KR20100132256A - 용접 흄 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법 - Google Patents

용접 흄 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20100132256A
KR20100132256A KR1020090050984A KR20090050984A KR20100132256A KR 20100132256 A KR20100132256 A KR 20100132256A KR 1020090050984 A KR1020090050984 A KR 1020090050984A KR 20090050984 A KR20090050984 A KR 20090050984A KR 20100132256 A KR20100132256 A KR 20100132256A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
genebank accession
biomarker
exposure
gene
fume
Prior art date
Application number
KR1020090050984A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101093726B1 (ko
Inventor
윤석주
송창우
권명상
오정화
양미진
양영수
박한진
허선희
이은희
Original Assignee
한국화학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국화학연구원 filed Critical 한국화학연구원
Priority to KR1020090050984A priority Critical patent/KR101093726B1/ko
Publication of KR20100132256A publication Critical patent/KR20100132256A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101093726B1 publication Critical patent/KR101093726B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/109—Invader technology

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 용접 흄(welding fume)에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 구체적으로 폐질환을 유발하는 용접 흄의 노출 또는 노출 후 회복에 의해 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커, 및 이를 이용한 용접 흄에 대한 노출 또는 노출역(歷) 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오마커가 집적된 DNA 마이크로어레이 칩은 인간의 폐에 대한 용접 흄 노출 또는 노출역(歷) 여부를 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 용접 흄에 의한 폐질환 유발 및 회복 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
용접 흄, 폐질환, 바이오마커, DNA 마이크로어레이 칩, 키트.

Description

용접 흄 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법{Biomarkers for identification of exposure to welding fume and the method of identification using the same}
본 발명은 용접 흄(welding fume)에 대한 노출 또는 노출역(歷) 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폐질환을 유발 하는 용접 흄의 노출 또는 회복에 의해 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 용접 흄에 대한 노출 또는 노출역(歷) 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
용접공(welder)들은 종종 반복되는 용접 흄(welding-fume) 노출에 의해 폐질환(pulmonary disease)으로 고통받는다(Lubianova, I. P., Gig. Tr. Prof. Zabol. 5:10-44, 1990; Ruegger, M., Med. Wochenschr. 125:467-474, 1995; Steurich, F., and Feyerabend, R., Pneumologie. 51:545-549, 1997). 대부분의 경우, 용접 흄에 대한 노출은 진폐증(pneumoconiosis)을 야기하지만, 아직까지 진행성 폐섬유 증(progressive lung fibrosis)을 나타낸 적은 없었다. 그러나, 용접공들과 같이 고농도의 용접 흄, 또는 규토(silica dust), 이산화질소(nitrogen dioxide) 가스 및 석면(asbestos)를 포함하는 혼합 화합물에 장기 노출되면 폐섬유증이 야기될 수 있다(Buerke, U., et al., Am. J. Ind. Med. 41:259-268, 2002).
용접 흄에 대한 장기 노출은 폐질환 뿐만 아니라, 신경독성 효과를 야기하고 폐암에 대한 위험을 증가시킬 수 있음이 보고된 바 있다(Josephs, K. A., et al., Neurology 64:2033-2039, 2005; Racette, B. A., et al., Neurology 64:230-235, 2005). 용접 중 가장 일반적인 유형인 스테인리스강을 결합시키는 수동적인 금속 아크 용접(manual metal arc welding combined with stainless steel, MMA-SS)은 건강에 치명적인 영향을 미치는 육가크로뮴(hexavalent chromium, CrⅥ)을 생성시키는 것으로 알려져 있다. 상기 MMA-SS 용접 흄은 불활성가스 텅스텐아크용접(tungsten inert gas arc welding, TIG) 및 불활성가스 금속아크용접(Metal Inert Gas Welding, MIG)과 같은 다른 용접 방법에 의해 생성되는 흄 보다 더 독성이 있는 것으로 보고된 바 있다(Hedenstedt, A., et al., Scand. J. Work Environ. Health. 3:203-211, 1977; Jelmert, O., et al., Mutat. Res. 320:223-233, 1994).여러 연구를 통해 MMA-SS 용접 흄 유발 시스템이 폐독성 효과을 야기하고 스프라그 다우리(Sprague-Dawley) 쥐의 폐에서 섬유증을 촉진시키는 것이 보고된 바 있다(Yu, I. J., et al., Toxicol. Lett. 116:103-111, 2000; Yu, I. J. et al., Toxicol. Sci. 63:99-106, 2001; Yu, I. J., et al., Toxicol. Lett. 143:247-259, 2003). 그러므로, MMA-SS 용접 흄에 노출된 쥐 모델의 용도는 폐 손상 및 질환과 관련된 분자 메커니즘을 이해하는데 도움이 될 수 있다.
최근에는, 마이크로어레이 기술을 이용한 게놈 접근이 간독성을 포함한 복합적인 독물학적 현상의 분석에 매우 유용할 수 있음이 보고되었다(Chung, H., et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 206:27-42, 2004; Lim, J. S., et al., Int. J. Toxicol. 26:213-220, 2007; Oda, H., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 335:458-468, 2005; Powell, C. L., et al., Toxicol. Sci. 93:213-222, 2006). 용접 흄 노출에 의해 유도되는 폐질환의 평가에 대해, 여러 연구는 조직학적 구조 및 폐 손상 마커에 대하여 주로 초점을 맞추었으나, 마이크로어레이 분석은 제한되어왔다.
본 발명자들의 기존 보고에서, 쥐를 30일 동안 용접 흄에 노출시킨 후 Affymetrix GeneChip® system을 이용하여 상기 쥐의 폐에서 일부 유전자들의 발현 프로파일을 분석한 바 있다(Oh, J. H., et al., Mol. Cell. Toxicol. 3:306-313, 2007). 그 결과, 염증 및 면역 반응과 관련된 많은 유전자들이 용접 흄 노출에 의해 발현이 차별적으로 조절되는 것을 보였다. 초기 숙주 방어는 폐 손상에 반응하여 신속하고 강하게 염증을 유발하는 것에 의존하는 것으로 고려된다. 게다가, 염증 및 조직 회복과 같은 숙주 방어는 손상된 부위의 벽을 조정하고 산속하게 염증 반응을 유발하거나 제거한다. 폐 섬유증은 염증 매개체 및 그 외 장기적인 상처 회복 반응을 유발하는 알려지지 않은 인자의 복합적 상호작용으로부터 야기되는 것으로 보고된 바 있다(Bringardner, B. D., et al., Antioxid. Redox. Signal. 10:287-301, 2008). 그러나, 용접 흄 노출 후 유발되는 폐 손상 또는 회복에 대한 메커니즘은 여전히 알려져 있지 않고 있다.
이에, 본 발명자들은 용접 흄 노출에 의해 유발되는 폐 손상의 숙주 방어 및 회복 경로의 분자적 기작(메커니즘)을 조사하기 위해, 30일 동안 용접 흄에 노출된 쥐와 상기 노출 후 30일 동안 용접 흄의 노출을 제거하여 회복되는 쥐의 유전자 발현 프로파일을 분석한 결과, 용접 흄의 노출군과 노출 후 회복군의 각 군 유래 쥐의 폐에서 대조군에 비해 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 유전자를 발굴하여 용접 흄 노출, 또는 노출 후 회복 과정을 분자적으로 통찰할 수 있는 새로운 바이오마커를 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 폐질환을 유발하는 용접 흄(welding fume)에 대한 노출 또는 노출 후 회복에 의해 특이적으로 과발현 또는 저발현되는 바이오마커, 및 상기 바이오마커를 이용한 용접 흄에 대한 노출 또는 노출역(歷) 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 용접 흄(welding fume) 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 용접 흄 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 용접 흄 노출 후 회복에 의해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 용접 흄 노출역(歷) 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된 용접 흄에 대한 노출 또는 노출역(歷) 여부 확인용 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 용접 흄에 대한 노출 또는 노출역(歷) 여부를 확인하기 위해 상기 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 용접 흄에 대한 노출 또는 노출역(歷) 여부 확인용 키트를 제공한다.
본 발명의 바이오마커 및 이를 이용한 방법은 DNA 마이크로어레이 칩 또는 키트를 통하여 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 용접 흄(welding fume) 노출 또는 노출역(歷) 여부를 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 용접 흄 노출에 의해 유발되는 폐 손상의 숙주 방어 및 회복 경로의 분자적 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 폐질환을 유발하는 용접 흄(welding fume) 노출에 의해 유전자의 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 용접 흄에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.
상기 바이오마커는 저농도 및 고농도의 용접 흄을 노출시킨 개체의 세포에서 발현이 변화된 유전자들로 p값(p value)이 0.05 이하에 해당하고, 2배 이상 발현이 증가 또는 감소한 유전자로써, 유전자의 기능은 면역반응, 혈액계 발달, 면역 및 림프계 발달, 조직 형태, 또는 조직 발달과 관련된 유전자로 구성되어 있다.
본 발명에서는 용접 흄을 매일 2시간씩 30일 동안 노출시킨 쥐의 폐 세포에서 유전자 발현패턴을 분석한 결과, 대조군에 비해 2배 이상 발현이 증가 또는 감 소한 유전자들을 발굴함으로써 상기 유전자들을 폐질환 유발 등 유해한 용접 흄이 노출되었는지를 판별할 수 있는 유전자 마커로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는, 용접 흄 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다:
유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001007612: Ccl7(chemokine (C-C motif) ligand 7), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001065601: RGD1564316[similar to scavenger receptor type A SR-A (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_130741: Lcn2(lipocalin 2), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_172044: Mcpt2(mast cell peptidase 2), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001008515: C1qa(complement component 1, q subcomponent, alpha polypeptide), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001008830: RT1-A3(RT1 class I, A3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001062080; XM_575331: RGD1559727[similar to lipoma HMGIC fusion partner-like 3 (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_139192: Scd1(stearoyl-Coenzyme A desaturase 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001071720; XM_345529: Igfbpl1[insulin-like growth factor binding protein-like 1 (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_022604: Esm1(endothelial cell-specific molecule 1), 유전자등록번 호(GeneBank accession No.) NM_017178: Bmp2(bone morphogenetic protein 2), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_244186; XR_007714: RGD1560587[similar to Eph receptor A4 (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_013104: Igfbp6(insulin-like growth factor binding protein 6), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_012651: Slc4a1(solute carrier family 4, member 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001056398; XM_229925: Neb(Nebulin).
1) 상기 바이오마커 중에서, 용접 흄 노출에 의해 발현이 증가하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다:
유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001007612: Ccl7(chemokine (C-C motif) ligand 7), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001065601: RGD1564316[similar to scavenger receptor type A SR-A (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_130741: Lcn2(lipocalin 2), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_172044: Mcpt2(mast cell peptidase 2), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001008515: C1qa(complement component 1, q subcomponent, alpha polypeptide).
2) 상기 바이오마커 중에서, 용접 흄 노출에 의해 발현이 감소하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다:
유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001008830: RT1-A3(RT1 class I, A3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001062080; XM_575331: RGD1559727[similar to lipoma HMGIC fusion partner-like 3 (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_139192: Scd1(stearoyl-Coenzyme A desaturase 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001071720; XM_345529: Igfbpl1[insulin-like growth factor binding protein-like 1 (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_022604: Esm1(endothelial cell-specific molecule 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_017178: Bmp2(bone morphogenetic protein 2), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_244186; XR_007714: RGD1560587[similar to Eph receptor A4 (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_013104: Igfbp6(insulin-like growth factor binding protein 6), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_012651: Slc4a1(solute carrier family 4, member 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001056398; XM_229925: Neb(Nebulin).
본 발명은 폐질환을 유발하는 용접 흄(welding fume) 노출 후 회복 과정에 의해 특이적으로 유전자의 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 용접 흄에 대한 노출역(歷) 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.
상기 바이오마커는 저농도 및 고농도의 용접 흄을 노출시킨 후 깨끗한 공기에서 회복시킨 개체의 세포에서 발현 조절 이상이 있는 유전자들로서, p값(p value)이 0.05 이하에 해당하고, 2배 이상 발현이 증가 또는 감소한 유전자로써, 유전자의 기능은 결합조직 발달, 골격 및 근계 발달, 조직 형태, 배 발달 또는 혈액계 발달과 관련된 유전자로 구성되어 있다.
본 발명에서는 용접 흄을 매일 2시간씩 30일 동안 노출시킨 후 30일 동안 용접 흄을 제거한 깨끗한 공기에서 회복시킨 쥐의 폐 세포에서 유전자 발현패턴을 분석한 결과, 대조군으로 발현이 되돌아가지 않고 발현 조절 이상이 있어, 대조군에 비해 2배 이상 발현이 증가 또는 감소한 유전자들을 발굴함으로써 상기 유전자들을 폐질환 유발 등 유해한 용접 흄이 과거에 노출되었는지를 판별할 수 있는 유전자 마커로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는, 용접 흄 노출역(歷) 여부 확인용 바이오마커를 제공한다:
유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001081950: Igj(immunoglobulin joining chain), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001025649: Tm9sf4(transmembrane 9 superfamily protein member 4), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_133303: Bhlhb3(basic helix-loop-helix domain containing, class B3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_139189: Lmbrd1(LMBR1 domain containing 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001072924: RGD1309696[similar to KIAA2019 protein (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_133617: Serpina10[serine (or cysteine) peptidase inhibitor], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_024157: Cfi(complement factor I), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001072829: RGD1306176(similar to FCRL), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_053744: Dlk1[delta-like 1 homolog (Drosophila)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_017105: Bmp3(bone morphogenetic protein 3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001060521: RGD1310180(similar to hypothetical protein FLJ12681), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001069608: RGD1565373(similar to CD69 antigen), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001059708: Pou2f3(POU domain, class 2, transcription factor 3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_013128: Cpe(carboxypeptidase E).
1) 상기 바이오마커 중에서, 용접 흄 노출 후 회복 과정에서 대조군에 비해 발현이 증가하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다:
유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001081950: Igj(immunoglobulin joining chain), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001025649: Tm9sf4(transmembrane 9 superfamily protein member 4), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_133303: Bhlhb3(basic helix-loop-helix domain containing, class B3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_139189: Lmbrd1(LMBR1 domain containing 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001072924: RGD1309696[similar to KIAA2019 protein (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_133617: Serpina10[serine (or cysteine) peptidase inhibitor], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_024157: Cfi(complement factor I).
2) 상기 바이오마커 중에서, 용접 흄 노출 후 회복 과정에서 대조군에 비해 발현이 감소하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다:
유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001072829: RGD1306176(similar to FCRL), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_053744: Dlk1[delta-like 1 homolog (Drosophila)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_017105: Bmp3(bone morphogenetic protein 3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001060521: RGD1310180(similar to hypothetical protein FLJ12681), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001069608: RGD1565373(similar to CD69 antigen), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001059708: Pou2f3(POU domain, class 2, transcription factor 3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_013128: Cpe(carboxypeptidase E).
또한, 본 발명은 본 발명의 용접 흄 노출에 의해 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된, 용접 흄 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 용접 흄 노출 후 회복 과정에 의해 대조군에 비해 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된, 용접 흄 노출역(歷) 여부 확인용 마이크로어레이 칩을 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 바이오마커 유전자의 바람직하게는 15 내지 50개, 더욱 바람직하게는 15 내지 30개의 핵산을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로파이펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 마이크로어레이 칩을 이용하여 용접 흄 노출, 또는 노출역 (歷) 여부 확인을 위한 상기 마커의 검출 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 한가지 양태에 따르면,
1) 실험군인 피검체 유래 폐세포와 대조군 폐세포에서 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cRNA로 증폭하면서 Biotin으로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 Biotin으로 표지된 cRNA를 용접 흄 노출에 의해 특이적으로 발현이 변화하는 바이오마커가 집적된 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 용접 흄 노출에 의해 특이적으로 발현이 변화하는 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 용접 흄 노출 여부를 확인하기 위해 본 발명의 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면,
1) 실험군인 피검체 유래 폐세포와 대조군 폐세포에서 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cRNA로 증폭하면서 Biotin으로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 Biotin으로 표지된 cRNA를 용접 흄 노출 후 회복에 의해 특이적으로 발현이 변화하는 바이오마커가 집적된 마이크로어레이 칩과 혼성화 시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 용접 흄 노출 후 회복에 의해 특이적으로 발현이 변화하는 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 용접 흄 노출역(歷) 여부를 확인하기 위해 본 발명의 상기 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 방법들에 있어서, 단계 1)의 폐세포는 쥐 유래 기관지폐포세척 세포를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 폐 조직에서 유래한 세포라면 모두 이용 가능하다. 이때, 대조군은 건강한 개체일 것이다.
상기 방법들에 있어서, 단계 3)의 마이크로어레이는 본 발명에서 바이오마커 유전자가 탑재된 마이크로어레이라면 사용 가능하고, Whole Human Genome Oligo Microarray(Affymetrix, USA) 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 분석은 혼성화된 마이크로어레이 칩을 세척 및 염색한 후 스캔하여 이미지 프로세싱을 수행한 다음 통계적 분석을 수행하는 것이 바람직하다. 상기 염색 및 세척은 Fuidics Station 450을 이용하고, 스캔은 GeneChip scanner　 3000을 이용하며, 이미지 프로세싱은 Affymetrix GeneChip　 Operating System(GCOS)을 이용하며, 모든 절차는 Affymetrix사의 프로토콜에 따라 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 통계학적 분석은 GenPlex software를 이용하여 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
또한, 본 발명은 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 이용하여 용접 흄 노출, 또는 노출역(歷) 여부 확인을 위한 상기 마커의 검출 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 한가지 양태에 따르면,
1) 실험군인 피검체 유래 폐세포와 대조군 폐세포에서 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를 대상으로, 용접 흄 노출에 의해 특이적으로 발현이 변화하는 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 용접 노출 여부를 확인하기 위해 본 발명의 상기 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면,
1) 실험군인 피검체 유래 폐세포와 대조군 폐세포에서 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를 대상으로, 용접 흄 노출 후 회복에 의해 특이적으로 발현이 변화하는 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 용접 노출역(歷) 여부를 확인하기 위해 본 발명의 상기 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 방법들에 있어서, 단계 1)의 폐세포는 쥐 유래 기관지폐포세척 세포를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 폐 조직에서 유래한 세포라면 모두 이용 가능하다. 이때, 대조군은 건강한 개체일 것이다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 프라이머 쌍은 단계 1)의 프라이머 쌍은 바이오마커 유전자의 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 15 내지 50머 길이, 바람직하게는 15 내지 30머의 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 25머의 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 모두 사용 가능하다.
상기 방법에 있어서, 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍의 고안은 당업자에게 자명한 것이다. 예를 들어, Primer3 software(http://frodo.wi.mit.edu/)를 이용하여 고안할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 용접 흄 노출에 의해 특이적 발현 변화하는 바이오마커가 집적된 마이크로어레이 칩을 포함하는, 용접 흄 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 용접 흄 노출 후 회복에 의해 특이적 발현 변화하는 바이오마커가 집적된 마이크로어레이 칩을 포함하는, 용접 흄 노출역(歷) 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 키트에 추가적으로 쥐 유래 기관지폐포세척 세포를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 용접 흄 노출에 의해 특이적 발현 변화하는 바이오마커 유전자에 상보적이고 상기 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 용접 흄 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 본 발명의 용접 흄 노출 후 회복에 의해 특이적 발현 변화하는 바이오마커 유전자에 상보적이고 상기 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 용접 흄 노출역(歷) 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 키트의 프라이머 쌍은 바이오마커 유전자의 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 15 내지 50머 길이, 바람직하게는 15 내지 30머의 길의, 더욱 바람직하게는 18 내지 25머의 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 모두 사용 가능하다.
상기 키트에 있어서, 바이오마커 유전자의 정보를 알고 있으므로 이에 대한 프라이머쌍의 고안은 당업자에게 자명한 것이다. 예를 들어, Primer3 software(http://frodo.wi.mit.edu/)를 이용하여 고안할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 키트에 추가적으로 쥐 유래 기관지폐포세척 세포를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 상기 반응 시약은 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 RT-PCR 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> MMA-SS 용접 흄의 생성
본 발명자들은 기존에 보고된 방법(Yu, I. J. et al., Toxicol. Sci. 63:99- 106, 2001)의 변형을 이용하여 MMA-SS 용접 흄을 생성시켰다. 상기 용접 흄은 바탕 금속으로서 스테인리스 디스크(SUS 304, 2.5 cm 두께, Korea Welding Electrode Co. Ltd., Seoul, Korea)과 용접 봉(KST 308, 26 × 300 mm, Korea Welding Electrode Co. Ltd.)의 회전을 이용하여 생성시켰다. 생성된 용접 흄을 저농도 노출 또는 고농도 노출 챔버(whole-body type, 1.5 m3 Dusturbo, Seoul, Korea) 내부로 통과시켰다. 상기 용접 흄을 2 L/분의 유량으로 개인용 포집기(personal sampler)(MSA, Pittsburgh, PA)를 이용하여 채취한 다음, 혼합된 셀룰로오스 에스테르 막 필터(mixed cellulose ester membrane filter)(구멍 크기 0.8 μm, 37 mm 직경, Millipore, Bedford, MA)로 상기 용접 흄 입자를 포획하였다. 원자흡광광도계(Atomic Absorption Spectrophotometry) 또는 유도결합플라즈마분석기(inductive coupling plasma analyzer)(Thermojeralash, ISIS, Houston, TX)를 이용하여 용접 흄 입자를 분석하였다. 상기 챔버내 농도는 용접 흄을 2시간 동안 노출시키는 동안 폴리염화비닐 막 필터(polyvinyl chloride membrane filter)(구멍 크기 5 μm, 37 mm 직경, PALL GLA-5000, Pall Corp., East Hills, NY)로 흄을 수집함으로써 측정하였다.
<실시예 2> 동물의 사육 및 분배
본 발명자들은 6주령의 스프라그 다우리 쥐(Sprague-Dawley rat)들을 구입(Charles River Laboratory, Atsuki, Japan)한 후, 용접 흄 노출 3주 전까지 순 응시켰다. 상기 쥐들을 통제된 온도 및 습도 하에서 12시간 명암 주기에서 사육하였으며, 표준 먹이를 섭취시켰다. 164.08±6.18 g의 무게를 가지는 쥐들을 무작위로 3가지군인 대조군, 용접 흄 저농도 노출군, 및 용접 흄 고농도 노출군으로 분배하였다. 저농도 및 고농도 노출군용 쥐들은 각각 51.4 ± 2.89 mg/m3 및 84.63 ± 2.87 mg/m3의 용접 흄을 매일 2시간 동안 30일까지 노출시켰다. 노출된 쥐들을 30일 동안 용접 흄을 제거한 깨끗한 공기에서 회복시켰다. 7마리의 쥐를 각 시험군으로 사용하였다. 30일 노출 후와 상기 노출 후 30일 회복 기간 후에 각각 부검을 실시하였다. 모든 실험은 실험동물사용관리위원회(Institutional Animal Care and Use Committees, IACUC)에 의해 승인받았으며, 국제실험동물관리공인협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International, AAALAC International) 안내에 따라 수행하였다.
<실험예 1> 기관지폐포 세척액(bronchioalveolar-lavage fluid, BALF)에서 조직 및 세포 분포 관찰
본 발명자들은 용접 흄 노출군, 회복군 및 대조군의 쥐들로부터 유래한 기관지폐포 세척액(bronchioalveolar-lavage fluid, BALF)의 조직병리학적 변화 및 세포 분포를 분석하였다.
구체적으로, 기관지폐포 세척액을 수득하여 기존에 보고된 방법으로 분석하였다(Antonini, J. M., et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 200:206-218, 2004). 각 군 유래 쥐들을 아이소플루란(isoflurane)으로 마취시킨 후, 복대동맥을 절단하여 방혈시켰다. 죄측 기관지를 집은 후, 우측 폐에서 기관지폐포 세척을 수행하였다. 우측 폐는 처음에 두개로 분리한 3 ㎖ 분취액의 따뜻한 칼슘제거 및 마그네슘제거 인산완충용액(pH 7.4)으로 세척하였다. 상기 두개의 기관지폐포 세척액 시료는 10분 동안 500× g 에서 원심분리를 수행한 후, 첫번재 및 두번째 분획으로부터 유래된 무세포액을 폐 손상을 결정하는데 이용하였다. 기관지폐포 세척에 의해 회수된 총 세포수는 Coulter Multisizer 3 입자 계수기(Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 이용하여 결정하였다. 기관지폐포 세척 세포는 5분 동안 800 rpm에서 원심분리한 후, Shandon Cytospin 4 원심분리기(Thermo-Shandon, Pittsburgh, PA)를 이용하여 슬라이드 위에 펼쳐놓았다. 그런 다음, 세포들(쥐당 300개)은 Wright-Giemsa 염색으로 염색시킨 후, 대식세포, 호중구(neutrophil, PMN) 또는 림프구(lymphocyte)로 구별하여 계수하였다. 두가지 염증 지표인 베타-N-아세틸 글루코시미니다제(β-N-acetyl glucosaminidase, β-NAG) 및 젖산탈수소효소(Lactate Dehydrogenase, LDH)의 활성은 활성된 식세포로부터 분비되는 효소를 검출하고 일반적인 세포독성 평가하기 위해 각각 측정하였다. LDH는 자동화 임상화학분석기(Fujifilm, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였고, β-NAG는 TBA 200FR 생화학분석기(Toshiba, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 대조군과 실험군간 차이의 통계적 유의성은 Dunn's rank 합계 및 편차 분석을 이용하여 산출하였다.
또한, 조직병리학적 분석은 용접 흄 노출군, 회복군 및 대조군 쥐들로부터 획득된 폐 샘플들을 10% 중성 완충 포르말린으로 고정시킨 후, 파라핀에 방치하였 다. 마이크로톰(microtome)(RM2165, Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 자른 각 절편(4 μm 두께)을 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin-eosin)으로 염색한 다음, 광학현미경(E400, Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
상기 분석 결과, 저농도 및 고농도의 MMA-SS 용접 흄 노출군에서 입자 포함 대식세포(particle-laden macrophage) 및 림프구의 수는 현저히 감소하였으나, 포말큰포식세포(foamy giant macrophage)는 세기관지(small bronchiole) 및 결절 형태를 가진 기관지관(bronchial vessel)에 축적되었다. 노출군에 있어서, 기관지폐포 세척액에서 대식세포, PMN 및 림프구가 상대적으로 감소하는 세포 분포를 나타내었다. 조직병리학적 분석 결과, MMA-SS 용접 흄에 의해 유발된 폐 손상이 30일 회복기간 동안 완벽하게 제거되지 않고, 염증이 일부 크기가 유지되었으나, β-NAG 및 LDH와 같은 염증 지표가 대조군에 비해 감소하였으며, 상기 지표가 30일 회복 기간에 의해 전체적인 염증 반응을 감소시켰음을 확인하였다(표 1).
노출군 및 회복군의 폐에서 염증성 매개변수와 세포밀도
30일 노출군 30일 회복군
대조군 발현감소 발현증가 대조군 발현감소 발현증가
세포밀도(×106)
대식세포 1.52 ±
0.27		 8.09 ±
0.44a 		16.05 ±
0.66a 		1.89 ±
0.18		 3.53 ±
0.42a 		4.00 ±
0.99a
다핵백혈구(PMN) 0.04 ±
0.01		 0.34 ±
0.02a 		0.50 ±
0.02a 		0.02 ±
0.00		 0.03 ±
0.01a 		0.04 ±
0.01a
림프구 0.03 ±
0.01		 0.25 ±
0.01a 		0.85 ±
0.03a 		0.02 ±
0.00		 0.03 ±
0.00a 		0.06 ±
0.01a
총수 1.64 ±
0.29		 8.69 ±
0.47a 		17.25 ±
0.71a 		1.97 ±
0.19		 3.73 ±
0.44a 		4.28 ±
1.07a
염증성 매개변수
β―NAG(IU/L) 1.48 ±
0.40		 4.36 ±
0.44a 		5.94 ±
0.74a 		1.08 ±
0.21		 1.00 ±
0.31		 2.01 ±
0.26
LDH(U/L) 32.33 ±
4.87		 159.42 ±
14.08a 		395.00 ±
51.38a 		24.83 ±
3.50		 19.14 ±
2.44		 23.28 ±
2.46
대조군에 대한 a p <0.01; 값은 평균 ± SD (n = 4).
<실험예 2> 마이크로어레이를 이용한 유전자 발현 프로파일 분석
본 발명자들은 용접 흄 노출군, 회복군 및 대조군의 쥐들 유래 폐의 샘플에서 유전자 발현 프로파일을 Affymetrix GeneChip® system을 이용하여 분석하였다.
<2-1> RNA의 분리
좌측 폐 샘플의 부위를 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 균질화시킨 다음, RNeasy mini kit(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 분리된 총 RNA를 정제하였다. NanoDrop 분광광도계(NanoDrop Technologies, Montchanin, DE)를 이용하여 총 RNA를 정량하였으며, DNA 칩 실험용 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)를 이용하여 RNA의 특성을 평가하였다.
<2-2> 마이크로어레이 분석
샘플 표지, 마이크로어레이 교잡, 세척 및 스캐닝은 제조사의 프로토콜(Affymetrix, Santa Clara, CA)에 따라 수행하였다. 세포 강도 파일의 전처리 및 마이크로어레이 분석은 GenPlex 소프트웨어(Istech Inc., Goyang, Korea)를 이용하여 수행하였다. 데이타 표준화는 전세계 범위 표준화를 이용하여 수행하였다. 30일 용접 흄 노출군 및 30일 회복군에서 대조군에 비해 발현 변화를 가지는 유전자를 변화 크기 및 Welch's t-test(2배 이상 및 p <0.05)를 근거로 선별하였다.
마이크로어레이 분석 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이 노출군 및 회복군에 각각 대응하는 514개 및 106개 유전자를 포함하는 총 577개의 유전자가 대조군에 비해 2배 이상의 발현 변화를 가지는 것을 확인하였다(p < 0.05, two-tailed, unpaired Welch's t test). 회복군은 노출군에 비해 일부 유전자들의 발현 변화가 대조군 수준으로 되돌아가는 것을 확인하였다.
용접 흄 노출 랫트의 폐에서 발현 변화를 가지는 유전자의 수
발현변화 유전자의 수(2배 이상 변화)
군 분량(Dose) p < 0.01 p < 0.05
30일 노출 발현감소 246 331
발현증가 297 396
총수 379 514
30일 회복 발현감소 28 68
발현증가 39 61
총수 52 106
총수 396 577
<2-3> 유전자 발현 패턴의 분석
선별된 유전자들을 주성분 분석(principal components analysis, PCA) 및 계층적 응집 클러스터링 알고리즘(hierarchical agglomerative clustering algorithm)(2차원이고 완전한 결합)으로 분석하였다. 또한, 상기 선별된 유전자를 이용하는 K-평균 클러스터링(K-Means Clustering)은 피어슨 상관계수(Pearson's correlation)(k = 10)를 포함하는 거리 매트릭스(distance matrix)를 기초로 수행하였다.
계층적 응집 클러스터링을 수행한 결과, 고농도 및 저농도 노출군 및 노출 후 회복군에서 각각 종속 클러스터링으로 구별되고, 고농도 노출 후 회복군을 제외하고 각 군의 샘플은 농도에 의해 5개의 클러스터링으로 분리되었다(도 1).
주성분 분석(PCA)을 수행한 결과, 노출군, 회복군 및 대조군 사이 3개의 주요 불일치를 나타내었으며, 일부 개별 변이는 고농도 노출 후 회복군에서 관찰되었다. 용접 흄 노출군에서 발현이 증가하거나 감소하는 대부분의 유전자들은 회복기간 동안 대조군의 수준으로 되돌아왔다. 그러나 일부 유전자들은 회복군에서 발현이 증가하거나 감소한 수준을 유지하였다.
노출군과 회복군에서 유전자 발현 패턴을 구체적으로 분석하기 위해, K-평균 클러스터링을 수행한 결과, 유전자 발현 패턴을 하기와 같은 두 개의 군으로 구별하였다: 1) 용접 흄 노출에 의해 변화된 유전자의 발현 수준이 30일 회복 기간 동안 대조군 수준으로 되돌아가는(군집 1,3, 6 및 7) 30일 노출군, 및 대조군에 비해 발현이 증가하거나 감소한 유전자의 발현 수준을 유지하거나(군집 2 및 4) 특이적으로 증가하거나 감소하는(군집 8) 30일 회복군(도 2).
<실험예 3> 유전자의 선별, 생물학적 기능 및 분자 네트워크 분석
본 발명자들은 K-평균 클러스터링을 통해, 발현이 변화된 프로파일을 가지는 376개의 유전자를 30일 노출군으로 동정하였고, 발현 조절 이상을 가지는 157개의 유전자를 30일 회복군으로 동정하였다. 이들 유전자들 중, 30일 노출군 및 30일 회복군에서 유의적으로 변화하는 유전자들을 선별하였다(표 3 및 표 4).
Figure 112009034820684-PAT00001
Figure 112009034820684-PAT00002
상기 노출군 및 회복군에서 발현이 변화하는 유전자들을 Ingenuity Pathways Analysis(Ingenuity Systems, Redwood, CA)을 이용하여 생물학적 기능 및 분자 네트워크를 분석하였다. 각 군의 네트워크는 '직접 또는 간접적 상호작용' 알고리즘에 의해 수행하였다. 상기 선별된 유전자들을 NetAffx (http://www.affymetrix.com)를 기초로 표시하였다.
생물학적 기능을 분석한 결과, 노출군의 유전자들은 면역반응과 관련되어 있는 반면에, 30일 회복군의 유전자들은 결합조직 발달과 관련이 있음을 확인하였다(표 5).
네트워크 분석을 수행한 결과, 노출군에서 29개 유전자의 네트워크가 Tnf와 같은 하나의 핵심 조절자를 가지는 감염 질환에 대한 반응으로 통합되어 있었다(도 3A). 다양한 케모카인 및 사이토카인을 포함하는 염증성 유전들 및 대사와 관련된 유전자들은 발현이 증가하였으며, 세포사멸과 관련된 유전자들은 발현이 감소하였다. 회복군에서, 11개의 유전자들은 Pparg와 같은 하나의 핵심 조절자를 가지는 배아 및 근육 발생을 위해 통합되어 있다(도 3B). 이런 네트워크에서, 핵심 조절자와 간접적으로 상호작용하는 Trem2는 고도로 발현이 증가하였으며, Bmp3 및 Dlk1를 포함하는 발생과 관련된 유전자들은 발현이 감소하였다.
30일 노출군 및 회복군에서 발현 변화를 가지는 유전자의 생물학적 기능
군 기능 p 값 a 유전자 수
30일 노출군 면역반응 4.62E-14 - 1.07E-03 67
혈액계 발달 3.74E-13 - 1.07E-03 53
면역 및 림프계 발달 1.12E-09 - 1.01E-03 53
조직 형태 4.17E-08 - 6.30E-04 43
조직 발달 1.34E-07 - 5.59E-04 40
30일 회복군 결합조직 발달 9.96E-05 - 4.5E-02 4
골격계 및 근계 발달 1.71E-03 - 4.53E-02 4
조직 형태 1.71E-03 - 4.53E-02 4
배 발생 1.93E-03 - 3.23E-02 2
혈액계 발달 1.93E-03 - 3.23E-02 2
a 표시: IPA는 Ingenuity Pathways knowledge base에 저장된 모든 함수 주석에서 이들 분자들의 발생 총 수에 대한 상대적인 관심 분자의 수를 비교함에 의해 p 값을 산출하였다(p 값을 가지는 Fisher's 정확 검정은 Benjamini. Hochberg 객관식 테스트 보정을 이용하여 조절되었다).
<실험예 4> 정량적 실시간 PCR에 의해 유전자 발현 변화의 유효성 검증
본 발명자들은 용접 흄 노출군 및 회복군에서 발현이 증가하거나 감소하는 유전자를 확인하기 위해, 각 군으로부터 유래한 발현이 고도로 변화된 일부 유전자들을 선별한 후, 정량적 실시간 RT-PCR을 수행하였다.
구체적으로, Rotor-Gene 6000 실시간 회전식 분석기(Corbett Research, Sydney, Australia)에서 제조사의 지시에 따라 SYBR Green(QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, Qiagen)을 이용하여 유전자 전사물을 검출 및 정량하였다. 프라이머는 Primer3 software(http://frodo.wi.mit.edu/)를 이용하여 고안하였다. 프라이머 서열은 하기 표 6에 기재하였다. PCR 산물의 특이성 및 보전을 확인하기 위해, 모든 증폭된 산물을 융해곡선분석(melting curve analyse)을 수행하였다. Gapdh 수준은 내부적 대조군으로 사용하였고, 발현 변화는 경쟁적 역 주기(comparative threshold cycle)(2C-Delta Delta(CT)) 방법에 따라 산출하였다(Livak, K. J., et al., Method. 25:402-408, 2001).
실시간 PCR에 이용되는 유전자의 프라이머
유전자 센스(5'→3') 안티센스(5'→3') 크기(bp)
Mmp12 tgcagctgtctttgatccac
(서열번호: 1)		 gcatcaatttttggcctgat
(서열번호: 2)		 150
Cd5l gggcctagggatctaactgc
(서열번호: 3)		 cccttccaaagacacactcc
(서열번호: 4)		 153
Ccl7 aaagggcatggaagtctgtg
(서열번호: 5)		 accgtagtccacccatttca
(서열번호: 6)		 192
Cxcl5 cgctaatttggaggtgatcc
(서열번호: 7)		 agtgcattccgctttgtttt
(서열번호: 8)		 171
Spp1 tgaggctctcaaggtcatcc
(서열번호: 9)		 gactgctcagtgctctcgtg
(서열번호: 10)		 177
Tnf gaagctgtcttcaggccaac
(서열번호: 11)		 gacagcctggtcaccaaatc
(서열번호: 12)		 176
Trem2 aagatgctggagacctctgg
(서열번호: 13)		 ggatgctggctgtaagaagc
(서열번호: 14)		 168
IgG-2a gcaaagtcaacagtggagca
(서열번호: 15)		 tctgggggatagaagccttt
(서열번호: 16)		 166
Igh-1a gttgactgagcaaacggtca
(서열번호: 17)		 tttccacattgagcttgctg
(서열번호: 18)		 170
Igj aagggttgtggtttggaact
(서열번호: 19)		 gctgagatgccaaagagtcc
(서열번호: 20)		 174
Unknown EST tgcttaaggccttggtcaaa
(서열번호: 21)		 aaccaccagccaatgaagag
(서열번호: 22)		 160
Sult1c2 agttcataacatcccagagtcg
(서열번호: 23)		 aaactccaagcaagacaaagc
(서열번호: 24)		 150
Il8ra catgtgggtgatctttgctg
(서열번호: 25)		 aagcccaggatctcggtaat
(서열번호: 26)		 165
Bat1a gtcacaggtgttccctccat
(서열번호: 27)		 cagatgtgcagaagcgagaa
(서열번호: 28)		 175
Gapdh ctcatgaccacagtccatgc
(서열번호: 29)		 ttcagctctgggatgacctt
(서열번호: 30)		 155
그 결과, 노출군에서 Ccl7, RGD1564316, Lcn2, Mcpt2 및 C1qa은 대조군에 비해 발현이 증가하였으며, RT1-A3, RGD1559727, Scd1, Igfbpl1, Esm1, Bmp2, RGD1560587, Igfbp6, Slc4a1 및 Neb은 대조군에 비해 발현이 감소하였다. 또한, 회복군에서 Igj, Tm9sf4, Bhlhb3, Lmbrd1, RGD1309696, Serpina10, Cfi은 대조군에 비해 발현이 증가하였으며, RGD1306176, Dlk1, Bmp3, RGD1310180, RGD1565373, Pou2f3 및 Cpe은 대조군에 비해 발현이 감소하였다.
본 발명의 바이오마커가 집적된 DNA 마이크로어레이 칩 또는 키트는 용접 흄(welding fume) 노출 또는 노출역(歷) 여부를 간단하고 신속하게 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 용접 흄에 의해 유발되는 폐질환 유발 및 회복 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
도 1은 용접 흄 30일 노출군 및 노출 후 30일 회복군의 폐에서 특이적으로 발현 변화하는 유전자들의 계층적 클러스터링을 보여주는 그림이다(0.5의 유사성(similarity)을 기초로 카테고리화된 5개의 클러스터를 색체된 박스로 나타냄).
도 2는 용접 흄 30일 노출군 및 노출 후 30일 회복군의 폐에서 특이적으로 발현 변화하는 유전자들의 k-평균 클러스터링(k-means clustering)을 보여주는 그림이다:
(A)는 k-평균 클러스터링의 히트맵(Heatmap)(10개의 클러스터는 색체된 라인으로 나타냄); 및
(B) 각각의 클러스터의 유전자 프로파일(X축은 히트맵에서 보여진 동일한 순서에 따라 샘플을 나타내며, k-평균 클러스터링은 k = 10(총 클러스터 = 10)으로 세팅함에 의해 수행).
도 3은 용접 흄 30일 노출군 및 노출 후 30일 회복군의 폐에서 특이적으로 발현 변화하는 유전자들의 네트워크를 나타내는 그림이다(빨간색은 발현 증가된 유전자, 녹색은 발현 감소된 유전자):
(A) 감염성 질환과 관련된 30일 노출군 유래 비정상적으로 발현되는 29개의 유전자의 네트워크; 및
(B) 배 발생 및 근육 발생과 관련된 노출 후 30일 회복군의 폐에서 조절 이상을 가지는 11개의 유전자들의 네트워크.
도 4는 용접 흄 노출군 및 회복군으로부터 각각 유래한 발현이 고도로 변화 된 일부 유전자들을 선별한 후, 정량적 실시간 RT-PCR을 수행하여 상대적인 발현수준을 나타내는 그래프이다:
(A) 30일 노출군에서 선별된 4개의 유전자들의 발현수준 비교;
(B) 30일 회복군에서 선별된 4개의 유전자들의 발현수준 비교; 및
(C) 30일 회복군에서 선별된 4개의 또 다른 유전자들의 발현수준 비교.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> Biomarkers for identification of exposure to welding fume and the method of identification using the same <130> 9p-04-41 <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp12 sense primer <400> 1 tgcagctgtc tttgatccac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp12 antisense primer <400> 2 gcatcaattt ttggcctgat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cd5l sense primer <400> 3 gggcctaggg atctaactgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cd5l antisense primer <400> 4 cccttccaaa gacacactcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccl7 sense primer <400> 5 aaagggcatg gaagtctgtg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccl7 antisense primer <400> 6 accgtagtcc acccatttca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cxcl5 sense primer <400> 7 cgctaatttg gaggtgatcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cxcl5 antisense primer <400> 8 agtgcattcc gctttgtttt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spp1 sense primer <400> 9 tgaggctctc aaggtcatcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spp1 antisense primer <400> 10 gactgctcag tgctctcgtg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnf sense primer <400> 11 gaagctgtct tcaggccaac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnf antisense primer <400> 12 gacagcctgg tcaccaaatc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trem2 sense primer <400> 13 aagatgctgg agacctctgg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trem2 antisense primer <400> 14 ggatgctggc tgtaagaagc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-2a sense primer <400> 15 gcaaagtcaa cagtggagca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-2a antisense primer <400> 16 tctgggggat agaagccttt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Igh-1a sense primer <400> 17 gttgactgag caaacggtca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Igh-1a antisense primer <400> 18 tttccacatt gagcttgctg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Igj sense primer <400> 19 aagggttgtg gtttggaact 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Igj antisense primer <400> 20 gctgagatgc caaagagtcc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EST sense primer <400> 21 tgcttaaggc cttggtcaaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EST antisens eprimer <400> 22 aaccaccagc caatgaagag 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sult1c2 sense primer <400> 23 agttcataac atcccagagt cg 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sult1c2 antisense primer <400> 24 aaactccaag caagacaaag c 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Il8ra sense primer <400> 25 catgtgggtg atctttgctg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Il8ra antisense primer <400> 26 aagcccagga tctcggtaat 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bat1a sense primer <400> 27 gtcacaggtg ttccctccat 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bat1a antisense primer <400> 28 cagatgtgca gaagcgagaa 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh sense primer <400> 29 ctcatgacca cagtccatgc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh antisense primer <400> 30 ttcagctctg ggatgacctt 20

Claims (16)

  1. 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는, 용접 흄(welding fume) 노출 여부 확인용 바이오마커:
    유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001007612: Ccl7(chemokine (C-C motif) ligand 7), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001065601: RGD1564316[similar to scavenger receptor type A SR-A (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_130741: Lcn2(lipocalin 2), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_172044: Mcpt2(mast cell peptidase 2), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001008515: C1qa(complement component 1, q subcomponent, alpha polypeptide), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001008830: RT1-A3(RT1 class I, A3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001062080; XM_575331: RGD1559727[similar to lipoma HMGIC fusion partner-like 3 (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_139192: Scd1(stearoyl-Coenzyme A desaturase 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001071720; XM_345529: Igfbpl1[insulin-like growth factor binding protein-like 1 (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_022604: Esm1(endothelial cell-specific molecule 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_017178: Bmp2(bone morphogenetic protein 2), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_244186; XR_007714: RGD1560587[similar to Eph receptor A4 (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_013104: Igfbp6(insulin-like growth factor binding protein 6), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_012651: Slc4a1(solute carrier family 4, member 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001056398; XM_229925: Neb(Nebulin).
  2. 제 1항에 있어서, 하기 유전자가 용접 흄 노출에 의하여 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 바이오마커:
    유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001007612: Ccl7(chemokine (C-C motif) ligand 7), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001065601: RGD1564316[similar to scavenger receptor type A SR-A (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_130741: Lcn2(lipocalin 2), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_172044: Mcpt2(mast cell peptidase 2), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001008515: C1qa(complement component 1, q subcomponent, alpha polypeptide).
  3. 제 1항에 있어서, 하기 유전자가 용접 흄 노출에 의하여 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 바이오마커:
    유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001008830: RT1-A3(RT1 class I, A3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001062080; XM_575331: RGD1559727[similar to lipoma HMGIC fusion partner-like 3 (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_139192: Scd1(stearoyl-Coenzyme A desaturase 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001071720; XM_345529: Igfbpl1[insulin-like growth factor binding protein-like 1 (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_022604: Esm1(endothelial cell-specific molecule 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_017178: Bmp2(bone morphogenetic protein 2), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_244186; XR_007714: RGD1560587[similar to Eph receptor A4 (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_013104: Igfbp6(insulin-like growth factor binding protein 6), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_012651: Slc4a1(solute carrier family 4, member 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001056398; XM_229925: Neb(Nebulin).
  4. 제 1항의 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된, 용접 흄 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩.
  5. 제 4항의 마이크로어레이 칩을 포함하는 용접 흄 노출 여부 확인용 키트.
  6. 제 1항의 바이오마커 유전자에 상보적이고 상기 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 15 내지 50머 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하는, 용접 흄 노출 여부 확인용 키트.
  7. 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는, 용접 흄(welding fume) 노출역(歷) 여부 확인용 바이오마커:
    유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001081950: Igj(immunoglobulin joining chain), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001025649: Tm9sf4(transmembrane 9 superfamily protein member 4), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_133303: Bhlhb3(basic helix-loop-helix domain containing, class B3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_139189: Lmbrd1(LMBR1 domain containing 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001072924: RGD1309696[similar to KIAA2019 protein (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_133617: Serpina10[serine (or cysteine) peptidase inhibitor], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_024157: Cfi(complement factor I), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001072829: RGD1306176(similar to FCRL), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_053744: Dlk1[delta-like 1 homolog (Drosophila)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_017105: Bmp3(bone morphogenetic protein 3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001060521: RGD1310180(similar to hypothetical protein FLJ12681), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001069608: RGD1565373(similar to CD69 antigen), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001059708: Pou2f3(POU domain, class 2, transcription factor 3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_013128: Cpe(carboxypeptidase E).
  8. 제 7항에 있어서, 하기 유전자가 용접 흄 노출 후 회복에 의하여 대조군에 비해 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 바이오마커:
    유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001081950: Igj(immunoglobulin joining chain), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_001025649: Tm9sf4(transmembrane 9 superfamily protein member 4), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_133303: Bhlhb3(basic helix-loop-helix domain containing, class B3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_139189: Lmbrd1(LMBR1 domain containing 1), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001072924: RGD1309696[similar to KIAA2019 protein (predicted)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_133617: Serpina10[serine (or cysteine) peptidase inhibitor], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_024157: Cfi(complement factor I).
  9. 제 7항에 있어서, 하기 유전자가 용접 흄 노출 후 회복에 의하여 대조군에 비해 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 바이오마커:
    유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001072829: RGD1306176(similar to FCRL), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_053744: Dlk1[delta-like 1 homolog (Drosophila)], 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_017105: Bmp3(bone morphogenetic protein 3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001060521: RGD1310180(similar to hypothetical protein FLJ12681), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001069608: RGD1565373(similar to CD69 antigen), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) XM_001059708: Pou2f3(POU domain, class 2, transcription factor 3), 유전자등록번호(GeneBank accession No.) NM_013128: Cpe(carboxypeptidase E).
  10. 제 7항의 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된, 용접 흄 노출역(歷) 여부 확인용 마이크로어레이 칩.
  11. 제 10항의 마이크로어레이 칩을 포함하는 용접 흄 노출역(歷) 여부 확인용 키트.
  12. 제 7항의 바이오마커 유전자에 상보적이고 상기 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 15 내지 50머 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하는, 용접 흄 노출역(歷) 여부 확인용 키트.
  13. 1) 실험군인 피검체 유래 폐세포와 대조군 폐세포에서 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cRNA로 증폭하면서 비오틴(Biotin)으로 표지하는 단계;
    3) 단계 2)의 비오틴으로 표지된 cRNA를 제 4항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
    4) 단계 3)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
    5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 용접 흄 노출 여부를 확인하기 위해 제 1 항의 바이오마커를 검출하는 방법.
  14. 1) 실험군인 피검체 유래 폐세포와 대조군 폐세포에서 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 RNA를 대상으로, 제 1항의 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 용접 노출 여부를 확인하기 위해 제 1항의 바이오마커를 검출하는 방법.
  15. 1) 실험군인 피검체 유래 폐세포와 대조군 폐세포에서 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cRNA로 증폭하면서 비오틴(Biotin)으로 표지하는 단계;
    3) 단계 2)의 비오틴으로 표지된 cRNA를 제 10항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
    4) 단계 3)의 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
    5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 7항의 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 용접 흄 노출역(歷) 여부를 확인하기 위해 제 7항의 바이오마커를 검출하는 방법.
  16. 1) 실험군인 피검체 유래 폐세포와 대조군 폐세포에서 RNA를 분리하는 단계;
    2) 단계 1)의 RNA를 대상으로, 제 7항의 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 용접 노출역(歷) 여부를 확인하기 위해 제 7항의 바이오마커를 검출하는 방법.
KR1020090050984A 2009-06-09 2009-06-09 용접 흄 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법 KR101093726B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090050984A KR101093726B1 (ko) 2009-06-09 2009-06-09 용접 흄 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090050984A KR101093726B1 (ko) 2009-06-09 2009-06-09 용접 흄 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100132256A true KR20100132256A (ko) 2010-12-17
KR101093726B1 KR101093726B1 (ko) 2011-12-19

Family

ID=43507967

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090050984A KR101093726B1 (ko) 2009-06-09 2009-06-09 용접 흄 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101093726B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106546580A (zh) * 2015-09-16 2017-03-29 北京博肽未名生物技术有限公司 一种用于鉴别人参产地的多肽微阵列芯片

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106546580A (zh) * 2015-09-16 2017-03-29 北京博肽未名生物技术有限公司 一种用于鉴别人参产地的多肽微阵列芯片
CN106546580B (zh) * 2015-09-16 2019-06-28 北京博肽未名生物技术有限公司 一种用于鉴别人参产地的多肽微阵列芯片

Also Published As

Publication number Publication date
KR101093726B1 (ko) 2011-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7115779B2 (ja) 核酸の標準化された配列決定のための方法およびその使用
ES2373044T3 (es) Procedimientos y composiciones para predecir la respuesta a warfarina.
US20070281299A1 (en) Diagnostic Test For Parkinson&#39;s Disease
CN113528645A (zh) 用于在移植受体中监测免疫抑制疗法的方法
WO2010028098A4 (en) Pathways underlying pancreatic tumorigenesis and an hereditary pancreatic cancer gene
KR101418402B1 (ko) 돼지의 등심단면적 수준 판단용 ｓｎｐ 마커 및 이의 용도
CN108707670A (zh) 一种在b-all患者中有预后评估意义的标记物
CN107312861A (zh) 一种b‑all患者预后风险评估标记物
US20150065384A1 (en) Sequences associated with tdp-43 proteinopathies and methods of using the same
KR102275752B1 (ko) 결정적 제한 부위 전체 게놈 증폭에 의해 수득된 dna 서열의 라이브러리의 게놈 무결성 및/또는 품질을 측정하기 위한 방법 및 키트
KR101093726B1 (ko) 용접 흄 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법
WO2016057852A1 (en) Markers for hematological cancers
KR101735415B1 (ko) 헥산알 노출 특이적 메틸화 마커 유전자 및 이를 이용한 확인 방법
KR102280463B1 (ko) 백혈병 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 백혈병 진단 방법
KR101728023B1 (ko) Ｐｃｒ―ｌｄｒ을 이용한 ａｔｐ７ｂ 유전자의 돌연변이 검출
KR101668813B1 (ko) 만성 폐쇄성 폐 질환 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이, 및 이를 이용한 만성 폐쇄성 폐 질환의 진단 방법
KR102362130B1 (ko) 고혈압 또는 비만의 예측 또는 진단용 조성물
KR102279183B1 (ko) 췌장염 고위험군 진단용 바이오마커
KR101609373B1 (ko) 저급 지방족 포화 알데하이드 류 특이적 메틸화 마커 유전자 및 이를 이용한 저급 지방족 포화 알데하이드 류 노출 여부 확인 방법
KR101823376B1 (ko) 돈육내 스테아릭산 함량 조절용 snp 마커 및 그의 용도
CN112469835A (zh) 扩增方法及用于其中的引物
KR20230064006A (ko) 페놀 노출 여부 평가용 바이오마커 및 이를 이용한 페놀 노출 여부 평가 방법
JP6124498B2 (ja) 化学物質の生体毒性の評価方法
JP5804629B2 (ja) 遺伝子発現変動解析による化学物質の毒性評価方法
JP2011137659A (ja) 遺伝子発現レベルを指標とした化学物質の生体に対する影響の検出・予測方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150918

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160927

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170901

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180917

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190918

Year of fee payment: 9