번호 (Genebank) W60781(Fatty acid binding protein 4, adipocyte), 유전자 등록번호 (Genebank) BC071990(Family with sequence similarity 7, member A2), 유전자 등록번호 (Genebank) BC043576[Fer3-like (Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) BX640701[Zwilch, kinetochore associated, homolog (Drosophila)], 유전자 등록번호 (Genebank) AL833626(Zinc finger, DHHC-type containing 20), 유전자 등록번호 (Genebank) AL832036(Hypothetical protein FLJ40629), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_018063(Helicase, lymphoid-specific), 유전자 등록번호 (Genebank) BX102654(Histone 1, H4b), 유전자 등록번호 (Genebank) BC004387(Clone BSYN39 immunoglobulin variable region VH mu domain), 유전자 등록번호 (Genebank) BM471410[Heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin)], 유전자 등록번호 (Genebank) AY251274(Junctophilin 3 ), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_014736(KIAA0101), 유전자 등록번호 (Genebank) BC052951(Lamin B1), 유전자 등록번호 (Genebank) XM_067448(similar to MEST), 유전자 등록번호 (Genebank) BC010526(Hypothetical LOC401127), 유전자 등록번호 (Genebank) AK125737(LOC440570), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_203411(Transmembrane protein 88), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_138703(Melanoma antigen family E, 2), 유전자 등록번호 (Genebank) AL136840[MCM10 minichromosome maintenance deficient 10 (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 (Genebank) AF516710(MLF1 interacting protein), 유전자 등록번호 (Genebank) AK000318(Leucine zipper protein 5), 유전자 등록번호 (Genebank) AK222819(Nucleolar and spindle associated protein 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_032882(Paraneoplastic antigen like 6A), 유전자 등록번호 (Genebank) BU675073(Pituitary tumor-transforming 1), 유전자 등록번호 (Genebank) CN484301[Transcribed locus, moderately similar to XP_227769.2 PREDICTED: similar to Ac1147 (Rattus norvegicus)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_013277(Rac GTPase activating protein 1), 유전자 등록번호 (Genebank) AY195859(Reticulocalbin 3, EF-hand calcium binding domain), 유전자 등록번호 (Genebank) NR_000041(RNA, U12 small nuclear), 유전자 등록번호 (Genebank) BQ216858(Ribosomal protein L39-like), 유전자 등록번호 (Genebank) AB007829(Scavenger receptor class A, member 3), 유전자 등록번호 (Genebank) CR617127[SIL1 homolog, endoplasmic reticulum chaperone (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_182513[Spindle pole body component 24 homolog (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 (Genebank) NM_012449(Six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1), 유전자 등록번호 (Genebank) NM_015180(Spectrin repeat containing, nuclear envelope 2), 유전자 등록번호 (Genebank) AJ243997(Transforming, acidic coiled-coil containing protein 3), 유전자 등록번호 (Genebank) BF032596[Translocase of inner mitochondrial membrane 10 homolog (yeast)], 유전자 등록번호 (Genebank) AB209297(Thymopoietin), 유전자 등록번호 (TIGR) THC2405066, 유전자 등록번호 (EnsEMBL) ENST00000354861, 유전자 등록번호 (TIGR) THC2282717.
본 발명자들은 심장독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 발굴하기 위하여, 심장독성을 나타내는 항암제인 독소루비신을 인간 제대 혈관 내피 세포주 (human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 독소루비신은 인간 제대 혈관 내피 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고 (도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 독소루비신의 처리를 위한 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 독소루비신을 인간 제대 혈관 내피 세포주에 처리하고, 상기 약물을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 형광물질 Cy5로 표지하였으며, 약물을 처리하지 않은 대조군의 경우 형광물질 Cy3로 표지하였다. 상기 형광표지 된 cDNA를 44 k Human whole genome 올리고마이크로어레이 칩 (Agilent, USA)과 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다 (도 2와 도3 참조). 분석시 중간값의 비(Cy5/Cy3의 비율)가 2.0 배 이상인 경우 발현이 증가한 유전자로 분류하였고, 0.5 배 이하인 경우 발현이 감소한 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 발현이 증가한 유전자는 0.20% (44,290개의 유전자 중 87개), 발현이 감소한 유전자는 0.33% (44,290개의 유전자 중 145개)임을 확인하였다. 이때, 독소루비신에 의해 발현이 유의하게 변화된 유전자들을 기능별로 분류하였을 때, 심장독성에 작용하는 기능으로 판단되는 지질 대사 (lipid metabolism), 발달 (development), 아폽토시스 (apoptosis), 면역 반응 (immune response), 세포 주기 (cell cycle), 세포 주기 점검점 (cell cycle checkpoint), 세포 부착 (cell adhesion), 세포 유착 분자 [cell adhesion molecules(CAMs)], 전사 (transcription), 유비퀴틴 회로 (ubiquitin cycle)에 관련된 유전자를 선별하였다(표 2와 표 3 참조). 상기 유전자들이 본 발명에서 사용한 독소루비신을 처리했을 때, 인간 제대 혈관 내피 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 심장독성 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
본 발명의 심장독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색 된 마커유전자를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭 (piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅 (micropipetting)법 또는 핀 (pin) 형태의 스폿터 (spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 바람직하게는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스이다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자를 이용한 심장독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
본 발명의 하기와 같은 과정을 포함하는 심장독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다:
1) 인간 제대 혈관 내피 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 DNA 마이크로어레이와 혼성화시키는 단계;
5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이를 분석하는 단계; 및
6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 본 발명의 마커유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 제대 혈관 내피 세포는 HUVEC을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 제대 혈관 내피 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC (poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC (rhodamine-B-isothiocyanate), 로다민 (rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole Human Genome Oligo Microarray (Agilent, USA)등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 과발현 또는 저발현 유전자(표 2 및 표 3 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어 (Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
아울러, 본 발명은 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 심장독성 유발 약물 검색 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 심장독성 유발 약물 검색 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 검색 키트에 추가로 인간 제대 혈관 내피 세포를 포함하는 심장독성 유발 약물 검색 키트를 제공한다. 상기 인간 제대 혈관 내피 세포는 HUVEC을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 제대 혈관 내피 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 키트에 추가로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스 트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질 (strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질 (chemiflurorensce) 및 화학발광물질 (chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 형광물질 Cy3와 형광물질 Cy5를 사용하였다. 아울러, 상기 검색 키트에 추가로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP (사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도체와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리
<1-1> 세포배양
인간 제대 혈관 내피 세포주인 HUVEC 세포 (CC-2517, CAMBREX, USA)를 2% FBS와 성장인자 (CC-4176, CAMBREX, USA)가 첨가된 EBM-2 배지 (CAMBREX, USA)를 이용하여 100 ㎜ 디쉬 (dish)에서 5 × 105 세포/㎖이 되도록 배양하였다. 본 발명 자들은 기존의 연구와 보고를 통해 심장독성을 부작용으로 나타내는 대표적인 약물인 독소루비신을 선정하였으며, DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.
<1-2> 세포 독성 실험 ( MTT assay ) 및 화학 물질 처리
Mossman 등 (J. Immunol . Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 HUVEC 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트에 10× 104/웰 세포수로 EBM-2 배지 (CAMBREX, USA)에서 DMSO에 용해된 독소루비신을 처리하고 48시간 후에 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈 (formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.
HUVEC 세포주에서 독소루비신의 세포독성을 살펴본 결과, 20% 생존저해율을 보이는 농도(IC20)는 82.973 ng/㎖ 이었으며 (도 1), 상기 농도로 결정하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
< 실시예 2> 마이크로어레이 실험
<2-1> 표적 RNA 의 분리 및 형광 물질 표지
1.65 × 106 세포/㎖ 농도로 100 ㎜ 디쉬에 HUVEC 세포를 분주한 후, 실시예 1-2에서 결정된 독소루비신의 농도를 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸 (trizol) 시약 (Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit (Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set (Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 순도는 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA)로 확인하였다.
<2-2> 표지된 cDNA 제조
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시예 2-1에서 수득한 독소루비신 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)을 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링 (annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사 (Reverse Transcript) 반응을 위해 표 1과 같이 시약을 혼합하였다.
구성 부피(㎕)
5X first strand buffer 6
dNTPs 0.6
0.1 M DDT 3
SuperScript II 효소 3
Cy-3 또는 Cy-5 dUTP 2
대조군인 HUVEC 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP (녹색)으로 표지화하였고, 독소루비신을 처리한 HUVEC 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP (적색)으로 표지화하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼 (Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제되었다.
<2-3> 혼성화 반응
혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로 44 k Whole Human Genome 올리고 마이크로어레이 (Agilent, USA)를 이용하였다. 세척 (2분간 2× SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1× SSC, 2분간 0.2× SSC에 세척) 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.
<2-4> 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B (Axon Instruments, USA)로 스캔하였다. 결합하지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너 (laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어 (Axon Instruments, USA)로 분석하였다. 이렇게 얻어진 데이터로부터 독소루비신에 대한 마커 유전자를 선별하였다 (도 2).
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 4천 개의 유전자 중에서 독소루비신에 의해 중간값의 비(Cy5/Cy3의 비율)가 2.0배 이상으로 유전자 발현 증가를 보이는 유전자는 0.20% (44,290개의 유전자 중 87개)이고, 0.5 배 이하로 발현이 감소된 유전자는 0.33% (44,290개의 유전자 중 145개)임을 확인하였다.
이때, 독소루비신에 의해 발현이 유의하게 변화된 유전자들을 기능별로 분류하였을 때, 심장독성에 작용하는 기능으로 판단되는 지질 대사 (lipid metabolism), 발달 (development), 아폽토시스 (apoptosis), 면역 반응 (immune response), 세포 주기 (cell cycle), 세포 주기 점검점 (cell cycle checkpoint), 세포 부착 (cell adhesion), 세포 유착 분자 [cell adhesion molecules(CAMs)], 전사 (transcription), 유비퀴틴 회로 (ubiquitin cycle)에 관련된 유전자로 분류되었다(표 2와 표 3). 상기 유전자들이 본 발명에서 사용한 독소루비신을 처리했을 때, 인간 제대 혈관 내피 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
독소루비신에 의해 발현이 증가하는 유전자
등록번호 유전자 약어 유전자 명 중간값의 비
1) 지질 대사(lipid metabolism)
AK055797 PTE2B Acyl-CoA thioesterase 4 3.1166
NM_000963 PTGS2 Prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase) 2.8109
AY268890 TPP1 Tripeptidyl peptidase I 2.0208
BC063416 PLA2G4C Phospholipase A2, group IVC (cytosolic, calcium-independent) 2.0037
BC034763 FDXR Ferredoxin reductase 3.9355
AK097009 PLTP phospholipid transfer protein 2.5955
AF023676 TM7SF2 Transmembrane 7 superfamily member 2 2.3837
2) 발달( development )
AY509035 ROBO3 Roundabout, axon guidance receptor, homolog 3 (Drosophila) 2.0883
CR623416 PHYH Phytanoyl-CoA hydroxylase 2.1179
BC098575 PCDHB2 Protocadherin beta 2 2.027
AY268890 TPP1 Tripeptidyl peptidase I 2.0208
3) 아폽토시스( apoptosis )
AK125880 TP53INP1 Tumor protein p53 inducible nuclear protein 1 2.0949
NM_001024807 APLP1 [Amyloid beta (A4) precursor-like protein 1 5.5395
AB209361 FAS Fas (TNF receptor superfamily, member 6) 2.8817
NM_078467 CDKN1A Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) 2.5889
AF332558 BBC3 BCL2 binding component 3 2.6946
4) 면역 반응( immune response )
NM_000963 PTGS2 Prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase) 2.8109
BC063416 PLA2G4C Phospholipase A2, group IVC (cytosolic, calcium-independent) 2.0037
NM_005532 IFI27 Interferon, alpha-inducible protein 27 2.0725
NM_003326 TNFSF4 Tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 4 (tax-transcriptionally activated glycoprotein 1, 34kDa) 2.2811
AB209361 FAS Fas (TNF receptor superfamily, member 6) 2.8817
5) 세포 주기( cell cycle )
NM_003620 PPM1D Protein phosphatase 1D magnesium-dependent, delta isoform 2.0364
CR623038 ID2 Inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein 3.6314
NM_078467 CDKN1A Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) 2.5889
6) 세포 부착( cell adhesion )
NM_001024807 APLP1 [Amyloid beta (A4) precursor-like protein 1 5.5395
BC098575 PCDHB2 Protocadherin beta 2 2.027
NM_005245 FAT FAT tumor suppressor homolog 1 (Drosophila) 4.235
7) 전사( transcription )
AY461717 ZNF385 Zinc finger protein 385 2.4681
AB209376 SATB2 SATB family member 2 2.317
BC012091 HES2 Hairy and enhancer of split 2 (Drosophila) 3.3522
CR623038 ID2 Inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein 3.6314
AB209032 ATF3 Activating transcription factor 3 5.2571
8) EST
NM_014301 NIFUN NifU-like N-terminal domain containing 2.1762
NM_014172 PHPT1 Phosphohistidine phosphatase 1 2.6096
NM_014668 GREB1 GREB1 protein 2.87
BC017338 FUCA1 Fucosidase, alpha-L- 1, tissue 3.0434
AB209274 POLD4 Polymerase (DNA-directed), delta 4 2.1039
BC050455 DDB2 LIM homeobox 3 2.2562
NM_004628 XPC Xeroderma pigmentosum, complementation group C 2.137
NM_004877 GMFG Glia maturation factor, gamma 2.5901
NM_058229 FBXO32 F-box protein 32 2.4771
AB033073 SULF2 Sulfatase 2 5.6833
AK097009 PLTP phospholipid transfer protein 2.5955
U86136 TEP1 Telomerase-associated protein 1 2.0805
AK128769 MYSB; CACNLB2; FLJ23743 calcium channel, voltage-dependent, beta 2 subunit 2.156
NM_002867 RAB3B RAB3B, member RAS oncogene family 2.1622
NM_003512 HIST1H2AC Histone 1, H2ac 2.2471
BC031391 C17 Cytokine-like 1 2.8647
NM_012189 CABYR Calcium binding tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated (fibrousheathin 2) 2.6441
BC034227 D4S234E DNA segment on chromosome 4 (unique) 234 expressed sequence 3.71
NM_004864 GDF15 Growth differentiation factor 15 2.8189
AK129833 TFPI2 Tissue factor pathway inhibitor 2 2.2404
NM_000361 THBD Thrombomodulin 2.0517
NM_001553 IGFBP7 Insulin-like growth factor binding protein 7 2.1419
AF001540 MALAT-1; alpha gene; metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1 metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 (non-coding RNA) 2.4622
AK093784 TDE2L Serine incorporator 2 2.431
AK095896 LOC340061 Hypothetical protein LOC340061 2.288
AK097664 LOC90557 Hypothetical protein BC016861 2.132
AK122903 EPS8L2 EPS8-like 2 3.8871
AK125888 FBXO32 F-box protein 32 2.3202
AK126536 TSK Leucine rich repeat containing 54 2.5486
AK223240 TMEM35 Transmembrane protein 35 2.3244
BC018702 SPINT1 Serine peptidase inhibitor, Kunitz type 1 2.0278
BC021008 CYFIP2 Cytoplasmic FMR1 interacting protein 2 4.0295
BC025396 LOC132671 Spermatogenesis associated 18 homolog (rat) 2.8676
BC042143 FLJ32009 Hypothetical protein FLJ32009 5.4973
BF983391 RPS27L Ribosomal protein S27-like 2.2429
BM805022 CST3 Cystatin C (amyloid angiopathy and cerebral hemorrhage) 2.1646
BX648509 CG018 Hypothetical gene CG018 2.1962
CR610240 LOC201229 Hypothetical protein LOC201229 2.6278
CR622352 CGI-38 Brain specific protein 3.2786
NM_001013632 LOC343521 Similar to hypothetical protein 4833401D15 2.8988
NM_013399 C16orf5 Chromosome 16 open reading frame 5 2.2538
NM_024430 PSTPIP2 Proline-serine-threonine phosphatase interacting protein 2 2.0221
NM_030926 ITM2C Integral membrane protein 2C 2.7309
NM_138463 LOC116238 Hypothetical protein BC014072 2.0531
NM_153267 MAMDC2 MAM domain containing 2 2.1512
NM_173553 FLJ25801 Hypothetical protein FLJ25801 2.1183
XM_047357 LBA1 Lupus brain antigen 1 2.0284
XM_498859 LOC440774 Similar to cDNA sequence BC021523 2.3344
9) 생물학적 기능이 밝혀지지 않은 유전자( Biological process unknown )
CN430223 Transcribed locus 17000600171867 GRN_PREHEP Homo sapiens cDNA 5', mRNA sequence [CN430223] 2.368
BE903789 Transcribed locus ALU1_HUMAN (P39188) Alu subfamily J sequence contamination warning entry, partial (10%) [THC2439183] 2.3427
CB124304 ACTA2 Transcribed locus, strongly similar to NP_001604.1 alpha 2 actin; alpha-cardiac actin [Homo sapiens] 4.2113
AK128234 CEAL1 unnamed protein product; Homo sapiens cDNA FLJ46368 fis, clone TESTI4051504. 2.0951
AI795990 Chromosome 1 open reading frame 133 2.705
AK128234 unnamed protein product; Homo sapiens cDNA FLJ46368 fis, clone TESTI4051504. 2.9887
AK024399 UNQ1971 CDNA FLJ14337 fis, clone PLACE4000494 6.9185
BI520836 DFNA5 Transcribed locus, weakly similar to XP_209041.2 PREDICTED: similar to KIAA1503 protein [Homo sapiens] 2.1173
AI292270 (HCFC1R1 Transcribed locus, weakly similar to XP_510761.1 PREDICTED: similar to host cell factor C1 regulator 1 (XPO1 dependant) isoform 1; HCF-1 beta-propeller interacting protein [Pan troglodytes] 2.1788
BX445423 ID2 Transcribed locus, weakly similar to XP_515285.1 PREDICTED: similar to inhibitor of DNA binding 2; inhibitor of differentiation 2; DNA-binding protein inhibitor ID2; helix-loop-helix protein ID2 [Pan troglodytes] 3.6194
10) 알려지지 않은 유전자( unknown gene )
THC2429167 Unknown 　 2.0486
THC2309312 Unknown 　 2.363
THC2295607 Unknown 　 3.1816
THC2374943 　Q08529 (Q08529) Glycine-rich protein, partial (8%) 2.8084
THC2308133 　Q5W0G2 (Q5W0G2) OTTHUMP00000000464, partial (7%) 3.6468
THC2310788 　LMB1_HUMAN (P07942) Laminin beta-1 chain precursor (Laminin B1 chain), partial (4%) 2.5972
독소루비신에 의해 발현이 감소하는 유전자
등록번호 유전자 약어 유전자 명 중간값의 비
1) 세포 주기(cell cycle)
AB209179 PLK1 Polo-like kinase 1 (Drosophila) 0.166
NM_001254 CDC6 CDC6 cell division cycle 6 homolog (S. cerevisiae) 0.242
U65410 MAD2L1 MAD2 mitotic arrest deficient-like 1 (yeast) 0.0949
NM_031966 CCNB1 Cyclin B1 0.1197
BC011000 CDCA5 Cell division cycle associated 5 0.1696
2) 세포 주기 점검점( cell cycle checkpoint )
NM_016343 CENPF Centromere protein F, 350/400ka (mitosin) 0.1098
NM_001254 CDC6 CDC6 cell division cycle 6 homolog (S. cerevisiae) 0.242
NM_016426 GTSE1 G-2 and S-phase expressed 1 0.2164
U65410 MAD2L1 MAD2 mitotic arrest deficient-like 1 (yeast) 0.0949
NM_003504 CDC45L CDC45 cell division cycle 45-like (S. cerevisiae) 0.1616
3) 세포 유착 분자[ cell adhesion molecules( CAMs )]
NM_001773 CD34 CD34 antigen 0.4118
NM_173808 NEGR1 Neuronal growth regulator 1 0.372
NM_003005 SELP Selectin P (granule membrane protein 140kDa, antigen CD62) 0.3342
M30640 SELE Selectin E (endothelial adhesion molecule 1) 0.1556
4) 전사( transcription )
AF117756 THRAP3 Thyroid hormone receptor associated protein 3 0.4993
NM_014588 VSX1 Visual system homeobox 1 homolog, CHX10-like (zebrafish) 0.4836
NM_002957 RXRA Retinoid X receptor, alpha 0.4455
BC065544 C14orf106 Chromosome 14 open reading frame 106 0.4347
AL833741 ENO1 Enolase 1, (alpha) 0.3987
NM_005934 MLLT1 Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila); translocated to, 1 0.3799
NM_004237 TRIP13 Thyroid hormone receptor interactor 13 0.1403
NM_202002 FOXM1 Forkhead box M1 0.1185
NM_016343 CENPF Centromere protein F, 350/400ka (mitosin) 0.1098
5) 면역 반응( immune response )
NM_001295 CCR1 Chemokine (C-C motif) receptor 1 0.0796
U81234 CXCL6 Chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2) 0.2477
M30640 SELE Selectin E (endothelial adhesion molecule 1) 0.1556
AB208912 GBP1 Guanylate binding protein 1, interferon-inducible, 67kDa 0.413
AF373846 TNFRSF13C Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 13C 0.4476
6) 유비퀴틴 회로( ubiquitin cycle )
NM_014176 HSPC150 Ubiquitin-conjugating enzyme E2T (putative) 0.266
AK055221 FBXO5 F-box protein 5 0.2316
AF041210 MID1 Midline 1 (Opitz/BBB syndrome) 0.4579
BC032677 UBE2C Ubiquitin-conjugating enzyme E2C 0.2345
7) 지질 대사( lipid metabolism )
BC020744 AKR1C4 Aldo-keto reductase family 1, member C4 (chlordecone reductase; 3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type I; dihydrodiol dehydrogenase 4) 0.3328
NM_014762 DHCR24 24-dehydrocholesterol reductase 0.2968
NM_005063 SCD Stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase) 0.3234
8) EST
NM_001067 TOP2A Topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa 0.0159
NM_006101 KNTC2 Kinetochore associated 2 0.034
AY367065 ASPM Asp (abnormal spindle)-like, microcephaly associated (Drosophila) 0.0384
NM_018492 PBK PDZ binding kinase 0.0537
NM_003258 TK1 Thymidine kinase 1, soluble 0.0764
NM_003981 PRC1 Protein regulator of cytokinesis 1 0.0903
NM_014750 DLG7 Discs, large homolog 7 (Drosophila) 0.0911
NM_030919 C20orf129 Chromosome 20 open reading frame 129 0.137
AF071592 KIF4A Kinesin family member 4A 0.1812
NM_170589 AF15Q14 Cancer susceptibility candidate 5 0.1892
NM_007280 OIP5 Opa interacting protein 5 0.1899
NM_001005414 ZWINT ZW10 interactor antisense 0.2109
AY750055 DIAPH3 Diaphanous homolog 3 (Drosophila) 0.234
AY032677 POLQ Polymerase (DNA directed), theta 0.2425
BC043166 KCNAB1 Potassium voltage-gated channel, shaker-related subfamily, beta member 1 0.2437
NM_006988 ADAMTS1 ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1 0.25
NM_003486 SLC7A5 Solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system), member 5 0.2624
NM_014791 MELK Maternal embryonic leucine zipper kinase 0.2654
NM_004111 FEN1 Flap structure-specific endonuclease 1 0.3315
NM_002156 HSPD1 Heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin) 0.3355
BC004352 KIF22 Kinesin family member 22 0.3363
AB209019 RGS4 Regulator of G-protein signalling 4 0.337
AK172841 SSTK Testis-specific serine kinase 6 0.3421
NM_000189 HK2 Hexokinase 2 0.3763
AB210026 MYH10 Myosin, heavy polypeptide 10, non-muscle 0.3814
NM_000841 GRM4 Glutamate receptor, metabotropic 4 0.3826
NM_012278 ITGB1BP2 Integrin beta 1 binding protein (melusin) 2 0.4112
NM_006653 FRS3 Fibroblast growth factor receptor substrate 3 0.4131
NM_021116 ADCY1 Adenylate cyclase 1 (brain) 0.4153
NM_012415 RAD54B RAD54 homolog B (S. cerevisiae) 0.4167
NM_014786 ARHGEF17 Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 17 0.4192
AK123010 RRM2 Ribonucleotide reductase M2 polypeptide 0.4234
NM_000513 OPN1MW Opsin 1 (cone pigments), medium-wave-sensitive (color blindness, deutan) 0.4436
AL713654 HSS pantothenate kinase 2 (Hallervorden-Spatz syndrome) 0.4441
L08238 SUV39H1 Suppressor of variegation 3-9 homolog 1 (Drosophila) 0.4495
AB209172 SLC6A6 Solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, taurine), member 6 0.4545
BX648814 ANGPT1 Angiopoietin 1 0.4589
NM_001620 MGC5395 AHNAK nucleoprotein (desmoyokin) 0.46
NM_000185 SERPIND1 Serpin peptidase inhibitor, clade D (heparin cofactor), member 1 0.4614
NM_000722 CACNA2D1 Calcium channel, voltage-dependent, alpha 2/delta subunit 1 0.4642
U20938 DPYD Dihydropyrimidine dehydrogenase 0.475
AF045459 BMX BMX non-receptor tyrosine kinase 0.4817
NM_022111 CLSPN Claspin homolog (Xenopus laevis) 0.4831
NM_015895 GMNN Geminin, DNA replication inhibitor 0.4874
AK091926 SLC13A2 Solute carrier family 13 (sodium-dependent dicarboxylate transporter), member 2 0.4901
AK091802 KIAA2002 KIAA2002 protein 0.4909
NM_003115 UAP1 UDP-N-acteylglucosamine pyrophosphorylase 1 0.4913
NM_002834 PTPN11 Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11 (Noonan syndrome 1) 0.4915
NM_003629 PIK3R3 Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3 (p55, gamma) 0.4941
NM_002758 MAP2K6 Mitogen-activated protein kinase kinase 6 0.4943
AB209505 MYO5A Myosin VA (heavy polypeptide 12, myoxin) 0.4967
9) 생물학적 기능이 밝혀지지 않은 유전자( Biological process unknown )
BF032596 TIMM10 Translocase of inner mitochondrial membrane 10 homolog (yeast) 0.4986
NR_000041 RNU12 RNA, U12 small nuclear 0.4976
BM471410 HSPD1 Heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin) 0.494
BX640641 C6orf107 Chromosome 6 open reading frame 107 0.4879
BX102654 HIST1H4B Histone 1, H4b 0.4745
BX640701 FLJ10036 Zwilch, kinetochore associated, homolog (Drosophila) 0.4619
AL833626 FLJ25952 Zinc finger, DHHC-type containing 20 0.4618
AY195859 RCN3 Reticulocalbin 3, EF-hand calcium binding domain 0.4606
BQ216858 RPL39L Ribosomal protein L39-like 0.458
NM_182513 Spc24 Spindle pole body component 24 homolog (S. cerevisiae) 0.4557
BC010526 LOC401127 Hypothetical LOC401127 0.4536
XM_067448 LOC131572 similar to MEST 0.4505
CN484301 Transcribed locus, moderately similar to XP_227769.2 PREDICTED: similar to Ac1147 [Rattus norvegicus] Q6QI74 (Q6QI74) LRRG00134, partial (10%) [THC2269657] 0.4503
AK090447 ARHGAP19 Rho GTPase activating protein 19 0.4459
AB209297 TMPO Thymopoietin 0.4395
XM_497443 DNM1DN3-2 DNM1DN3.2 duplicon 0.4316
BC043576 FERD3L Fer3-like (Drosophila) 0.4267
CR617127 SIL1 SIL1 homolog, endoplasmic reticulum chaperone (S. cerevisiae) 0.425
NM_203411 LOC92162 Transmembrane protein 88 0.4221
NM_018204 CKAP2 Cytoskeleton associated protein 2 0.4169
AL136840 MCM10 MCM10 minichromosome maintenance deficient 10 (S. cerevisiae) 0.4156
AK125737 LOC440570 LOC440570 0.4106
AK126548 C20orf144 Chromosome 20 open reading frame 144 0.4043
NM_001012507 C6orf173 Chromosome 6 open reading frame 173 0.4034
NM_152446 C14orf145 Chromosome 14 open reading frame 145 0.3967
AB007829 SCARA3 Scavenger receptor class A, member 3 0.3911
NM_018063 HELLS Helicase, lymphoid-specific 0.3865
AY251274 JPH3 Junctophilin 3 0.384
BC004387 Clone BSYN39 immunoglobulin variable region VH mu domain Homo sapiens, Similar to hypothetical protein PRO1722, clone IMAGE:3619551, mRNA. [BC004387] 0.376
BC006173 C14orf151 Chromosome 14 open reading frame 151 0.3736
NM_006716 ASK DBF4 homolog (S. cerevisiae) 0.3632
W60781 FABP4 Fatty acid binding protein 4, adipocyte 0.3629
AL832235 C6orf173 Chromosome 6 open reading frame 173 0.3285
NM_015180 SYNE2 Spectrin repeat containing, nuclear envelope 2 0.325
NM_012449 STEAP Six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1 0.3228
NM_015426 DKFZP434C245 WD repeat domain 51A 0.3163
AK222819 NUSAP1 Nucleolar and spindle associated protein 1 0.3041
BC052951 LMNB1 Lamin B1 0.2963
AK000318 MTB Leucine zipper protein 5 0.2891
NM_014783 ARHGAP11A Rho GTPase activating protein 11A 0.2795
BX107768 Transcribed locus BX107768 Soares_testis_NHT Homo sapiens cDNA clone IMAGp998E154173, mRNA sequence [BX107768] 0.2576
BC071990 FAM7A2 Family with sequence similarity 7, member A2 0.2478
BU675073 PTTG1 Pituitary tumor-transforming 1 0.2415
NM_138703 MAGEE2 Melanoma antigen family E, 2 0.2366
CR621398 CDCA3 Cell division cycle associated 3 0.2255
NM_032882 PNMA6A Paraneoplastic antigen like 6A 0.2209
BQ278454 CKS1B CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B 0.2073
NM_018154 ASF1B ASF1 anti-silencing function 1 homolog B (S. cerevisiae) 0.2063
NM_013277 RACGAP1 Rac GTPase activating protein 1 0.1706
AJ243997 TACC3 Transforming, acidic coiled-coil containing protein 3 0.1689
CR604810 CCNA2 Cyclin A2 0.1602
BQ056337 CDKN3 Cyclin-dependent kinase inhibitor 3 (CDK2-associated dual specificity phosphatase) 0.1538
XM_291222 DKFZP586J0619 Integrator complex subunit 1 0.1462
AF516710 MLF1IP MLF1 interacting protein 0.1107
AL832036 FLJ40629 Hypothetical protein FLJ40629 0.1095
CD049340 AURKB Aurora kinase B 0.102
NM_152562 CDCA2 Cell division cycle associated 2 0.0896
NM_014736 KIAA0101 KIAA0101 0.0858
AB091343 C10orf3 Centrosomal protein 55kDa 0.0339
NM_018685 ANLN Anillin, actin binding protein (scraps homolog, Drosophila) 0.0334
10) 알려지지 않은 유전자( unknown gene )
THC2405066 　predicted protein {Methanosarcina acetivorans C2A;} , partial (13%) [THC2405066] 0.3091
ENST00000354861 　PREDICTED: Homo sapiens similar to Hnrpa1 protein (LOC120364), mRNA [XM_062025] 0.4817
THC2282717 　Q87726 (Q87726) Glycoprotein 120 (Fragment), partial (13%) [THC2282717] 0.1791
본 발명의 심장독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 심장독성 유발 약물 검색 방법은, DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 마커유전자로 이용하여 새로운 심장독성의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질의 모니터링 및 판정하는데 유용하며, 심장독성을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

Claims (10)

  1. 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 전체서열 또는 일부서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 독소루비신에 대한 노출 여부 진단용 DNA 마이크로어레이 칩:
    유전자 등록번호 (Genebank) AK055797(Acyl-CoA thioesterase 4), 유전자 등록번호 NM_000963[Prostaglandin endoperoxide synthase 2 (prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase)], 유전자 등록번호 AY268890(Tripeptidyl peptidase I), 유전자 등록번호 BC063416[Phospholipase A2, group IVC (cytosolic, calcium-independent)], 유전자 등록번호 BC034763(Ferredoxin reductase), 유전자 등록번호 AK097009(phospholipid transfer protein), 유전자 등록번호 AF023676(Transmembrane 7 superfamily member 2), 유전자 등록번호 AY509035[Roundabout, axon guidance receptor, homolog 3 (Drosophila)], 유전자 등록번호 CR623416(Phytanoyl-CoA hydroxylase), 유전자 등록번호 BC098575(Protocadherin beta 2), 유전자 등록번호 AK125880(Tumor protein p53 inducible nuclear protein 1), 유전자 등록번호 NM_001024807[Amyloid beta (A4) precursor-like protein 1], 유전자 등록번호 AB209361[Fas (TNF receptor superfamily, member 6)], 유전자 등록번호 NM_078467[Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1)], 유전자 등록번호 AF332558(BCL2 binding component 3), 유전자 등록번호 NM_005532(Interferon, alpha-inducible protein 27), 유전자 등록번호 NM_003326[Tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 4 (tax-transcriptionally activated glycoprotein 1, 34kDa)], 유전자 등록번호 NM_003620(Protein phosphatase 1D magnesium-dependent, delta isoform), 유전자 등록번호 CR623038(Inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호 NM_005245[FAT tumor suppressor homolog 1 (Drosophila)], 유전자 등록번호 AY461717(Zinc finger protein 385), 유전자 등록번호 AB209376(SATB family member 2), 유전자 등록번호 BC012091[Hairy and enhancer of split 2 (Drosophila)], 유전자 등록번호 AB209032(Activating transcription factor 3), 유전자 등록번호 NM_014301(NifU-like N-terminal domain containing), 유전자 등록번호 NM_014172(Phosphohistidine phosphatase 1), 유전자 등록번호 NM_014668(GREB1 protein), 유전자 등록번호 BC017338(Fucosidase, alpha-L- 1, tissue), 유전자 등록번호 AB209274(Polymerase (DNA-directed), delta 4), 유전자 등록번호 BC050455(LIM homeobox 3), 유전자 등록번호 NM_004628(Xeroderma pigmentosum, complementation group C), 유전자 등록번호 NM_004877(Glia maturation factor, gamma), 유전자 등록번호 NM_058229(F-box protein 32), 유전자 등록번호 AB033073[(Sulfatase 2)], 유전자 등록번호 U86136(Telomerase-associated protein 1), 유전자 등록번호 AK128769(calcium channel, voltage-dependent, beta 2 subunit), 유전자 등록번호 NM_002867(RAB3B, member RAS oncogene family), 유전자 등록번호 NM_003512(Histone 1, H2ac), 유전자 등록번호 BC031391(Cytokine-like 1), 유전자 등록번호 NM_012189[Calcium binding tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated (fibrousheathin 2)], 유전자 등록번호 BC034227[DNA segment on chromosome 4 (unique) 234 expressed sequence], 유전자 등록번호 NM_004864(Growth differentiation factor 15), 유전자 등록번호 AK129833(Tissue factor pathway inhibitor 2), 유전자 등록번호 NM_000361(Thrombomodulin), 유전자 등록번호 NM_001553(Insulin-like growth factor binding protein 7), 유전자 등록번호 AF001540[metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 (non-coding RNA)], 유전자 등록번호 AK093784(Serine incorporator 2), 유전자 등록번호 AK095896(Hypothetical protein LOC340061), 유전자 등록번호 AK097664(Hypothetical protein BC016861), 유전자 등록번호 AK122903(EPS8-like 2), 유전자 등록번호 AK125888(F-box protein 32), 유전자 등록번호 AK126536(Leucine rich repeat containing 54), 유전자 등록번호 AK223240(Transmembrane protein 35), 유전자 등록번호 BC018702(Serine peptidase inhibitor, Kunitz type 1), 유전자 등록번호 BC021008(Cytoplasmic FMR1 interacting protein 2), 유전자 등록번호 BC025396[Spermatogenesis associated 18 homolog (rat)], 유전자 등록번호 BC042143(Hypothetical protein FLJ32009), 유전자 등록번호 BF983391(Ribosomal protein S27-like), 유전자 등록번호 BM805022[Cystatin C (amyloid angiopathy and cerebral hemorrhage)], 유전자 등록번호 BX648509(Hypothetical gene CG018), 유전자 등록번호 CR610240(Hypothetical protein LOC201229), 유전자 등록번호 CR622352(Brain specific protein), 유전자 등록번호 NM_001013632(Similar to hypothetical protein 4833401D15), 유전자 등록번호 NM_013399(Chromosome 16 open reading frame 5), 유전자 등록번호 NM_024430(Proline-serine-threonine phosphatase interacting protein 2), 유전자 등록번호 NM_030926(Integral membrane protein 2C), 유전자 등록번호 NM_138463(Hypothetical protein BC014072), 유전자 등록번호 NM_153267(MAM domain containing 2), 유전자 등록번호 NM_173553(Hypothetical protein FLJ25801), 유전자 등록번호 XM_047357(Lupus brain antigen 1), 유전자 등록번호 XM_498859(Similar to cDNA sequence BC021523), 유전자 등록번호 CN430223(Transcribed locus), 유전자 등록번호 BE903789(Transcribed locus), 유전자 등록번호 CB124304[Transcribed locus, strongly similar to NP_001604.1 alpha 2 actin; alpha-cardiac actin (Homo sapiens)], 유전자 등록번호 AK128234(unnamed protein product; Homo sapiens cDNA FLJ46368 fis, clone TESTI4051504.), 유전자 등록번호 AI795990(Chromosome 1 open reading frame 133), 유전자 등록번호 AK024399(CDNA FLJ14337 fis, clone PLACE4000494), 유전자 등록번호 BI520836[Transcribed locus, weakly similar to XP_209041.2 PREDICTED: similar to KIAA1503 protein (Homo sapiens)], 유전자 등록번호 AI292270[Transcribed locus, weakly similar to XP_510761.1 PREDICTED: similar to host cell factor C1 regulator 1 (XPO1 dependant) isoform 1; HCF-1 beta-propeller interacting protein (Pan troglodytes)], 유전자 등록번호 BX445423[Transcribed locus, weakly similar to XP_515285.1 PREDICTED: similar to inhibitor of DNA binding 2; inhibitor of differentiation 2; DNA-binding protein inhibitor ID2; helix-loop-helix protein ID2 (Pan troglodytes)], 유전자 등록번호 THC2429167, 유전자 등록번호 A_23_P255111, 유전자 등록번호 THC2309312, 유전자 등록번호 THC2295607, 유전자 등록번호 THC2374943, 유전자 등록번호 THC2308133, 유전자 등록번호 THC2310788,
    유전자 등록번호 AB209179[Polo-like kinase 1 (Drosophila)], 유전자 등록번호 NM_001254[CDC6 cell division cycle 6 homolog (S. cerevisiae), 유전자 등록번호 U65410[MAD2 mitotic arrest deficient-like 1 (yeast)), 유전자 등록번호 NM_031966(Cyclin B1), 유전자 등록번호 BC011000(Cell division cycle associated 5), 유전자 등록번호 NM_016343[Centromere protein F, 350/400ka (mitosin)], 유전자 등록번호 NM_016426(G-2 and S-phase expressed 1), 유전자 등록번호 NM_003504[CDC45 cell division cycle 45-like (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 NM_001773(CD34 antigen), 유전자 등록번호 NM_173808(Neuronal growth regulator 1), 유전자 등록번호 NM_003005[Selectin P (granule membrane protein 140kDa, antigen CD62)], 유전자 등록번호 M30640[Selectin E (endothelial adhesion molecule 1)], 유전자 등록번호 AF117756(Thyroid hormone receptor associated protein 3), 유전자 등록번호 NM_014588[Visual system homeobox 1 homolog, CHX10-like (zebrafish)], 유전자 등록번호 NM_002957(Retinoid X receptor, alpha), 유전자 등록번호 BC065544(Chromosome 14 open reading frame 106), 유전자 등록번호 AL833741[Enolase 1, (alpha)], 유전자 등록번호 NM_005934[Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila); translocated to, 1], 유전자 등록번호 NM_004237(Thyroid hormone receptor interactor 13), 유전자 등록번호 NM_202002(Forkhead box M1), 유전자 등록번호 NM_001295[Chemokine (C-C motif) receptor 1], 유전자 등록번호 U81234[Chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2)], 유전자 등록번호 AB208912(Guanylate binding protein 1, interferon-inducible, 67kDa), 유전자 등록번호 AF373846(Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 13C), 유전자 등록번호 NM_014176[Ubiquitin-conjugating enzyme E2T (putative), 유전자 등록번호 AK055221(F-box protein 5), 유전자 등록번호 AF041210[Midline 1 (Opitz/BBB syndrome)], 유전자 등록번호 BC032677(Ubiquitin-conjugating enzyme E2C), 유전자 등록번호 BC020744[Aldo-keto reductase family 1, member C4 (chlordecone reductase; 3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type I; dihydrodiol dehydrogenase 4)], 유전자 등록번호 NM_014762(24-dehydrocholesterol reductase), 유전자 등록번호 NM_005063[Stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase), 유전자 등록번호 NM_001067[Topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa, 유전자 등록번호 NM_006101(Kinetochore associated 2), 유전자 등록번호 AY367065[Asp (abnormal spindle)-like, microcephaly associated (Drosophila)), 유전자 등록번호 NM_018492(PDZ binding kinase), 유전자 등록번호 NM_003258(Thymidine kinase 1, soluble), 유전자 등록번호 NM_003981(Protein regulator of cytokinesis 1), 유전자 등록번호 NM_014750[Discs, large homolog 7 (Drosophila)], 유전자 등록번호 NM_030919(Chromosome 20 open reading frame 129), 유전자 등록번호 AF071592(Kinesin family member 4A), 유전자 등록번호 NM_170589(Cancer susceptibility candidate 5), 유전자 등록번호 NM_007280(Opa interacting protein 5), 유전자 등록번호 NM_001005414(ZW10 interactor antisense), 유전자 등록번호 AY750055[Diaphanous homolog 3 (Drosophila)], 유전자 등록번호 AY032677[Polymerase (DNA directed), theta], 유전자 등록번호 BC043166(Potassium voltage-gated channel, shaker-related subfamily, beta member 1), 유전자 등록번호 NM_006988(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1), 유전자 등록번호 NM_003486[Solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system), member 5, 유전자 등록번호 NM_014791(Maternal embryonic leucine zipper kinase), 유전자 등록번호 NM_004111(Flap structure-specific endonuclease 1), 유전자 등록번호 NM_002156[Heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin)], 유전자 등록번호 BC004352(Kinesin family member 22), 유전자 등록번호 AB209019(Regulator of G-protein signalling 4), 유전자 등록번호 AK172841(Testis-specific serine kinase 6), 유전자 등록번호 NM_000189(Hexokinase 2), 유전자 등록번호 AB210026(Myosin, heavy polypeptide 10, non-muscle), 유전자 등록번호 NM_000841(Glutamate receptor, metabotropic 4), 유전자 등록번호 NM_012278[Integrin beta 1 binding protein (melusin) 2]), 유전자 등록번호 NM_006653 (Fibroblast growth factor receptor substrate 3), 유전자 등록번호 NM_021116[Adenylate cyclase 1 (brain)], 유전자 등록번호 NM_012415[RAD54 homolog B (S. cerevisiae), 유전자 등록번호 NM_014786[Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 17], 유전자 등록번호 AK123010(Ribonucleotide reductase M2 polypeptide), 유전자 등록번호 NM_000513[Opsin 1 (cone pigments), medium-wave-sensitive (color blindness, deutan)], 유전자 등록번호 AL713654[pantothenate kinase 2 (Hallervorden-Spatz syndrome)], 유전자 등록번호 L08238[Suppressor of variegation 3-9 homolog 1 (Drosophila)], 유전자 등록번호 AB209172[Solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, taurine), member 6, 유전자 등록번호 BX648814(Angiopoietin 1), 유전자 등록번호 NM_001620[AHNAK nucleoprotein (desmoyokin)], 유전자 등록번호 NM_000185[Serpin peptidase inhibitor, clade D (heparin cofactor), member 1], 유전자 등록번호 NM_000722(Calcium channel, voltage-dependent, alpha 2/delta subunit 1), 유전자 등록번호 U20938 (Dihydropyrimidine dehydrogenase), 유전자 등록번호 AF045459(BMX non-receptor tyrosine kinase), 유전자 등록번호 NM_022111[Claspin homolog (Xenopus laevis)], 유전자 등록번호 NM_015895(Geminin, DNA replication inhibitor), 유전자 등록번호 AK091926[Solute carrier family 13 (sodium-dependent dicarboxylate transporter), member 2], 유전자 등록번호 AK091802(KIAA2002 protein), 유전자 등록번호 NM_003115(UDP-N-acteylglucosamine pyrophosphorylase 1), 유전자 등록번호 NM_002834[Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11 (Noonan syndrome 1)], 유전자 등록번호 NM_003629[Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3 (p55, gamma)], 유전자 등록번호 NM_002758(Mitogen-activated protein kinase kinase 6), 유전자 등록번호 AB209505[Myosin VA (heavy polypeptide 12, myoxin)], 유전자 등록번호 BF032596[Translocase of inner mitochondrial membrane 10 homolog (yeast)], 유전자 등록번호 NR_000041(RNA, U12 small nuclear), 유전자 등록번호 BM471410[Heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin)], 유전자 등록번호 BX640641(Chromosome 6 open reading frame 107), 유전자 등록번호 BX102654(Histone 1, H4b), 유전자 등록번호 BX640701[Zwilch, kinetochore associated, homolog (Drosophila)], 유전자 등록번호 AL833626(Zinc finger, DHHC-type containing 20), 유전자 등록번호 AY195859(Reticulocalbin 3, EF-hand calcium binding domain), 유전자 등록번호 BQ216858(Ribosomal protein L39-like), 유전자 등록번호 NM_182513[Spindle pole body component 24 homolog (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 BC010526(Hypothetical LOC401127), 유전자 등록번호 XM_067448(similar to MEST), 유전자 등록번호 CN484301[Transcribed locus, moderately similar to XP_227769.2 PREDICTED: similar to Ac1147 (Rattus norvegicus)], 유전자 등록번호 AK090447(Rho GTPase activating protein 19), 유전자 등록번호 AB209297(Thymopoietin), 유전자 등록번호 XM_497443(DNM1DN3.2 duplicon), 유전자 등록번호 BC043576[Fer3-like (Drosophila)], 유전자 등록번호 CR617127[SIL1 homolog, endoplasmic reticulum chaperone (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 NM_203411(Transmembrane protein 88), 유전자 등록번호 NM_018204(Cytoskeleton associated protein 2), 유전자 등록번호 AL136840[MCM10 minichromosome maintenance deficient 10 (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 AK125737(LOC440570), 유전자 등록번호 AK126548(Chromosome 20 open reading frame 144), 유전자 등록번호 NM_001012507(Chromosome 6 open reading frame 173), 유전자 등록번호 NM_152446(Chromosome 14 open reading frame 유전자 등록번호 AB007829(Scavenger receptor class A, member 3), 145), 유전자 등록번호 NM_018063(Helicase, lymphoid-specific), 유전자 등록번호 AY251274(Junctophilin 3), 유전자 등록번호 BC004387(Clone BSYN39 immunoglobulin variable region VH mu domain), 유전자 등록번호 BC006173(Chromosome 14 open reading frame 151), 유전자 등록번호 NM_006716[DBF4 homolog (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 W60781(Fatty acid binding protein 4, adipocyte), 유전자 등록번호 AL832235(Chromosome 6 open reading frame 173), 유전자 등록번호 NM_015180(Spectrin repeat containing, nuclear envelope 2), 유전자 등록번호 NM_012449(Six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1), 유전자 등록번호 NM_015426(WD repeat domain 51A), 유전자 등록번호 AK222819(Nucleolar and spindle associated protein 1), 유전자 등록번호 BC052951(Lamin B1), 유전자 등록번호 AK000318(Leucine zipper protein 5), 유전자 등록번호 NM_014783(Rho GTPase activating protein 11A), 유전자 등록번호 BX107768(Transcribed locus), 유전자 등록번호 BC071990(Family with sequence similarity 7, member 유전자 등록번호 BU675073(Pituitary tumor-transforming 1), A2), 유전자 등록번호 NM_138703(Melanoma antigen family E, 2), 유전자 등록번호 CR621398(Cell division cycle associated 3), 유전자 등록번호 NM_032882(Paraneoplastic antigen like 6A), 유전자 등록번호 BQ278454(CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B), 유전자 등록번호 NM_018154[ASF1 anti-silencing function 1 homolog B (S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 NM_013277(Rac GTPase activating protein 1), 유전자 등록번호 AJ243997(Transforming, acidic coiled-coil containing protein 3), 유전자 등록번호 CR604810(Cyclin A2), 유전자 등록번호 BQ056337[Cyclin-dependent kinase inhibitor 3 (CDK2-associated dual specificity phosphatase)], 유전자 등록번호 XM_291222(Integrator complex subunit 1), 유전자 등록번호 AF516710(MLF1 interacting protein), 유전자 등록번호 AL832036(Hypothetical protein FLJ40629), 유전자 등록번호 CD049340(Aurora kinase B), 유전자 등록번호 NM_152562(Cell division cycle associated 2), 유전자 등록번호 NM_014736(KIAA0101), 유전자 등록번호 AB091343(Centrosomal protein 55kDa), 유전자 등록번호 NM_018685[Anillin, actin binding protein (scraps homolog, Drosophila)], 유전자 등록번호 THC2405066, 유전자 등록번호 ENST00000354861, 유전자 등록번호 THC2282717.
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  9. 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 독소루비신에 대한 노출 여부 측정용 키트.
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