KR101609373B1

KR101609373B1 - 저급 지방족 포화 알데하이드 류 특이적 메틸화 마커 유전자 및 이를 이용한 저급 지방족 포화 알데하이드 류 노출 여부 확인 방법

Info

Publication number: KR101609373B1
Application number: KR1020140022322A
Authority: KR
Inventors: 류재천; 최한샘; 송미경
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2014-02-26
Filing date: 2014-02-26
Publication date: 2016-04-05
Also published as: JP5940635B2; JP2015159809A; KR20150101092A

Abstract

본 발명은 저급 지방족 포화 알데하이드 류(Lower aliphatic saturated aldehydes)의 노출에 특이적인 메틸화 바이오마커 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 저급 지방족 포화 알데하이드 류에 의해 특정 유전자의 프로모터 부위가 공통적으로 메틸화되는 저급 지방족 포화 알데하이드 류 노출 특이적 마커 유전자 및 이를 이용한 저급 지방족 포화 알데하이드 류에 대한 노출 여부 확인을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 메틸화 마커는 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자의 메틸화된 프로모터 부위를 바이오마커로 이용하여 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 저급 지방족 포화 알데하이드 류의 노출을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 저급 지방족 포화 알데하이드 류에 의해 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

Description

저급 지방족 포화 알데하이드 류 특이적 메틸화 마커 유전자 및 이를 이용한 저급 지방족 포화 알데하이드 류 노출 여부 확인 방법{Methylation marker for identification of exposure to Lower aliphatic saturated aldehydes and the method of identification using thereof}

본 발명은 저급 지방족 포화 알데하이드 류(Lower aliphatic saturated aldehydes) 노출에 특이적인 메틸화 바이오마커 및 이를 이용한 저급 지방족 포화 알데하이드 류 에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.

생체에서 유전자의 단백질-코딩 서열에서 변이가 없더라도 상기 유전자의 기능이 손실되어 주된 메카니즘(mechanism)이 방해받게 된다. DNA 메틸화( methylation)는 이러한 현상 중의 하나이며 특정 유전자의 프로모터 부위가 과메틸화(hypermethylation)되면 상기 유전자의 발현이 억제되고 반대로 저메틸화(hypomethylation)되면 유전자의 발현이 증가한다. DNA 메틸화는 원핵생물에서는 외부 유전자의 침입으로부터 보호해 주는 역할을 하며, 진핵생물에서는 발달과정에서 유전자의 발현을 조절해 주는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근의 연구에서는 DNA 메틸화가 그 외에도 유전체 각인 및 안정화나 X염색체의 불활성화 등에도 관여하며, 조직 특이적 유전자 활성, 질병과 연관된 유전자들의 발현 증가 또는 억제에도 영향을 미친다는 것이 밝혀지고 있다. 메틸화의 메커니즘은 암 발병, 세포 노화, 장기의 성장 등에 주요한 영향을 미치고 있으며, 이에 따라 메틸화 관련 연구는 암 발생, 노화 등의 생명현상 인과 관계 규명에 중추적 역할을 할 뿐만 아니라, 향후 발생 및 분화나 줄기세포를 이용한 세포치료제 개발 등의 연구에도 적용시킬 수 있는 우리나라 바이오 연구의 핵심 분야로 자리 잡을 수 있을 것으로 예상된다. 따라서, 메틸화 마커의 발굴은 암을 포함하여 질병의 조기 진단 가능성을 예측하는 데에 많은 도움을 줄 것이라는 점에서 의의가 있다.

최근의 급격한 기술 발달에 따라, 유전체 전반에 걸친 메틸화 분석이 시도되고 있으며, 이를 통해 이제까지 알려지지 않은 새로운 것을 포함하여 전반적인 메틸화의 기능에 대한 연구가 가능해 질 것으로 여겨지고 있다. 특히 고 분해능의 마이크로어레이(microarray)와 초고속 차세대 염기서열분석 등의 기술들은 보다 많은 질병에 있어서 메틸화 전반에 걸친 연구를 가능하게 하여 질병 유발 과정에 대한 새로운 지식을 제공하고 이를 통한 새로운 진단 마커 및 치료 표적의 발굴을 가능하게 할 것이다.

뿐만 아니라 메틸화 마커는 특정 환경유해물질의 노출 예측에도 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 생각되어지고 있다. 지금까지는 환경유해물질의 노출에 따른 유전자(mRNA)의 변화 양상과 그에 따른 질병과의 연관성에 관련된 연구가 주로 진행되었으나 최근 DNA 메틸화와의 연관성에 대한 관심이 증가함에 따라 몇몇 연구에서 벤젠(benzene), 비소(arsenic) 또는 RDX(cyclonite)와 같은 유해물질의 노출에 따른 메틸화 변화를 관찰하였으며 특이적인 변화를 보이는 메틸화 유전자를 유해물질에 대한 마커로 제시하였다(Baccarelli, A. & Bollati, V. Curr . Opin . Prediatr . 21, 243-251, 2009 참조). 또한 발굴된 메틸화 유전자는 노출 예측을 위한 마커로서 뿐만 아니라 환경유해물질에 의한 독성 기작 예측을 위한 마커로서 유용하게 쓰일 수 있다. 이렇듯 메틸화 마커의 환경유해물질 노출 및 독성기작 예측에서의 역할이 매우 중요하다고 할 수 있음에도 불구하고 현재 DNA 메틸화 관련 연구는 주로 질병 진단용 마커 발굴에 국한되어 있으며 다양한 환경 중에 노출 가능성이 큰 저급 지방족 포화 알데하이드 류와 같은 유해물질 노출에 의한 유전자 메틸화 변화에 대한 연구는 부족하다. 또한, 후성유전학적 변화는 유전자의 발현과 같은 유전학적 변화의 다양성에 비해 그 정도가 심하지 않게 때문에 다수의 마커가 필요한 유전자 발현 프로파일링에 비해서 단 하나의 DNA 메틸화나 마이크로 RNA와 같은 후성유전체 마커로도 질병이나 유해물질 노출을 초기에 진단 할 수 있다는 장점뿐만 아니라 비 침습적 방법으로 진단할 수 있다는 이점이 있다.

알데하이드(aldehydes)는 탄화수소를 비롯한 다른 유기물들의 불완전 연소에 의해서 생성된다. 또한, 알데하이드는 질소산화물과 몇몇 탄화수소의 광화학적인 반응에 의해서도 생성되며 이는 대기중의 오염물질에 의해서도 알데하이드가 생성 될 수 있음을 말한다. 대기중에 퍼진 알데하이드는 자체적으로 광화학적인 반응을 통해 오존, 과산화물과 같은 산화제와 일산화탄소를 대기중에서 생성할 수 있다.

실내에서 알데하이드류의 주된 생성 원인은 가구, 카페트, 수지합판, 직물, 도색페인트 등에서 발생하는 것으로 알려져 있고, 음식을 조리시에 발생하는 연기에도 다양한 종류의 알데하이드가 포함되어있다고 알려져 있다. 또한, 흡연과정에서 발생하는 연기에는 다양한 알데하이드류가 포함되어 있고 이는 주요한 실내 알데하이드류의 생성 원인이 된다(Crit Rev Toxicol 35(7):609-662, 2005).

알데하이드류 중에서도 저급 지방족 포화 알데하이드류(Lower aliphatic saturated aldehydes)는 탄소사슬의 길이가 0 ~ 9개이며 각 물질마다 자극적인 냄새를 지닌 기체 또는 액체로 물에 녹는다. 이들 중 탄소사슬의 길이가 6 ~ 9개인 알데하이드는 주로 향료로 쓰이며 식품 첨가물, 향수산업 등에서 활용되고 있다. 저급 지방족 포화 알데하이드류의 실내외 농도는 포름알데하이드(Formaldehyde), 아세트알데하이드(Acetaldehyde)를 제외한 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal), 노나날(Nonanal) 등의 알데하이드의 농도의 경우 단일 규제대상 혹은 위험성 물질로 분류되어 있지 않은 지역이 많아 조사된 바가 드물다. 몇몇 조사된 바에 따르면 이들 저급 지방족 포화 알데하이드 류의 노출수준은 일정하지 않으며, 실내환경의 경우 건물의 상태, 환경조건에 따라 차이가 매우 컸다. 포름알데하이드와 아세트알데하이드를 제외한 다른 저급 지방족 포화 알데하이드의 단일 물질 규제 현황으로는 전 세계적으로 일본과 대한민국만 시행하고 있으며 단일 물질로써는 프로피온알데하이드, 부틸알데하이드, 발러알데하이드 3종의 물질만이 규제되어 있다.

저농도의 저급 지방족 포화 알데하이드에 노출될 경우 안구 자극과 호흡기 자극증상을 보인다. 고농도의 저급 지방족 포화 알데하이드를 흡입하였을 경우에는 호흡기 자극으로 인한 타는듯한 느낌, 구역질, 어지러움, 기침, 가래, 후두염, 두통, 호흡수 증가, 숨막힘 등을 느낄 수 있고 장기적으로 흡입하는 환경에 노출될 경우 경련, 발작, 기관지염, 폐렴, 후두 부종 등을 일으킬 수 있다(http://toxnet.nlm.nih.gov).

혈류를 타고 흐르는 휘발성 유기화합물은 폐포막의 확산현상에 의해 폐에 영향을 미치게 되며, 헥산(hexane), 메틸펜탄(methylpentan), 이소프로펜(isopropene), 벤젠(benzene) 등은 질환의 마커로 사용되고 있으며(J Vet Sci 5(1):11-18, 2004), 최근 날숨 테스트(exhaled breath analysis)를 통해 포집된 물질의 휘발성 유기화합물류 분석 결과로부터 간단한 폐암 진단법이 개발되어 이용되고 있다. 휘발성 유기화합물류 중 알데히드류(Aldehydes)는 폐암질환자들에게 나타나는 대표적 물질로 보고되고 있다(J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 878(27):2643-2651, 2010). 따라서, 저급 지방족 포화알데하이드류 특이적 바이오마커 발굴은 폐질환 및 저급 지방족 포화알데하이드류의 환경 중 노출을 스크리닝하는데 활용될 수 있다.

저급 지방족 포화 알데하이드류에 대한 독성연구는 다른 환경오염물질에 비해 연구가 매우 빈약한 실정이다. 저급 지방족 포화 알데하이드류는 독성을 일으키는 작용기전이 명확하지 않을 뿐만 아니라 용량-반응관계도 잘 알려져 있지 않아 체계적인 위해성 평가의 확립을 위해서는 보다 다양한 실험 모델과 조건을 통한 세밀한 연구가 요구되며, 저급 지방족 포화 알데하이드류의 독성을 평가할 수 있는 민감한 생체지표의 발굴도 시급한 실정이다.

새로운 유해물질의 위해성에 대한 연구는 지표물질 또는 환경 매질에 축적된 독성물질의 농도측정이 중심이 되어오고 있다. 그러나 수 천 내지 수 만 가지가 넘는 유해 화학물질을 모두 분석할 수 없으며, 신종 오염물질의 존재는 생물의 위해성 여부를 진단하는 과정을 우선적으로 거쳐야만, 국가적 차원의 대응과 관리가 이루어질 수 있다. 또한 체내 농도측정 등의 한정된 결과만으로는 생물에 미치는 독성 영향을 알 수 없다. 이러한 이유에서 독성물질의 정확한 독성 작용기전 확립과 함께 저급 지방족 포화 알데하이드류 노출에 가장 먼저 반응하는 분자생물학적 수준의 체계적인 지표개발 연구가 필요하다. 그래서 보다 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 마이크로 어레이 칩 또는 프라이머(primer)를 이용하는 실시간 PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 등으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용, 특히 암을 비롯한 다양한 질병 유발에 관여하는 메틸화 변화 여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 저급 지방족 포화 알데하이드류의 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.

DNA chip 기술의 발달로 인해 최근 연구들은 암이나 기타 질병 또는 특정 자극에 따른 DNA 메틸화 양상 변화의 특징을 분석하는 쪽으로 이루어지고 있다. 이러한 분석 방법에는 메틸화된 서열(sequence)과 그렇지 않은 서열의 차이를 이용, 제한효소를 사용하는 방법(HELP)과 항 5-메틸사이토신(methylcytosine) 항체를 이용한 면역침강 방법(MIRA, MeDIP) 및 중아황산나트륨(sodium bisulfite)을 이용한 서열 분석 방법 등 다양한 방법이 최근 들어 개발 및 사용되고 있다. 이들 중 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자 메틸화 양상을 확인하고 이들의 기능을 연구하기 위한 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구, 즉 마이크로어레이(microarray) 분석이 주로 이루어지고 있다.

마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et. al. J. Am . Acad . Dermatol. 51, 681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어 지고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al. J. Am . Acad . Dermatol. 51, 681-692, 2004).

유전자의 메틸화 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 메틸화된 DNA만을 얻어 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 DNA는 형광이나 동위원소로 표지화한다.

최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯해 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서의 DNA 메틸화 변화 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 메틸화 양상을 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 확인 가능하게 될 것이다.

이에 본 발명자들은 인간 유전자 프로모터 부위 41만 여개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 저급 지방족 포화 알데하이드류의 DNA 메틸화 프로파일을 이용하여 특이적으로 변화되는 메틸화 DNA를 발굴하였고, 상기 메틸화 DNA를 저급 지방족 포화 알데하이드류 노출시 메틸화 변화 여부를 검출할 수 있는 바이오마커로 이용하여 저급 지방족 포화 알데하이드 노출 여부를 확인하는 방법을 확립하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 저급 지방족 포화 알데하이드류(Lower aliphatic saturated aldehydes)의 노출에 의해 공통적으로 메틸화 정도가 변화되는 유전자 및 상기 유전자를 바이오마커로 이용하여 저급 지방족 포화 알데하이드류에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은

하기의 군으로부터 선택되는 유전자 프로모터 부위 또는 그의 상보가닥 분자가 하나 이상 직접된, 저급 지방족 포화 알데하이드 류(Lower aliphatic saturated aldehydes)에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩을 제공한다:

GenBank 유전자 등록번호 NM_199121(VWA1, von Willebrand factor A domain containing 1); 및

GenBank 유전자 등록번호 NM_194298(SLC16A9, solute carrier family 16, member 9 (monocarboxylic acid transporter 9)).

또한, 본 발명은

1) 저급 지방족 포화 알데하이드 류에 노출이 의심되는 노출군 및 노출되지 않은 대조군의 체세포에서 DNA를 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 노출군 및 대조군의 DNA를 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;

3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 DNA를 본 발명의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 하는 단계;

4) 단계 3)의 혼성화한 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및

5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 본 발명의 마이크로어레이 칩에 직접된 유전자의 메틸화 변화 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 저급 지방족 포화 알데하이드 류에 대한 노출 여부 확인 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 저급 지방족 포화 알데하이드 류 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

본 발명의 저급 지방족 포화 알데하이드류 노출에 공통적 메틸화 바이오 마커 및 이를 이용한 저급 지방족 포화 알데하이드류 노출 여부 확인 방법은, 저급 지방족 포화 알데하이드류의 노출을 조기에 모니터링 및 판정이 가능하고 통상적인 방법에 비해 정확하게 노출을 모니터링 할 수 있어, 저급 지방족 포화 알데하이드 류에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 저급 지방족 포화 알데하이드류의 인간 폐암 세포주에서의 세포 독성을 조사한 그래프이다;
도 1a는 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal) 및 헥사날(Hexanal)의 인간 폐암 세포주에 대한 세포 독성을 나타내며;
도 1b는 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal) 및 노나날(Nonanal)의 인간 폐암 세포주에 대한 세포 독성을 나타낸다.
도 2는 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 이용한 저급 지방족 포화 알데하이드류에 노출된 시료에서의 DNA 메틸화 변화 양상을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 3는 저급 지방족 포화 알데하이드류의 노출에 의해 공통적으로 4.0배 이상 혹은 이하로 메틸화 양상이 변화하는 2종의 유전자 프로브의 메틸화 변화 양상을 분석한 결과를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 저급 지방족 포화 알데하이드 류(Lower aliphatic saturated aldehydes)의 노출에 의해 특이적으로 DNA 메틸화 정도가 변화를 일으키는 저급 지방족 포화 알데하이드 류 특이적 노출 여부 확인용 DNA 메틸화 바이오 마커를 제공한다.

상기 유전자는 하기의 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다:

상기 GenBank 유전자 등록번호 NM_199121의 프로모터 부위는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 기재되는 염기 서열을 갖는 것이 바람직하고, 상기 GenBank 유전자 등록번호 NM_194298의 프로모터 부위는 서열번호 2로 기재되는 염기 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 저급 지방족 포화 알데하이드 류는 알데하이드 중에서도 탄소사슬의 길이가 0 내지 9 개를 포함하는 것이 바람직하며, 구체적으로 포름알데하이드(Formaldehyde), 아세트알데하이드(Acetaldehyde), 프로피온알데하이드(propionaldehyde), 부틸알데하이드(buthylaldehyde), 발러알데하이드(Valeraldehyde), 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal) 및 노나날(Nonanal)과 같은 당업계에서 통상적으로 알려져 있는 저급 지방족 포화 알데하이드 류 모두인 것이 보다 바람직직하고, 보다 구체적으로는 프로파날, 부타날, 펜타날, 헥사날, 헵타날, 옥타날 및 노나날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예 에서, 본 발명자들은 저급 지방족 포화 알데하이드 류의 노출에 대한 DNA 메틸화 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 저급 지방족 포화 알데하이드 류를 인간 폐암 세포인 A549 세포주에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 저급 지방족 포화 알데하이드 류는 인간 폐암 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1a 및 도 1b 참조), 상기 실험에서 20% 생존율을 보이는 농도(IC₂₀)는 각각 propanal 2.5 mM, Butanal 3.5 mM, pentanal 1.7 mM, Hexanal 0.5 mM, Heptanal 0.6 mM, Octanal 0.58 mM, Nonanal 0.7 mM 이었으며, 상기와 같이 저급 지방족 포화 알데하이드 류의 노출 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 저급 지방족 포화 알데하이드 류를 인간 폐암 세포주에 처리하고, 상기 물질을 처리한 세포주에서 메틸화 DNA만을 특이적으로 분리하여 총 게놈 증폭(whole genome amplification)을 하면서 형광물질(Cy5)로 표지하였으며 투입된(input) DNA의 경우 Cy3로 표지하였다. 상기 형광표지된 DNA를 Agilent SurePrint G3 Human Promoter 2x400K microarray(Agilent, 미국)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 DNA 메틸화 양상의 차이를 분석하였다(도 2 참조). 분석시 저급 지방족 포화 알데하이드 류를 처리하지 않은 대조군에 비해 저급 지방족 포화 알데하이드 류를 처리한 노출군에서 공통적으로 유의하게 메틸화 변화를 나타낸 DNA에 대해 메틸화의 변화가 4.0배 이상 증가 혹은 감소된 프로모터 부위를 가지는 유전자가 2종이었으며(표 2 및 도 3 참조), 상기 유전자는 저급 지방족 포화 알데하이드 류를 처리했을 때, 인간 폐암 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.

따라서, 본 발명의 저급 지방족 포화 알데하이드 류에 특이적 메틸화 바이오 마커는 저급 지방족 포화 알데하이드 류의 노출을 조기에 모니터링 및 판정이 가능하고 통상적인 방법에 비해 정확하게 노출을 모니터링 할 수 있어 유용하며, 저급 지방족 포화 알데하이드 류에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 유전자 프로모터 부위 또는 그의 상보가닥 분자가 하나 이상 직접된 저급 지방족 포화 알데하이드 류 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩을 제공한다:

GenBank 유전자 등록번호 NM_199121, GenBank 유전자 등록번호 NM_194298.

상기 저급 지방족 포화 알데하이드 류는 알데하이드 중에서도 탄소사슬의 길이가 0 내지 9 개를 포함하는 것이 바람직하며, 구체적으로 포름알데하이드, 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부틸알데하이드, 발러알데하이드, 프로파날, 부타날, 펜타날, 헥사날, 헵타날, 옥타날 및 노나날과 같은 당업계에서 통상적으로 알려져 있는 저급 지방족 포화 알데하이드 류 모두인 것이 보다 바람직직하고, 보다 구체적으로는 프로파날, 부타날, 펜타날, 헥사날, 헵타날, 옥타날 및 노나날로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 마이크로어레이 칩은 DNA 메틸화 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하며, 상기 바이오마커는 저급 지방족 포화 알데하이드 류 노출에 의해 공통적으로 메틸화 변화가 4.0배 이상 증가 혹은 감소된 프로모터 부위를 가지는 유전자로 구성되어 있다.

본 발명의 저급 지방족 포화 알데하이드 류 검색용 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 inkjet 방식 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 SurePrint inkjet micro dropping 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 에폭시(epoxy), 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 에폭시가 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 저급 지방족 포화 알데하이드 류의 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 저급 지방족 포화 알데하이드 류의 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다:

5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 본 발명의 마이크로어레이 칩에 직접된 유전자의 메틸화 변화 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.

상기 단계 1)의 체세포는 인간의 폐암세포 또는 인간 폐암 세포인 A549 세포주를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 폐세포 또는 인간 폐암의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 단계 5)의 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩은 Agilent SurePrint G3 Human Promoter 2x400K microarray(Agilent, USA)등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 DNA 프로모터 부위 중 본 발명에서 상기 메틸화 양상이 변화된 DNA 프로모터 부위(표 1 및 표 2 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다.

또한, 단계 5)의 분석 방법은 Genomic Workbench와 GeneSpring GX 12 소프트웨어(Agilent, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.

또한, 본 발명은 저급 지방족 포화 알데하이드 류 노출에 대한 DNA 메틸화 변화 여부 확인용 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 포함하는 저급 지방족 포화 알데하이드 류 노출에 대한 DNA 메틸화 변화 여부 확인용 키트를 제공한다.

상기 확인용 키트에 추가적으로 인간 체세포를 포함하는 저급 지방족 포화 알데하이드 류의 노출에 대한 DNA 메틸화 변화 여부 확인용 키트를 제공한다. 상기 인간 체세포는 인간의 폐세포 또는 인간 폐암세포주인 A549를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 폐세포 또는 인간 폐암의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.

상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리

<1-1> 세포배양

인간 폐암 세포주인 A549 세포(한국 세포주 은행)를 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지(Gibro-BRL, US)를 이용하여 100 ㎜ 디쉬(dish)에서 80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 환경 중 노출되는 휘발성 유기화합물에 속하는 저급 지방족 포화알데하이드류(Lower aliphatic saturated aldehydes)중 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal), 노나날(Nonanal)을 선정하였으며, DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.

<1-2> 세포 독성 실험( MTT assay ) 및 화학 물질 처리

Mossman 등(J. Immunol . Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 A549 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 상기 세포는 24-웰 플레이트에 3.5 ㅧ10⁴/웰 세포수로 RPMI 배지(Gibro-BRL, USA)에서 DMSO에 용해된 저급 지방족 포화알데하이드류를 처리하고 48시간 후에 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 플레이트에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 상기 용해물을 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.

그 결과, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이 A549 세포주에서 저급 지방족 포화알데하이드류의 세포독성을 살펴본 결과, 20% 생존율을 보이는 농도(IC₂₀)는 각각 propanal 2.5 mM, Butanal 3.5 mM, pentanal 1.7 mM, Hexanal 0.5 mM, Heptanal 0.6 mM, Octanal 0.58 mM, Nonanal 0.7 mM 이었으며, 상기 농도들로 결정하여 하기 <실시예 2>의 마이크로어레이를 수행하였다(도 1a 및 도 1b).

< 실시예 2> 마이크로어레이 실험

<2-1> 게놈( Genomic ) DNA 의 분리

저급 지방족 포화 알데하이드류 노출군과 대조군 시료로부터의 DNA 분리는 QIAamp DNA 미니 키트(mini Kit)를 사용하여 정제하였다. 각 전체 DNA 시료의 농도는 분광광도계인 NanoDrop ND 1000 분광도계(spectrophotometer)(NanoDrop Technologies Inc., 미국)를 이용하여 측정하였으며 순도는 아가로스 젤(agarose gel) 전기영동으로 확인하였다.

<2-2> 게놈( Genomic ) DNA 의 단편화

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 저급 지방족 포화알데하이드류 시료 전체 DNA로부터 메틸화 DNA만을 특이적으로 추출하여야 한다. 이때, genomic DNA의 크기가 200bp에서 1000bp 정도가 적당하므로 초음파 균질분쇄기(Sonic Dismembrator)를 이용하여 20 sec. 'ON', 20 sec. 'OFF' 4회를 1 사이클(cycle)로, 3 사이클을 수행하여 DNA를 200 bp~1000 bp로 자른 다음, DNA의 크기를 확인하기 위해 아가로스 젤 전기영동을 수행하였다.

<2-3> 메틸화 DNA 면역침강법

메틸화 DNA만을 특이적으로 추출하기 위하여 면역침강법을 이용하였으며 Invitrogen사의 메틸마이너 메틸화 DNA 농축 키트(MethylMiner Methylated DNA Enrichment Kit)를 사용하며 제조사의 지시방법에 따라 실험을 진행하였다.

구체적으로, 면역침강법은 비드(beads)의 원리에 의해 진행되며 실시예 <2-2>에서 수득한 단편화 DNA를 비드(beads)와 혼합하여 실온에서 1시간 동안 반응시키거나 4℃에서 밤새 반응(overnight)시킨다. 반응되지 않은(non-captured) DNA는 세척과정을 반복하여 제거시키고 NaCl로 메틸화된(methylated) DNA를 용출(elution)시킨 후 최종적으로 페놀-클로로포름(phenol-chloroform)으로 DNA만을 추출하였다. 이렇게 추출된 메틸화 DNA를 메틸화 특이 프라이머를 이용하여 PCR 한 후, 아가로스젤 전기영동을 통해 최적의 상태임을 확인하였다.

<2-4> 표지된 DNA 제조

총 게놈 증폭 키트(Whole genome amplification kit)(SIGMA_WGA2)을 이용하여 DNA와 메틸화 DNA 40 ng을 증폭하여 사용하였다. 상기 증폭한 DNA와 메틸화 DNA 1 ㎍에 random 프라이머 5 ㎕을 넣고 95℃에서 3분간 반응시키고 얼음(ice)에서 5분간 유지시켜 어닐링(annealing)시켰다. 상기 DNA 표지를 하기 위해 [표 1]과 같은 Master mix를 넣고 잘 섞은 후 37℃에서 2시간 동안 반응한 뒤 효소(enzyme)을 비활성 시키기 위해 65℃에서 10분 동안 반응해준 뒤 ice로 옮겨주었다.

DNA 표지를 위한 Master mix의 조성

구성성분	부피(㎕)
5X buffer	10
10X dNTPs	5
Cy-3 or Cy-5 dUTP (1.0 mM)	3
Exo-Klenow fragment	1

<2-5> 혼성화 반응

표지된 DNA와 메틸화 DNA를 정제(purification) 과정을 거쳐 2.5 ~ 5 ㎍ 정도 사용하여 Agilent 10x blocking와 Agilent 2x hyb buffer를 넣고 잘 섞은 뒤 95℃에서 3분간 변성(denature)한 뒤 37℃에서 30분간 반응시킨다. 칩(chip)에 잘 넣고 67℃에서 40시간(2x formats) 동안 오븐에서 혼성화 반응을 하였다. 40시간 뒤 세척과정(Oligo aCGH/ChIP-on-chip 1에서 5분, Oligo aCGH/ChIP-on-chip 2에서 37℃, 1분)을 거친 후, 상기 chip을 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다. 메틸화 DNA 마이크로어레이 칩으로는 Agilent SurePrint G3 Human Promoter 2x400K microarray(Agilent, 미국)를 이용하였다.

<2-6> 형광 이미지 획득

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Agilent C scanner(Agilent technologies, USA)로 스캔하였으며 추출된 데이터는 Agilent Genomic Workbench와 GeneSpring GX 12(Agilent technologies)를 이용하여 normalization을 거쳐 각 DNA 프로모터 부위의 메틸화 변화 양상을 분석하였다.

상기 형광표지된 DNA를 Agilent SurePrint G3 Human Promoter 2x400K microarray (Agilent, USA)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 DNA 메틸화 양상의 차이를 분석하였다(도 2).

그 결과, 도 3 및 하기 [표 2]에 나타낸 바와 같이, 상기 올리고 칩 상에 존재하는 대략 41만 여개의 유전자 프로모터 부위를 포함하는 프로브 중에서 대조군에 비해 유의하게 메틸화 변화를 나타낸 DNA에 대해 메틸화 변화가 4.0배 이상 증가 혹은 감소된 프로모터 부위를 가지는 유전자가 2종임을 확인하였으며(도 3 및 표 2), 이들 유전자들은 저급 지방족 포화 알데하이드류 노출시, 인간 폐암 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없었다.

저급 지방족 포화 알데하이드류 처리에 의해 공통으로 메틸화 정도가 변화하는 유전자

등록번호	유전자 약어	유전자 명	중간값의 비							메틸화 정도
등록번호	유전자 약어	유전자 명	Propanal	Butanal	Pentanal	Hexanal	Heptanal	Octanal	Nonanal	메틸화 정도
NM_199121	VWA1	von Willebrand factor A domain containing 1	-4.94	-4.82	-4.94	-4.94	-4.94	-4.33	-4.94	저 메틸화
NM_194298	SLC16A9	solute carrier family 16, member 9 (monocarboxylic acid transporter 9)	-4.76	-6.37	-5.62	-6.93	-6.30	-6.93	-4.39	저 메틸화

아울러, 본 발명에 있어서, 상기 2종 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 영역은 하기 [표 3]에 서열번호 1에서 서열번호 2로 표시되는 서열임을 확인하였다(표 3).

저급 지방족 포화 알데하이드 류 노출에 의해 공통으로 메틸화 정도가 변화하는 유전자의 서열

유전자	프로브 서열	서열번호
VWA1	GAGGCCCCTCGAAGTGGTACAGCTTGCACTCTGGGGACCCAAAGT	서열번호 1
SLC16A9	CAGGGAGACCAAGGAACACTCGCATTCATTTGTACACCCCGGCTC	서열번호 2

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Methylation marker for identification of exposure to Lower aliphatic saturated aldehydes and the method of identification using thereof <130> 13P-11-043 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaggcccctc gaagtggtac agcttgcact ctggggaccc aaagt 45 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Herpetosiphon <400> 2 cagggagacc aaggaacact cgcattcatt tgtacacccc ggctc 45

Claims

하기의 모든 유전자의 프로모터 부위 또는 그의 상보가닥 분자가 모두 집적된, 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal) 및 노나날(Nonanal)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩:
GenBank 유전자 등록번호 NM_199121(VWA1, von Willebrand factor A domain containing 1); 및
GenBank 유전자 등록번호 NM_194298(SLC16A9, solute carrier family 16, member 9 (monocarboxylic acid transporter 9)).
제 1항에 있어서, GenBank 유전자 등록번호 NM_199121의 프로모터 부위는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 기재되는 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal) 및 노나날(Nonanal)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩.
제 1항에 있어서, GenBank 유전자 등록번호 NM_194298의 프로모터 부위는 서열번호 2로 기재되는 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal) 및 노나날(Nonanal)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 마이크로어레이 칩은 DNA 메틸화 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는, 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal) 및 노나날(Nonanal)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩.
1) 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal) 및 노나날(Nonanal)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 노출이 의심되는 노출군 및 노출되지 않은 대조군의 체세포에서 DNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 노출군 및 대조군의 DNA를 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 DNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 하는 단계;
4) 단계 3)의 혼성화한 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 메틸화 변화 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal) 및 노나날(Nonanal)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 대한 노출 여부 확인 방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 1)의 체세포는 인간의 폐암 세포 또는 인간 폐암세포 유래인 세포인 것을 특징으로 하는, 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal) 및 노나날(Nonanal)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 대한 노출 여부 확인 방법.
제 7항에 있어서, 상기 인간의 폐암 세포는 A549인 것을 특징으로 하는, 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal) 및 노나날(Nonanal)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 대한 노출 여부 확인 방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal) 및 노나날(Nonanal)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 대한 노출 여부 확인하는 방법.
삭제
제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는, 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal) 및 노나날(Nonanal)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 대한 노출 여부 확인용 키트.
제 11항에 있어서, 인간 체세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal) 및 노나날(Nonanal)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 대한 노출 여부 확인용 키트.
제 12항에 있어서, 상기 인간의 체세포는 A549인 것을 특징으로 하는, 프로파날(Propanal), 부타날(Butanal), 펜타날(Pentanal), 헥사날(Hexanal), 헵타날(Heptanal), 옥타날(Octanal) 및 노나날(Nonanal)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 대한 노출 여부 확인용 키트.
삭제